khoá luận phượng2
TRANSCRIPT
MỞ ĐẦU
I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Bò sát là động vật có nhiều đặc điểm sống khá phong phú và hấp dẫn
đồng thời có nhiều lợi ích. Từ nhiều thế kỷ trước, khoa học đã dành khá nhiều
thời gian và công sức để tìm hiểu về nhóm động vật có số lượng không nhiều
này, nhưng vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu tìm hiểu của con người.
Ở Việt Nam, các loài bò sát đã được chú ý dùng làm thuốc chữa bệnh
từ thế kỉ XIV, nhưng mãi đến thời kỳ thực dân Pháp xâm lược nước ta mới có
những công trình nghiên cứu thực sự về Bò sát của các tác giả người nước
ngoài, đặc biệt là R.Bourret và cộng sự trong thời gian từ năm 1924 – 1944.
Tuy nhiên từ sau năm 1945 đến nay các công trình nghiên cứu về Bò sát đã
được đẩy mạnh nhiều hơn.
Trong số loài thằn lằn được biết ở Việt Nam, Leiolepis belliana (Gray,
1827) là một loài thuộc họ Nhông (Agamidae). Tên phổ thông ở Việt Nam là
nhông cát. Nhông cát thường gặp ở các dãi cát ven biển Việt Nam.
Từ rất lâu nhân dân ta đã biết sử dụng nhông cát để chữa các bệnh như
hen suyễn, ghẻ lở, còi xương ở trẻ con... Ngoài ra nhông cát còn được sử dụng
để ngâm rượu làm thuốc bổ như tắc kè và rắn. Do thịt nhông thơm và ngon
nên được sử dụng để làm thực phẩm. Mặt khác khi phân tích thành phần thức
ăn tự nhiên của chúng thấy có nhiều loài động vật và thực vật khác nhau,
trong đó có nhiều loài côn trùng có hại như cào cào, châu chấu, bọ xít, bướm,
ruồi. Do đó có thể nói nhông cát được xem là loài động vật phổ biến ở các
vùng cát ven biển miền Trung Việt Nam đã cùng với các loài động vật khác
trong hệ sinh thái giữ vai trò nhất định, không những đảm bảo nâng dần năng
suất sinh học trong thiên nhiên mà còn có vai trò ổn định thế cân bằng trong
các hệ sinh thái.
1
Như vậy, nhông cát là một trong những nguồn tài nguyên thiên nhiên
có giá trị. Nghiên cứu khai thác, sử dụng và bảo vệ nguồn tài nguyên động vật
và thực vật trong đó có nhông cát là rất cần thiết để góp phần vào sự nghiệp
phát triển kinh tế, văn hóa, khoa học và đời sống.
Trên thế giới và Việt Nam, việc nghiên cứu về nhông cát vẫn chưa
nhiều, phần lớn các công trình chỉ tập trung vào các vấn đề đặc điểm sinh học,
sinh thái học, phân bố, phân loại dựa vào các đặc điểm về hình thái cấu tạo và
các đặc điểm sinh học. Năm 1991, tác giả Ngô Đắc Chứng trong luận án phó
tiến sĩ của mình đã mô tả kĩ về đặc điểm hình thái và sinh thái ở hai phân loài
của loài Leiolepis belliana là Leiolepis belliana belliana và Leiolepis belliana
guttata Cuvier. Luận án đã bổ sung một số hiểu biết về nhông cát mà các tài
liệu có được cho đến nay chưa đề cập hoặc đề cập còn ít, cung cấp một số cơ
sở khoa học cho việc khai thác, sử dụng chăn nuôi và bảo vệ nguồn lợi này ở
nước ta. Tuy nhiên, do yêu cầu, mục đích của luận án và do số liệu chưa đầy
đủ nên chưa chứng minh Leiolepis belliana belliana và Leiolepis belliana
guttata Cuvier là hai phân loài, loài hay dạng sinh thái mà tác giả chỉ tạm
công nhận đó là hai phân loài.
Theo xu hướng hiện nay, việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử
vào nghiên cứu phân loại động, thực vật và vi sinh vật rất phổ biến trên thế
giới. Như đã nói ở trên, hai loài nhông cát ở Thừa Thiên Huế đã được nghiên
cứu về hình thái học, tuy nhiên vẫn chưa được nghiên cứu ở mức độ phân tử.
Chính vì những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài “Góp phần nghiên cứu
tính đa hình của nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier ở Thừa Thiên
Huế”.
2
II. MỤC TIÊU VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU
1. Mục tiêu
- Mô tả một số đặc điểm hình thái của nhông sọc Leiolepis belliana
guttata Cuvier.
- Phân tích ADN của nhông sọc về mặt định tính và định lượng.
2. Nhiệm vụ
- Thu mẫu nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier ở Thủy Phù –
Hương Thủy - Thừa Thiên Huế.
- Mô tả đặc điểm hình thái về trọng lượng thân, chiều dài cơ thể, vẩy
môi trên, vẩy môi dưới, lỗ đùi, một số tính trạng kích thước so với chiều dài
thân và chiều dài đầu.
- Tách chiết và tinh sạch ADN, sau đó xác định nồng độ và chất lượng
ADN của nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier
3
Phần 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
I. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU NHÔNG CÁT
1. Trên thế giới
Theo E.H. Taylor thì Leiolepis belliana (Gray) được Gray xác định và
mô tả lần đầu vào năm 1827 dưới tên là Uromastyx belliana Gray dựa trên
hình vẽ của Hardwicke từ mẫu thu ở Penang (Malaysia). Năm 1864, trong
“Reptiles of British India”, Gunther gọi là Leiolepis guttata. Tên Leiolepis
belliana lại được Gray đặt vào năm1845 trong “Catalogue of the Lizards in
the British Museum”. Về sau, nhiều tác giả khác cũng đã sử dụng tên này như:
Ridley (1869), Boulenger (1890), Annandale (1900), Laidlaw (1901), Schmidt
(1927), Smith (1935), Taylor và Elbel (1950), Nertens (1961),...Tên loài này
cũng được một công trình khác của C.H. Pope nhắc đến. Gần đây, trong công
trình nghiên cứu về nhiễm sắc thể, A. KynpurHoBa cũng gọi là L.belliana.
Đặc biệt trong cuốn “Từ điển tên gọi các loài động vật năm thứ tiếng” (Tiếng
Nga) xuất bản năm 1989 đã nêu tên 5 loài thằn lằn thuộc giống Leiolepis
trong đó có loài Leiolepis belliana (Gray).
Cho đến nay, việc nghiên cứu các mặt của các phân loài và loài
trong giống Leiolepis trên thế giới tương đối còn ít. Trong số đó, đáng chú ý
là các công trình sau:
M. Smith (1935) đã mô tả loài Leiolepis belliana ở Ấn Độ, Miến
Điện và Srilanca. Cũng vào năm 1935, trong công trình nghiên cứu Bò sát ở
trung Quốc, C.H. Pope trình bày khoá để xác định các giống trong họ
Agamidae ở Trung Quốc và các loài trong giống Leiolepis. Theo C.H. Pope
thì ở Trung Quốc họ Agamidae có các giống sau: Draco, Phoxophrys,
Japalura, Genocephalus, Phisignathus và Leiolepis. Riêng Leiolepis có một
loài là Leiolepis belliana (Gray). Loài này phân bố từ nam Miến Điện đến các
4
quần đảo Đông Nam Á và đảo Sumatra thuộc Indonesia, còn ở Trung Quốc đã
tìm gặp ở Quảng Châu, Quảng Đông và đảo Hải Nam.
Căn cứ vào mẫu vật thu được ở một số vùng thuộc các tỉnh Loei,
Kanchanaburi, Rat Buri và Sisaket (Thái Lan), E.H. Taylor và R. Elbel đã giới
thiệu một số dẫn liệu hình thái của L. belliana belliana trong một công trình
về Ếch nhái – Bò sát ở Thái Lan.
Sau đó, trong bài “Các loài thằn lằn của Thái Lan” đăng trên tạp chí
“The University of Kansas Science Bulletin”, E.H. Taylor đã mô tả đặc trưng
của loài này như sau: “Thân dẹp theo hướng lưng bụng; không có mào lưng;
vẩy bình thường, nhỏ, xếp sát nhau, hình nón hay hình tháp, ít nhiều hóa sừng;
túi họng không thấy rõ, nhưng có một hoặc hai nếp hầu nằm ngang; cả cá thể
đực và cái đều có lỗ đùi; đuôi dài, đôi khi dày lên ở gốc, vảy gần như đồng
hình; vảy bụng xếp đè lên nhau, tạo thành những vảy gần như ô vuông”. Theo
E.H. Taylor thì có hai phân loài được ghi nhận ở Thái Lan là L. belliana
belliana (Gray) và L .belliana rubritaeniata Mertens thuộc các vùng phía Tây
và Trung Bắc; còn L.belliana guttata Cuvier có thể gặp ở các vùng xa về phía
Đông Thái Lan.
Năm 1976, trong luận án của mình, D.C. Leroy có nói đến
L.belliana. Theo ông, đặc trưng của chúng là không có mào lưng và sống ở
dưới đất. Người ta thường gặp loài này ở vùng Nam Á và Indonesia.
Nhìn chung các công trình nói trên chỉ tập trung mô tả các đặc điểm
hình thái dùng trong phân loại và sự phân bố địa lí của Leiolepis belliana ở
các vùng nghiên cứu và trên thế giới. Ngoài ra có các cồng trình nghiên cứu
đối tượng này trên các lĩnh vặc khác như:
Về tập tính hoạt động và nơi ở của nhông cát có các dẫn liệu của
C.H.Pope và D.C.Leroy. Theo các tác giả trên khi nghiên cứu ở Tây Pakistan
và Bắc Ấn Độ thì nhông cát ở trong các hang tự đào vùng đất cát dài từ 2,44 –
2,74 m (8 – 9 feet) và sâu 1,22 – 1,52 m (4 – 5 feet). Những lúc trời rét và ban
đêm chúng chui vào hang và lấp kín cửa hang.
5
Đặc điểm cấu tạo giải phẩu đã được A.G.Edmund, R.Hoffstetter và
J.P.Gase trình bày trong “Biology of the Reptilia”. Khi nghiên cứu về răng
của các loài trong họ Agamidae, A.G.Edmund cho rằng L. belliana có 3 – 4
răng trước hàm, 12 răng hàm và 12 răng ở phần trước xương răng. Các răng ở
phần trước xương răng thường lớn và theo kiểu răng nanh. Đặc điểm của cột
sống và xương sườn của Leiolepis cũng giống như các loài trong họ Teiidae
và Agamidae nhưng có phần thân đốt và phần gian thân đốt không phân biệt
rõ.
Đặc điểm của các loài trong họ Agamidae cũng như Iguanidae có cấu
tạo giống Sphenodon. Còn cấu tạo của xương khẩu cái, xương hàm, xương lá
mía và ống đổ của cơ quan Jacobson theo kiểu “lỗ khoan cổ” như nhiều loài
thằn lằn khác.
Về cấu trúc nhân có công trình nghiên cứu của A.KynpurHoBa, khi
nghiên cứu kiểu nhân của ba loài thằn lằn họ Agamidae là Stellio chernovi,
Stellio himalayanus và Leiolepis belliana belliana. Kết quả nghiên cứu này
cho thấy các loài trên có bộ nhiễm sắc thể 2n = 36.
Về số lượng loài của giống Leiolepis Cuvier, theo công trình của nhiều
tác giả mà B.E.CokovoB làm chủ biên cho thấy có năm loài là L.belliana
(Gray), L. guttata Cuvier, L. peugensis Peters, L.reevessi (Gray) và L.triploida
Peters, tất cả đều sống ở châu Á.
Năm 1993, Darevsky và Kupriyanova đã nghiên cứu phát hiện và mô tả
loài nhông Leiolepis guentherpetersi (Theo Cuvier, 1829) là Leiolepis
belliana guttata Cuvier). Các phân tích về hình thái, kiểu nhân và địa lý sinh
vật học cho thấy rằng đây là loài tam bội có nguồn gốc từ sự lai tạo tự nhiên.
Tuy nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá ở mức phân tử đối với loài này [4].
2. Ở Việt Nam
Tài liệu đầu tiên nói đến nhông cát L.belliana (Gray) của R. Bourret.
Trong đó tác giả mô tả đặc điểm của loài và hai phân loài của L.belliana là
L.belliana belliana và L.belliana guttata khác nhau về số lượng lỗ đùi ở mỗi
6
bên, Theo tác giả thì L.belliana phân bố ở Nam Miến Điện, Thái Lan, Đông
Dương, đảo Hải Nam, Nam Trung Quốc, Malaysia và Sumatra. Ở Việt Nam
đã gặp ở Cù Lao Chàm, Nha Trang và Quảng Trị.
Căn cứ vào các mẫu vật đã thu được và các công trình đã công bố,
Đào Văn Tiến đã công bố danh sách 77 loài thằn lằn hiện có ở Việt Nam cùng
với đặc điểm hình thái dùng trong phân loại cũng như khoá định loại các loài
thằn lằn đó. Trong số 17 loài thằn lằn thuộc họ Agamidae của danh sách này
có hai phân loài của L.belliana là nhông thường L.belliana belliana và nhông
gutta L.bellana guttata Cuvier.
Năm 1981, trong “Kết quả điều tra cơ bản động vật miền Bắc Việt
Nam” của Uỷ ban Khoa học và kĩ thuật Nhà nước do tác giả Trần Kiên,
Nguyễn Văn Sáng và Hồ Thu Cúc thực hiện đã thu mẫu và xác định
L.belliana phân bố ở Hà Tĩnh và Vĩnh Linh (Quảng Trị).
Gần đây, theo kết quả điều tra về khi hệ động vật các đảo có nguồn gốc
lục địa của Viện Địa lý (Viện HLKH Viễn Đông – Liên Xô) cho thấy có
L.belliana ở Cù Lao Chàm trong số các đảo đã khảo sát từ vịnh Bắc Bộ đến
vịnh Thái Lan [4].
Năm 1991, Trong luận án phó tiến sĩ của mình, Ngô Đắc Chứng đã
nghiên cứu về các đặc điểm về hình thái và sinh thái của hai phân loài
L.belliana belliana và L.belliana guttata Cuvier ở Thừa Thiên Huế. Về đặc
điểm hình thái của phân loài L.belliana belliana, tác giả đã mô tả như sau:
“Thân dẹp theo hướng lưng bụng, không có mào lưng, không có gai trên đầu.
Vảy nhỏ, phần lớn hoá sừng. Có một hoặc hai nếp họng nhỏ nằm ngang. Lỗ
đùi làm thành hai dãy ở vùng mu hai bên lỗ huyệt. Đuôi dày lên ở gốc. Mỗi
bàn chân có 5 ngón, các ngón chân dài và có móng nhọn. Bề rộng và bề dài
của mõm gần bằng nhau. Bờ mõm được giới hạn bởi hai vảy môi và sáu tấm
vảy sau mõm. Lỗ mũi mở trực tiếp ra ngoài, trán và vùng gian ổ mắt đôi khi
to; các vảy trên ổ mắt là các vảy chấm rất nhỏ. Màng nhĩ rộng và nông, đường
kính của nó gần bằng chiều dài lỗ mắt. Hai bên cổ có những nếp da nằm
ngang kéo ngang qua phần gáy.
7
Vẩy lưng nhỏ, hoá sừng; vẩy mặt bụng lớn hơn ở mặt lưng”.
Đặc điểm hình thái của con cái tương tự như con đực, chỉ khác ở một
số điểm sau: Con cái da ở hai bên sườn không thể bạnh ra khi ở tư thế dọa nạt;
ở con đực mặt lưng từ đầu đến đuôi màu phân ngựa với những vùng sẫm ở hai
bên, riêng mặt lưng phần thân có những chấm màu vàng viền đen hình mạng
lưới, mặt bụng từ đầu đến đuôi màu trắng đục, đặc biệt hai bên thân có hai dải
chấm màu da cam thể hiện khá rõ khi nhông bạnh nếp da hai bên sườn, còn
con cái các chấm vàng viền đen ở mặt lưng sắp thành bốn dãy dài chạy dọc
lưng từ sau gáy tới gốc đuôi, ngoài ra ở hai bên sườn không có các dãy chấm
màu da cam.
Về tính trạng khối lượng cơ thể, chiều dài thân thì cá thể đực thường
lớn hơn cá thể cái (cá thể đực có khối lượng trung bình là 41,17 g và chiều dài
thân trung bình là 114,0 mm; trong khi con cái là 30,52 g và 107,4 mm). Số
lượng lỗ đùi trung bình của cá thể đực ít hơn cá thể cái (con đực là 17 và con
cái là 18).
Đặc điểm hình thái của phân loài L.belliana guttata Cuvier cũng tương
tự như ở phân loài L.belliana belliana, chỉ khác ở một số tính trạng sau: Mặt
lưng của L.belliana guttata Cuvier không có các chấm vàng viền đen mà có
các chấm màu phân ngựa hình lục giác, có bốn sọc dài màu vàng nhạt rộng
trung bình 3 mm: hai sọc chạy từ sau tai đến gốc đuôi, hai sọc chạy từ gốc
chân trước đến gốc chân sau. Mặt bụng màu trắng đục, không có các chấm
màu da cam hai bên thân và không có khả năng bạnh da hai bên sườn.
L.belliana guttata Cuvier có khối lượng cơ thể trung bình là 56,0g và
chiều dài thân trung bình là 120,83 mm. Số lượng lỗ đùi là 20 – 23
Ở Thừa Thiên Huế, nhông cát sinh sống ở hai vùng sinh cảnh khác
nhau là vùng cát ven biển và vùng nương rẫy ở đồng bằng các xã Thuỷ Phù,
Thuận An và Lộc Hải.
Quan sát và theo dõi hoạt động của nhông cát ngoài tự nhiên, tác giả
thấy rằng nhông hoa hoạt động ban ngày những hôm trời nắng với nhiệt độ
8
không khí từ 30 – 38oC, nhiệt độ mặt đất từ 33 – 40oC và độ ẩm từ 30 – 78 %.
Nhông sọc hoạt động ở nhiệt độ không khí từ 27 – 38oC, nhiệt độ mặt đất từ
27 – 59oC và độ ẩm 30 – 64 %. Chúng hoàn toàn không hoạt động vào những
ngày mưa, trời âm u hoặc trước lúc bắt đầu mưa và về mùa đông (từ tháng XI
– tháng III) khi nhiệt độ không khí nhỏ hơn 25oC và độ ẩm trên 90 %. Vào
những ngày nắng nóng (nhiệt độ tren 38oC) chúng vẫn hoạt động với điều kiện
là độ ẩm thấp.
Ngoài ra vào những ngày nắng nóng nhiệt độ mặt đất tăng lên quá cao
có thể trên 50oC, nhông cát vẫn hoạt động. Lúc đó chúng kiếm ăn trong các
bóng râm hoặc chạy rất nhanh trên cát hoặc các cây cỏ khác.
Từ tháng XI đến tháng III nhông cát trú đông trong hang. Vào thời kì
này nhiệt độ trung bình trong hang xuống thấp từ 18,5 – 24,4oC, độ ẩm trung
bình từ 83 – 92oC
Về vấn đề sinh sản của nhông cát, tác giả lưu ý một số vấn đề sau: “Đối
với loài nhông hoa, kích thước và khối lượng của tinh hoàn và của buồng
trứng vào các tháng IV và VI lớn hơn các tháng còn lại. Trong khi đó khối
lượng thể mỡ lại bé vào các tháng IV, V và VI và lớn hơn vào các tháng khác.
Đối với nhông sọc, khối lượng của buồng trứng vào các tháng IV, VI
và VII, trong khi khối lượng thể mỡ lại bé vào các tháng này và lớn hơn vào
các tháng khác.
Trứng có kích thước lớn hơn 4 mm chỉ thấy xuất hiện vào tháng IV và
VI ở phân loài nhông hoa và vào tháng IV, VI và VII ở phân loài nhông sọc.
Như vậy mùa sinh sản của nhông hoa là từ tháng IV đến tháng VI, của
nhông sọc là từ tháng IV đến tháng VII hàng năm. Đặc biệt, trong tất cả
những mẫu vật thu được ở Thuỷ Phù và Lộc Hải không có cá thể nào là đực
nên đưa đến khả năng nhông sọc là loài thằn lằn trinh sinh, tức là trứng phát
triển không có sự thụ tinh [4]. Tuy nhiên, tác giả cũng nhấn mạnh đây có phải
là loài trinh sinh hay không vẫn còn là vấn đề nghi vấn và cần tiếp tục theo
dõi.
9
II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ
1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước.
Trong những thập kỷ qua, nhờ sự phát triển của các kỹ thuật phân tử,
phân loại học phân tử đã có những bước tiến bộ đáng kể. Đã có nhiều công
trình nghiên cứu về lĩnh vực này trên các đối tượng động vật, thực vật và vi
sinh vật. Những thành tựu này đặc biệt có ý nghĩa đối với những loài mới
được phát hiện hay với những loài đã bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên.
Việc nghiên cứu tính đa hình các cá thể trong một quần đàn, các quần
đàn trong một giống, các giống với nhau, các họ với nhau hoặc các bộ với
nhau nhằm mục đích cải biến di truyền, chọn giống, hoàn thiện cây tiến hóa,
tìm hiểu lịch sử di cư liên quan tới địa lý, nghiên cứu sự liên quan giữa tính đa
hình và khả năng chống chịu bệnh tật hoặc dễ nhiễm bệnh và pháp y hình sự.
Để nghiên cứu tính đa hình và phân loài người ta thường sử dụng các
phương pháp sinh hóa cổ điển như isoenzyme đa hình, hay các phương pháp
chỉ thị phân tử hiện đại như ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RADP),
ADN đa hình chiều dài các phân đoạn được cắt giới hạn (RELP), ADN đa
hình độ dài các phân đoạn được khuếch đại (AFLP), vi vệ tinh, đa hình
nucleotide đơn (SNP) hay đọc trình tự rồi trực tiếp so sánh các trình tự ADN
với nhau. Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm nhất định,
không giống nhau nhưng có thể bổ sung cho nhau đêr hoàn thiện kết quả
nghiên cứu. Đặc biệt khi các phương pháp phân loại hình thái đã bão hòa
không thể đi sâu được nữa, thì các phương pháp sinh học phân tử sẽ trợ giúp
một cách có hiệu quả.
Năm 1993, Darevsky và Kupriyanova đã nghiên cứu phát hiện và mô tả
một loài nhông mới thuộc giống Leiolepis CUVIER, 1829 có nguồn gốc từ
Việt Nam là Leiolepis guentherpetersi. Đây là một trong hai loài nhông có
mặt ở Thừa Thiên Huế. Các phân tích về hình thái, kiểu nhân và địa lý sinh
vật học cho thấy rằng đây là loài tam bội có nguồn gốc từ sự lai tạo tự nhiên.
Tuy nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá ở mức độ phân tử đối với loài này.
10
Turbeville et a. (1991) dựa trên sự phân tích 18S rRNA để nghiên cứu
sự phát sinh chủng loại của chân khớp. Cũng bằng phương pháp này, Passhley
et al. (1993) đã phân loại Bộ côn trùng biến thái hoàn toàn.
Miya và Nishida (1998) đã nghiên cứu sự phát sinh chủng loại và tiến
hóa ở mức độ phân tử của các loài cá sống ở vùng biển sâu thuộc giống
Sternoptyx dựa trên phân tích gen mã hóa 12S – rRNA và 16S – rRNA ở ty
thể.
Boyce et al. (1999) nghiên cứu cấp phân loại phụ của quần thể cừu
sừng lớn (Ovis canadensis) dựa trên phân tích 515 bp đầu tiên của vùng khởi
động ADN ty thể.
Nhiều nghiên cứu theo hướng đa dạng di truyền và nhận dạng các loài
ở mức phân tử cũng đã được tiến hành (Carvalho et al. 2001; Garrjardo et al.
2002)
2.Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, cũng đã có một số công trình nghiên cứu về hai loài
nhông cát ở Thừa Thiên Huế. Tuy nhiên các công trình này chỉ nghiên cứu về
hình thái, đặc điểm sinh học, đặc điểm quần thể, sinh thái học cũng như hoạt
động ngày đêm của chúng (Ngô Đắc Chứng 1986, 1992, 1993, 1994). Ở Việt
Nam nói chúng phân loại phân tử vẫn còn là một lĩnh vực mới mẻ. Gần đây
một số công trình nghiên cứu theo hướng sử dụng các phương pháp sinh học
phân tử để phân tích đa hình di truyền, xác định quan hệ họ hàng của một số
loài đã được công bố.
Quyền Đình Thi và cộng sự (2003) đã sử dụng các kỹ thuật
microsatellite, mtRFLP, RAPD để phân tích đa hình của các quần thể đàn tôm
sú, cá tra nuôi ở Việt Nam. Nhóm nghiên cứu đã tìm được nhiều chỉ thị phân
tử đặc trưng như RAPD để phân biệt các quần đàn cá tra nuôi trong các trại cá
khác nhau. Những chỉ thị này có thể được nghiên cứu tiếp phục vụ công tác
chọn giống [13].
11
Nguyễn Thị Thanh Bình và cộng sự (2005) đã nghiên cứu đa dạng
phân tử của các giống tằm sử dụng trong sản xuất bằng PCR – RAPD. Cũng
bằng kĩ thuật này, Đinh Thị Phương Anh (2005) đã nghiên cứu tính đa dạng
của thạch sùng vùng núi Bà Nà, Đà Nẵng [1,3].
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH
Có nhiều phương pháp để nghiên cứu tính đa hình, mỗi phương pháp
đều có những ưu điểm và nhược điểm nhất định, không giống nhau nhưng có
thể bổ sung cho nhau để hoàn thiện kết quả nghiên cứu.
1. Phương pháp isoenzyme cổ điển
Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc biệt phản ứng hóa
học và là chất xúc tác sinh học. Isoenzym là những dạng khác nhau của một
enzyme có cùng hoạt tính cơ chất đặc hiệu nhưng lại khác nhau về phương
diện di truyền tức là khác nhau về cấu trúc bậc một và do các locus gene khác
nhau xác định. Còn allozyme lại là các dạng khác nhau của một isoenzym do
chỉ một locus gene xác định (Prakash, 1969) [7,10].
Hiện tượng các phân tử enzym có nhiều biến dạng tồn tại trong quần
đàn tự nhiên là kết quả của các đột biến gây ra sự thay thế các acid amin trong
cấu trúc bậc một của chuỗi polypeptid. Chính vì vậy khi điện di trên gel
agarose, tinh bột thuỷ phân, polyacrylamide cùng với việc phối hợp nhuộm tế
bào cho phép ta phát hiện các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme, phát
hiện các isoenzyme và các allozyme.
Các hệ thống isozyne đa hình là các mô hình rất thuận lợi cho việc
nghiên cứu, do bản chất di truyền tương đối đơn giản và hầu hết được biểu
hiện di truyền đồng trội. Do đó khi sử dụng các dữ kiện về đa hình isozyme
không những biết kiểu gen của cá thể mà còn biết mức độ dị hợp của quần
đàn. Mặt khác, mỗi biến dạng phân tử enzyme là một “chỉ thị” của gene,
12
nghiên cứu quan hệ họ hàng, nguồn gốc của vật nuôi, gia súc. Dựa trên tần số
allele, người ta xác định được khoảng cách di truyền giữa các quần đàn.
Nhiều nghiên cứu trên động vật, côn trùng, sử dụng các phương pháp
đánh giá trên cho thấy số đo khoảng cách di truyền có tương quan rõ rệt với
các thứ hạng phân loại của nhóm sinh vật nghiên cứu (Manwell và Barker,
1970; Namikawa, 1972) [7,10].
Những chỉ thị isozyme chỉ thể hiện ở những giai đoạn khác nhau trong
quá trình phát triển cá thể tuỳ thuộc vào cơ chế phức tạp của sự đóng mở
gene. Mặt khác do có số lượng không nhiều mà sự biểu hiện lại phụ thuộc vào
giai đoạn phát triển cá thể, không phản ánh chính xác bản chất di truyền của
một tính trạng nên chỉ thị isozyme được sử dụng tương đối hạn chế.
2. Các phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử ADN
Chỉ thị ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình của ADN. Nó
có thể là những dòng gene có sẵn hay dưới dạng những thông tin di truyền
được lưu giữ và chuyển tải trong các file dữ liệu máy tính (ví dụ như trình tự
các mồi SSR, RAPD, AFLP). Người ta chia chỉ thị ADN thành 3 loại chính:
- Chỉ thị dựa trên các trình tự nhận biết enzyme hạn chế (RFLP và
AFLP).
- Chỉ thị dựa trên các trình tự nucleotide ngẫu nhiên (RAPD).
- Chỉ thị dựa trên các trình tự ngắn lặp lại nhiều lần (tiểu vệ tinh)
2.1. Phương pháp RAPD
RAPD (Ramdon Amplified Polymorphism DNA) là các phân đoạn
DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên. Phương pháp này do William
(1990). Welsh và cộng sự (1991) phát triển từ phương pháp PCR chuẩn nhưng
với một mồi duy nhất có kích trước từ 5 đến 12 nucleotide. Do kích thước bộ
gen của một cá thể là rất lớn từ vài trăm triệu với vài tỉ base, là những chuỗi
13
được hình thành từ bốn base duy nhất là adenine, guanine, cytosine, và
thymine cho nên sẽ tồn tại nhiều trình tự 5 đến 12 base bắt cặp với trình tự
mồi ngẫu nhiên. Sản phẩm PCR với một mồi có trình tự ngẫu nhiên như vậy,
ở những điều kiện PCR nhất định sẽ cho một (hoặc vài) phân đoạn DNA
(khác nhau) trên điện di đồ.
Các cá thể sinh vật cùng loài, giống, họ có bộ gene giống nhau hoàn
toàn giống nhau. Kết quả điện di trên điện di đồ sẽ gồm những band vạch
DNA có kích thước như nhau. Khi bộ gen của chúng có nhiều trình tự khác
nhau, với một mồi ngẫu nhiên nào đó, các sản phẩm PCR của chúng sẽ cho
một số band vạch DNA có kích thước khác nhau trên điện di đồ.
Phương pháp RAPD cho phép phát hiện tính đa hình giữa các cá thể
trong một quần đàn, giữa các quần đàn trong cùng một loài hoặc giữa các loài
trong một giống, mà không cần biết trình tự sắp xếp các nucleotide ra sao.
Mặt khác mồi RAPD sẽ chỉ ra một đa hình thường xuất hiện nhất [12].
Mồi ngẫu nhiên được thiết kế là những oligonucleotide có kích thước
từ 5 đến 12 nucleotide, và được tổng hợp hóa học. Tuỳ theo hãng sản xuất,
các mồi có kí hiệu, tên gọi cũng như trình tự rất khác nhau. Yêu cầu cơ bản là
mồi phải bắt cặp và bám vào hai đầu của đoạn khuôn, để phân đoạn DNA nằm
giữa có kích thước khoảng 50 đến 5000 nucleotide được nhân lên. Mồi càng
ngắn thì khả năng bắt cặp càng cao, và do đó số sản phẩm PCR càng nhiều.
Ngược lại mồi càng dài thì thì độ bắt cặp chính xác càng lớn, số phân đoạn
PCR càng ít đi.
Ưu điểm của phương pháp RAPD là thời gian thực hiện nhanh, dễ làm
và ít tốn kém, giúp cho xác định tính đa dạng sinh học, nguồn gốc các giống
động vật, thực vật và vi sinh vật, còn gọi là phân loại phân tử [12].
2.2. Phương pháp RFLP
RFLP (Restrition Fragment Length Polymorphism DNA) là DNA đa
hình chiều dài các phân đoạn DNA được cắt giới hạn. Chỉ thị này lần đầu tiên
14
được biết đến khi Botstein sử dụng nó để lập bản đồ các gen có liên quan đến
bệnh ở người. Các RFLD được sinh ra bởi những điểm cắt enzyme giới hạn
trong DNA hệ gen. Nó biểu thị sự khác nhau giữa các loại DNA, do những
đột biến tự nhiên gây ra như đột biến gene tạo ra đặc điểm riêng biệt ở mọi
giống, loài thậm chí mỗi cá thể. Bởi vậy khi sử dụng các enzyme hạn chế để
cắt các phân đoạn DNA có kích thước gần như nhau không thể phân biệt được
trên điện di đồ, thành các phân đoạn có nhỏ hơn có kích thước khác nhau thì
có thể phân biệt được trên điện di đồ.
Nếu hai trình tự phân đoạn DNA gần giống nhau hoàn toàn, tức là có
một vài nucleotide khác nhau trong trình tự, thì thực sự rất khó phát hiện ra sự
khác nhau giữa chúng trên điện di đồ nhưng chúng lại không đồng nhất với
nhau khi so sánh sơ đồ cắt enzyme hạn chế. Khi người ta xử lý các mẫu DNA
với cùng một enzyme giới hạn nào đó sẽ tạo ra các phân đoạn cắt có kích
thước khác nhau. Các phân đoạn cắt này được coi là các “điểm chỉ” đặc trưng
cho từng loại DNA.
Ví dụ: Nếu chúng ta có hai phân tử DNA gần giống nhau về trình tự
base, dài 1000 bp, ngoại trừ sự đa hình sau: DNA1 có trình tự GGATCC tại vị
trí bắt đầu với base 324, trong khi DNA2 có trình tự GGTTCC đã bị thay thế
bởi GGTTCC cùng vị trí. Khi xử lý mỗi DNA đó với cùng một enzyme giới
hạn BamHI thì điều gì sẽ xảy ra với GGATCC? Kết quả điện di đoạn DNA
chỉ ra một sự khác nhau: với DNA1 cho hai band vạch DNA, trong khi đó
DNA2 chỉ cho một band vạch, BamHI không cắt DNA2 do trình tự GGATCC
đã bị thay thế bởi GGTTCC. Vì vậy band chính khác từ một sự đa hình di
truyền rất nhỏ. Đó gọi là sự đa hình RFLP.
Khác với phương pháp RAPD, phương pháp RFLP phải dùng hai mồi
có những trìn tự nhất định để khuếch đại một phân đoạn DNA nào đó.
15
2.3. Phương pháp AFLP
AFLP là DNA đa hình phân đoạn được khuếch đại do Vos và cộng sự
tìm ra vào năm 1993. Là một kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên mà thực hiện
trong điều kiện phản ứng PCR nghiêm ngặt. Các mồi thường dài khoảng 17 –
21 nucleotide và có đầu mút giống nhau hoàn toàn. AFLP không bị ảnh hưởng
bởi các thông số khuếch đại (chu kỳ, nhiệt độ, nồng độ khuôn, chu kỳ PCR)
[12].
2.4. Microsatellite
Microsatellite hoặc SSR (Simple Sequênc Repeats) là những trình tự
nucleotide đặc biệt được tạo thành lặp lại nhiều lần từ một phân đoạn
oligonucleotide ngắn, đơn giản, còn gọi là vi vệ tinh hay tiểu vệ tinh. Phương
pháp truy tìm các phân đoạn ADN đơn giản lặp đi lặp lại được gọi là phương
pháp vi vệ tinh.
Bộ gene sinh vật nhân thực có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn dài
ngắn khác nhau tuỳ theo từng loài [12]. Các chuỗi lặp lại này thường từ 1- 6
nucleotide. SSR được phát hiện và sử dụng đầu tiên ở người, hiện nay được sử
dụng để lập bản đồ phân tử người, động vật và một số thực vật. SSR cũng
được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền ở động vật và thực vật.
Bản chất đa hình của SSR là ở chỗ nó có thể được sinh ra đa hình từ rất
nhiều vùng tương ứng, bao phủ khắp hệ gene và có bản chất đồng trội, dễ
dàng phát hiện bằng PCR.
2.5. Đọc trình tự ADN
Có lẽ kỹ thuật quan trọng nhất có thể có được cho các nhà Sinh học
phân tử là đọc trình tự ADN, mà trong đó các vị trí nucleotide của phân đoạn
ADN được xác định một cách chính xác. Các phương pháp xác định tình tự
16
trở thành nhanh chóng và có hiệu quả từ cuối thập kỷ 70 của thế kỷ trước.
Phân tử ADN đầu tiên được xác định trình tự là hệ gene của bacteriophage
oX174 (5386 bp) được hoàn thành vào năm 1975. Tiếp theo là các đoạn trình
tự của virus SV40 (5243 bp) vào năm 1977 và pBR322 (4363 bp) vào năm
1978. Dần dần đọc trình tự được áp dụng cho các trình tự dài hơn.
Có hai kỹ thuật khác nhau được phát triển đồng thời, phương pháp xác
định trình tự của F. Sanger và A. R. Coulson (Anh) và phương pháp phân huỷ
hóa học của A. Maxam và W. Gilbert (Mỹ). Cả hai phương pháp đều cho
phép đọc trình tự với chiều dài hàng vài kb trong thời gian ngắn nhất.
Trong phân tích đa hình, tiến hóa, người ta thường đọc trình tự những
gene cấu trúc rồi đem so sánh với nhau tìm ra phần trăm đồng dạng và khác
biệt. Phương pháp này có ưu điểm chính xác, nhưng không thực hiện được với
số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn
2.6. Phân tích ADN ty thể
Ty thể là bào quan có kích thước hiển vi phổ biến ở mọi sinh vật, cả vi
sinh vật hiếu khí. Chức năng chủ yếu của ty thể là trung tâm giải phóng năng
lượng của tế bào. Ty thể có đầy đủ các thành phần quan trọng như: ADN,
ARN, ATP và các hệ enzyme, do đó chúng có khả năng tự tổng hợp protein
đặc thù, cùng với lục lạp góp phần qui định tính di truyền của tế bào chất [11].
mtDNA ở dạng chuỗi kép, trần, mạch vòng, kích thước khoảng 15-20
kb, trong đó bao gồm 13 gene mã hóa protein, 22 gene tRNA, 2 gen rRNA và
vùng không mã hóa dài khoảng 1000bp gọi là vùng điều khiển (vùng giàu A-
T ở động vật không xương sống và vùng D-loop ở động vật có xương sống, là
vùng không mã hóa duy nhất với các promoter để tái bản và phiên mã
mtDNA. mtDNA là vật chất di truyền nằm ngoài nhân, di truyền theo dòng
mẹ. Sự đa dạng mtDNA có thể sử dụng rộng rãi trong phân loại phân tử bởi
các đặc tính sau: (1) mtDNA có mặt ở hầu hết trong hệ gene động vật, (2) Tỷ
lệ tiến hoá của chúng nhanh hơn 5-10 lần so với bất kì một gene nhân nào;
17
hơn nữa vùng điều khiển tiến hóa nhanh hơn 5-10 lần so với các vùng khác
của mtDNA. Vì vậy trình tự nucleotide của vùng điều khiển mtDNA là một
công cụ rất hữu hiệu để nghiên cứu mối quan hệ trong và giữa các quần đàn
cùng loài.
18
Phần 2.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
I. NGUYÊN LIỆU
1. Nguyên liệu
Nhông cát : Leiolepis belliana guttata Cuvier
Loài Nhông cát : Leiolepis belliana
Giống : Leiolepis Cuvier
Họ : Agamidae
Phân bộ Thằn lằn : Sauria
Bộ có vảy : Squamata
Lớp Bò sát : Reptilia
- Nhông cát được thu ở Thủy Phù (Hương Thuỷ) và Lộc Hải (Phú Lộc)
- Thừa Thiên Huế.
- Enzym proteinase K (Hãng Sigma, Mỹ)
- ADN chuẩn (Hãng Pharmacia, Thụy Ðiển).
2. Dụng cụ
Để tiến hành xác định các đặc điểm hình thái, tách chiết, điện di và
đánh giá độ tinh sạch của ADN nhông cát L.b.guttata Cuvier, chúng tôi đã sử
dụng các trang thiết bị thể hiện ở bảng 1:
19
Trang thiết bị Công ty sản xuất
Bể ổn nhiệt
Cân phân tích
Hệ thống chớp ảnh gel tự động
Máy đo quang phổ tự động Diode array
spectrophotometer 8452A
Máy li tâm lạnh 5415C
Máy điện di Power Pac 300
Máy soi ADN Mini – Transilluminator
Tủ lạnh sâu - 200C
Tủ lạnh sâu - 700C
Cân
Thước đo mm
Kính lúp, compa
OSI, Đức
Mettler Toledo 10-4g, Thụy
Điển
Pharmacia Biotech, Thụy Điển
Hewlett Packard, Mỹ
Eppendorf, Đức
Bio Rad, Mỹ
Bio Rad, Mỹ
Sanyo, Nhật Bản
Sanyo, Nhật Bản
Bảng 1. Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
3. Hóa chất
- Agarose
- Ethanol, phenol, cloroform, isoamyl.
Các hoá chất trên được mua tại các hãng Sigma (Mỹ), Serva (Đức),
Pharmacia (Thụy Điển).
4. Dung dịch và đệm
- Đệm TE, pH 8.0
+ 10 mM Tris – Cl, pH 8.0
20
+ 1 mM EDTA, pH 8.0
- Đệm TAE
+ 40 mM Tris – Cl
+ 2 mM EDTA, pH 8.3
H2O đến 1 lít
- Đệm cắt (Digestion buffer)
+ 100 mM NaCl
+ 10 mM Tris – Cl, pH 8.0
+ 25 mM EDTA, pH 8.0
0,5 % (w/v) SDS
0,1 mg/ml proteinase K
- Đệm tra mẫu (Loading buffer)
0,1 ml bromophenol blue 10%
0,3 ml glycerin 100%
H2O đến 1ml
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Phương pháp nghiên cứu lí thuyết
Thu thập và xử lý các tài liệu liên quan đến đề tài.
2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
2.1. Phương pháp thu mẫu
Có nhiều cách để thu mẫu như: bắt bằng bẫy ống, bắt bằng thòng lọng,
bắt bằng lưỡi câu, bắt bằng cách đào hang [4]. Ở đây chúng tôi tiến hành thu
mẫu theo 2 cách chủ yếu:
2.1.1. Bắt bằng cách đào hang
Khi quan sát thấy nhông chui vào hang hoặc quan sát miệng hang đúng
là hang nhông, dùng que tre hoặc cành cây thọc vào hang để khỏi hất dấu
hang rồi dùng cuốc hoặc xẻng để đào.
21
Nhông thường có hang phụ nên trước khi đào phải bít miệng hang này
lại đồng thời thường xuyên theo dõi vì nhông có thể theo vết đào chạy ngược
ra để tẩu thoát.
2.1.2. Bắt bằng cách giăng lưới
Khi quan sát miệng hang đúng là hang nhông thì dùng một miếng lưới
rộng hơn miệng hang để bịt lại và dùng các que cây giữ lưới. Khi đó, nếu
nhông chui ra khỏi hang hoặc chui vào hang đều bị mắc lại ở lưới. Cách này
đơn giản hơn nhưng phải đợi tương đối lâu để bắt nhông.
Mẫu sau khi bắt phải còn sống và được nhốt trong lồng để cân trọng
lượng, đo các tính trạng kích thước của cơ thể và dùng trong thí nghiệm phân
tích DNA . Một điểm thuận lợi là nhông cát có thể không ăn trong nhiều ngày
mà vẫn sống, chỉ cần thỉnh thoảng vẩy nước cho chúng.
2.2. Phương pháp phân tích đặc điểm hình thái
- Dùng cân để cân trọng lượng của mẫu vật.
- Dùng thước và compa để đo các tính trạng: chiều dài thân, chiều dài
đầu, khoảng cách từ mũi đến mõm, từ mắt đến mõm, khoảng cách giữa hai
mắt, giữa hai mũi, khoảng cách từ tai đến mõm, từ mép miệng đến mõm,
chiều dài mắt, chiều rộng đầu, chiều dài đùi, chiều dài ống chân.
- Dùng kính lúp để đếm chính xác số vẩy môi trên, vẩy môi dưới và lỗ
đùi.
- Xử lý các số liệu thu được theo phương pháp thống kê sinh học.
2.3. Phương pháp định lượng ADN bằng quang phổ kế.
* Nguyên tắc:
Dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của
các base purine và pyrimidine, người ta sẽ đo được giá trị mật độ quang ở
bước sóng260 nm (OD260nm – Optical Density 260nm) của các mẫu, và cho phép
xác định nồng độ ADN trong mẫu dựa vào tương quan sau: một đơn vị OD-
22
260nm tương ứng với một nồng độ là: 50(g/ml) cho một dung dịch ADN sợi
đôi. Do đó nồng độ ADN trong mẫu được tính theo công thức sau:
CADN (g/ml) = OD260 nm x 50 x Độ pha loãng
Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280
nm (OD 280). 280 nm là bước sóng ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất,
nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic
acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Một dung dịch
nucleic acid được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số OD 260
nm/OD 280 nm nằm trong khoảng 1,8 – 2,0
* Các bước tiến hành:
- Lấy 1 ml dung môi hòa tan ADN (TE pH 8.0 hoặc nước khử ion vô
trùng) cho vào cuvette đo làm đối chứng.
- Cho 5 m1 dung dịch ADN cần định lượng vào 995 m1 dung môi hòa
tan ADN (pha loãng 200 lần). Sau đó cho vào cuvette và đo OD ở bước sóng
260 nm và 280 nm.
- Từ kết quả thu được ta tính nồng độ ADN và độ tinh sạch của ADN
theo công thức trên.
2.4. Phương pháp điện di trên gel agarose
ADN được tách chiết sau phản ứng PCR, sau khi xử lý enzym giới
hạn... đều được phân tích định tính nhờ phương pháp điện di trên gel agarose.
Agarose là một loại polymer tách từ rong biển, được cấu tạo bởi 2 monomer là
D-galactose và 3,6 - anhydro L–galactose. Gel agarose là loại gel thông dụng
nhất do thao tác đơn giản.
* Nguyên tắc:
Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các
ADN. Ðó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi
chịu tác động của một điện trường có hiệu điện thế và cường độ thích hợp,
chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Các đoạn ADN sẽ di
23
chuyển trong điện trường trên bản gel, với tốc độ tương quan nghịch với kích
thước của chúng. Trong cùng một thời gian nhất định (tùy thí nghiệm) các
đoạn bé sẽ di chuyển xa hơn các đoạn lớn, từ đó mà ADN được tách thành các
vạch trên bản gel.
Việc chọn nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn
ADN cần phân tách. Ðoạn ADN có kích thước càng nhỏ đòi hỏi hàm lượng
agarose trong gel càng lớn và ngược lại. Bảng 2 cho thấy mối tương quan giữa
nồng độ agarose cần sử dụng để phân tách các trình tự ADN có kích thước xác
định.
Hàm lượng agarose trong gel(%w/v)
Kích thước các đoạn ADNcần phân tách (kb)
0,3 5 – 60
0,6 1 -20
0,7 0,8 – 10
0,9 0,5 – 7
1,2 0,4 – 6
1,5 0,2 – 3
2,0 0,1 – 2
Bảng 2. Tương quan giữa nồng độ gel agarose và kích thước đoạn ADN
cần phân tách (Nguồn: Sambrook J. và cộng sự, 1989)
Trong điện di trên gel agarose, các đoạn ADN được hiện hình dưới tia
tử ngoại (UV) nhờ ethimidium bromide (EtBr) có khả năng gắn xen giữa các
base của ADN phát huỳnh quang dưới tác dụng của UV. Sau điện di, gel được
chiếu sáng bằng UV, các đoạn ADN hiện thành vạch đỏ da cam. Để ước
lượng kích thước các trình tự ADN trong gel agarose, người ta dùng “yếu tố
24
đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker – MWM). Đó là một
tập hợp nhiều trình tự ADN có kích thước đã biết (thang ADN).
* Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị gel agarose 0,8 %:
Cho 0,8g agarose vào 100 ml đệm TAE 1X, đem đun trên bếp cách
thuỷ hoặc lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Hạn chế bay hơi nước
khi đun để tránh tăng nồng độ agarose. Nếu quá trình đun mất nước quá nhiều
thì phải thêm nước cho đủ 100ml. Để nguội đến khoảng 60oC thì đổ dung dịch
agarose vào khuôn gel điện di đã cài lược sẵn. Chiều dày gel khoảng 5 mm là
thích hợp. Sau 30 – 40 phút khi gel đã đông cứng thì cho vào máy điện di, đổ
đệm TAE vào ngập khuôn cách mặt gel từ 1 – 2 mm, rồi gỡ lược ra.
- Tra mẫu ADN vào giếng điện di:
+ Mẫu ADN được trộn với đệm tra mẫu (với tỉ lệ 1/10 đệm tra mẫu),
sau đó tra vào giếng nhỏ trên gel.
+ Chạy điện di cùng với ADN chuẩn (Marker) để xác định kích thước
phân tử của ADN.
- Chạy điện di: Cho chạy máy điện di với chương trình: U = 30 – 40V,
I = 60 – 80 mA. Phân tử ADN sẽ di chuyển từ cực âm đến cực dương. Quan
sát sự di chuyển bằng màu bromophenol để biết lúc nào cần ngừng điện di.
- Nhuộm ADN bằng ethimidium bromide (EtBr): Sau khi kết thúc điện
di, bản gel được lấy ra nhẹ nhàng khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr có
nồng độ 0,5 g/ml khoảng 10 – 15 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó lấy bản gel ra
và rửa bằng cách ngâm trong nước sạch 2 lần, mỗi lần 5 – 10 phút.
- Quan sát và chụp ảnh: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại
254 nm trên máy soi ADN, sau đó chụp ảnh bằng hệ thống chụp ảnh gel tự
động (Pharmacia Biotech, Thụy Điển).
2.5. Phương pháp tách chiết ADN từ mô động vật
25
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc
thu nhận một lượng ADN đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm
kế tiếp. Đã có rất nhiều phương pháp được áp dụng để tách chiết ADN từ
nhiều đối tượng khác nhau, mỗi phương pháp đều có những ưu điểm phù hợp
cho từng đối tượng. Vì vậy việc lựa chọn một phương pháp tách chiết ADN
thích hợp nhất cho từng đối tượng và đạt hiệu suất, độ tinh sạch cao nhất để
phục vụ cho những thí nghiệm sau là rất quan trọng.
* Nguyên tắc:
Màng tế bào và màng nhân phải được phá vỡ bằng các biện pháp cơ
học (nghiền, lắc mạnh) và các chất tẩy mạnh (SDS...), ADN genom giải phóng
ra được tách sạch protein nhờ proteinase K và hỗn hợp phenol, chloroform,
izoamyl alcohol. Sau đó ADN genome được tủa bằng ethanol 100% ở 40oC và
thu lại bằng li tâm.
* Các bước tiến hành:
Phương pháp tách chiết ADN từ mô động vật được tiến hành theo
Gross – Bellard và cộng sự, 1972.
- Nghiền 200 mg – 1g mô bằng cồi chày sứ (cối chày sứ phải để lạnh
trước trong tủ lạnh sâu -70oC) cho đến khi thành dạng bột mịn ở điều kiện 4oC
- Hoà tan mẫu trong đệm cắt với tỉ lệ 1,2ml đệm cắt / 100mg mô
- Ủ mẫu, lắc nhẹ trong bể ổn nhiệt ở 50oC từ 12 đến 18 tiếng.
- Sau đó ủ mẫu được tách chiết với dung dịch phenol / chloroform /
izoamyl alcohol theo tỉ lệ 1:1 về thể tích. Lắc mạnh, li tâm 14000 vòng/phút,
10 phút ở 4oC. Hút dịch phía trên chuyển sang Eppendorf mới. Nếu các pha
không phân tách tốt thì ta thêm một thể tích đệm cắt không cần proteinase K
và li tâm lại. Sau đó chiết pha ở trên có chứa ADN sang một Eppendorf mới.
- Thêm vào ½ thể tích muối amonium acetat 7,5 M và 2 thể tích ethanol
100 %. Li tâm 14000 vòng/phút, 2 phút, 4oC để tủa ADN.
- Rửa cặn tủa ADN trong ethanol 70 % để loại bỏ các muối còn dính lại
trên mẫu, hong khô ở nhiệt độ phòng. Sau đó hòa tan lại trong đệm TE hoặc
nước khử ion vô trùng với nồng độ 1mg/ml.
26
2.6. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả được xử lí theo phương pháp thống kê Sinh học
1. Trung bình cộng mẫu.
=
: Trung bình cộng của mẫu
Xi : Giá trị từng lần nhắc lại
N : Số lần lặp lại
2. Độ lệch chuẩn.
=
3. Hệ số biến động.
Cv% =
4. Sai số thực nghiệm.
m =
5. Độ chính xác của thí nghiệm.
m% =
27
Phần 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
I. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI
1. Đặc điểm hình thái chung
Nhông cát có thân dẹp theo hướng lưng bụng, không có mào lưng,
không có gai trên đầu. Vảy nhỏ, phần lớn hoá sừng. Có một hoặc hai nếp họng
nhỏ nằm ngang. Lỗ đùi làm thành hai dãy ở vùng mu hai bên lỗ huyệt. Đuôi
dày lên ở gốc. Mỗi bàn chân có 5 ngón, các ngón chân dài và có móng nhọn.
Bề rộng và bề dài của mõm gần bằng nhau. Bờ mõm được giới hạn bởi hai
vảy môi và sáu tấm vảy sau mõm. Lỗ mũi mở trực tiếp ra ngoài, trán và vùng
gian ổ mắt đôi khi to; các vảy trên ổ mắt là các vảy chấm rất nhỏ. Màng nhĩ
rộng và nông, đường kính của nó gần bằng chiều dài lỗ mắt. Hai bên cổ có
những nếp da nằm ngang kéo ngang qua phần gáy. Vẩy lưng nhỏ, hoá sừng;
vẩy mặt bụng lớn hơn ở mặt lưng. Mặt lưng của L.belliana guttata Cuvier có
các chấm màu phân ngựa hình lục giác, có bốn sọc dài màu vàng nhạt rộng
trung bình 3 mm: hai sọc chạy từ sau tai đến gốc đuôi, hai sọc chạy từ gốc
chân trước đến gốc chân sau. Mặt bụng màu trắng đục, không có các chấm
màu da cam hai bên thân và không có khả năng bạnh da hai bên sườn.
2. Một số đặc điểm hình thái của nhông cát Leiolepis belliana guttata
Cuvier
Sau khi phân tích các mẫu vật thu ở Thuỷ Phù – Hương Thủy - Thừa
Thiên Huế, chúng tôi đã thu được kết quả thể hiện ở bảng 3:
28
STT Tính trạng
S ố
lượng
mẫu (n)Cv% m m%
1Khối lượng
cơ thể (g)30 38.94 2.13 5.43 0.43 1.1
2Chiều dài
thân (mm)30 79.76 2.02 2.53 0.41 0.52
3Chiều dài
đầu (mm)30 25.24 0.67 2.64 0.14 0.54
4Vẩy môi
trên30 9.4 (8 – 11) 0.173 1.84 0.03 0.37
5Vẩy môi
dưới30 9.68 (8 – 12) 0.19 1.95 0.04 0.39
6 Lỗ đùi 30 19.44 (15-23) 0.41 2.11 0.08 0.43
Bảng 3: Giá trị trung bình của chiều dài thân, chiều dài đầu, khối lượng
cơ thể, số lượng vảy và lỗ đùi của L.b.guttata Cuvier
Qua bảng 3 cho thấy khối lượng cơ thể trung bình là 38.94g (mẫu nhỏ
nhất là 16,10g và lớn nhất là 50g), chiều dài thân trung bình là 79,76 mm (nhỏ
nhất là 58 mm và lớn nhất là 95 mm). Như vậy khối lợng cơ thể trung bình và
chiều dài thân trung bình của các mẫu vật chúng tôi phân tích nhỏ hơn kết quả
nghiên cứu trước đây [4]: khối lượng cơ thể trung bình là 56,0g, chiều dài
thân trung bình là 120,83 mm. Sai khác này có thể là do chúng tôi thu mẫu
vào giai đoạn sớm hơn trong quá trình sinh trưởng của nhông cát, vì vậy mà
cơ thể của chúng chưa đạt kích thước tối đa.
Số lượng vảy môi trên, vảy môi dưới và lỗ đùi của các mẫu đem phân
tích là: vảy môi trên trung bình là 9,40 (8 – 11), vảy môi dưới trung bình là
9,68 (8 – 12), lỗ đùi là 19,44 (15 – 23). Như vậy, kết quả nghiên cứu này phù
29
hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Ngô Đắc Chứng (1991) [4]: vảy môi
trên trung bình 9,33 (9 – 10), số vảy môi dưới trung bình là 10,00 (10 – 12), lỗ
đùi trung bình 21,60 (20 – 23).
Tần số gặp lỗ đùi, vảy môi trên và vảy môi dưới của các mẫu vật được
trình bày thông qua bảng 4:
Lỗ đùi
Số lượng 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Tổng
Tần số 1 2 2 5 3 6 7 3 1 30
Tần suất(%)
3,33 6,67 6,67 16,67 10 20 23,33 10 3,33 100
Vảy môi trên
Số lượng 8 9 10 11
Tần số 5 8 14 3 30
Tần suất(%)
16,67 26,67 46,66 10 100
Vảy môi dưới
Số lượng 8 9 10 11 12
Tần số 3 10 10 5 2 30
Tần suất(%)
10 33,33 33,33 16,67 6,67 100
Bảng 4: Tần số gặp lỗ đùi, vảy môi trên, vảy môi dưới của nhông cát
L.b.guttata Cuvier
30
Qua bảng 4 ta thấy số lỗ đùi dao động từ 15 – 23, trong đó tần số gặp
cao nhất là 21 lỗ. Như vậy kết quả của chúng tôi có khác so với kết quả
nghiên cứu trước đây [4]: số lỗ đùi dao động từ 20 – 23 lỗ. Sự khác nhau về số
lượng lỗ đùi giữa các cá thể là tương đối lớn, cho ta thấy tính đa hình của loài
nhông cát này.
Số vảy môi trên dao động từ 8 – 11, trong đó tần số bắt gặp cao nhất
là 10 lỗ; Số vảy môi dưới dao động từ 8 – 12, trong đó tần số bắt gặp cao nhất
là 10 lỗ. Như vậy ta thấy số lượng vảy của nhông cát L.b.guttata Cuvier cũng
biến thiên tương đối đa dạng.
3. Tính trạng kích thước khác
Các tính trạng kích thước cơ thể của nhông cát được đem tính % so với
chiều dài thân và chiều dài đầu. Kết quả được trình bày ở bảng 5:
31
STT Tính trạng
Số
lượng
mẫu
Cv% m m%
1 Mũi – mõm / dài đầu 30 18.86 1.98 10.50 0.40 2.12
2 Mắt – mõm / dài đầu 30 69.92 5.47 7.82 1.12 1.60
3 Mắt / dài đầu 30 24.61 3.07 1.56 0.63 2.56
4 Rộng đầu / dài đầu 30 77.52 5.29 6.82 1.80 1.39
5 Mắt – mắt / dài đầu 30 55.43 3.13 5.65 0.64 1.15
6 Mũi – mũi / dài đầu 30 21.74 2.59 11.91 0.54 2.48
7 Tai – mõm / dài đầu 30 91.02 4.58 5.03 0.93 1.02
8 Mép miệng – mõm / dài đầu 30 67.28 6.73 10.00 1.37 2.04
9 Dài đầu / dài thân 30 31.40 2.29 7.29 0.47 1.50
10 Dài đùi / dài thân 30 23.88 2.62 10.97 0.53 2.22
11 Dài ống / dài thân 30 26.44 3.24 12.25 0.66 2.50
Bảng 5: Tỉ lệ % giữa các tính trạng kích thước so với chiều dài đầu và
chiều dài thân của L.b.guttata Cuvier
Qua bảng trên cho thấy tỷ lệ % kích thước so với chiều dài đầu và
chiều dài thân giữa các cá thể khác nhau không chênh lệch nhiều, chỉ có tỷ lệ
% của khoảng cách mắt – mõm / dài đầu, rộng đầu / dài đầu, tai – mõm /dài
đầu, mép miệng – mõm / dài đầu là có sự chênh lệch lớn.
32
II. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ADN MÔ NHÔNG CÁT1. Tách chiết ADN
ADN mô nhông cát được tách chiết theo phương pháp của Gross-
Bellard và cộng sự như đã mô tả ở phần phương pháp. Nguyên liệu sử dụng
để tách là các mẫu đuôi, gan, và cơ của nhông cát.
Quá trình tách chiết ADN cơ bản gồm 3 bước:
- Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân.
- Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu
là các protein.
- Bước 3: Kết tủa ADN và thu nhận sản phẩm .
Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết ADN là thu nhận các
phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân
cơ học (phân tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị cắt bởi
enzym nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các ADN cần
được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các
enzym nội bào (deoxyribonuclease, ribonuclease). Ðể đảm bảo điều kiện này,
trước khi nghiền mẫu phải để lạnh cối, chày sứ trong tủ lạnh - 70oC. Sau khi
nghiền mẫu, tế bào được hòa trong dung dịch đệm có chứa chất tẩy SDS và
proteinase K. Hỗn hợp dung dịch đệm này sẽ phá hủy các protein liên kết với
ADN. Ðể loại bỏ protein trong mẫu chúng tôi sử dụng phenol / chloroform/
isoamyl alcohol.
Cuối cùng ADN được thu nhận bằng cách tủa trong ethanol 100% (2,5
thể tích ethanol/ 1 thể tích mẫu), để ở -20ºC. Với nồng độ ethanol cao và nhiệt
độ thấp hầu như toàn bộ ADN đều tủa.
2. Điện di ADN
Sau khi tách được ADN, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra trên gel
agarose 0,8%.
33
Sau khi nhuộm bằng EtBr, các vạch trong gel agarose phát quang dưới
tia tử ngoại (UV). Kết quả điện di được thể hiện trên hình 1
bp
1221681447126
M 1 2 3 4 5 6
Hình 1: Ðiện di đồ chế phẩm ADN tách chiết được từ đuôi, cơ và gan
nhông cát L.b. guttata Cuvier
M (Marker): Thang ADN chuẩn1;4: ADN đuôi2;5: ADN gan3;6: ADN cơ
Kết quả cho thấy các phân tử ADN mô nhông cát (đuôi, cơ, gan) có phân
tử lượng lớn, tập trung thành một băng chính.Và ta thấy các phân tử ADN
tách chiết từ các loại mô của nhông cát L.b.guttata Cuvier đều có kích thước
lớn hơn 12216 bp.
3. Đánh giá độ tinh sạch và hàm lượng của chế phẩm ADN
Sau khi điện di kiểm tra trên gel agarose, chúng tôi tiến hành đánh giá độ
tinh sạch và hàm lượng của chế phẩm ADN bằng máy đo quang phổ 8425A
(Hewlet Packard, Mỹ): Các chế phẩm ADN được kiểm tra ở các bước sóng
260nm và 280nm. Kết quả được thể hiện ở hình 2, bảng 6 và bảng 7
34
Hình 2: Phổ hấp thụ tử ngoại của chế phẩm ADN tách chiết từ đuôi, cơ
và gan nhông cát L.b.guttata Cuvier
1. ADN đuôi2. ADN gan3. ADN cơ
* Các kết quả bước sóng: thể hiện ở bảng 6:
260 nm 280 nm
1. ADN đuôi 0,04121 0,02209
2.ADN gan 0,08969 0,04961
3. ADN cơ 0,07610 0,04187
Bảng 6: Phổ hấp thụ tử ngoại của ADN tách chiết từ đuôi, cơ, gan của
nhông cát L. b.guttata Cuvier ở các bước sóng 260 nm và 280 nm.
35
Bước sóngMẫu
0
1
0,2
0,3
0,5
0,4
0,6
200 300 400 500 600
Độ dài bước sóng (nm)
Độ hấp thụ AU
23
0,1
Qua hình và bảng cho thấy phổ hấp thụ tử ngoại của các chế phẩm
ADN đều có đỉnh cực đại ở bước sóng 260nm.
Kết quả định lượng ADN bằng phương pháp đo quang phổ được trình
bày ở bảng 7:
Mẫu
Số mẫu tách ADN
Nồng độ
ADN (g/ml)
Tỉ số
OD260nm/OD280nm
Hàm lượng ADN
(μg/mg mô)
Ðuôi
Gan
Cơ
15
15
15
412,1
896,9
761,0
1,865
1,807
1,817
0,50
0,91
0,76
Bảng 7: Kết quả định lượng ADN trong mẫu tách chiết được từ đuôi, cơ
và gan nhông cát L.b.guttata Cuvier bằng phương pháp đo
quang phổ
Qua kết quả trên ta thấy ADN tách chiết được từ gan có nồng độ và
hàm lượng cao nhất (896,9 và 0,91 (g/ml)) đồng thời độ tinh sạch cũng cao
nhất (tỉ số OD260nm/OD280nm là 1,807); Tiếp theo là ADN tách chiết từ cơ: nồng
độ ADN là 761, 00 (g/ml), hàm lượng ADN là 0,76 (g/ml), tỉ số
OD260nm/OD280nm là 1,817; Cuối cùng là ADN tách chiết từ đuôi: nồng độ ADN
là 412,1 (g/ml), hàm lượng ADN là 0,50 (g/ml), tỉ số OD260nm/OD280nm là
1,865. Như vậy, ADN tách chiết được từ gan có chất lượng tốt nhất. Tuy
nhiên, chế phẩm ADN tách chiết được từ ba loại mô của nhông cát
L.b.guttata Cuvier đều có chất lượng tốt (Tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong
khoảng 1,8 – 2,0) [6] đảm bảo cho những nghiên cứu tiếp theo.
36
Phần 4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
I. KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu đề tài “Góp phần nghiên cứu tính đa hình của nhông
cát Leiolepis belliana guttata Cuvier”, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
- Nhông cát L.b.guttata Cuvier có khối lượng cơ thể trung bình là 38,94
g, chiều dài thân trung bình là 79,76 mm
- Số lượng lỗ đùi là 15 - 23, vảy môi trên là 8 - 11, vảy môi dưới là 8 -
12.
- Tỷ lệ % kích thước so với chiều dài đầu và chiều dài thân giữa các cá
thể khác nhau không chênh lệch nhiều, tỷ lệ % của khoảng cách mắt – mõm /
dài đầu, rộng đầu / dài đầu, tai – mõm /dài đầu, mép miệng – mõm / dài đầu là
có sự chênh lệch lớn.
- Sai khác về số lượng lỗ đùi, vảy môi trên, vảy môi dưới giữa các cá
thể khác nhau trong một quần đàn cho thấy nhông cát L.b.guttata Cuvier có
tính đa hình cao.
- Đã tách chiết và tinh sạch ADN tổng số của nhông cát L.b.guttata
Cuvier.
- Chế phẩm ADN tách chiết được từ các mô của nhông cát (đuôi, cơ,
gan) theo phương pháp của Gross – Bellard và cộng sự đều có chất lượng tốt
đảm bảo cho những nghiên cứu tiếp theo.
II. ĐỀ NGHỊ
Trong phạm vi của một đề tài khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi không có
đủ điều kiện sử dụng các chỉ thị phân tử ADN như RAPD, RFLP, AFLP để
37
phân tích tính đa hình của nhông cát Leiolep is belliana guttata Cuvier. Vì vậy
tôi xin đề nghị:
- Kéo dài thời gian nghiên cứu đặc điểm hình thái để thu được mẫu vào
những thời điểm khác nhau trong năm.
- Nghiên cứu thêm một số tính trạng khác để thấy rõ tính đa hình.
- Tiếp tục nghiên cứu ở mức độ phân tử, phân tích ADN để thấy tính đa
hình của loài.
- Phân tích ADN của cả hai loài nhông hiện có ở Thừa Thiên Huế để
củng cố giả thuyết chúng thuộc hai loài hay một loài.
38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đinh Thị Phương Anh, 2005. Bước đầu nghiên cứu tính đa dạng di truyền
thạch sùng vùng núi Bà Nà bằng kỹ thuật PCR – RAPD. Báo cáo khoa học,
Hội nghị Khoa học toàn quốc, công nghệ sinh học trong nghiên cơ bản, Hà
Nội: 72 – 75.
2. Nguyễn Thị Bảy, 2004. Sử dụng các chỉ thị phân tử để phân tích tính đa
hình của các quần đần cá Tra nuôi (Pangasius Hypophthalmus) ở Việt Nam.
Luận văn thạc sĩ khoa học Sinh học, Hà Nội.
3. Nguyễn Thị Thanh Bình, et al. 2005. Nghiên cứu đa dạng phân tử của các
giống tằm sử dụng trong sản xuất bằng kỹ thuật PCR – RAPD. Báo cáo Khoa
học, Hội nghị Khoa học toàn quốc, Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ
bản, Hà Nội: 76 – 79.
4. Ngô Đắc Chứng, 1991. Nghiên cứu đực điểm hình thái và sinh thái của
nhông cát Leiolepis belliana ở Thừa Thiên Huế. Luận án phó tiến sĩ khoa học
Sinh học.
5. Trần Quốc Dung, 2001. Nghiên cứu chuyển gen hormone sinh trưởng
người vào cá chạch Misgurnus anguillicaudatus bằng vi tiêm. Luận án Tiến
sĩ Sinh học, Hà nội.
6. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1997. Sinh học phân tử. Nxb Giáo dục: 122 – 134.
7. Trịnh Đình Đạt, 1994. Cơ sở di truyền chọn giống động vật. Giáo trình cao
học, Nxb Nông nghiệp: 145 – 149.
8. Phạm Thành Hổ, 2004. Di truyền học. Nxb Giáo dục: 405 – 408.
39
9. Trần Thị Mai Hường, 2006. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và
nuôi thử nghiệm Rồng đất (Physignathus cocincinus Cuvier, 1829) ở Nam
Đông - Thừa Thiên Huế. Luận văn thạc sĩ Sinh học, Huế.
10. Phan Cự Nhân, 2001. Di truyền học động vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật:
128 – 132; 148 – 151.
11. Phan Cự Nhân, Trần Bá Hoành, Lê Quang Long, Phạm Đình Thái, Hoàng
Thị Sản, Mai Đình Yên, 1997. Sinh học đại cương, tập 1. Nxb Đại học Quốc
gia Hà Nội: 330 – 336.
12. Khuất Hữu Thanh, 2002. Một số phương pháp ứng dụng PCR trong phân
loại phân tử xác định tính đa dạng di truyền của sinh vật. Tập bài giảng trường
ĐHBK Hà Nội. Lưu hành nội bộ.
13. Quyền Đình Thi, et al. 2003. Sử dụng microsarosatell, mtRFLP và RAPD
để phân tích đa hình tôm sú (Panaeus monodon). Tạp chí Công nghệ sinh học
1930: 287 – 298.
14. Quyền Đình Thi, et al. 2004. Sử dụng các chỉ thị phân tử RAPD và
mtDNA – RFLP để phân tích đa hình các quần đàn cá tra (Pangasius
hypophthalmus) nuôi ở Việt Nam. Tuyển tập hội thảo toàn quốc về nghiên
cứu và ứng dụng khoa học công nghệ trong nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu:
919 – 941.
40
PHỤ LỤC
I. NHÔNG CÁT Leiolepis belliana guttata Cuvier
41
II. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA NHÔNG CÁT
Mẫu
Khối
lượng (g)
Dài
thân
(mm)
Dài
đầu
(mm)
Rộng
đầu
(mm)
Dài
mắt
(mm)
Vảy
môi
trên
Vảy
môi
dưới
Lỗ
đùi
1 47 90 27 20 9,00 10 11 21
2 46 94 26 21 6,50 10 10 19
3 47,50 95 26 21,5 7,00 8 8 16
4 27,05 73 22 18 6,00 10 11 17
5 16,10 68 20 15 5,00 9 10 15
6 46,60 93 28 20 6,0 10 10 21
7 16,80 65 20 17 6,00 10 10 18
8 43,90 79 25 2 7,00 11 9 23
9 45,50 84 28 20 6,00 10 8 20
10 43 82 27 19 6,00 1 8 21
11 19 58 22 15 5,00 10 9 19
12 24,40 80 26 19 6,00 9 10 18
13 50 90 28 20 7,00 8 9 22
14 47,60 85 27 22 6,50 10 10 22
15 49,10 86 27 22 6,00 10 9 16
16 33,10 70 23 18 6,00 9 9 21
17 42,80 82 28 21 6,00 9 10 21
18 46 89 26 20 6,00 9 10 20
19 47 90 26 21 7,00 9 12 20
20 26 70 21 17 5,00 8 10 18
21 35,50 72 23 19 6,00 10 10 20
22 40 75 24 18 5,00 10 11 21
23 30,50 68 22 18 5,00 8 9 18
24 45 83 28 20 6,00 10 11 20
42
25 37 73 23 20 6,00 8 9 19
26 38,50 75 24 20 6,00 9 9 20
27 42 80 25 21 6,50 10 9 21
28 35 70 21 18 5,00 10 10 18
29 39,30 75 25 19 5,50 11 9 20
30 43,20 80 27 21 6,00 9 12 22
Mẫu
Mũi –
mõm
(mm)
Mắt –
mõm
(mm)
Mắt -
mắt
(mm)
Mũi –
mũi
(mm)
Tai –
mõm
(mm)
Mép miệng
- mõm
(mm)
Dài
đùi
(mm)
Dài
ống
(mm)
1 6,00 19 15 7,00 25 19 17 18
2 5,00 17 15 6,00 24 18 16 17
3 5,50 18,50 15 6,00 25 17,50 21 22
4 4,00 15 12 4,00 20 14 18 20
5 3,50 14 12 3,00 18,50 14 15 18
6 6,00 17 14,50 6,00 23 19 22 22
7 3,00 14 11 4,00 19 13 16 18
8 5,00 18 15 6,00 21 17 20 21
9 5,00 18 15 6,00 24 18 20 25
10 5,00 18 15 5,00 24 18 18 21
11 4,00 15 10 5,00 19 14 13 18
12 5,00 18 15 5,50 25 17 22 22
13 5,00 19 14 6,00 25 16 19 22
14 5,00 18 15 6,00 24 15 21 23
15 4,00 19 15 6,00 24 17 20 22
16 4,00 17 12 5,00 21 18 18 20
17 6,00 17 14 6,00 24 17 20 22
18 5,00 19 14 7,00 25 18 21 21
19 6,00 19 15 7,00 25 19 21 22
43
20 4,00 14 12 4,00 20 14 18 19
21 4,00 18 13 5,00 22 18 20 21
22 4,50 18 14 5,50 23 18 18 23
23 4,00 15 12 4,50 20 16 19 22
24 5,00 18 14 6,00 24 18 20 23
25 4,50 19 14 5,00 22 18 21 22
26 4,50 17 13 5,00 23 17 18 19
27 5,50 19 15 6,00 24 18 20 22
28 4,50 17 13 5,00 21 18 19 20
29 5,00 18 14 5,50 22 19 18 21
30 6,00 19 15 6,00 23 17 20 21
44
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU......................................................................................................1
I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI...............................................................................1
II. MỤC TIÊU VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU.........................................3
1. Mục tiêu.....................................................................................................3
2. Nhiệm vụ...................................................................................................3
Phần 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.....................................4
I. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU NHÔNG CÁT.................................................4
1. Trên thế giới..............................................................................................4
2. Ở Việt Nam...............................................................................................6
II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ..........................10
1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước...........................................................10
2. Tình hình nghiên cứu trong nước ...........................................................11
III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH...................12
1. Phương pháp isoenzyme cổ điển............................................................ 12
2. Các phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử AND.....................................13
2.1. Phương pháp RAPD.............................................................................13
2.2. Phương pháp RFLP..............................................................................14
2.3. Phương pháp AFLP..............................................................................16
2.4. Microsatellite.......................................................................................16
2.5. Đọc trình tự AND.................................................................................16
2.6. Phân tích ADN ty thể............................................................................17
Phần 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........19
I. NGUYÊN LIỆU.......................................................................................19
1. Nguyên liệu ............................................................................................19
2. Dụng cụ...................................................................................................19
3. Hóa chất...................................................................................................20
45
4. Dung dịch và đệm...................................................................................20
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................................21
1. Phương pháp nghiên cứu lí thuyết..........................................................21
2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm....................................................21
2.1. Phương pháp thu mẫu..........................................................................21
2.2. Phương pháp phân tích đặc điểm hình thái.........................................22
2.3. Phương pháp định lượng ADN bằng quang phổ kế............................22
2.4. Phương pháp điện di trên gel agarose.................................................23
2.5. Phương pháp tách chiết ADN từ mô động vật..........................................25
2.6. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................27
Phần 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................28
I. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI........................................................................28
1. Đặc điểm hình thái chung........................................................................28
2. Một số đặc điểm hình thái của nhông cát Leiolepis belliana guttata
Cuvier..........................................................................................................28
3. Tính trạng kích thước khác.....................................................................31
II. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ADN MÔ NHÔNG
CÁT.............................................................................................................33
1. Tách chiết AND......................................................................................33
2. Điện di AND...........................................................................................33
3. Đánh giá độ tinh sạch và hàm lượng của chế phẩm ADN ....................34
Phần 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................37
I. KẾT LUẬN..............................................................................................37
II. ĐỀ NGHỊ................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................39
PHỤ LỤC....................................................................................................41
46