Kérdések és megoldásokImmunhisztokémiai eljárások.Az eredmények interpretálása.

Kerekasztal moderátor

Péter Ilona

Dako Workshop

A Frank Diagnosztika Kft. és azOrszágos Onkológiai Intézet szervezésében

Budapest 2013. december 6.

Immunhisztokémia / Immuncitokémia módszer

a szövetekben vagy sejtekben fellelhető antigének

kimutatása specifikus antigén-antitest felismerés útján

Immunhisztokémia

indikációk a mindennapi daganat diagnosztikában

• eredet meghatározása• fenotípus• biológiai viselkedés• proliferációs készség jellemzése• terápiás célpont kimutatása• kórokozók kimutatása

Módszerek:

• Rutin szövettani feldolgozás /Hematoxilin-Eosin festés/

• Immunhisztokémia:

Indirekt envision detektáló rendszer (Dako A/S)

Ventana Immunhisztokémiai festő automata készülék

Vizsgált antigének:

calcitonin, CD10, CD20, CD56, CD99

chromogranin, E-cadherin, estrogén receptor (ER)

HER2(c-erbB-2/neu), Helicobacter pylori, Ki67 (MIB1), MDM2, Melan-A, p53 protein, progesteron receptor (PR), S100

Immunhisztokémiai eljárások

A bemutatásra kerülő esetek feldolgozása

Antitestek

• specificitása → 100%

• szenzitivitása → 100 %

Lehetőségek / Korlátok

Immunhisztokémiai reagensek

elvárások a mindennapi gyakorlatban

Eredet meghatározása

Szövetspecifikus antigén kimutatása

Elsődleges daganat

TTF-1

• pajzsmirigy szövet

• tüdő szövet

• egyes endokrin daganatok

Thyreoglobulin,

Prostata specifikus antigén

Áttét

?

MIB-1TTF-1TG

Pajzsmirigy, hyalinizáló trabeculáris tumor

TGTTF1

TPO

Csontvelő, pajzsmirigyrák áttéte

CD68

S100Bőr, soliter neurofibroma(Meissner test)

CK/AE1/AE3

Nyelvgyök, invaziv laphámrák és nyirokcsomóba adott áttéte

MelanA

Nyirokcsomóban melanoma malignum áttéte

Fenotípus

Daganat differenciáldiagnosztika•Immunpanel értelme•Algoritmusok helye a diagnosztikában

Áttéti / Ismeretlen eredetű daganatok(CK; S100; LCA; Vimentin) (CK7-CK20)

CD10 expresszió jelentősége

CD10 100 kDa transzmembrán protein

Expresszálódik

ép nyiroktüszőben (centrocyta)

az éretlen T és B precursor sejtekben

(eltűnik a sejtek érési folyamata során)

a precursor B sejt eredetű acut lymphoblastosleukémiában (ALL)

T sejtes ALL–ban is megjelenhet

érett B sejtes leukémiában,

beleértve myeloma multiplexben is

lymphomákban

vese glomerulus és tubulus sejtjeiben

fibroblastokban

epe canaliculusokban

endometrialis stroma sejtjeiben CD10

Világossejtes veserák

Ép nyiroktüsző

CD10

CD10 pozitívendometrialis cystadenofibroma

borderline komponenssel

• endometriumban pozitív: stromalis sejt

• endometrialis cystadenofibromában pozitív: stroma sejt és morula hámsejt

Toki T és mtsai: CD10 is a marker for normal and neoplastic endometrial stromal cells. Int J Gynecol Pathol. 2002; 21:41-47.

CD10 ER Ki67

Biológiai viselkedés

p53 oncoprotein (DO7 klón)A vad és a mutáns típusú p53 proteinnel reagálpozitív sejtek aránya / reakció intenzitása:

clonalis expresszió → malignitás

fokális, szórványos expresszió → regeneráció

p53

TTF1

Bőr, basalioma

p53

Pajzsmirigy, follicularis carcinoma

Proliferációs készség

Mitózis szám / Ki67 / DNS tartalom

Ki67 (MIB-1)

A Ki67 antigén nagy nuclearis protein (345, 395 kDa)

• a sejt ciklus aktív fázisaiban

(G1, S, G2 és M fázisban) expresszálódik,

• a nyugvó sejtekben (G0 fázisban) nem mutatható ki.

A szövettani diagnosztikában és a sejtbiológiai vizsgálatokban a normál és daganatos sejtek növekedési frakciói monitorozhatók.

Proliferációs készségMitózis szám / Ki67 / DNS tartalom

nuclearis expresszió > proliferációs aktivitás jele

membránhoz kötött reakció > pajzsmirigy, hyalinizáló trabecularis tumor

Ranjbari N és mtsa: The Ki-67/MIB-1 index level and recurrence of papillary thyroid carcinoma. Med Hypothesis 2013; 80: 311-314.

Hirokawa M, Carney JA: Cell membrane and cytoplasmic staining for MIB-1 in hyalinizing trabecular adenoma of the thyroid gland. Am J Surg Pathol 2000; 24:575-578

Ki67 (MIB-1)

Ki67 (MIB-1)

Ép nyiroktüsző

CD56 (123C3 klón) expresszió jellemzőiKimutatható

•a természetes ölő sejtekben (NK)

•a perifériás vérben keringő CD4+ és CD8+ T sejtekben

•neuroblastoma,

•kis sejtes tüdőrák,

•pajzsmirigy normál folliculus hám, adenoma,

follicularis rák sejtjeiben,

Demellawy DE és mtsai: Application of CD56, p63, CK19 in immunohistochemistry in the diagnosis of papillary carcinoma of the thyroid. Diagn Pathol. 2008;3:5-17.

CD56

CD56 Vékonybél, plexus,glia sejtek

Pajzsmirigy, follicularis rák

A szokásos papillaris rákban általában nem expresszálódik

Terápiás célpont kimutatása

Emlő tumorokban

A jelenleg elérhető célzott terápiás kezelések célpontjai

• hormonreceptorok: ER, PR• EGFR/HER 2

Mihály Zs és mtsa: HER2-pozitív emlőtumorok célzott terápiájában alkalmazott szerek és a terápiás válasz előrejelzése. Magyar Onkológia; 2013; 57: 147-156.

Dank M és mtsa: Monoklonális antitest-terápia emlőrákban. Magyar Onkológia2013; 57 157-165.

ER PR HER-2

ER/PR % meghatározásaQuick vagy Allred pontrendszer pozitivitás

szemiquantitatív meghatározásához

pozitív daganatsejtek aránya / reakció intenzitása

pontszám pontszám

0 % 0 Negatív reakció 0

<1 % 1 Enyhe reakció 1

1-10 % 2 Közepes intenzitású reakció 2

11-33 % 3 Kifejezett intenzitású reakció 3

34-66 % 4

67-100 % 5

az együttes pontszám 0 és 8 közötti lehet, 3 alatt negatívnak lehet tartani a daganatokat (emlő)klinikai jelentősége: prognosztikai és prediktív (hormonkezelés) faktor

Allred DC, Harvey JM és mtsai: Prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohistochemical analysis. Mod Pathol 1998; 11:155-168.

Yamashita, H., Ando Y, és mtsai: Immunohistochemical evaluation of hormone receptor status for predicting response to endocrine therapy in metastatic breast cancer. Breast Cancer 2006;13:74-83.

PR

E-Cadherin

ER

Emlő, invaziv ductalis carcinoma

Immunhisztokémiai

HER2 expresszió értékelésepozitív sejtek aránya (%) /

reakció intenzitása (+/0) cut-off értékklinikai jelentősége: prediktív (target terápia)

HER-2Emlő, invaziv ductalis carcinoma

3+ komplett erős intenzitású membránfestődés

a sejtek >30 %-ában

2+ komplett közepes intenzitású membránfestődésa sejtek>10%-ában,

illetve komplett erős membránfestődés

a sejtek >10%-ában, de kevesebb, mint 30 %-ában

1+ komplett gyenge membránfestődés a sejtek >10 %-ában

0 <10%-ban észlelt pozitívitás, inkomplett festődés, vagy a festődés hiánya

Az emlőrák patológiai diagnosztikája, feldolgozása és kórszövettani leletezése (2009) Cserni Gábor és mtsai II. Emlőrák Konszenzus; 2009, Kecskemét

HER2 immunhisztokémiai vizsgálatának

értékelése

Immunhisztokémiai

HER2 expresszió értékelésepozitív sejtek aránya (%) /

reakció intenzitása (+/0) cut-off értékklinikai jelentősége: prediktív (target terápia)

HER-2Emlő, invaziv ductalis carcinoma

pozitív vagy negatív reakció

* qualitativ értékelés

* becsült vagy mérésen alapuló %-os arány

meghatározása (guideline, nyomvezető

segítségével)

specifikus vagy nem specifikus reakció

Immunhisztokémiaeredmények értékelése

ImmunhisztokémiaHibalehetőségek keresése

Nem specifikus pozitív festődésés háttérfestődés

Ajánlás:Csökkenteni kell az elsődleges és /vagy másodlagos antitest koncentrációját

CD99Malignus kis kereksejtes tumor, core biopszia

ImmunhisztokémiaHibalehetőségek keresése

Nincs jel AjánlásAntitest szintjén Koncentráció növelése;

Elsődleges és / vagy másodlagos antitest inkubációs idő növelése;

Antitest kompatibilitás: Ellenőrizni kell, hogy az elsődleges és a másodlagos antitestek kompatibilisek-e.

Szövetek fixálása: Túlfixált a preparatum!Elégtelen fixáláskor: a preparatum szélén éles sötét csík jelenik meg, a közepe nem festődik.

Nem megfelelő permeabilitásikörülmények!

0,5-1,0% Triton detergens a pufferben oldva segítheti az antitest szövetbe jutását.

ERER

Emlő, invaziv ductalis carcinoma

core biopsziaexcisio

ER, ismételt reakció

ER + kontroll

Emlő, invaziv ductalis carcinoma

ER, hamis negatív

CD99

MDM2

Rhabdomyosarcoma/dedifferenciált liposarcoma, core biopszia

Oxálsav, más néven: sóskasav, etán-disav. Képlete: HOOC-COOH

CT

CT CT Natív Chr-A

Pajzsmirigy, medulláris carcinoma

HP

Gyomor biopszia, Helicobacter pylori kimutatása,immunhisztokémiai módszerrel

HP HP

Összefoglalás

Az immunhisztokémiai reakciók

eredményének értékelése és interpretálása:

• mi volt az eredeti kérdésfeltevés a reakció elvégzése előtt;

• a várható pozitív vagy negatív eredményt kaptuk-e;

• az immunhisztokémiai reakció minősége az elvártaknak

megfelel-e, ha nem, meg kell keresni a hiba forrását;

• A hamis pozitív és hamis negatív reakciók kiszűrése

az immunhisztokémiai laboratóriumban minden reakciónál:

pozitív és negatív kontrollok,

belső szöveti kontrollok biztosítása és

külső intézetekkel kontroll lehetőség kialakítása.

Az immunhisztokémiai reakciók értékelésekor a

szokásostól eltérő eredmény interpretálásohoz,

ha technikai hiba nem áll fenn a

szakirodalom további gondos átnézése indokolt,

− a még nem ismert újabb adatok felkutatása,

− a helyes diagnózis felállítása céljából.

Összefoglalás, folytatás

Köszönöm a figyelmet!