két foton mikroszkópia
TRANSCRIPT
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
1/17
Két-foton mikroszkópia a
neurobiológiában
Tóth Tímea
Info-bionika MSc
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
2/17
Fluoreszcens és konfokális
mikroszkópia
Henry Mühlpfordt https://www.microscopyu.com/articles/confoc
al/confocalintrobasics.html
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
3/17
Miért nem konfokális mikroszkópot
használunk élő állathoz?
Fritjof Helmchen & Winfried Denk
Nature Methods 2, 932 - 940 (2005)
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
4/17
Miért nem konfokális mikroszkópot
használunk élő állathoz?
Stem cell-based photodynamic therapy
Tej B. Shrestha et al.
Photochem. Photobiol. Sci., 2012,11, 1251-1258
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
5/17
Szórás
• Rayleigh-féle szórás:• A szórt fény intenzitásának szögeloszlását a
következő összefüggés írja le:
I: fényintenzitás, θ: szögeltérés, λ: hullámhossz
• Ha a képalkotást a közeli-infravörös
fénytartományban végezzük, minimalizálhatjuk az
abszorpció és a szórás okozta kellemetlenségeket
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
6/17
Egy-fotonos és két-fotonos gerjesztés
http://mcb.berkeley.edu/labs2/robey/content/2-photon-imaging
Mindkét fotonnak egyidőben
kell érkeznie (
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
7/17
Két-fotonos gerjesztés
• A folyamat létrejöttéhez szükséges, hogy a két
foton szinte egyidőben érkezzen
• => gerjesztés csak a fókuszpont közelében
történik (ahova lézerfény a legkoncentrál-
tabban érkezik)
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
8/17
Egy- és két-foton mikroszkópia
http://parkerlab.bio.uci.edu/microscopy_construction/build_your_own_twophoton_
microscope.htm
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
9/17
Lézer
Mindez femtoszekundum pulzushosszúságú, ún.
"mode-lock" lézer használatával lehetséges,
amely a pulzusok ideje alatt a kétfoton-
gerjesztéshez szükséges igen nagy fotonfluxust
képes előállítani, ugyanakkor a két pulzus között
eltelt nanoszekundumos idő alatt "alszik",
amivel az átlagos energiaközlés rendkívül alacsony szinten tartható (Denk és Svoboda,
1997).
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
10/17
Egy- és két-foton mikroszkópia
http://parkerlab.bio.uci.edu/microscopy_construction/build_your_own_twophoton_
microscope.htm
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
11/17
Két-foton mikroszkópia
https://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/
multiphoton/multiphotonintro.html
Két-foton
mikroszkópiánál
• Nincs szükség
konfokális résre
• Mivel minden emittált
fény a fókuszpontból
érkezik, nem kell róla
képet alkotni, csak
intenzitást rögzíteni • Egész minta pásztázása
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
12/17
Két-foton mikroszkópia előnyei
• Penetráció
• Fokális gerjesztés
•
A fotonszóródás kihasználása • Hangolhatóság
• Időbeni felbontás
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
13/17
Példák
Egér neocortex
• Transgenic egér
• Clomeleont expresszál
• Clomeleon: fúziós protein,
ami két fluorofórt tartalmaz
(YFP és CFP)
Fritjof Helmchen & Winfried Denk
Nature Methods 2, 932 - 940 (2005)
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
14/17
Példák
GABAerg neuronok
PV: paralbumint expresszál
Sst: szomatosztatint expresszál
Genetikai módosítás: tdTomato protein-expresszió (piros)
ChR2-t expresszáló neuron (zöld)
Aurélie Pala and Carl
C.H. PetersenNeuron 85, 68 –75,
January 7, 2015
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
15/17
Példák
Balazs Lendvai et al.
Learn. Mem. 2000 7: 433-441
Piramissejtek• EGFP fehérjét (Enhanced
Green Fluorescent Protein)
tartalmazó piramissejtek egy
patkány szomatoszenzoroskérgében élő, altatott állatban
• Az fluoreszkáló fehérje génjét
vírusok segítségével jutatták
az állat agyába.
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
16/17
Felhasznált irodalom
• https://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintr
obasics.html
• Deep tissue two-photon microscopy : Fritjof Helmchen &
Winfried Denk, Nature Methods 2, 932 - 940 (2005)
• http://www.termeszetvilaga.hu/szamok/kulonszamok/k0602/l
endvai.html
• http://mcb.berkeley.edu/labs2/robey/content/2-photon-
imaging
-
8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia
17/17
Köszönöm a figyelmet!