kĩ thuật thực phẩm 3

8/20/2019 Kĩ thuật thực phẩm 3

1/75

29

CHƯƠ NG 5

CÁC PHƯƠ NG PHÁP, THIẾT BỊ VÀ ĐIỀU KHIỂN QUÁ TRÌNH LÊN MEN

Trong tự nhiên xảy ra muôn vàn các quá trình lên men do hoạt động sống của visinh vật. Có thể nói r ằng bất cứ một hợ p chất nào có trong tự nhiên vi sinh vật cũng có

thể tổng hợ p đượ c. Do vậy lên men là muôn hình muôn vẻ, nhưng tất cả các quá trìnhnày dù là trong tự nhiên, trong phòng thí nghiệm hay trong sản xuất công nghiệ p đều cómột nguyên lý giống nhau.

Nghiên cứu một quá trình lên men thực chất là nghiên cứu các đặc điểm sinh lý –hoá sinh và hoạt động sống của một chủng vi sinh vật, các đặc điểm nuôi cấy của nó vớ icác thông số như thành phần dinh dưỡ ng, các yếu tố ảnh hưở nh và hoạt động của toànthể quá trình này trong sản xuất công nghiệ p.

5.1. Các phươ ng pháp lên men

Tuỳ thuộc đặc điểm sinh lý của vi sinh vật nuôi cấy đối vớ i oxy, ta coi quá trìnhđó là hiếu khí hay k ỵ khí không bắt buộc. Đối vớ i lên men k ị khí thực hiện theo phươ ng

pháp nuôi cấy chìm, ngh ĩ a là vi sinh vật nuôi cấy ở sâu tronh môi tr ườ ng, thỉnh thoảngkhuấy để tăng sự trao đổi giữa tế bào vi sinh vật vớ i môi tr ườ ng trong suốt quá trìnhkhông sục khí. Vớ i quá trình lên men k ỵ khí không bắt buộc, như trong lên men r ượ ucác giống men khi có oxy thì ngả sang sinh tr ưở ng, tăng sinh khối, khi thiếu oxy thì ngả sang hướ ng tích tụ etanol. Vì vậy lên men r ượ u thồi k ỳ đầu thườ ng đượ c cấ p không khíđể giống nấm men phát triển tốt, sau đó ngừng sục khí để lên men r ượ u. Lên men hiếu

khí đượ c thực hiện nhờ hai phươ ng pháp cơ bản: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu.

5.2. Lên men bề sâu trong môi trườ ng lỏng

Lên men chìm là phươ ng pháp đượ c phổ biến r ộng nhất trong quy trình lên mencông nghiệ p, vì có thể kiểm soát đượ c toàn bộ các khâu trong quá trình một cách dễ dàng. So vớ i phươ ng pháp lên men bề mặt, thì lên men chìm có nhiều ưu điểm đó là: ítchoán bề mặt (không mất nhiều diện tích), dễ cơ giớ i hóa và tự động hóa trong quá trìnhtheo dõi. Tuy nhiên phươ ng pháp lên men chìm đòi hỏi đầu tư nhiều kinh phí cho trang

thiết bị. Ngoài ra, nếu một mẻ lên men, vì một lý do nào đó bị xử lý thì không thể xử lýcục bộ đượ c, đa phần phải hủy bỏ cả quá trình lên men, gây tốn kém lớ n. Phế liệu củaquá trình lên men thải ra phải kèm theo công nghệ xử lý chống ô nhiễm môi tr ườ ng.

Phươ ng pháp này dùng cho cả vi sinh vật k ị khí và hiếu khí. Đối vớ i nuôi vi sinh vậtk ị khí trong quá trình nuôi không cần sục khí chỉ thỉnh thoảng khuấy tr ộn còn vớ i vi sinh


2/75

30

vật hiếu khí thì phải sục khí liên tục. Đây là phươ ng pháp hiện đại đã đượ c dùng trongkhoảng nửa cuối thế k ỉ XX và cho k ết quả r ất to lớ n đối vớ i công nghệ vi sinh.

Nuôi cấy chìm hay nuôi cấy bề sâu dùng môi tr ườ ng dịch thể. Chủng vi sinh vật cấyvào môi tr ườ ng đượ c phân tán khắ p mọi điểm và chung quanh bề mặt tế bào đượ c tiế p

xúc vớ i dịch dinh dưỡ ng. Đặc điểm này đòi hỏi trong suốt quá trình nuôi cấy phải khuấyvà cung cấ p ôxy bằng cách sục khí liên tục. Ngày nay phươ ng pháp nuôi cấy chìm đượ cdùng phổ biến trong công nghệ vi sinh để sản xuất men bánh mì, protein đơ n bào, cácchế phẩm vi sinh làm phân bón, thuốc tr ừ sâu, các enzyme, các acid amin, vitamin, cácchất kháng sinh, các chất kích thích sinh học v.v...

Phươ ng pháp nuôi cấy chìm có một số ưu điểm:

- Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắ p đặt dây chuyền.

- Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơ n vị sản phẩm thấ p.

- Dễ tổ chức đượ c xí nghiệ p có sản lượ ng lớ n.- Các thiết bị lên men chìm dễ cơ khí hoá, tự động hoá .

Song phươ ng pháp chìm cũng có một số nhượ c điểm sau:

- Đòi hỏi trang bị k ĩ thuật cao, dễ bị nhiễm trùng toàn bộ. Vì vậy, những thiết bị lênmen chìm cần phải chế tạo đặc biệt cẩn thận, chịu áp lực cao, đòi hỏi kín và làm việc vớ iđiều kiện vô trùng tuyệt đối (trong nuôi cấy bề mặt có thể loại bỏ phần đã nhiễm trùng,các phần khác vẫn còn dùng đượ c).

- Trong lên men chìm cần phải khuấy và sục khí liên tục vì vi sinh vật chỉ sử dụng

đượ c ôxy hoà tan trong môi tr ườ ng. Khí đượ c nén qua một hệ thống lọc sạch tạ p trùng,hệ thống này tươ ng đối phức tạ p và dễ gây nhiễm cho môi tr ườ ng nuôi cấy

5.2.1. Lên men gián đoạn

Trong phươ ng pháp nuôi không liên tục (batch - culture) hay còn gọi là nuôi gián đoạn,thông thườ ng vi sinh vật sinh tr ưở ng đến chừng nào một thành phần chủ yếu của môitr ườ ng dinh dưỡ ng bị giớ i hạn. Khi đó culture chuyển từ pha luỹ thừa sang pha cân

bằng. Sinh tr ưở ng gắn liền vớ i sự thay đổi kéo dài của điều kiện nuôi, sự giảm chất dinhdưỡ ng và sự tăng khối lượ ng tế bào. Trong quá trình đó tr ạng thái sinh lí của tế bào cũng

thay đổi. Thông thườ ng việc tạo thành sản phẩm mong muốn liên quan vớ i một tr ạngthái sinh lí nhất định trong pha sinh tr ưở ng. Không thể duy trì đượ c tr ạng thái này trongmột thờ i gian dài.

Phươ ng pháp nuôi gián đoạn đượ c sử dụng tr ướ c hết cho sự lên men vô trùng,vì cách

nuôi này là dễ dàng về mặt k ỹ thuật.


3/75

31

Sinh tr ưở ng là biểu thị sự tăng tr ưở ng các thành phần của tế bào. Đối vớ i các vi sinh vậtcó hình thức sinh sản bằng nẩy chồi hay phân đôi thì sinh tr ưở ng dẫn tớ i sự gia tăng số lượ ng tế bào. Tế bào tăng tr ưở ng đến một mức độ nhất định thì sẽ phân cắt thành hai tế

bào thế hệ con có kích thướ c hầu như bằng nhau. Đối vớ i các vi sinh vật đa nhân thì sự phân cách nhân không đồng hành vớ i sự phân cắt tế bào - sự sinh tr ưở ng làm tăng kích

thướ c tế bào mà không làm tăng số lượ ng tế bào. Vì vi sinh vật r ất nhỏ bé cho nên là đốitượ ng r ất không thuận tiện để nghiên cứu về sinh tr ưở ng và phát triển. Chính vì vậy màkhi nghiên cứu về sinh tr ưở ng, ngườ i ta thườ ng xét đến sự biến đổi về số lượ ng của cả quần thể vi sinh vật.

ĐƯỜ NG CONG SINH TR ƯỞ NG

Sự sinh tr ưở ng quần thể vi sinh vật đượ c nghiên cứu bằng cách phân tích đườ ng congsinh tr ưở ng trong một môi tr ườ ng nuôi cấy vi sinh vật theo phươ ng pháp nuôi cấy theomẻ (batch culture) hoặc trong một hệ thống kín. Có ngh ĩ a là vi sinh vật đượ c nuôi cấy

trong một thiết bị kín, trong quá trình nuôi cấy không thay đổi môi tr ườ ng và thờ i giannuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dưỡ ng càng giảm sút, các chất phế thải củatrao đổi chất càng tăng lên. Nếu lấy thờ i gian nuôi cấy là tr ục hoành và lấy số logarit củasố lượ ng tế bào sống làm tr ục tung sẽ có thể vẽ đượ c đườ ng cong sinh tr ưở ng của các visinh vật sinh sản bằng cách phân đôi. Đườ ng cong này có 4 giai đoạn (phases) khácnhau.

Hình 14.1: Đườ ng cong sinh tr ưở ng trong hệ thố ng kín(Theo sách của Prescott, Harley và Klein)

Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase)

Khi cấy vi sinh vật vào một môi tr ườ ng mớ i số lượ ng thườ ng không tăng lên ngay, đó làgiai đoạn Tiềm phát hay pha Lag. Trong giai đoạn này tế bào chưa phân cắt nhưng thể tích và khối lượ ng tăng lên rõ r ệt do có sự tăng các thành phần mớ i của tế bào. Nguyênnhân là do tế bào ở tr ạng thái già, thiếu hụt ATP, các cofactor cần thiết và ribosome.Thành phần môi tr ườ ng mớ i không giống môi tr ườ ng cũ cho nên tế bào cần một thờ igian nhất định để tổng hợ p các enzyme mớ i nhằm sử dụng đượ c các chất dinh dưỡ ng


4/75

32

mớ i. Các tế bào cũng có thể bị thươ ng tổn và cần một thờ i gian để hồi phục. Bất k ỳ vìnguyên nhân gì thì k ết quả vẫn là tế bào phải tự trang bị lại các thành phần của mình, táitạo ADN và bắt đầu tăng khối lượ ng. Giai đoạn tiềm phát dài hay ngắn liên quan đến

bản thân từng loại vi sinh vật và tính chất của môi tr ườ ng. Nếu tính chất hóa học củamôi tr ườ ng mớ i sai khác nhiều vớ i môi tr ườ ng cũ thì giai đoạn tiềm phát sẽ kéo dài.

Ngượ c lại, nếu cấy từ giai đoạn logarit vào một môi tr ườ ng có thành phần tươ ng tự thìgiai đoạn tiềm phát sẽ rút ngắn lại. Nếu cấy vi sinh vật từ giai đoạn tiềm phát hay từ giaiđoạn tử vong thì giai đoạn tiềm phát sẽ kéo dài.

Giai đoạn logarit (Log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase)

Trong giai đoạn này vi sinh vật sinh tr ưở ng và phân cắt vớ i nhị p độ tối đa so vớ i bảntính di truyền của chúng nếu gặ p môi tr ườ ng và điều kiện nuôi cấy thích hợ p. Nhị p độ sinh tr ưở ng của chúng là không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôimột cách đều đặn. Do các tế bào sinh ra chỉ khác nhau r ất ít cho nên đườ ng cong sinh

tr ưở ng là một đườ ng tr ơ n nhẵn chứ không gấ p khúc (hình 14.1). Quần thể tế bào tronggiai đoạn này có tr ạng thái hóa học và sinh lý học cơ bản là như nhau cho nên việc nuôicấy ở giai đoạn này thườ ng đượ c sử dụng để nghiên cứu sinh hóa học và sinh lý học visinh vật.

Sinh tr ưở ng logarit là sinh tr ưở ng đồng đều, tức là các thành phần tế bào đượ c tổng họ pvớ i tốc độ tươ ng đối ổn định. Nếu cân bằng dinh dưỡ ng hay các điều kiện môi tr ườ ngthay đổi sẽ dẫn đến sự sinh tr ưở ng không đồng đều. Sự sinh tr ưở ng khi nhị p độ tổng hợ pcác thành phần của tế bào tươ ng đối biến hóa sẽ biến đổi theo cho đến khi đạt tớ i một sự cân bằng mớ i. Phản ứng này r ất dễ quan sát thấy khi làm thực nghiệm chuyển tế bào từ một môi tr ườ ng nghèo dinh dưỡ ng sang một môi tr ườ ng giàu hơ n. Tế bào tr ướ c hết phảitạo nên các ribosome mớ i có thể nâng cao năng lực tổng hợ p protein, sau đó là sự tăngcưở ng tổng hợ p protein và ADN. Cuối cùng tất yếu dẫn đến tốc độ phát triển nhanhchóng.

Lúc chuyển quần thể tế bào từ một môi tr ườ ng giàu dinh dưỡ ng tớ i một môi tr ườ ngnghèo thì cũng có k ết quả về sự sinh tr ưở ng không đồng đều như vậy. Vi sinh vật tr ướ cđó có thể thu đượ c từ môi tr ườ ng nhiều thành phần của tế bào nhưng khi chuyển sangmôi tr ườ ng nghèo chúng cần có thờ i gian để tạo ra các enzyme cần thiết để sinh tổnghợ p các thành phần không có sẵn trong môi tr ườ ng. Sau đó tế bào mớ i có thể phân cắt,ADN mớ i có thể tái tạo, nhưng việc tổng hợ p protein và ARN là chậm cho nên tế bào

nhỏ lại và tổ chức lại sự trao đổi chất của chúng cho đến khi chúng có thể sinh tr ưở ngtiế p. Sau đó sự sinh tr ưở ng cân bằng sẽ đượ c hồi phục và tr ở về lại giai đoạn logarit.

Các thí nghiệm trên đây cho thấy sự sinh tr ưở ng của vi sinh vật đượ c kiểm soát mộtcách chính xác, phối hợ p và phản ứng nhanh chóng vớ i những sự biến đổi của môitr ườ ng.


5/75

33

Khi sự sinh tr ưở ng của vi sinh vật bị hạn chế bở i nồng độ thấ p của các chất dinh dưỡ ngcần thiết thì sản lượ ng tế bào cuối cùng sẽ tăng lên cùng vớ i sự tăng lên của các chấtdinh dưỡ ng bị hạn chế (hình 14.2a). Đây chính là cơ sở để sử dụng vi sinh vật trong việcđịnh lượ ng vitamin và các nhân tố sinh tr ưở ng khác. Tốc độ sinh tr ưở ng cũng tăng lêncùng vớ i sự tăng nồng độ các chất dinh dưỡ ng (hình 14.2b). Hình dáng của đườ ng cong

hầu như phản ánh tốc độ hấ p thu chất dinh dưỡ ng nhờ sự chuyển vận protein của vi sinhvật. Lúc nồng độ chất dinh dưỡ ng đủ cao thì hệ thống vận chuyển sẽ bão hòa và tốc độ sinh tr ưở ng không tăng lên cùng vớ i sự tăng lên của nồng độ chất dinh dưỡ ng.

Hình 14.2: N ồng độ chấ t dinh d ưỡ ng và sinh tr ưở ng

(a )- Ả nh hưở ng của sự hạn chế chấ t dinh d ưỡ ng đố i vớ i sản l ượ ng chung của vi sinh

vật. Lúc nồng độ đủ cao thì sản l ượ ng chung sẽ đạt t ớ i ổ n định.(b)- Ả nh hưở ng của sự hạn chế chấ t dinh d ưỡ ng t ớ i t ố c độ sinh tr ưở ng.

Giai đoạn Ổn định (Stationary Phase) hay Pha Cân bằng

Qua giai đoạn Logarit sự sinh tr ưở ng của quần thể cuối cùng sẽ dừng lại, đườ ng congsinh tr ưở ng đi ngang (hình 14.1). Nồng độ vi khuẩn trong giai đoạn ổn định thườ ng vàokhoảng 109/ml. Vớ i các vi sinh vật khác thườ ng không đạt đượ c đến nồng độ này. Vớ iđộng vật nguyên sinh và vi tảo thườ ng chỉ đạt đến nồng độ 10 6/ml. Đươ ng nhiên, số lượ ng tế bào cuối cùng quyết định bở i ảnh hưở ng chung của điều kiện dinh đưỡ ng,

chủng loại vi sinh vật và các nhân tố khác. Trong giai đoạn này số lượ ng tế bào sống làkhông thay đổi, có thể do số lượ ng tế bào mớ i sinh ra cân bằng vớ i số lượ ng tế bào chếtđi, hoặc là tế bào ngừng phân cắt mà vẫn giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất.

Có nhiều nguyên nhân làm cho quần thể vi sinh vật chuyển sang giai đoạn ổn định.Trong đó nguyên nhân chủ yếu là sự hạn chế của chất dinh dưỡ ng. Nếu một chất dinhdưỡ ng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm tr ọng thì sự sinh tr ưở ng sẽ chậm lại. Vi sinh vậthiếu khí thườ ng bị hạn chế bở i nồng độ oxygen. Oxygen thườ ng hòa tan ít trong nướ c,


6/75

34

O2 trong nội bộ môi tr ườ ng r ất nhanh chóng bị tiêu thụ hết, chỉ có các vi sinh vật sinhtr ưở ng ở bề mặt môi tr ườ ng mớ i có đủ nồng độ O2 để sinh tr ưở ng. Vì vậy khi nuôi cấyvi sinh vật phải sử dụng tớ i máy lắc hay các biện pháp thông khí khác. Quần thể vi sinhvật cũng có thể bị đình chỉ sinh tr ưở ng khi gặ p sự tích lũy của các sản phẩm trao đổichất có hại. Một số vi sinh vật k ỵ khí (như Streptococcus) có thể lên men đườ ng làm sản

sinh một lượ ng lớ n acid lactic hay các acid hữu cơ khác, làm acid hóa môi tr ườ ng và ứcchế sự sinh tr ưở ng của vi sinh vật. Đồng thờ i sự tiêu hao hết đườ ng cũng làm cho tế bàođi vào giai đoạn ổn định. Sau nữa là, một số chứng cứ cho thấy khi số lượ ng vi sinh vậtđạt đến một giớ i hạn nhất định thì sự sinh tr ưở ng có thể bị đình chỉ. Sự sinh tr ưở ng củavi sinh vật chuyển sang giai đoạn ổn định có thể do k ết quả chung của r ất nhiều nhân tố khác nhau

Như chúng ta.đã thấy vi khuẩn khi nuôi cấy theo mẻ sẽ chuyển sang giai đoạn ổn địnhkhi thiếu thức ăn. Trong tự nhiên, do nhiều môi tr ườ ng có nồng độ chấ dinh dưỡ ng r ấtthấ p nên vi sinh vật thườ ng chuyển sang giai đoạn ổn định. Đối vớ i vi khuẩn việc

chuyển sang giai đoạn ổn định có thể là một loại thích ứng tốt. Nhiều loại vi khuẩnkhông có sự biến hóa rõ r ệt về hình thái (như hình thành bào tử nội sinh-endospore)nhưng chúng có thể thu nhỏ kích thướ c lại, thườ ng do chất nguyên sinh co lại và nhângiả (nucleoid) đậm đặc lại. Một biến đổi quan tr ọng hơ n là, khi thiếu thức ăn vi khuẩn sẽ sinh ra một loại protein đói ( starvation proteins) làm cho tế bào đề kháng nhiều hơ n vớ icác thươ ng tổn bằng nhiều con đườ ng khác nhau. Chúng làm tăng các liên k ết

peptidoglycan và sự bền vững của thành tế bào. Chẳng hạn Dps (D NA-binding proteinfrom starved cells), một loại protein k ết hợ p vớ i ADN lấy từ các tế bào đói, có thể bảovệ cho ADN. Phân tử Chaperones cản tr ở sự biến tính của protein và hồi phục lại đượ ccác protein bị tổn thươ ng. Vì những việc đó và nhiều cơ chế khác mà các tế bào đói cóthể khó bị chết đi và đề kháng đượ c vớ i tình tr ạng bị đói, vớ i sự biến hóa của nhiệt độ,sự tổn thươ ng về ôxy hóa và sự thẩm thấu, cũng như tăng sức đề kháng vớ i các hóa chấtcó hại (như chlorine chẳng hạn). Những cải biến này r ất có hiệu quả và làm cho một số vi khuẩn có thể sống lại sau vài năm bị đói. Rõ ràng việc hiểu rõ những vấn đề này sẽ cótầm quan tr ọng thực tiễn to lớ n đối vớ i y học và vi sinh vật học công nghiệ p. Chúng còncó thể chứng minh vi khuẩn thươ ng hàn (Salmonella typhimurium) và nhiều vi khuẩngây bệnh khác có thể có khả năng gây bệnh mạnh hơ n khi bị đói.

Giai đoạn tử vong (Death Phase)

Việc tiêu hao chất dinh dưỡ ng và việc tích lũy các chất thải độc hại sẽ làm tổn thất đến

môi tr ườ ng sống của vi sinh vật, làm cho số lượ ng tế bào sống giảm xuống. Đó là đặcđiểm của giai đoạn tử vong. Giống như giai đoạn logarit, sự tử vong của quần thể vi sinhvật cũng có tính logarit (tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không đổi). Tổng số tế bàosống và tế bào chết không thay đổi vì các tế bào chết chưa bị phân hủy. Muốn xác địnhsố lượ ng tế bào sống phải pha loãng ra r ồi cấy lên thạch đĩ a và đưa vào điều kiện thíchhợ p để xác định số khuẩn lạc xuất hiện. Mặc dầu phần lớ n vi sinh vật tử vong theo

phươ ng thức logarit nhưng sau khi số lượ ng tế bào đột nhiên giảm xuống thì tốc độ chết


7/75

35

của tế bào chậm lại. Đó là do một số cá thể sống lại nhờ có tính đề kháng đặc biệt mạnh.Vì điều này và những nguyên nhân khác làm cho đườ ng cong của giai đoạn tử vong cóthể khá phức tạ p.

Tính toán về quá trình sinh trưở ng

Không ít các nhà vi sinh vật học đã tính toán về tốc độ sinh tr ưở ng của vi sinh vật tronggiai đoạn logarit. Tính toán nhị p độ sinh tr ưở ng sẽ làm cơ sở cho các nghiên cứu về sinhlý học, sinh thái học vi sinh vật, và còn để giải quyết một số vấn đề ứng dụng trong sảnxuất công nghiệ p.

Trong giai đoạn logarit mỗi cá thể vi sinh vật tiến hành phân cắt trong một thờ i gianhằng định. Số lượ ng tế bào tăng theo phươ ng thức 2n. Thờ i gian giữa hai lần phân chialiên tiế p hay thờ i gian cần cho sự tăng đôi số tế bào đượ c gọi là thờ i gian thế hệ ( generation time hay doubling time). Ví dụ đưa một tế bào vào môi tr ườ ng nuôi cấy, cứ

20 phút phân cắt một lần thì sau 20 phút có 2 tế bào, sau 40 phút có 4 tế bào và tiế p tụcnhư vậy (bảng 14.1)

Bảng 14.1: M ột ví d ụ về sinh tr ưở ng theo logarit

Thờ i gian* Số lần phân cắt 2n Số lượ ng (N0 x 2n) lg10 Nt

0 0 20=1 1 0,00020 1 21=2 2 0,30140 2 22=4 4 0,60260 3 23=8 8 0,903

80 4 24

=16 16 1,204100 5 25=32 32 1,505120 6 26=64 64 1,806

*Thờ i gian thế hệ là 20 phút, giả thiế t là nuôi cấ y t ừ 1 t ế bào

Số lượ ng logarit tế bào là 2n, n là số thế hệ. Có thể biểu thị các số liệu trong bảng 14.1 bằng công thức sau đây:

Trong đó: N0 là số lượ ng tế bào ban đầu; Nt là số lượ ng tế bào ở thờ i gian t; n là số thế hệ.

Từ công thức trên có thể biến đổi như sau và số thế hệ n đượ c tính bằng logarit thậ p phân:


8/75

36

Khi nuôi cấy phân mẻ (batch culture) tốc độ sinh tr ưở ng trong giai đoạn logarit có thể biểu thị bằng hằng số tốc độ sinh tr ưở ng bình quân k (mean growth rate constant k). Đólà số thế hệ sinh ra trong đơ n vị thờ i gian, thườ ng biểu thị bằng số thế hệ trong 1 giờ :

Thờ i gian cần thiết để tăng gấ p đôi tổng số tế bào là thờ i gian thế hệ bình quân (meangeneration time) hay thờ i gian tăn gấ p đôi bình quân (mean doubling time) và đượ c biểuthị bằng g. Nếu t=g thì N t= 2N0. Thay vào công thức trên ta có:

Thờ i gian thế hệ bình quân là đảo số của hằng số tốc độ sinh tr ưở ng bình quân:

Thờ i gian thế hệ bình quân g có thể căn cứ tr ực tiế p vào đồ thị bán logarit

(semilogarithmic plot) và hằng số tốc độ sinh tr ưở ng để tính ra (hình 14.4). Ví dụ ,số lượ ng vi khuẩn tại giờ thứ 10 là từ 103 tăng lên đến 109 thì :

(thế hệ/h)

giờ /thế hệ hay 30 phút/thế hệ


9/75

37

Hình 14.3: Sinh tr ưở ng thế hệ của vi sinh vật(biể u thị 6 thế hệ )

(Theo sách của Prescott,Harley và Klein).

Hình 14.4; Xác định thờ i gian thế hệ.

Thờ i gian thế hệ có thể xác định bằ ngđườ ng cong sinh tr ưở ng của vi sinh vật. Lấ y thờ i gian là tr ục hoành và l ấ y số l ượ ng t ế bào làm tr ục tung. Thờ i gian

t ăng g ấ p đ ôi số l ượ ng của quần thể (thờ i gian thế hệ ) có thể đọc tr ự c tiế p trên đồ

thị

Thờ i gian thế hệ thay đổi tùy theo chủng loại vi sinh vật, điều kiện nuôi cấy. Một số vikhuẩn thờ i gian thế hệ không quá 10 phút (0,17h) trong khi ở một số vi sinh vật nhânthực (eucaryotic) lại dài tớ i vài ngày (Bảng 14.2). Thờ i gian thế hệ trong tự nhiênthườ ng là dài hơ n so vớ i khi nuôi cấy.

Bảng 14.2: Thờ i gian thế hệ của một số loài vi sinh vật

Vi sinh vật Nhiệt độ (0C) Thờ i gian thế hệ (giờ )

Vi khuẩn và Vi khuẩn lam

Beneckea natriegens 37 0,16

Escherichia coli 40 0,35

Bacillus subtilis 40 0,43

Staphylococcus aureus 37 0,47


10/75

38

Pseudomonas aeruginossa 37 0,58

Clostridium botulinum 37 0,58

Rhodospirillum rubrum 25 4,6-5,3

Anabaena cylindrica 25 10,6Mycobacterium tuberculosis 37 Khoảng 12

Treponema pallidum 37 33

Tảo

Scenedesmus quadricauda 25 5,9

Chlorella pyrenoidosa 25 7,75

Asterionella formosa 20 9,6

Euglena gracilis25 10,9

Ceratium tripos 20 82,8

Động vật nguyên sinh

Tetrahymena geleii 24 2,2-4,2

Leishmania donovani 26 10-12

Paramecium caudatum 26 10,4

Acanthamoeba castellanii 30 11-12

Giardia lamblia37 18

Nấm

Saccharomyces cerevisiae 30 2

Monilinia fructicola 25 30

XÁC ĐỊNH SỰ SINH TR ƯỞ NG CỦA VI SINH VẬT

Có nhiều cách thông qua việc xác định sự biến đổi số lượ ng và chất lượ ng vi sinh vật để hiểu đượ c sự sinh tr ưở ng của vi sinh vật, biết đượ c tốc độ sinh tr ưở ng và thờ i gian thế hệ. Dướ i đây sẽ giớ i thiệu các phươ ng pháp thườ ng dùng nhất cùng các ưu, khuyết điểmcủa các phươ ng pháp này. Không có phươ ng pháp nào là tốt nhất, lựa chọn phươ ng phápnào còn phụ thuộc vào từng tr ườ ng hợ p cụ thể.

Xác định số lượ ng tế bào

Phươ ng pháp đơ n giản nhất để xác định số lượ ng tế bào là đếm tr ực tiế p dướ i kính hiểnvi. Dùng các phòng đếm để đếm vừa nhanh chóng, dễ dàng, lại r ẻ tiền nhất, lại có thể


11/75

39

quan sát thấy kích cỡ và hình dáng tế bào. Thườ ng dùng phòng đếm Petroff-Hausser để đếm tế bào động vật nguyên sinh. Dùng phòng đếm hồng cầu có thể đếm đượ c các tế

bào nhân nguyên thủy cũng như tế bào nhân thật. Vớ i tế bào nhân nguyên thủy cầnnhuộm màu hoặc là dùng kính hiển vi tươ ng phản pha hay kính hiển vi huỳnh quang(phase-constrast or fluoresence microscope) để dễ quan sát hơ n. Phòng đếm có cấu trúc

để có một độ sâu nhất định lại có chia ra thành các ô nhỏ (hình 14.5). Khi đếm số lượ ngta đưa dịch pha loãng vào phòng đếm, đậy lá kính (lamelle/ cover glass) lên trên, sau đótiến hành đếm số lượ ng dướ i kính hiển vi. Khuyết điểm của phươ ng pháp này là khôngxác định đượ c vớ i các mẫu có số lượ ng vi khuẩn quá nhỏ, độ chính xác cũng không caovì không phân biệt đượ c giữa tế bào sống và tế bào chết.

Hình 14.5: Phòng đế m Petroff-Hauser:

(a)- M ặt nhìn nghiêng của phòng đế m- Phòng đế m chứ a d ịch huyề n phù vi khuẩ n làkhoảng không gian bên d ướ i lá kính; (b)- Giữ a phiế n kính có phòng đế m vớ i các ô nhỏ;(c) Ở độ phóng đại khoảng x 400-500 tiế n hành đế m số l ượ ng vi khuẩ n trong các ô nhỏ. Lấ y số l ượ ng bình quân để tính ra mật độ vi khuẩ n trong mẫ u vật. Trong phạm vi 1mm2

có 225 ô nhỏ , do đ ó số l ượ ng vi khuẩ n trên 1mm2 là (số vi khuẩ n/mm) x 25; vì phòngđế m có chiề u d ầ y là 0,02mm do đ ó nồng độ vi khuẩ n trong phòng đế m là: (số vikhuẩ n)/m2 x 25 (t ổ ng số ô nhỏ ) x 50= số vi khuẩ n/mm 3.

Vì 1 cm3=1 mm3 x 103cho nên giả thử số l ượ ng vi khuẩ n bình quân trong mỗ i ô nhỏ là

28 thì trong 1 cm3

có nồng độ vi khuẩ n là 28 x 25 x 50 x103

= 3,5 x 107

vi khuẩ n. Nhânvớ i độ pha loãng ban đầu (nế u có) sẽ biế t đượ c nồng độ vi khuẩ n trong mẫ u kiể m tra.

Vớ i động vật nguyên sinh, vi tảo và nấm men có thể dùng máy đếm điện tử như loạimáy Coulter Counter để xác định số lượ ng. Nguyên lý là hai bên mỗi lỗ nhỏ có điện cựcvà nối điện. Khi tế bào trong dịch huyền phù đi qua lỗ nhỏ thì cứ mỗi tế bào đi qua thì


12/75

40

điện tr ở lại tăng lên (hoặc tính dẫn điện giảm xuống) và sinh ra một tín hiệu điện, máyđếm sẽ tự động ghi số. K ết quả xác định của loại máy này khá chính xác, có thể ứngdụng r ộng rãi để xác định số lượ ng hồng cầu và bạch cầu, nhưng phươ ng pháp nàykhông thích hợ p xác định số lượ ng vi khuẩn vì dễ bị can thiệ p bờ i các hạt nhỏ và các vậtchất dạng sợ i trong mẫu vật.

Cả hai phươ ng pháp nói trên đều không phân biệt đượ c tế bào sống và tế bào chết. Để xác định số lượ ng tế bào sống ngườ i ta thườ ng dùng phươ ng pháp cấy dịch pha loãnglên bề mặt môi tr ườ ng thạch đĩ a. Sau khi nuôi cấy mỗi vi khuẩn sẽ tạo thành 1 khuẩnlạc. Ví dụ ở độ pha loãng 1 x 10-6 đếm đượ c 150 khuẩn lạc thì có ngh ĩ a là mật độ vikhuẩn trong mẫu là 1,5 x 108.

Dùng dụng cụ đếm khuẩn lạc càng thêm thuận tiện. Phươ ng pháp này cho biết số lượ ngcác tế bào sống của vi sinh vật. Phươ ng pháp này đơ n giản, nhạy cảm và thích hợ p ứngdụng r ộng rãi để xác định số lượ ng vi sinh vật sống khi phân tích các mẫu thực phẩm,

nướ c, đất...Tuy nhiên k ết quả cũng chịu ảnh hưở ng của một số nhân tố. Nếu vi khuẩndính thành khối không tách r ờ i nhau ra thì k ết quả thu đượ c là thấ p hơ n thực tế., vì mỗikhuẩn lạc không phát triển từ một tế bào riêng r ẽ. Vì vậy k ết quả thu đượ c từ phươ ng

pháp này đượ c coi là số đơ n vị hình thành khuẩn lạc (CFU-colony forming unit). CFUkhông hoàn toàn phù hợ p vớ i số tế bào sống trong mẫu vật. Trong quá trình sử dụng

phươ ng pháp này nên sử dụng độ pha loãng nào cho số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩ a chỉ nằm trong phạm vi khoảng 30-300 mà thôi. Đươ ng nhiên môi tr ườ ng dinh dưỡ ng khôngthể đáp ứng chung cho mọi loại vi sinh vật, do đó k ết quả thu đượ c bao giờ cũng thấ phơ n thực tế. Khi tr ộn thạch vớ i dịch pha loãng thì thạch đã đủ nguội để không làm chếtvi khuẩn hay làm thươ ng tổn vớ i một số loại mẫn cảm vớ i nhiệt độ . Việc cấy cấy dịch

pha loãng trên bề mặt r ồi dàn đều bằng que gạt thủy tinh thườ ng cho k ết quả cao hơ n về số lượ ng vi sinh vật so vớ i phươ ng pháp tr ộn vớ i môi tr ườ ng thạch chưa đông.


13/75

41

Hình 14.6: Tách khuẩ n l ạc và phươ ng pháp kiể m tra số l ượ ng vi sinh vật thông qua đế mkhuẩ n l ạc mọc trên môi tr ườ ng thạch đĩ a.

(a) (b)- Cách ria cấ y để tách khuẩ n l ạc riêng r ẽ (không dùng để đế m số l ượ ng) (c)(d)-Cách pha loảng r ồi tr ộn vớ i môi tr ườ ng thạch chư a đ ông

(e)(f)- Cách dàn d ịch pha loãng bằ ng que g ạt trên mặt thạch (cho số l ượ ng khuẩ n l ạcnhiề u hơ n).Theo sách của K.P.Talaro,2005.

Để xác định số lượ ng vi sinh vật còn có thể nuôi cấy giấy lọc đã lọc dịch pha loãng mẫuvật. Phươ ng pháp này gọi là phươ ng pháp màng lọc (membrane filter). Dùng một thiết

bị lọc đặc biệt đặt vừa một giấy lọc hình tròn có các lỗ nhỏ hơ n kích thướ c vi khuẩn vàcác vi sinh vật khác. Sau khi lọc đặt giấy lọc lên môi tr ườ ng thạch thích hợ p hoặc thấmướ t màng lọc bằng dịch môi tr ườ ng thích hợ p r ồi để nuôi cấy 24 giờ . Đếm số khuẩn lạcmọc trên giấy lọc để tính ra mật độ vi khuẩn sống có mặt trong mẫu vật (hình 14.7)


14/75

42

Hình 14.7: Phươ ng pháp l ọc màng để xác định số l ượ ng vi sinh vật

Phươ ng pháp này thích hợ p để sử dụng phân tích vi sinh vật trong nướ c. Có thể dùngcác môi tr ườ ng khác nhau thích hợ p vớ i các nhóm vi sinh vật khác nhau (hình 14.8)

Hình 14.8: Các loại khuẩ n l ạc mọc trên màng l ọc.Theo sách của Prescott,Harley và Klein (2005)

(a)- T ổ ng số vi khuẩ n mọc trên môi tr ườ ng tiêu chuẩ n, Dùng chỉ thị màu để nhuộm đỏ khuẩ n l ạc cho d ễ đ iế m;

(b)- Dùng môi tr ườ ng thích hợ p để kiể m tra nhóm vi khuẩ n coliform có nguồn g ố c t ừ phân (khuẩ n l ạc bắ t màu xanh);

(c)- Dùng môi tr ườ ng thạch m-Endo để xác định vi khuẩ n E.coli và các Coliform khác-khuẩ n l ạc có màu l ục;

(d)- N ắ m sợ i và nấ m men mọc trên môi tr ườ ng Thạch - M ạch nha.


15/75

43

Phươ ng pháp màng lọc còn dùng để đếm tr ực tiế p vi khuẩn. Dịch mẫu vật đượ c lọc quamột màng polycarbonate màu đen. Vi khuẩn trên màng lọc đượ c nhuộm màu huỳnhquang bằng thuốc nhuộm acridine da cam hoặc DAPI (diamidino-2-phenylindole). Quansát dướ i kính hiển vi huỳnh quang có thể thấy các tế bào vi sinh vật hiện lên màu da camhay màu lục trên một nền đen. Hiện đã có những kit thươ ng mại cho phép phân biệt tế

bào sống và tế bào chết khi kiểm tra.

Xác định khối lượ ng tế bào

Sự sinh tr ưở ng của vi sinh vật không chỉ biểu hiện ở số lượ ng tế bào mà còn ở cả sự tăng tr ưở ng của tổng khối lượ ng tế bào. Phươ ng pháp tr ực tiế p nhất là xác định tr ọnglượ ng khô của tế bào. Tr ướ c hết cần ly tâm để thu nhận sinh khối tế bào. Sau đó r ửa tế

bào r ồi làm khô trong lò sấy r ồi cân tr ọng lượ ng khô. Phươ ng pháp này thích hợ p để xácđịnh sự sinh tr ưở ng của nấm. Phươ ng pháp này tốn thờ i gian và không thật mẫn cảm.Đối vớ i vi khuẩn vì tr ọng lượ ng từng cá thể là r ất nhỏ, thậm chí phải ly tâm tớ i vài tr ăm

ml mớ i đủ số lượ ng để xác định tr ọng lượ ng sinh khối khô.Phươ ng pháp nhanh hơ n, mẫn cảm hơ n là dùng phươ ng pháp đo độ đục nhờ tán xạ ánhsáng. Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận vớ i nồng độ tế bào. Lúc nồng độ vi khuẩn đạtđến 107 tế bào/ml thì dịch nuôi cấy sẽ vẩn đục, nồng độ càng tăng thì độ đục cũng tăngtheo và làm cản tr ở ánh sáng đi qua dịch nuôi. Có thể đo độ tán xạ ánh sáng bằng quang

phổ k ế (spectrophotometer). Ở một mức độ hấ p thụ ánh sáng thấ p, giữa nồng độ tế bàovà giá tr ị hấ p thụ ánh sáng có quan hệ tuyến tính (hình 14.9). Chỉ cần nồng độ vi sinhvật đạt tớ i nồng độ có thể đo đượ c là đều có thể dùng phươ ng pháp đo độ đục trên quang

phổ k ế để xác định sự sinh tr ưở ng của vi sinh vật. Nếu hàm lượ ng một số vật chất trongmỗi tế bào là giống nhau thì tổng lượ ng chất đó trong tế bào có tươ ng quan tr ực tiế p vớ itổng sinh khối vi sinh vật. Chẳng hạn, thu tế bào trong một thể tích nhất định của dịchnuôi cấy, r ửa sạch đi r ồi đo tổng lượ ng protein hay tổng lượ ng nitrogen, có thể thấy sự tăng quần thể vi sinh vật là phù hợ p vớ i sự tăng tổng lượ ng protein (hay N). Cũng tươ ngtự như vậy, việc xác định tổng lượ ng chlorophyll có thể dùng đẻ đo sinh khối tảo; đohàm lượ ng ATP có thể biết đượ c sinh khối của các vi sinh vật sống.


16/75

44

Hình 14.9: Đo số l ượ ng vi sinh vật bằ ng phươ ng pháp đ o độ đục.

Thông qua việc đo độ hấ p thụ ánh sáng có thể xác định đượ c sinh khối vi sinh vật.Khi số lượ ng tế bào tăng lên sẽ dẫn đến việc tăng độ đục, mức độ tán xạ ánh sáng nhiềuhơ n và quang phổ k ế sẽ đo đượ c mức độ tăng lên của tr ị số hấ p thụ ánh sáng. Trênquang phổ k ế có hai thang chia độ: phía dướ i là tr ị số hấ p thụ ánh sáng, phía trên là mứcđộ thấu quang. Khi tr ị số hấ p thụ ánh sáng tăng lên thì mức độ thấu quang hạ xuống


17/75

45

5.2. Lên men liên tục

Các phươ ng pháp nuôi cấy liên tục có thể là:

- Phươ ng pháp đơ n cấ p: nuôi vi sinh vật trong một nồi lên men, môi tr ườ ng dinhdưỡ ng đượ c bổ sung cũng như môi tr ườ ng đã lên men rút ra khỏi nồi lên men một cách

liên tục vớ i cùng một tốc độ. Phươ ng pháp này đơ n giản, dễ ứng dụng vào sản xuất đốivớ i tế bào nấm men để thu sinh khối hoặc sản phẩm là các chất chuyển hoá gắn tr ực tiế pvớ i sự phát triển của tế bào.

- Phươ ng pháp nhiều cấ p: Vi sinh vật đượ c nuôi ở hệ thống nồi lên men đặt làmnhiều cấ p. Nồi thứ nhất đượ c dùng cho vi sinh vật phát triển tốt nhất, các nồi sau để cáctế bào tiết ra chất chuyển hoá. Môi tr ườ ng dinh dưỡ ng mớ i đượ c bổ sung vào nồi thứ nhất và từ đó lần lượ t chảy vào nồi tiế p theo.

Trong các hệ thống hở của phươ ng pháp nuôi liên tục thì nồi lên men thườ ng

xuyên đượ c cung cấ p thêm dung dịch dinh dưỡ ng mớ i, và cũng vớ i mức độ như vậy,môi tr ườ ng đã bị sử dụng một phần và các tế bào đã đượ c rút đi. Việc khuấy và thôngkhí nhằm tr ộn đều chất chứa trong nồi lên men (hệ thống đồng nhất). Nhờ vậy các tế

bào trong nồi lên men luôn luôn sinh tr ưở ng theo hàm số mũ và luôn luôn tồn tạitrong cùng những điều kiện sinh lí. Tuy nhiên, các tế bào đang phân chia và các tế

bào không phân chia cùng tồn tại vì không có sự sinh sản đồng bộ.

Hệ thống liên tục đượ c điều khiển bở i các yếu tố hoá học chemostas. Khi chuyểntừ tr ạng thái này sang tr ạng thái khác thì tr ạng thái cân bằng mớ i đạt đượ c sau một

thờ i gian. Nhờ việc tăng tốc độ dòng vào mà sinh tr ưở ng có thể đượ c tăng gần tốc độ cực đại. Tốc độ pha loãng (D) và tốc độ sinh tr ưở ng (μ) là bằng nhau trong phạm vi

của tốc độ pha loãng tiêu chuẩn.

Các hệ thống liên tục có ý ngh ĩ a công nghiệ p. Đặc điểm của những hệ thống nàylà ở chỗ, các tế bào ở lại trong hệ thống hoặc đưa tr ở lại đó, trong khi môi tr ườ ngchảy đi không ngừng. Vì các tế bào chỉ hoạt động trong một thờ i gian nhất định nênsau một thờ i gian nào đó cần phải thay thế hoặc bổ sung chúng. Thực chất thì hệ thống này là sự kéo dài pha cân bằng của sự nuôi gián đoạn nhờ việc đưa cơ chất vàomột cách liên tục. Các tế bào, hoặc đượ c giữ lại trong hệ thống như tr ườ ng hợ p của vi

khuẩn acetic sinh tr ưở ng trên vỏ bào gỗ của phươ ng pháp lên men nhanh, hoặc đượ ctách ra và đưa tr ở lại như trong sản xuất bia r ượ u. Trong việc làm sạch nướ c thải, cácđám vi khuẩn cũng bị giữ lại trong các bể bùn sống. Một kiểu khác là cho dòng dungdịch dinh dưỡ ng chảy vào những váng nấm. Đó là kiểu nuôi nổi của hệ thống liên tụckín. Ở quy mô phòng thí nghiệm, các hệ thống đượ c kiểm tra, trong đó tế bào và cơ chất đượ c tách riêng bằng các màng hoặc dụng cụ lọc (nồi lên men - màng).


18/75

46

Hiện nay việc nuôi liên tục đượ c ứng dụng nhiều trong công nghiệ p để sản xuấtsinh khối và các sản phẩm lên men. Việc sản xuất các chất trao đổi bậc một và bậchai cũng như các enzyme thườ ng đượ c tiến hành theo cách không liên tục.

Ư u điểm của phươ ng pháp nuôi cấy liên tục:

- Giảm bớ t thờ i gian làm vệ sinh thiết bị, khử khuẩn và làm nguội.- Giảm bớ t thể tích của toàn bộ thiết bị.

- Lao động dễ dàng và có khả năng tự động hoá các thao tác.

- Tăng hiệu suất của toàn bộ quá trình công nghệ nhờ chọn lọc tốt nhất các điều kiệnthao tác.

Nhượ c điểm:

- Đòi hỏi cán bộ và công nhân thành thạo chuyên môn. Khi hoạt động, cùng một lúc phải có đủ các dạng năng lượ ng cần thiết, giá thành cao đối vớ i tự động hoá và dụng cụ đo lườ ng hiện đại.

- Trong quá trình nuôi cấy tế bào vi sinh vật có thể có những đột biến bất ngờ xảy ralàm hỏng cả quá trình.

- Phải vô khuẩn tuyệt đối trong toàn bộ thờ i gian thao tác. Vì trong quá trình nuôiliên tục đã tạo ra các điều kiện tối ưu cho chủng nuôi cấy thì cũng tối ưu đối vớ i nhiềuloài tạ p khuẩn.

- Đối vớ i các vi sinh vật sinh hệ sợ i như nấm mốc và xạ khuẩn r ất khó tách hệ sợ imột cách vô khuẩn và đặc biệt là hiệu suất chuyển hoá thườ ng thấ p hơ n so vớ i nuôi cấytừng mẻ vớ i những chủng sản ra chất chuyển hoá không gắn vớ i sự phát triển.

Hiện nay việc nuôi liên tục đượ c ứng dụng nhiều trong công nghiệ p để sản xuất sinhkhối và các sản phẩm lên men. Việc sản xuất các chất trao đổi bậc một và bậc hai cũngnhư các enzyme thườ ng đượ c tiến hành theo cách không liên tục.

Ư u điểm của phươ ng pháp nuôi cấy liên tục:

- Giảm bớ t thờ i gian làm vệ sinh thiết bị, khử khuẩn và làm nguội.

- Giảm bớ t thể tích của toàn bộ thiết bị.

- Lao động dễ dàng và có khả năng tự động hoá các thao tác.- Tăng hiệu suất của toàn bộ quá trình công nghệ nhờ chọn lọc tốt nhất các điều kiện

thao tác.

Nhượ c điểm:


19/75

47

- Đòi hỏi cán bộ và công nhân thành thạo chuyên môn. Khi hoạt động, cùng một lúc phải có đủ các dạng năng lượ ng cần thiết, giá thành cao đối vớ i tự động hoá và dụngcụ đo lườ ng hiện đại.

- Trong quá trình nuôi cấy tế bào vi sinh vật có thể có những đột biến bất ngờ xảy ra

làm hỏng cả quá trình.- Phải vô khuẩn tuyệt đối trong toàn bộ thờ i gian thao tác. Vì trong quá trình nuôi

liên tục đã tạo ra các điều kiện tối ưu cho chủng nuôi cấy thì cũng tối ưu đối vớ i nhiềuloài tạ p khuẩn.

- Đối vớ i các vi sinh vật sinh hệ sợ i như nấm mốc và xạ khuẩn r ất khó tách hệ sợ imột cách vô khuẩn và đặc biệt là hiệu suất chuyển hoá thườ ng thấ p hơ n so vớ i nuôi cấytừng mẻ vớ i những chủng sản ra chất chuyển hoá không gắn vớ i sự phát triển.

Trong các phần trên chúng ta xem xét vi

ệc nuôi c

ấy phân m

ẻ (batch cultures) trong các

hệ thống kín, tức là không có chuyện bổ sung chất dinh dưỡ ng, cũng không thải loại cácsản phẩm có hại sinh ra trong quá trinh sống. Giai đoạn logarit chỉ duy trì qua vài thế hệ sau đó chuyển vào giai đoạn ổn định. Nếu nuôi cấy vi sinh vật trong một hệ thống hở ,trong quá trình nuôi cấy thườ ng xuyên bổ sung chất dinh dưỡ ng và thải loại các chất cặn

bã thì có thể làm cho môi tr ườ ng luôn giữ ở tr ạng thái ổn định. Đó là hệ thống nuôi cấyliên tục (continuous culture system). Trong hệ thống này sự sinh tr ưở ng của vi sinh vậtluôn giữ đượ c ở tr ạng thái logarit, nồng độ sinh khối vi sinh vật luôn giữ đượ c ổn địnhtrong một thờ i gian tươ ng đối dài.

Giả thử ta có một bình nuôi cấy trong đó vi khuẩn đang sinh tr ưở ng, phát triển. Ta cho

chảy liên tục vào bình một môi tr ườ ng mớ i có thành phần không thay đổi. Thể tích bìnhnuôi cấy giữ ổn định. Dòng môi tr ườ ng đi vào bù đắ p cho dòng môi tr ườ ng đi ra vớ icùng một tốc độ. Ta gọi thể tích của bình là v (lit), tốc độ dòng môi tr ườ ng đi vào là f(lít/ giờ ). Tốc độ (hay Hệ số) pha loãng đượ c gọi là D (f/v). Đại lượ ng D biểu thị sự thayđổi thể tích sau 1 giờ . Nếu vi khuẩn không sinh tr ưở ng và phát triển thì chúng sẽ bị rútdần ra khỏi bình nuôi cấy theo tốc độ:

ν= d X /dt = D.X

X là sinh khối tế bào

Ngườ i ta thườ ng dùng hai loại thiết bị nể nuôi cấy liên tục vi sinh vât. Đó là Chemostatvà Turbidostat.

Chemostat

Khi sử dụng Chemostat để nuôi cấy vi sinh vật ngườ i ta đưa môi tr ườ ng vô khuẩn vào bình nuôi cấy vớ i lượ ng tươ ng đươ ng vớ i tốc độ đưa môi tr ườ ng chứa vi khuẩn ra khỏi


20/75

48

bình nuôi cấy (xem hình 14.10). Trong môi tr ườ ng một số chất dinh dưỡ ng thiết yếu (như một vài acid amin) cần khống chế nồng độ trong một phạm vi nhất định. Vì vậy tốcđộ sinh tr ưở ng của vi sinh vật trong hệ thống quyết định bở i tốc độ môi tr ườ ng mớ iđượ c đưa vào hệ thống và nồng độ tế bào phụ thuộc vào nồng độ các chất dinh dưỡ ngđượ c hạn chế. Nhị p độ đổi mớ i chất dinh dưỡ ng biểu thị bở i nhị p độ pha loãng D

(dilution rate). Tốc độ lưu thông của chất dinh dưỡ ng (ml/h) đượ c biểu thị bằng f và thể tích bình nuôi cấy là V (ml):

D= f/V

Chẳng hạn nếu f là 30ml/h và V là 100ml thì nhị p độ pha loãng D là 0,30h-1. Cả số lượ ng vi sinh vật và thờ i gian thế hệ đều có liên quan đến nhị p độ pha loãng (hình14.11). Trong một phạm vi nhị p độ pha loãng tươ ng đối r ộng thì mật độ vi sinh vậttrong hệ thống là không thay đổi.. Khi nhị p đọ pha loãng tăng lên, thờ i gian thế hệ hạ xuống (tốc độ sinh tr ưở ng tăng lên), khi đó chất dinh dưỡ ng hạn chế bị tiêu hao hết. Nếu

nhị p độ pha loãng quá cao thì vi sinh vật bị loại ra khỏi bình nuôi cấy tr ướ c khi k ị p sinhsôi nẩy nở bở i vì lúc đó nhị p độ pha loãng cao hơ n tốc độ sinh tr ưở ng của vi sinh vật. Nồng độ các chất dinh dưỡ ng hạn chế tăng lên khi nhị p độ pha loãng tăng cao vi có ít visinh vật sử dụng chúng.

Hình 14.10: Nuôi cấ y liên t ục trong Chemostat và Turbidostat

Hình14.11: H ệ thố ng nuôi cấ y liên t ục(Chemostat)

Khi nhị p độ pha loãng r ất thấ p thì nếu tăng nhị p độ pha loãng sẽ làm cho cả mật độ tế bào và tốc độ sinh tr ưở ng đều tăng lên. Đó là do hiệu ứng của nồng độ chất dinh dưỡ ngđối vớ i nhị p độ sinh tr ưở ng (growth rate). Quan hệ này có lúc đượ c gọi là quan hệ Monod (Monod relationship). Trong điều kiện nhị p độ pha loãng thấ p , chỉ có ít ỏi chấtdinh dưỡ ng đượ c cung cấ p thì tế bào phải dùng phần lớ n năng lượ ng để duy trì sự sốngchứ không dùng để sinh tr ưở ng, phát triển. Lúc nhị p độ pha loãng tăng lên, chất dinh


21/75

49

dưỡ ng tăng lên, tế bào có nhiều năng lượ ng đượ c cung cấ p, không những để duy trì sự sống mà còn có thể dùng để sinh tr ưở ng, phát triển, làm tăng cao mật độ tế bào. Nóicách khác, khi tế bào có thể sử dụng năng lượ ng vượ t quá năng lượ ng duy trì(maintenance energy) thì nhị p độ sinh tr ưở ng sẽ bắt đầu tăng lên.

Hình 14.12: T ỷ l ệ pha loãng trong chemostat và sinh tr ưở ng của vi sinh vật

5.1.4. Thi ế t b ị nuôi cấ y vi sinh vật trên môi tr ườ ng l ỏng

Nuôi cấy vi sinh vật để sản xuất các sản phẩm của các chất hoạt hoá sinh học là quátrình tinh vi và phức tạ p nhất để thu nhận các sản phẩm tổng hợ p vi sinh. Tổng hợ p sinh

học các chất hoạt hoá sinh học do vi sinh vật tạo ra phụ thuộc vào một số yếu tố như nhiệt độ, pH của môi tr ườ ng và canh tr ườ ng phát triển, nồng độ hoà tan, thờ i gian nuôicấy, k ết cấu và vật liệu thiết bị.

Phụ thuộc vào các phươ ng pháp ứng dụng để đánh giá hoạt động thiết bị lên mendùng để cấy chìm vi sinh vật và đượ c chia ra một số nhóm theo các dấu hiệu sau:

Theo phươ ng pháp nuôi cấy - các thiết bị hoạt động liên tục và gián đoạn.

Theo độ tiệt trùng - các thiết bị kín và các thiết bị không đòi hỏi độ kín nghiêmngặt.

Theo k ết cấu - các thiết bị lên men có bộ khuếch tán và tuabin, có máy thông giódạng quay, có bộ đảo tr ộn cơ học, có vòng tuần hoàn bên ngoài; các thiết bị lên mendạng tháp, có hệ thông gió kiểu phun.

Theo phươ ng pháp cung cấ p năng lượ ng và tổ chức khuấy tr ộn, thông gió các thiết bị cung cấ p năng lượ ng cho pha khí, pha lỏng và pha tổng hợ p.

Trong công nghiệ p vi sinh thực tế hầu như tất cả các quá trình nuôi cấy sản xuất ra


22/75

50

các chất hoạt hoá sinh học đượ c tiến hành bằng phươ ng pháp gián đoạn trong các điềukiện tiệt trùng.

Các thiết bị lên men nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện tiệt trùng

Nuôi cấy các vi sinh vật phần lớ n đượ c tiến hành trong các điều kiện tiệt trùng. Độ tiệt trùng của quá trình đượ c đảm bảo bằng phươ ng pháp tiệt trùng thiết bị lên men, cácđườ ng ống dẫn, cảm biến dụng cụ; nạ p môi tr ườ ng dinh dưỡ ng tiệt trùng và giống cấythuần chuẩn vào thiết bị lên men đã đượ c tiệt trùng; không khí tiệt trùng để thông giócanh tr ườ ng và chất khử bọt tiệt trùng; các dụng cụ cảm biến tiệt trùng trong thiết bị lênmên để kiểm tra và điều chỉn các thông số của quá trình ; bảo vệ đệm kín tr ục của bộchuyển đảo, các đườ ng ống công nghệ và phụ tùng quá trình nuôi cấy

4.1.4.1. Thiế t bị lên men cóbộđảo tr ộn cơ học d ạng sủi bọt

Dạng thiết bị lên men này đượ c sử dụng r ộng rãi cho các quá trình tiệt trùng để nuôi cấy vi sinh vật - sản sinh ra các chất hoạt hoá sinh học.

Thiết bị lên men có thể tích 63 m3. Dạng thiết bị lên men này là một xilanh đứng đượ c chế tạo bằng thép X18H10T hay kim loại kép có nắ p và đáy hình nón (hình 7). Tỷ lệ chiều cao và đườ ng kính bằng 2,6:1. Trên nắ p có bộ dẫn động cho cơ cấu chuyển đảovà cho khử bọt bằng cơ học; ống nối để nạ p môi tr ườ ng dinh dưỡ ng, vật liệu cấy, chấtkhử bọt, nạ p và thải không khí; các cửa quan sát; cửa để đưa vòi r ửa; van bảo hiểm vàcác khớ p nối để cắm các dụng cụ kiểm tra.

Khớ p xả 16 ở đáy của thiết bị dùng để tháo canh tr ườ ng. Bên trong có tr ục 6 xuyênsuốt. Các cơ cấu chuyển đảo đượ c gắn chặt trên tr ục. Cơ cấu chuyển đảo gồm có cáctuabin 8 có đườ ng kính 600 ÷1000 mm vớ i các cánh r ộng 150 ÷ 200 mm đượ c địnhvị ở 2 tầng, còn tuabin hở thứ ba đượ c gắn chặt trên bộ sủi bọt 13 để phân tán các bọtkhông khí. Bộ sủi bọt có dạng hình thoi đượ c làm bằng những ống đột lỗ. Ở phần trêncủa bộ sủi bọt có khoảng 2000 ÷ 3000 lỗ theo kiểu bàn cờ .


23/75

51

Hình 7. Thiế t bị lên men vớ i bộ đảo tr ộn cơ học d ạng sủi bọt có sứ c chứ a 63 m3:

1- Động cơ ; 2- H ộ p giảm t ố c; 3- Khớ p nố i; 4- Ổbi; 5- Vòng bít kín; 6- Tr ục;7- Thành thiế t bị ; 8- Máy khuấ y tr ộn tuabin; 9- Bộtrao đổ i nhiệt kiể u ố ng xoắ n;10- Khớ p nố i; 11- Ống nạ p không khí; 12- Máy tr ộn kiể u cánh quạt; 13- Bộ sủi

bọt; 14- Máy khuấ y d ạng vít; 15- Ổđỡ ; 16- Khớ p để tháo; 17- Ao; 18- Khớ p nạ pliệu; 19- Khớ p nạ p không khí

Động cơ - bộ truyền động làm quay tr ục 6 vàcác cơ cấu đảo tr ộn 8, 12, 14. Sử dụng bộ giảm tốc và bộ dẫn động có dòng điện không đổi để điều chỉnh vô cấ p số vòng quaytrong giớ i hạn 110 ÷ 200 vòng/ phút.

Thiết bị lên men đượ c trang bị áo 17, gồm từ 6 ÷ 8 ô. Mỗi ô có 8 rãnh đượ c chế tạo


24/75

52

bằng thép góc có kích thướ c 120×60 mm. Diện tích làm việc của áo 60 m2. Bề mặt làmviệc bên trong 45 m2 gồm ống xoắn 9 có đườ ng kính 600 mm vớ i số vít 23 khi tổngchiều cao của ruột xoắn 2,4 m.

Thiết bị lên men đượ c tính toán để hoạt động dướ i áp suất dư 0,25 MPa và để tiệt

trùng ở nhiệt độ 130 ÷ 1400C, cũng như để hoạt động dướ i chân không. Trong quá trìnhnuôi cấy vi sinh vật, áp suất bên trong thiết bị 50 kPa; tiêu hao không khí tiệt trùng đến1 m3/(m3/phút). Chiều cao cột chất lỏng trong thiết bị 5 ÷ 6 m khi chiều cao của thiết bị hơ n 8 m.

Để tiện lợ i cho việc thao tác và tránh những sai lầm cần dán vào thiết bị sơ đồ chỉ dẫn thao tác (hình 10.2).

Để đảm bảo tiệt trùng trong suốt quá trình (giữ đượ c hơ i), các tr ục của cơ cấuchuyển đảo phải có vòng bít kín. Các vòng bít kín đượ c tính toán để hoạt động ở áp suất

0,28 MPa và áp suất dư không nhỏ hơ n 2,7 kPa, nhiệt độ 30 ÷ 2500

C và số vòng quaycủa tr ục đến 500 vòng/ phút. Nhờ các vòng đệm này mà ngăn ngừa đượ c sự rò r ỉ môitr ườ ng hay sự xâm nhậ p không khí vào khoang thiết bị ở vị trí nhô ra của tr ục.

Vòng bít kín khi tiế p xúc vớ i môi tr ườ ng làm việc đượ c chế tạo bằng thépX18H10T vàX17H13M2T, cũng như bằng titan BT-10. Thờ i gian hoạt động ổn định củacác vòng này không nhỏ hơ n 2000 h khi tuổi thọ 8000 h. Độ đảo hướ ng kính cho phépcủa tr ục trong vùng đệm kín không lớ n hơ n 0,25 mm, độ đảo chiều tr ục của tr ục khônglớ n hơ n 0,250.

Để sản xuất lớ n các chất hoạt hoásinh học bằng tổng hợ p vi sinh, việc ứng dụng cácthiết bị lên men cóthểtích 63 m3 làkhông kinh tế.

Thiế t bị lên men có thể tích 100 m3 đượ c sản xuấ t ở Đứ c. Loại này thuộc thiết bị xilanh có bộ dẫn động ở dướ i cho cơ cấu đảo tr ộn. Cơ cấu đảo tr ộn vớ i hai sốvòng quaycủa tr ục - 120 và180 vòng/ phút. Theo dấu hiệu về k ết cấu nó gần giống vớ i thiết bị lênmen có thể tích 63 m3. Bảo vệ vòng bít kín của tr ục bằng cửa van dầu, đượ c tiệt trùng ở nhiệt độ đến 1400C. Ngoài ra còn có bít kín dự phòng để mở một cách tự động khi tr ụcngừng hoạt động, nhằm bảo vệ vòng bít kín chính của tr ục và cho phép thay đổi vòng

bít kín chính trong quátrình nuôi cấy để không phá huỷ độ tiệt trùng của canh tr ườ ng.

Trên tr ục lắ p ba máy khuấy đảo kiểu tuabin dạng mở vớ i đườ ng kính từ 820 đến1100 mm. Thiết bị lên men có bề mặt trao đổi nhiệt ở bên trong và bên ngoài để thảinhiệt.


25/75

53

Hình 8. S ơ đồ chỉ d ẫ n thao tác của thiế t bị lên men: 1- H ơ i vào; 2- Không khí tiệt trùng vào; 3- Không khí tiệt trùng hay hơ i vào vùng

bít kín; 4- Thoát hơ i hay không khí tiệt trùng t ớ i bộ sủi bọt; 5- H ơ i hay không khí tiệttrùng vào thiế t bị ở phần trên; 6- Thải hơ i hay không khí tiệt trùng t ớ i bộl ấ y mẫ uthử nghiệm; 7- Thải hơ i hay không khí tiệt trùng; 8- C ơ cấ u ố ng nhánh cóvan đ iề u chỉ nhbằ ng khí động học; 9- N ạ p hơ i hay không khí tiệt trùng vào thiế t bị ở phần d ướ i; 10-Tháo nướ c ng ư ng; 11- Ap k ế ; 12- Van; 13- Ống tháo; 14- Van khoá; 15- Van l ấ y mẫ u;16- N ạ p hơ i hay không khí tiệt trùng khi l ấ y mẫ u; 17- Đoạn ố ng để nố i áp k ế kiể m tra;18, 25- Các áp k ế ; 19- Van để nạ p vật liệu cấ y; 20- N ạ p canh tr ườ ng; 21, 23- N ạ pdung d ịch chuẩ n; 22- Thải hơ i hay không khí t ừ vùng bít kín; 24- Ống nhánh để nạ pdung d ịch chuẩ n; 26- Cung cấ p khí thải t ừ thiế t bị; 27- Cung cấ p nướ c; 28- Van rót;29- Van để rót nướ c t ừ áo; 30- Van để nạ p nướ c l ạnh; 31- Ống nhánh để nạ p nướ c l ạnh;32- Lượ c; 33- Ap k ế ; 34- Van an toàn; 35- C ảm biế n nhiệt độ; 36, 37- Các d ụngcụthứ cấ p đểđ o nhiệt độvà độ pH; 38- C ảm biế n pH met; 39- Thiế t bị lên men; 40- C ơ cấ u để làm sạch không khí

Đặc tính k ỹ thuật của thiế t bị lên men đượ c sản xuấ t ở Đứ c:

Thểtích, m3

:hình học: 00làm việc: 70

Diện tích bềmặt, m2:

bên ngoài: 9 bên trong: 7


26/75

54

Thiế t bị lên men của Hãng Nordon (Pháp). K ết cấu của loại thiết bị lên men này khác vớ i các loại đã nêu ở chổ cơ cấu phần đảo nằm ở dướ i tr ục gồm 6 cánh điều chỉnhcó tiết diện hình chữ nhật, còn cơ cấu cơ học để khử bọt nằm ở phía trên gồm hai cánh(tiết diện hình chữ nhật) có các gờ cứng. Khi nuôi cấy nấm mốc, các cánh của cơ cấuchuyển đảo đượ c nghiêng dướ i một góc 33 ÷ 340. Hình 10.3 mô tả sơ đồ bít kín tr ục nhờ

6 lớ p đệm vòng khít đượ c gia công sơ bộdung dịch 0,5 % phenol tinh thể.Các lớ p épchặt lại trong ống bọc nhờ các gugiông (vít cấy). Đệm vòng khít 2 chèn lắ p giữa tr ục 1và cốc đột lỗ 3. Hai khớ p nối 8 đượ c dẫn tớ i các lỗ cốc. Hơ i nạ p theo các khớ p nối nàyđể tiệt trùng các vòng bít. Tiệt trùng ở nhiệt độ1350C trong 1 h. Nướ c ngưng chảy vào

phần dướ i và đượ c thải ra qua khớ p nối 9. Khi k ết thúc quá trình tiệt trùng khớ p tháonướ c ngưng đượ c đóng lại vàkhông khí tiệt trùng qua khớ p 5 vào cơ cấu bít kín. Trongthờ i gian của quátrình nuôi cấy, áp suất không khí đượ c giữ ở mức 0,2 ÷ 0,4 MPa.

Sau khi tiệt trùng thiết bị vàhạáp suất đến áp suất khí quyển thì nạ p tựđộng

không khí tiệt trùng đểtạo áp suất 0,2 MPa, vàchỉ cósau đómớ i nạ p nướ c làm lạnh vàothiết bị. Tháo chất lỏng canh tr ườ ng ra khỏi thiết bị nhờ không khí nén đượ c tiệt trùng.

Hình 10.3. Bít kín tr ục của thiế t bị lên men:

Áp suất làm việc, MPa:trong thiết bị: 0,29trong ống xoắn: 0,4

Công suất của bộ dẫn động, kW: 120/180Đườ ng kính, mm: 3600

Chiều cao thiết bị vàbộ dẫn động, mm: 14270


27/75

55

1- Tr ục; 2- Đệm vòng kín; 3- C ố c đột l ỗ ; 4- V ỏcủa bộnút kín; 5- Khớ p nố i để d ẫ n khôngkhí tiệt trùng; 6- Ống lót ép; 7- Gugiông; 8- Khớ p nố i để nạ p khí; 9- Khớ p nố iđể thải nướ c ng ư ng

Ghi chú:(1) Công suất điện đã đượ c nêu trên chỉ trong tr ườ ng hợ p sử dụng thiết bị

lên men đểnuôi cấy nấm mốc - cho sản phẩm amiloglucozidaza.Các thi ế t b ị lên men có đảo tr ộn bằng khí động học và thông gió môi tr ườ ng

Các thiết bị mà bên trong nó có trang bị các vòi phun, ống khuếch tán, các bộ làm sủi bọt để nạ p không khí đều thuộc loại này. Không khí vào đượ c sử dụng để khuấy tr ộncanh tr ườ ng, để đảm bảo nhu cầu oxy cho vi sinh vật và để thải các chất chuyển hoá

tạo thành.

Bảng 2. Đặc đ i ể m k ỹ thuật của các thi ế t b ị lên men

của Hãng Nordon có đảo tr ộn cơ học

Số vòng quay củacơ cấu tr ộnvòng/phút Đườ ng kính, Chiều cao, Công suất độngThể tích,

m3

mm mm cơ , kW

2 Từ150 dến 500 2000 3260 7,5

3 250 1100 3910 18,515 170 1900 6350 22,5

32 175 2400 8299 30,0

60 160 2900 10650 225,0 (1)

120 120 2800 12150 225,0


28/75

56

Hình 9. Thiế t bị lên men d ạng xilanh có đảo tr ộn bằ ng khí động học và thổ i khí môitr ườ ng:

1- Khớ p nố i để tháo; 2- Thiế t bị thổ i khí; 3- Ống xoắ n; 4- C ử a; 5- Khớ p nố iđể nạ p không khí; 6- Khớ p thải không khí; 7- Khớ p nạ p liệu; 8- C ầu thang; 9- Ốngkhuế ch tán; 10- Ao; 11- Thành thiế t bị; 12- Ống quááp

Thi ế t b ị lên men d ạng xilanh. Thiết bị loại này về k ết cấu bên ngoài tươ ng tự như thiết bị lên men có khuấy tr ộn bằng cơ học, nhưng bên trong không có cơ cấu khuấytr ộn bằng cơ học. Ống khuếch tán dạng xilanh 9 có miệng loa ở đáy, đượ c lắ p bêntrong thiết bị. Máy thông gió 2 đượ c lắ p theo đườ ng tâm của thiết bị. Nhờ các cánhhướ ng, không khí có áp suất đượ c đưa vào máy thông gió theo tiế p tuyến đến tán phễutròn làm cho nhũ tươ ng không khí - chất lỏng chuyển động xoáy. Nhũ tươ ng tuần hoàn

liên tục theo vòng khép kín bên trong theo mép biên của xilanh, vòng không gian giữatườ ng trong và tườ ng ngoài thiết bị, sau đó một lần nữa lại lên trên qua miệng loa. Việcchuyển đảo và thổi khí mạnh do tạo ra vùng tuần hoàn bên trong. Để thải nhiệt sinh lýcó k ết quả hơ n, ngoài áo 10 cónhiều ngăn còn bổ sung bề mặt làm lạnh của ống khuếchtán 9.

K ết cấu của thiết bị lên men đượ c tính toán cho hoạt động dướ i áp suất dư.


29/75

57

Đặc tính k ỹ thuật của thiế t bị lên men có đảo tr ộn bằ ng khí động học.

Thể tích của thiết bị lên men, m3:25,

49, 63, 200

Áp suất làm việc, MPa: 0,2 ÷ 0,3

Hệ số chứa đầy: 0,5

Tốc độ thoát không khí từthiết bị thông gió, m/s: 25

Tiêu hao không khí, m3 cho 1 m3 canh tr ườ ng vi sinh vật: 0,5 ÷ 0,2

Loại này có thể tích làm việc nhỏ hơ n so vớ i các thiết bị lên men đảo tr ộn bằng cơ học, đượ c hoạt động vớ i môi tr ườ ng lên bọt mạnh. Chúng đượ c áp dụng trong nhữngtr ườ ng hợ p khi giống sinh vật không cần phải khuấy tr ộn mạnh và độ nhớ t không lớ n.

Các thiế t bị lên men d ạng đứ ng . Loại thiết bị này dùng để tăng cườ ng độ trao đổi khối, giảm tiêu hao đơ n vị của không khí nén tiệt trùng và tăng tốc độ tổng hợ p sinh họccác chất hoạt hoá.

K ết cấu của các loại thiết bị lên men cho phép thực hiện quá trình nuôi cấy chìmkhi vận tốc dài của dòng môi tr ườ ng bằng 2 m/s và lớ n hơ n.

Thiết bị lên men dạng đứng (hình 10) bao gồm khối tr ụ đứng 7, bên trong có cơ cấuchuyển đảo 8 đượ c lắ p chặt trên tr ục, ống tuần hoàn, thiết bị thổi khí, buồng trao đổinhiệt 5, các đoạn ống để nạ p môi tr ườ ng dinh dưỡ ng, các đoạn ống để nạ p không khí, để rót canh tr ườ ng 13 và để thải khí 16.

Ở phần dướ i của ống tuần hoàn đượ c lắ p cơ cấu chuyển đổi 8 dạng vít. Các cánhhướ ng đượ c phân bổ trên và dướ i vít: các cánh trên thẳng đứng, còn các cánh dướ inghiêng.

Hệ tuần hoàn của thiết bị lên men gồm máy phun đượ c nối vớ i phần dướ i của thiết

bị, bơ m và các đườ ng ống. Ống tuần hoàn 15 có dạng thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống cóhai ống góp. Bên trong ống góp trên có hai vách đặc đượ c định vị trong mặt phẳngxuyên tâm, còn bên trong ống góp dướ i không có vách. Ngoài ra bộ trao đổi nhiệt dạngống còn có các ống trao đổi nhiệt nằm giữa các ống góp thông nhau và nối nhau bở i cáctườ ng chắn.

Buồng trao đổi nhiệt đượ c lắ p chặt trong giá đỡ có hai bích và có thể tháo lắ p dễ


30/75

58

dàng để sửa chữa. Bộ khử bọt bằng phươ ng pháp cơ học 4 đượ c gá trên nắ p thiết bị lênmen 3. Bộ dẫn động cho thiết bị khử bọt 2 và bốn cửa để r ửa bằng phươ ng pháp cơ học,đều đượ c lắ p trên nắ p.

Hình 10. Thiế t bị lên men d ạng trao đổ i khố i mạnh Φ BO - 40 - 0,6:

1- Ống cung cấ p khí để thổ i; 2- Bộ d ẫ n động kín; 3- N ắ p; 4- C ơ cấ u khử bọt; 5- Miế ngđệm vớ i buồng trao đổ i nhiệt; 6- H ộ p không khí; 7- Khố i tr ụ đứ ng; 8- C ơ cấ u chuyể nđảo; 9- Ống để nạ p nướ c l ạnh; 10- Động cơ ; 11- Bánh đ ai; 12- Truyề n động bằ ng đ aihình thang; 13- C ơ cấ u tháo d ỡ ; 14- Ống để thải nướ c; 15- Các ố ng trao đổ i nhiệt; 16-Ống thải không khí; 17- Ống để khử bọt;18- C ử a quan sát

Nhờ truyền động bằng đai hình thang 12, mà động cơ 10 làm chuyển động vít vớ i số vòng quay 280 ÷ 350 vòng/phút. Để đảm bảo độ kín và độ tiệt trùng trong quá trình nuôicấy cần bố trí vòng bít kín trên tr ục của cơ cấu chuyển đảo. Cơ cấu khử bọt bằng cơ học

đượ c lắ p trên tr ục của bộ dẫn động nhờ ống r ỗng. Khí thoát ra từ chất lỏng đượ c dẫn quaống r ỗng trên. Cơ cấu này gồm bộ đĩ a hình nón có gờ . Điều khiển động cơ tại chổ vàđiều khiển từ xa lấy tín hiệu từ bảng điều khiển.

Để khảo sát quá trình nuôi cấy vi sinh vật, trên tườ ng thiết bị phân bổ sáu cửa quansát 8. Thiết bị đượ c thiết k ế để hoạt động vớ i áp lực đến 0,3 MPa.

Các bộ phận tự động dùng để điều chỉnh các thông số cơ bản của quá trình: nhiệt


31/75

59

độ canh tr ườ ng bên trong thiết bị - theo sự biến đổi tiêu hao nướ c lạnh trong phòng traođổi nhiệt; lượ ng chất lỏng - theo sự biến đổi thoát ra của chất lỏng canh tr ườ ng; nồng độ ion hydro - theo sự mở và tắt của bơ m định lượ ng nạ p kiềm hay axit; nồng độ oxy hoàtan trong môi tr ườ ng theo sự biến đổi tiêu hao không khí tiệt trùng; tiêu hao môi tr ườ ng

dinh dưỡ ng - theo sự biến đổi môi tr ườ ng dinh dưỡ ng vào thiết bị và nồng độ sinh khối -theo sự biến đổi tiêu hao môi tr ườ ng dinh dưỡ ng.

K ết cấu của thiết bị cũng có khả năng kiểm tra tiêu hao nướ c lạnh, mức độ đồnghoá nitơ , nồng độ CO2 và O2, độ ẩm không khí, nhiệt độ và áp lực trong những điểmriêng biệt của thiết bị.

Thiết bị lên men này có thể hoạt động gián đoạn hay liên tục. Khi k ết thúc quá trìnhtiệt trùng và làm lạnh của thiết bị và của các cơ cấu phụ, thì rót đầy môi tr ườ ng dinhdưỡ ng tiệt trùng và tiến hành cho hoạt động cơ cấu chuyển đảo để thực hiện tuần hoàn

môi tr ườ ng theo vòng khép kín. Nạ p không khí nén một cách liên tục qua thiết bị thổikhí vào không gian giữa tườ ng và ống tuần hoàn. Không khí cuốn hút chất lỏng thànhdòng, đậ p vỡ ra thành bọt nhỏ và đượ c khuấy tr ộn mạnh vớ i môi tr ườ ng, tạo ra hỗn hợ pđồng hoá giả.Chuyển động quay của môi tr ườ ng đượ c tạo nên trong ống tuần hoàn nhờ các cánh hướ ng, k ết quả tạo ra vùng xoáy trung tâm có hàm lượ ng khí cao.

Nhờ ma sát chất lỏng vớ i phần gờ của các ống trong bộ trao đổi nhiệt mà sự chảyr ối của các lớ p biên đượ c duy trì. Không khí thải đượ c tách ra khỏi chất lỏng và đượ cthải ra qua ống lót r ỗng của thiết bị khử bọt.

Để tăng cườ ng quá trình cần nạ p môi tr ườ ng dinh dưỡ ng vào thiết bị qua máy phun.Bơ m hút chất lỏng canh tr ườ ng và đẩy qua vòi phun của máy phun, cho nên mức độ phân tán của chất dinh dưỡ ng đạt đượ c r ất cao và tạo ra bề mặt tiế p xúc của các pha r ấtlớ n. Sự tuần hoàn nhiều lần của canh tr ườ ng trong vòng khép kín vớ i các bềmặt địnhhình tốt, bảo đảm hiệu suất cao của quá trình và bảo đảm tính đồng nhất của hỗn hợ ptrong không gian vòng tuần hoàn. Buồng trao đổi nhiệt bảo đảm tốt tốc độ chảy của tácnhân lạnh cao làm cho hệ số trao đổi nhiệt lớ n. Bộ trao đổi nhiệt kiểu chùm ống trongống góp cho phép tăng bề mặt đơ n vị làm lạnh khoảng 10 lần lớ n hơ n khi truyền nănglượ ng qua tườ ng thiết bị. Hệ số truyền nhiệt đượ c tăng lên một số lần và đạt gần 3900

W/(m2

K). Đặc tính k ỹ thuật của thiế t bị lên men d ạng đứ ng:

Hệ số chứa đầy: 0,6 ÷ 0,7

Thể tích, m3: 40

Lượ ng môi tr ườ ng đượ c nạ p, m3: đến 28


32/75

60

Ap suất, MPa:

trong tườ ng: 0,6

trong phòng trao đổi nhiệt và trong áo

ngoài: 0,3trong thiết bị: 0,1 ÷ 0,6

Công suất bộ dẫn động, kW:

cho cơ cấu khuấy tr ộn: 125

cho cơ cấu khử bọt: 40

Số vòng quay của tr ục, vòng/phút:

cho cơ cấu khuấy tr ộn: 350 và200

cho cơ cấu khử bọt: 1500

Kích thướ c cơ bản, mm: 4600×2600×12000

Các thiết bị lên men không đòi hỏi tiệt trùng các quá trình nuôi cấy vi sinh vật

Các quá trình nuôi cấy sản sinh ra các nấm men gia súc thuộc các quá trình nuôicấy vi sinh vật không tiệt trùng. Theo k ết cấu các thiết bị lên men, để sản xuất nấm mentươ ng tự như các thiết bị để sản xuất enzim, các kháng sinh chăn nuôi, các amino axit và

các sản phẩm tổng hợ p khác, nhưng không có sự bảo vệ hơ i và không khí của tr ục quayvà một số bộ phận k ết cấu. Trong nhiều tr ườ ng hợ p để sản xuất nấm men gia súc, ứngdụng các thiết bị đã đượ c sử dụng trong các quá trình tiệt trùng.

Các thi ế t b ị lên men có đảo tr ộn bằng khí động học và đườ ng vi ền tuần hoàn bêntrong

Các thiết bị nuôi cấy nấm men dùng phươ ng pháp bơ m dâng bằng khí nén của hệ thống Lephrancia có đườ ng viền tuần hoàn bên trong đượ c ứng dụng phổ biến nhất.Trong sản xuất nấm men thủy phân thườ ng ứng dụng các thiết bị loại này có sức chứa

250, 320, 600 và 1300 m3

. K ết cấu các thiết bị lên men không có các thiết bị cơ học để khử bọt. Bọt đượ c khử dướ i tr ọng lực của cột chất lỏng khi tuần hoàn.

Không khí vào thiết bị theo ống trung tâm vào chậu, tại đây hỗn hợ p khí - chất lỏngđượ c tạo thành từ nướ c hoa quả nạ p vào và từ chất lỏng ở phần dướ i thiết bị. Hỗn hợ ptrên đượ c chuyển động theo ống khuếch tán bên trong. Một phần không khí đượ c tách rakhỏi bọt và thải ra khí quyển qua lỗ ở nắ p thiết bị, còn một phần khác cùng vớ i bọt hạ


33/75

61

xuống theo đườ ng rãnh vòng giữa ống khuếch tán và tườ ng. Khi chuyển động xuốngdướ i bọt bị khử.Độ bội tuần hoàn đạt cao 1,5 ÷ 2 thể tích chất lỏng hoạt động trong một phút. Các thiết bị công nghiệ p có chiều cao 12 ÷ 15 m. Bọt dâng cao lên 10 ÷ 12 m.Tiến hành làm nguội thiết bị lên men bằng tướ i nướ c tườ ng ngoài và nạ p nướ c vào áo

của ống khuếch tán. Tiêu hao không khí cho 1 kg nấm men khô là 20 m3

.Đặc tính k ỹ thuật của các thiết bị lên men công nghiệ p hoạt động ở áp suất khí

quyển đượ c giớ i thiệu ở bảng 10.2.

Bảng 3. Đặc tính k ỹ thuật của các thiế t bị lên men có đảo tr ộn bằ ng khí động học vàkhố i khí để sản xuấ t nấ m men gia súc

Thể tích của thiết bị, m3

Các chỉ số

320 500 600 1300 Năng suất theo lượ ng nướ c

20 ÷ 30 30 ÷ 35 55 ÷ 62

hoa quả chảy, m3/h

pH 4,5 pH 3,5÷4,5 pH 4,2÷4,5

Môi tr ườ ng

đến 5000 9000 14000÷16000 18000

Tiêu hao không khí, m3/h

Áp suất dư của không khí,

0,6 0,75 0,4 0,6

kg lực / cm2

Bề mặt làm lạnh của áo

ống khuếch tán, m2

30

50×3=150 58 50×4=200

Kích thướ c cơ bản, mm

5700×13350 7600×112007400×14175 11000×14500


34/75

62

Thi ế t b ị lên men hình tr ụ có bộ phận bơ m dâng bằng khí nén vớ i sứ c chứ a 1300m3 Thiết bị loại này đượ c dùng để nuôi cấy nấm men một cách liên tục trong nướ cquả.Nó gồm có vỏ thép hàn, đáy hình nón cụt và nắ p hình nón có lỗ ở chính giữa (hình11).

Hình 11. Thiế t bị lên men hình tr ụ có bộ phận bơ m dâng bằ ng khí nén vớ i sứ c chứ a1300 m3

Bốn ống khuếch tán 7 đượ c lắ p bên trong thiết bị để tạo ra bốn dòng tuần hoàn độc lậ p.Không khí nén đượ c đẩy qua ống góp 2 vào các ống trung tâm của mỗi ống khuếch tán,ở cuối ống trung tâm có côn và chậu 8.

Thùng phân phối đượ c đặt trên nắ p thiết bị, dịch lên men, nướ c quả, nấm men vànướ c amoniac cho vào các ống khớ p nối 3, 4, 5. Tất cả các cấu tử đượ c tr ộn lại và tạo ra

một dung dịch dinh dưỡ ng và theo các đườ ng ống có đườ ng kính 100 mm chảy xuốngdướ i các chậu của thiết bị thổi khí.

Hỗn hợ p dinh dưỡ ng khi chảy tràn qua mép chậu đượ c khuấy tr ộn vớ i không khíthoát qua khe dướ i chậu. Nhũ tươ ng không khí - chất lỏng đượ c tạo thành dâng lên theoống khuếch tán đến tấm chặn 6 thì bị phá vỡ và chảy xuống dướ i. Dùng thiết bị tướ idạng ống góp đểlàm lạnh tườ ng ngoài thiết bị.


35/75

63

Thiết bị lên men dạng tháp

Các thiết bị lên men này bao gồm loại đĩ a và loại không có các cơ cấu chuyển đảonằm ngang. Sự khác biệt của loại thiết bị này so vớ i các loại thiết bị đã đượ c nêu ở các

phần trên là tr ị số tỷ số giữa chiều cao và đườ ng kính r ất lớ n. Thiết bị dạng tháp có

nhiều triển vọng bở i k ết cấu đơ n giản, khả năng tăng cườ ng quá trình sinh tổng hợ p vàcông suất đơ n vị lớ n. Ư u điểm về k ết cấu của thiết bị dạng tháp là không có các phầnquay chuyển động và diện tích chiếm chỗ nhỏ.

Thi ế t b ị lên men d ạng phun. Thiết bị lên men của Đức vớ i sự trao đổi khối mạnh. Có thể tích đến 10003, sử dụng phươ ng pháp các tia ngầm.

Hoạt động của thiết bị (hình 10.7) đượ c mô tả dướ i đây: bơ m ly tâm có chức năngkhử khí, đẩy chất lỏng đến cửa vào của thiết bị lên men dạng đứng. Chất lỏng chảyxuống dọc theo tườ ng đứng ở dạng dòng vòng khuyên. Dòng chảy r ối ở đầu cuối nằm

ngang mức bề mặt chất lỏng của hỗn hợ p bị thắt lại trong tiết diện ngang của ống và từ đó chảy thành dạng tia để tạo ra vùng áp suất thấ p.

Khi tạo hỗn hợ p đồng hoá vớ i chất lỏng thì không khí đượ c hút qua lỗ ở đỉnhkhoang trong vùng áp suất thấ p. Chất lỏng sủi bọt (ở dạng tia xâm nhậ p tự do, do dự tr ữ năng lượ ng động học) đến đáy của thiết bị lên men, tạo ra tr ườ ng r ối mạnh trong dungdịch canh tr ườ ng. Các bọt khí từ đáy thiết bị nổi lên bềmặt, một lần nữa qua tr ườ ng r ốiđượ c tạo ra từ các tia xâm nhậ p tự do.

Nhờ hệ thổi khí tươ ng tự như thế có thể đảm bảo cung cấ p oxy cho các thiết bị lên

men loại lớ n có thể tích đến 2000 m

3

, khi cườ ng độ khuấy mạnh.Đặc tính k ỹ thuật của thiết bị lên men dạng phun để nuôi cấy nấm mốc đượ c giớ ithiệu ở bảng 5.

Khi tốc độ chuyển động của các dòng tia 8 ÷ 12 m/s và áp suất không đổi thì sự phân tán của không khí sẽ đạt đượ c tốt. Nhờ tác động phun ở vùng vào của dòng, nhờ chuyển động điểm ở tườ ng của thiết b

kĩ thuật thực phẩm 3

Documents