i

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Duy và

TS. Phạm Thu Thủy đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh nghiệm và giúp

đỡ tôi từng bước tiếp cận và hoàn thành luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học

và môi trường. Thầy cô đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy và truyền đạt kiến thức quý

báu, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được nền

tảng kiến thức bước tiếp những chặng đường tiếp theo.

Con xin gửi lòng biết ơn đến ba mẹ và anh chị đã luôn bên cạnh động viên,

ủng hộ và dành cho con tất cả tình yêu thương, con sẽ luôn cố gắng sống và phấn

đấu với niềm tin yêu này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn lớp 48 CNSH, đã đồng hành

và chia sẽ buồn vui với tôi trong những năm tháng sinh viên, trong suốt khóa học

cũng như quá trình thực hiện đề tài.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Minh Nhật và nhóm G8-50SH đã

quan tâm và nhiệt tình giúp đỡ để bài luận văn được hoàn thành.

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người đã dành cho tôi tình

cảm quý báu này!

Nha Trang, tháng 07 năm 2010

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Cẩm Ly

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ i

MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii

DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT ........................................................................... iv

DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... v

DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................... vi

LỜI NÓI ĐẦU ............................................................................................................... 1

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ........................................................................................ 2

1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm hải sản ................................................................. 2

1.1.1. Trên thế giới ......................................................................................................... 2

1.1.2. Ở Việt Nam .......................................................................................................... 6

1.2. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ............................................... 7

1.2.1. Phân loại chi Vibrio ............................................................................................. 7

1.2.2. Đặc điểm của V. parahaemolyticus ..................................................................... 9

1.2.3. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của V. parahaemolyticus ........................ 12

1.2.4. Khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus ................................................... 13

1.2.5. Gen độc tố của V. parahaemolyticus ................................................................. 14

1.3. Mục tiêu và tính cấp thiết của đề tài ................................................................. 18

1.3.1. Mục tiêu ............................................................................................................ 18

1.3.2. Tính cấp thiết ..................................................................................................... 18

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 19

2.1. Vật liệu ................................................................................................................. 19

2.1.1. Mẫu .................................................................................................................... 19

2.1.2. Thiết bị chuyên dụng ......................................................................................... 19

2.1.3. Hóa chất, môi trường và thuốc thử .................................................................... 20

2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 24

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................... 25

iii

2.3.1. Phân lập vi khuẩn V. parahaemolyticus ............................................................. 25

2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn Vibrio.............................................. 26

2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng .......................................................................... 27

2.3.4. Xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng Vibrio .................................. 28

2.3.5. Bảo quản chủng vi khuẩn. .................................................................................. 30

2.3.6. Tách chiết DNA hệ gen từ tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus ..................... 30

2.3.7. Xác định gen độc tố bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ............ 31

2.3.8. Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di ................................................. 33

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 35

3.1. Phân lập vi khuẩn vi khuẩn Vibrio từ thực phẩm hải sản .............................. 35

3.2. Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng Vibrio .............................................. 39

3.3. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng Vibrio ................................................ 41

3.4. Một số đặc tính sinh hóa của V. parahaemolyticus........................................... 42

3.5. Xác định gen độc tố của các chủng Vibrio bằng kỹ thuật PCR...................... 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................53

iv

DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT

Base pair bp

Deoxynucleotide triphosphate dNTP

Deoxyribonucleotide Acid DNA

Polymerase Chain Reaction PCR

Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose TCBS

Food and Drug Adimistration FDA

Thermostable direct hemolysin tdh (TDH)

Tdh-related hemolysin trh (TRH)

V. parahaemolyticus toxRS Vp-toxRS

Random Amplification of Polymorphic DNA RAPD

Loop mediated isothermal amplification LAMP

Reverse Transcription PCR RT- PCR

Ethylenediaminetetraacetic Acid EDTA

Optical Density OD

Type III Secretion System T3SS

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các nhóm thực phẩm V. parahaemolyticus gây ngộ độc thực phẩm ............ 4

Bảng 1.2. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi V. parahaemolyticus do tiêu thụ thực phẩm

hải sản 1993 -2000 Hồng Kông .................................................................................. 5

Bảng 1.3. Các triệu chứng lâm sàng viêm dạ dày ruột gây ra bởi Vibrio

parahaemolyticus ........................................................................................................ 5

Bảng 1.4. Các đặc tính khác nhau của các loài thường gây bệnh trên người liên quan

đến việc tiêu thụ hải sản .............................................................................................. 8

Bảng 1.5. Các kháng nguyên của V. parahaemolyticus (1986) ................................... 11

Bảng 2.1. Các mẫu hải sản thu mua từ một số chợ ở thành phố Nha Trang dùng để

phân lập vi khuẩn Vibrio ........................................................................................... 19

Bảng 2.2. Đặc điểm các mồi sử dụng cho phản ứng PCR: .......................................... 32

Bảng 2.3. Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR ............................................ 32

Bảng 3.1. Mật độ tế bào và đặc điểm hình thái của các chủng Vibrio được phân lập từ

các mẫu hải sản ở chợ Vĩnh Hải, Vĩnh Thọ, chợ biển (Bãi Dương) ........................ 36

Bảng 3.2. Khả năng chịu muối của các chủng Vibrio.................................................. 43

Bảng 3.3. Khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn Vibrio ......................... 44

Bảng 3.4. Khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn ........................................ 45

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus được quan sát dưới kính hiển vi ....... 9

Hình 1.2. Hai nhiễm sắc thể dạng vòng của V. parahaemolyticus ............................. 17

Hình 2.1. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài............................. 24

Hình 2.2. Sơ đồ chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR ............................................. 33

Hình 3.1. Các khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio sau một ngày (24 giờ) nuôi trên môi

trường thạch TCBS ở điều kiện pH 8,5, nhiệt độ 370C ............................................ 35

Hình 3.2. Các khuẩn lạc chủng C2 màu xanh (A) và khuẩn lạc chủng C13 màu vàng

sữa (B) ....................................................................................................................... 35

Hình 3.3. Tế bào chủng vi khuẩn C2 được soi tươi ..................................................... 39

Hình 3.4. Tế bào của chủng vi khuẩn Vibrio C7 sau khi nhuộm Gram ....................... 40

Hình 3.5. Đường cong sinh trưởng của các chủng Vibrio (C1, C2, C7, C15, C23) nuôi

trên môi trường APW, ở pH 8,5 ± 0,2, nhiệt độ phòng và lắc ở 150 vòng/phút ...... 41

Hình 3.6. Thí nghiệm lên men đường của chủng vi khuẩn C15 (A) và C2 (B) .......... 44

Hình 3.7. Thí nghiệm sử dụng lysin của các chủng Vibrio ......................................... 45

Hình 3.8. DNA tổng số của các chủng vi khuẩn được điện di và soi dưới tia UV ............. 46

Hình 3.9. Sản phẩm khuếch đại gen toxR được điện di và soi dưới tia UV ................ 47

1

LỜI NÓI ĐẦU

Trong những năm trở lại đây, nhiều địa phương trên cả nước thường xuyên

phải đối mặt với tình trạng ngộ độc thực phẩm, có nơi ngộ độc thực phẩm đã xảy ra

hàng loạt. Có nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm trong đó tiêu thụ hải sản là

một trong những nguyên nhân chính yếu. Các món ăn hải sản ngày càng phong phú

và là thực phẩm bổ dưỡng hàng đầu, đi kèm đó cũng chứa đựng nhiều nguy cơ tiềm

ẩn gây hại cho sức khỏe của con người.

Khi ăn các món ăn sống như ăn gỏi, ăn tái người ăn rất dễ bị nhiễm các bệnh

về hệ tiêu hóa. Dù mang lại nguồn dinh dưỡng cao nhưng phải sử dụng nguồn hải

sản tươi, đun nấu chín, hợp vệ sinh, tuyệt đối không được ăn tái nếu không sẽ bị

nhiễm khuẩn, nhiễm độc, làm lây truyền dịch bệnh tiêu chảy cấp và các bệnh truyền

nhiễm đường tiêu hoá.

Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn thường sống kí sinh trên các

đối tượng hải sản như tôm, mực, cua, cá,… chúng được coi là nguyên nhân chính

gây ra các vụ ngộ độc thức ăn nên cần nghiên cứu khả năng gây bệnh của chúng.

Đề tài “Phân lập và xác định gen độc tố của vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus trong hải sản tƣơi sống tại các chợ ở thành phố Nha Trang”

được tiến hành với mục tiêu:

Phân lập và định danh loài V. parahaemolyticus ở các chợ thành phố

Nha Trang có mặt trong một số hải sản tươi sống (tôm, mực, cá, cua…).

Xác định gen độc tố của vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật PCR, tạo cơ

sở khoa học cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh sớm.

2

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN

1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm hải sản

1.1.1. Trên thế giới

Ngộ độc thực phẩm là một vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khoẻ

con người, có thể gây ra nguy hiểm, thậm chí tử vong. Triệu chứng của ngộ độc thực

phẩm bao gồm buồn nôn, co thắt dạ dày, tiêu chảy, nôn, sốt và đau đầu. Triệu chứng

có thể xảy ra trong vòng 30 phút sau khi ăn trong một vài giờ, hoặc vài ngày sau đó

và ở mức độ nặng, nhẹ khác nhau.

Vi khuẩn V. parahaemolyticus là nguyên nhân phổ biến gây ngộ độc thực

phẩm ở nhiều nước châu Á, bao gồm Trung Quốc (31,1% vụ dịch ngộ độc thực

phẩm được báo cáo giữa năm 1991 và 2001), Nhật Bản (chiếm 20-30% các trường

hợp từ 1981 đến 1993) và Đài Loan (69% trường hợp được báo cáo giữa năm 1981

và 2003). Ngoài ra, dịch còn xảy ra ở các nước châu Âu như Tây Ban Nha (1989,

1999, 2004), Pháp (1997) và cả Châu Mỹ, điển hình là Hoa Kỳ (Norinaga và cộng

sự, 2005).

Nhật Bản: Trước năm 1994, tỷ lệ mắc bệnh do V. parahaemolyticus được

công bố còn ít. Thời kì 1994-1995 đã có 1.280 vụ về nhiễm bệnh do V.

parahaemolyticus được báo cáo, còn nhiều hơn các vụ ngộ độc thực phẩm do

Salmonella. Phần lớn các trường hợp ngộ độc xảy ra trong mùa hè, số lượng ca ngộ

độc lớn nhất xuất hiện trong tháng tám. Từ 1996-1998, đã có 496 ổ dịch, với 24.373

trường hợp do V. parahaemolyticus gây ra. Số lượng các trường hợp ngộ độc thực

phẩm V. parahaemolyticus tăng gấp đôi vào năm 1998 so với năm 1997.

Ấn Độ: Thời kì 1994-1996, xác định được 146 bệnh nhân bị ngộ độc do vi

khuẩn V. parahaemolyticus (Okuda và cộng sự, 1997). Tỷ lệ này tăng đột ngột vào

tháng hai năm 1996 và vẫn còn cao cho đến tháng tám. Tỷ lệ của bệnh do V.

parahaemolyticus tăng lên liên quan đến tăng sự lưu hành của chủng O3: K6. Tỷ lệ

mắc tiêu chảy do chủng O3: K6 chiếm 63% các chủng phân lập từ bệnh nhân ở

Calcutta giữa tháng 9 năm 1996 và tháng 4 năm 1997.

3

Mexico: Tổng số 266 mẫu nước biển, nhuyễn thể và cá thu thập từ 12 điểm

khác nhau trong đầm phá Pueblo Viejo, Mexico vào các tháng khác nhau trong năm

cho thấy: V. parahaemolyticus được tìm thấy ở 11 trong 12 điểm trên. Các chủng đã

được kiểm tra kiểu huyết thanh cho mục đích dịch tễ học và O3 là nhóm huyết thanh

thường gặp nhất. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng nhân tố tác động đến phân bố V.

parahaemolyticus trong môi trường bao gồm nhiệt độ nước, muối, nồng độ oxy, sự

tương tác với thực vật nổi, sự có mặt của các trầm tích, chất hữu cơ trong huyền phù,

cá và hải sản cũng như sự lên xuống của thủy triều ở cửa sông (Maria và cộng sự,

2004).

Chile: Tóm tắt dịch bệnh tiêu chảy liên quan đến tiêu thụ hải sản và V.

parahaemolyticus xảy ra trong mùa hè năm 2004 và 2005 ở các vùng quanh của

Puerto Montt, Chile. V. parahaemolyticus thu được từ động vật có vỏ và mẫu lâm

sàng trong thời gian dịch bệnh chủ yếu thuộc nhóm O3: K6 (Loreto và cộng sự,

2005).

Đài Loan : Từ năm 1983 đến 1993, có 786 chủng Vibrio parahaemolyticus đã

được thu thập từ các dịch bệnh truyền qua thực phẩm và một số các trường hợp tiêu

chảy ở miền bắc Đài Loan, gồm 42 kiểu huyết thanh. Năm kiểu huyết thanh thường

gặp là K8 (36,8%), K15 (10,8%), K12 (8,7%), K56 (7,9%) và K63 (4,7%). Đa số

chủng gây ra bệnh có kiểu huyết thanh là O3:K6 (Wong và cộng sự, 2000).

Gần đây, bệnh tiêu chảy do V. parahaemolyticus đã được báo cáo từ Việt

Nam, Úc, Hoa Kỳ, Trung Mỹ và Anh. Tại châu Phi, V. parahaemolyticus lần đầu

tiên được xác định trong các dịch bệnh tại Togo. Do triệu chứng phát bệnh tương tự

với tả nên người ta đẩy mạnh về công tác y tế công cộng (Bockemuhl và Triemer,

1974).

V. parahaemolyticus là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm như viêm

dạ dày ruột ở người thông qua tiêu thụ hải sản nấu chưa chín hoặc vết thương tiếp xúc

với động vật biển hoặc vùng nước ấm ven biển đặc biệt là ở Đông Nam Á (Wong và

cộng sự, 2000). Khi nhiệt độ tăng lên trong một khoảng thời gian ngắn là đủ cho vi

4

khuẩn V. parahaemolyticus phát triển cho đến khi đạt đến mức độ nhiễm độc (106 vi

khuẩn) (Daniels và cộng sự, 2000).

Trong những năm gần đây, Sở Y tế Hồng Kông nghiên cứu cho biết Vibrio

parahaemolyticus đã liên tục gây ngộ độc và được xếp vào nguyên nhân hàng đầu

do ăn thực phẩm hải sản.

Bảng 1.1. Các nhóm thực phẩm V. parahaemolyticus gây ngộ độc thực phẩm

(từ 1999 đến 2003)

Nhóm thực phẩm Số ca xác nhận Số ngƣời mắc phải

Hải sản 313 (56,7%) 1465 (53,8%)

Món ăn hỗn hợp 68 (12,3%) 449 (16,5%)

Thịt, sản phẩm từ thịt và cá tạp 54 (9,8%) 314 (11,5%)

Ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc 39 (7,1%) 89 (3,3%)

Gia cầm và sản phẩm từ gia cầm 29 (5,3%) 187 (6,9%)

Trái cây, rau và sản phẩm từ chúng 25 (4,5%) 98 (3,6%)

Nhóm khác (chƣa rõ) 33 (4,3%) 123 (4,6%)

Tổng 552 (100%) 2725 (100%)

(Nguồn: Risk Assessment Studies, Report No.20, 2005 )

5

Bảng 1.2. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi V. parahaemolyticus do tiêu thụ thực

phẩm hải sản 1993 -2000 Hồng Kông

Nhóm thực phẩm Loại thực phẩm Số ca mắc bệnh Số ngƣời mắc phải

Giáp xác

Cua 46 (14,7%) 180 (12,3%)

Tôm 43 (13,7%) 299 (20,4%)

Tôm Hùm 1 (0,3%) 2 (0,1%)

Tổng 90 (28,7%) 481 (32,8%)

Chân bụng Mực 82 (26,2%) 371 (25,3%)

Thân mềm

Trai 15 (4,8%) 49 (3,3%)

Hàu 12 (3,8%) 41 (2,8%)

Hến 12 (3,8%) 45 (3,1%)

Sò , điệp 6 (1,9%) 24 (1,6%)

Các loại thân mềm khác 4 (1,3%) 29 (2,0%)

Tổng 49 (15,7%) 188 (12,8%)

Các sản phẩm khác

từ biển

49 (15,7%) 255 (17,4%)

Cá 43 (13,7%) 170 (11,6%)

Tổng 313 (100%) 1465 (100%)

(Nguồn: Risk Assessment Studies, Report No.20, 2005 )

Bảng 1.3. Các triệu chứng lâm sàng viêm dạ dày ruột gây ra bởi Vibrio

parahaemolyticus

Triệu chứng Tỷ lệ của triệu chứng

Trung bình Phạm vi (khoảng)

Tiêu chảy 98% 80 - 100%

Đau thắt bụng 82% 68 - 100%

Nôn 71% 40 - 100%

Buồn nôn 52% 17 – 79%

Đau đầu 42% 13- 56%

Sốt 27% 21 – 33%

Ớn lạnh 24% 4 – 56%

(Nguồn Barker và Gangarosa, 1974; Levine và cộng sự, 1993)

6

V. parahaemolyticus là một loại vi khuẩn ưa mặn, có khả năng gây ngộ độc

thực phẩm và viêm dạ dày ruột, vết thương nhiễm trùng, và nhiễm trùng huyết ở

người. Nhiễm trùng huyết là mối đe dọa nghiêm trọng vì sinh vật gây bệnh lây lan

nhanh hoặc sự hiện diện và tồn tại lâu dài của các độc tố do chúng sản xuất ra lưu

thông trong máu. Dấu hiệu đặc trưng là sốt hoặc hạ huyết áp và khả năng phân tách

các vi sinh vật từ máu. Trong trường hợp nhiễm trùng huyết, các triệu chứng có thể

bao gồm sưng, đau đớn tứ chi với xuất huyết (Hlady, 1997; Klontz, 1990). Tử vong

cũng có thể xảy ra tiếp theo khi có sự xuất hiện của nhiễm trùng huyết. Thời gian ủ

bệnh có thể từ 2 giờ đến 10 ngày (Barker và Gangarosa, 1974).

1.1.2. Ở Việt Nam

Tại Việt Nam từ năm 1999 đến 2008 đã có khoảng 1.000 vụ ngộ độc thực

phẩm được báo cáo với trên 25.000 người mắc, trong đó có 300 người tử vong.

Riêng tại tỉnh Khánh Hòa, tình hình ngộ độc thực phẩm xảy ra tính từ năm 2001 đến

2008 có 215 ca ngộ độc, trong đó có 7 ca tử vong. Nguyên nhân của các vụ ngộ độc

thực phẩm là do cá nóc (25 ca), vi sinh vật (48 ca), nấm dại (46 ca). Thời điểm trong

năm hay xảy ra ngộ độc thực phẩm là từ tháng 7 đến tháng 12. Loại thực phẩm gây

ngộ độc thực phẩm thường gặp là rau, thịt, nhưng hải sản cũng chiếm 11,11% các ca

ngộ độc.

Theo báo cáo của Tuyet và cộng sự (2002) đã có 548 ca nhiễm bệnh do V.

parahaemolyticus gây ra được xác định giữa 1/1995 đến 9/2001 ở Khánh Hòa.

Trong thời gian này, các nhà nghiên cứu ghi nhận trong số này có 471 người lớn và

có 57 trẻ em. Phân tích vi sinh cho thấy trong số 548 trường hợp tiêu chảy, có 53%

dương tính với vi khuẩn V. parahaemolyticus. Nhiều địa phương trên cả nước hiện

phải đối mặt với tình trạng ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng do nhu cầu ăn hải sản

ngày càng nhiều, có nơi ngộ độc thực phẩm đã xảy ra hàng loạt. Điều kiện để dịch

bệnh xuất hiện là do tình trạng vệ sinh môi trường, nước, thực phẩm kém, đặc biệt là

thói quen, sở thích ăn gỏi, ăn tái hải sản.

Tuy các phương tiện truyền thông đưa tin về ngộ độc thực phẩm do loài này

gây ra rất nhiều do chúng gây bệnh trên các loài hải sản như tôm, cá (Võ Văn Nha

7

và cộng sự, 2006) nhưng ở nước ta còn có ít nghiên cứu cơ bản về gen độc tố của vi

khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh. Đề tài được thực hiện để đáp ứng tình hình

thực tế ấy, làm cơ sở cho nghiên cứu chẩn đoán và điều trị bệnh kịp thời.

1.2 . Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

1.2.1. Phân loại chi Vibrio

Vibrio thuộc chi vi khuẩn Gram âm, hình dấu phẩy và di động bằng tiêm mao

đơn cực dinh dưỡng theo phương thức dị dưỡng hữu cơ (Thompson và cộng sự,

2004). Chúng là loài lên men tùy tiện (facultative) và hầu hết dương tính với phản

ứng oxydase. Chi Vibrio được chia ra thành các loài không ưa mặn (V. cholerae) và

các loài ưa mặn (V. parahaemolyticus, V. alginolyticus). Chúng khác nhau về kích

cỡ, có thể là dài và mảnh hoặc ngắn và mập, dễ dàng sống trên môi trường chứa

dinh dưỡng và sống tốt khi môi trường giàu oxy. Hầu hết các loài Vibrio sống ở

30oC nhưng có một số loài ưa mặn sinh trưởng ở 37

oC và các loài V.

parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. cholerae có thể sinh trưởng ở 42oC. Các loài

Vibrio hầu hết sống trong môi trường trung tính nhưng chúng cũng có khả năng chịu

được môi trường kiềm, còn kém phát triển trong môi trường chứa acid. Chúng sinh

trưởng tốt trong khoảng pH từ 7,4 – 9,6, ức chế ở pH 6,8 và 10,2 (Rujiwat, 2007).

Các loài Vibrio chủ yếu sống ở nước và phân bố dựa vào nhiệt độ, nồng độ

Na+, hàm lượng dinh dưỡng có trong nước và sự có mặt của các loài thực vật và

động vật (McCarter, 1999). Chúng thường sống ở biển hoặc cửa sông, trên bề mặt

và trong ruột động vật biển. Người ta thường phân lập chúng từ các cặn trầm tích,

nước, thực vật và hải sản. Các loài hải sản là nơi an toàn cho các loài Vibrio sinh

sống, bao gồm các loài như trai, sò, cua, tôm, mực. Đối với các loài không ưa mặn,

chúng có thể được phân lập từ mẫu nước ngọt (Rujiwat, 2007).

Hầu hết các loài Vibrio phân lập từ các mẫu lâm sàng của người đều gây bệnh

ngoại trừ V. vurnissi. Vibrio spp. thường gây tiêu chảy hoặc nhiễm độc ngoài ruột

(extraintestinal infection), riêng V. cholerae có thể gây ra cả hai hiện tượng. Gần đây

các loài V. fluvialis, V. hollisae, V. minicus cũng liên quan đến gây bệnh ở người,

nhưng ít phổ biến. Các loài khác thuộc họ Vibrionaceae, gồm V. vulnificus,

8

AliiVibrio salmonicida và V. harveyi, là tác nhân gây bệnh trên các loài hải sản và

chúng gây ra thiệt hại lớn về kinh tế. Photobacterium profundum, đại diện cho một

chi khác trong họ Vibrionaceae, cũng được kể đến trong danh sách các loài gây

bệnh trên hải sản (Rujiwat, 2007).

Bảng 1.4. Các đặc tính khác nhau của các loài thƣờng gây bệnh trên ngƣời liên

quan đến việc tiêu thụ hải sản

** **

TCBS agar V V V V Km V X X X V X

mCPC agar Km Ti Km Km Km Km Km Km V Km Km

CC agar Km Ti Km Km Km Km Km Km V Km Km

AGS KA Ka KK KK Ka KK KA KA KA KK 0

Oxidase + + + + + − + + + + +

Arginine dihydrolase − − + + − + − − − + +

Ornithine

decarboxylase

+ + − − − − + + + − +

Lysine decarboxylase + + − − − + + + + T +

Khả

năng

chịu

muối

0% NaCl − + − − − − + − − + +

3% NaCl + + + + + + + + + + +

6% NaCl + − + + + + − + + + −

8% NaCl + − T + − T − − − − −

10% NaCl + − − − − − − − − − −

Phát triển ở 42°C + + T − 0 T + + + T +

Khả

năng

lên

men

Sucrose + + + + − + − − T T −

D-cellobiose − − + − − − − T + + −

Lactose − − − − − − − − + T −

Arabinose − − + + + − − + − T −

9

D-Mannose + + + + + + + + + T −

D-Mannitol + + + + − + + + T + −

ONPG − + + + − + + − + + −

Voges-

Proskauer

+ T − − − + − − − + −

Nhạy

với

10 µg O/129 K N K K 0 N N K N K N

150 µg O/129 N N N N 0 N N N N K N

Gelatinase + + + + − + + + + + −

Urease − − − − − − − T − − −

** Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides

Các từ viết tắt: V = vàng; Km = không mọc hoặc mọc rất ít; N = nhạy cảm; 0 = không làm;

X = màu xanh; T = tùy chủng (có thể mọc hoặc không mọc); K= kháng; Ti = màu tía (purple);

AGS = Arginine glucose slant; mCPC = Modified cellobiose polymyxin; KK = Slant alkaline

/ Butt alkaline (thạch nghiêng có kiềm); Ka = Slant alkaline/ Butt slightly acidic (sinh hơi);

KA = Slant alkaline /Butt acidic (thạch nghiêng có acid)

Nguồn: www.fda.gov

1.2.2 Đặc điểm của V. parahaemolyticus

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi

(Tế bào vi khuẩn có hình dấu phẩy, di động bằng lông mao đơn cực)

10

Phân loại khoa học của Vibrio parahaemolyticus:

Giới : Vi khuẩn

Ngành : Proteobacteria

Lớp: Gamma Proteobacteria

Bộ : Vibrionales

Họ: Vibrionaceae

Chi: Vibrio

Loài: V. parahaemolyticus

Theo khóa phân loại của Bergey, V. parahaemolyticus là một loại vi khuẩn

Gram âm, hình dấu phẩy, có tiêm mao ở một đầu, di động, kỵ khí tùy tiện và ưa môi

trường kiềm mặn. Chúng có thời gian thế hệ 8-9 phút (Daniels và cộng sự, 2000),

thường sống ở các cửa sông và ven biển của hầu hết các vùng trên thế giới. Người ta

cũng đã phân lập được chúng trong cát, bùn và nước biển, cũng như ở hải sản

(Maria và cộng sự, 2004).

Các đặc tính sinh hóa đặc trưng cho V. parahaemolyticus theo như mô tả trên

gồm: phản ứng oxydase (+), khả năng sử dụng lysin (+), ornithin (+), arginine (+),

khả năng lên men đường arabinose (+), lactose (-), sucrose (-), mannitol (+),

mannose (+), sống được trong phạm vi muối từ 3-8%, không mọc ở môi trường

không có muối (0%) hoặc muối quá cao (10%).

Các chủng V. parahaemolyticus phân lập có thể phân biệt nhau bằng kiểu

huyết thanh (serotyping). Hệ thống để xác định các kiểu huyết thanh của V.

parahaemolyticus dựa trên các cấu trúc kháng nguyên khác nhau của các nhóm

lipopolysaccharides (gọi tắt là nhóm O) và các loại nang (gọi tắt là các loại K)

(Joseph và cộng sự, 1983). Theo nguồn từ FDA, có 12 nhóm O và 65 loại K đã được

xác định (Bảng 1.5).

11

Bảng 1.5. Các kháng nguyên của V. parahaemolyticus (1986)

Nhóm O Loại K

1 1,25,26,32,38,41,56,58,64,69

2 3,28

3 4,5,6,7,27,30,31,33,37,43,45,48,54,57,58,59,65

4 4,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55,63,67

5 5,15,17,30,47,60,61,68

6 6,18,46

7 7,19

8 8,20,21,22,39,70

9 9,23,44

10 l9,24,52,66,71

11 36,40,50,51,61

12 52

Tổng số: 12 65

Các kiểu huyết thanh (O4: K48 và O1: K56, và O3: K6) chiếm ưu thế trong

các dịch bệnh (Nandini và cộng sự, 2000). Các chủng V. parahaemolyticus được

phân lập cùng một kiểu huyết thanh có thể giống nhau hoặc phân biệt với nhau.

Không phải tất cả các chủng V. parahaemolyticus đều gây bệnh ở người. Thực tế,

phần lớn các chủng phân lập từ môi trường hoặc hải sản không gây bệnh. Các chủng

gây bệnh thì sản xuất ra thermostable direct hemolysin (TDH). TDH là một enzyme

có thể làm tan (phá vỡ) các tế bào hồng cầu trên môi trường thạch máu Wagatsuma,

được gọi là hiện tượng Kanagawa. Vai trò của các độc tố trong cơ chế gây bệnh

chưa được biết rõ ( Kozo và cộng sự, 2003).

Dịch bệnh do V. parahaemolyticus gây ra có xu hướng tập trung dọc theo

vùng ven biển trong mùa hè và đầu mùa thu khi nhiệt độ nước cao hơn mức nhiệt độ

bình thường. Các loại thực phẩm liên quan đến các vụ ngộ độc thường là mực ống,

cá thu, cá ngừ, cá mòi, cua, tôm, và các loại động vật hai mảnh vỏ như hàu, sò, trai.

12

Thời kì ủ bệnh thường là 12 đến 24 giờ, kèm theo các triệu chứng nôn, mửa, đau

bụng, tiêu chảy đôi khi sốt. Các triệu chứng thường kéo dài trong 72 giờ, nhưng có

thể kéo dài đến 10 ngày đối với người có hệ thống miễn dịch suy giảm.

1.2.3. Các phƣơng pháp kiểm tra sự có mặt của V. parahaemolyticus

Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện V. parahaemolyticus như

dựa vào quan sát hình thái dưới kính hiển vi, các đặc tính sinh hóa và các kĩ thuật

sinh học phân tử như PCR, RAPD, miễn dịch phân tử.

Khi quan sát dưới kính hiển vi, V. parahaemolyticus có hình dấu phẩy, di

động bằng tiêm mao đơn cực. Về kích cỡ tùy thuộc vào chủng, có chủng thì dài,

mảnh hoặc ngắn, mập. Khi nhuộm Gram, chúng được phát hiện là Gram âm.

Các loài V. parahaemolyticus khi nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc

Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) có màu xanh lá cây hoặc màu xanh

đậm trên thạch (Kudo và cộng sự, 2003). Ngoài ra, V. parahaemolyticus còn phát

triển trên môi trường chọn lọc khác là CHROMagarTM

Vibrio cho thấy các khuẩn lạc

có màu tía hoặc tím.

Cuối cùng, V. parahaemolyticus có thể được phát hiện bằng các kĩ thuật sinh

học phân tử như PCR, RAPD, LAMP, RT- PCR.... Kỹ thuật PCR được sử dụng để

phát hiện V. parahaemolyticus trong các mẫu khác nhau bao gồm hải sản hoặc mẫu

nước. Phương pháp này thực hiện nhanh, dễ dàng và đáng tin cậy. Chính vì vậy, kỹ

thuật này được ứng dụng để khuếch đại các gen độc tố (toxR, tdh, trh). Gen tdh, trh

là các gen trực tiếp sản xuất ra các protein độc tố TDH, TRH. Còn gen toxR là gen

điều hòa operon độc tố, đoạn gen này là bảo tồn đối với V. parahaemolyticus (Kim

và cộng sự, 1999). Ngoài toxR, gen gyrB cũng là gen bảo tồn nên ta cũng có thể

thực hiện phản ứng PCR đối với đoạn gen này để xác định loài V. parahaemolyticus

(Zulkifli và cộng sự, 2009).

13

1.2.4. Khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus

V. parahaemolyticus là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm, như viêm

dạ dày ruột ở người thông qua tiêu thụ hải sản nấu chưa chín hoặc qua vết thương

tiếp xúc với động vật biển hoặc vùng nước ấm ven biển đặc biệt là ở Đông Nam Á

(Wong và cộng sự, 2000). Loài này có thế hệ thời gian ngắn (8-9 phút). Chúng chỉ

cần một thời gian ngắn có nhiệt độ tăng (khoảng từ 30 - 42oC, tối ưu là 37

oC) là đủ

để phát triển đến mức độ lây nhiễm (106 tế bào/ml) (Daniels và cộng sự, 2000).

Hầu hết các kết quả lâm sàng cho thấy bệnh do các chủng có mang gen

thermostable direct hemolysin (tdh), gen tdh - related hemolysin (trh) hoặc mang cả

hai gen. Loài vi khuẩn này gây bệnh không chỉ trên người mà còn là các đối tượng

hải sản như tôm, cá,...(Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004).

Khi gây bệnh trên người, sự lây nhiễm có thể qua đường ăn uống, lây nhiễm

từ người sang người do tiếp xúc với mầm bệnh (chất nôn, phân, dụng cụ,...), người

bệnh không rửa tay kỹ, ăn thực phẩm tươi sống hay chưa nấu chín. Đây là nguyên

nhân chủ yếu gây ra viêm dạ dày ruột (gastroenteritis) cấp tính. Sự lây nhiễm qua

vết thương cũng có, nhưng ít phổ biến hơn ngộ độc do ăn hải sản và thực phẩm bị

nhiễm chéo với các loại thực phẩm hải sản khác. Theo trung tâm an toàn thực phẩm

Hồng Kông, quá trình chế biến bị lây nhiễm hoặc nguồn nước sử dụng bị nhiễm và

xử lý không đúng cách. Ngoài ra, bơi lội hoặc làm việc ở vùng bị ảnh hưởng có thể

dẫn đến nhiễm trùng mắt hoặc tai và các vết thương hở .

Bên cạnh loài V. parahaemolyticus, các loài Vibrio khác cũng gây ra các vấn

đề nghiêm trọng trong hoạt động nuôi tôm và hầu hết là tác nhân gây bệnh trên vật

chủ hải sản. Các loài Vibrio được phân lập từ bệnh tôm là V. parahaemolyticus, V.

harveyi, V. alginolyticus, V.vulnificus, V. damsela, V. anguillarum và V. fluvialis

(Leangphibul và cộng sự, 1985; Lightner, 1988; Ruangpan và Kitao, 1991; Nash và

cộng sự, 1992; Jiravanichpaisal và cộng sự, 1994). Vibrio spp. đều có thể xâm nhập

và gây bệnh khi điều kiện môi trường thuận lợi đến các giai đoạn phát triển của tôm

như ấu trùng, hậu ấu trùng, tiền trưởng thành và trưởng thành.

14

1.2.5. Gen độc tố của V. parahaemolyticus

V. parahaemolyticus được công nhận là nhân tố gây ra viêm dạ dày ruột liên

quan đến sự tiêu thụ hải sản, nhưng không phải chủng nào của loài này cũng gây

bệnh. Một yếu tố độc tính từ lâu đã được coi liên quan đến dịch tễ học liên kết với

bệnh là hemolysin. Hemolysin là ngoại độc tố, tấn công vào màng tế bào máu và

làm tan tế bào. Hemolysin chuyển các ion liên kết với protein như hemolysin,

transferrin, lactoferrin thành dạng tự do. Các ion này (Fe3+

) sẽ liên kết với các phức

chất dạng chelator ở ngoài tế bào (Zhang và Austin, 1998). Trong nhiều trường hợp,

phạm vi tấn công của hemolysin không dừng ở các tế bào hồng cầu mà còn mở rộng

phạm vi đến các tế bào biểu mô, tế bào thần kinh và các tế bào nhân đa hình

(polymorphonuclear) làm tăng cường độc tố và gây phá hủy các mô. Kết quả của sự

phân giải này là giải phóng beta-hemolysin (phân hủy hoàn toàn hemoglobin) và

alpha-hemolysin (phân hủy không hoàn toàn hemoglobin). Hemolysin được sản xuất

bởi nhiều loài vi khuẩn khác nhau, bao gồm: Escherchia coli, Pseudomonas

aeruginosa và các loài Vibrio (Zhang và Austin, 1998). Với mỗi loài, hemolysin có

thể có cơ chế giống nhau hoặc khác nhau trong xâm nhiễm và gây độc.

V. parahaemolyticus trên môi trường thạch máu Wagatsumar đã sản xuất ra

beta-hemolysin. Hầu hết các chủng V. parahaemolyticus phân lập từ các mẫu lâm

sàng đều cho thấy hoạt tính tán huyết (hemolytic), hoạt tính này được gọi là hiện

tượng Kanagawa (KP) nhưng chỉ có 1-5% các chủng không từ nguồn lâm sàng lại

cho dương tính KP. Do vậy, hemolysin được xem là yếu tố độc tố quan trọng và

phản ứng KP được dùng để đánh dấu nhận biết cho các chủng độc hại. Hemolysin

này có tên là TDH (thermostable direct hemolysin), cấu trúc của nó không có lipid

hay carbonhydrat mà là một dimer, bao gồm hai tiểu đơn vị và mỗi tiểu đơn vị có

khối lượng 21 kDa (Takeda và cộng sự, 1978). Nó rất bền nhiệt, khi đun nóng ở

100oC trong 10 phút thì protein bị phân giải còn lại 165 amino acid với một cầu nối

disulfua gần nhóm carboxyl (–COOH) ở cuối cùng (Tsunasawa và cộng sự, 1987),

hoạt tính hemolysin tác động trực tiếp lên tế bào hồng cầu, ly giải phá vỡ hồng cầu.

TDH gây tiết chất dịch trong ruột cũng như gây ra độc tố cho một vài loại tế bào.

15

Honda và cộng sự (1992) đã chứng tỏ TDH phá vỡ tế bào eucaryote theo ba bước,

đầu tiên chúng liên kết với màng tế bào hồng cầu sau đó chúng tham gia tạo ra các

kênh lỗ màng (porin channel) ở tế bào ruột có đường kính khoảng 2 nm, cho phép

nhiều loại ion tràn vào như Na+, Mg

+, Ca

+. Khi TDH tăng lên thì cũng tăng lên các

kênh này làm cho các ion này tràn vào tự do và tế bào căng lên hết mức và phá vỡ tế

bào do mất cân bằng thẩm thấu.

Năm 1988, Honda và các đồng nghiệp phát hiện ra một hemolysin mới trong

khi phân lập các chủng lâm sàng KP dương tính (Honda và cộng sự, 1988).

Hemolysin này được gọi là TDH-related haemolysin (TRH), có tính chất hóa lý,

miễn dịch và sinh học tương tự như TDH. TDH và TRH được mã hóa bởi gen tdh và

trh tương ứng, chúng được coi là yếu tố độc tính quan trọng trong gây bệnh của V.

parahaemolyticus (Nishibuchi và cộng sự, 1992; Honda và Iida, 1993; Xu và cộng

sự, 1994). Gen tdh, trh lần lượt có kích thước 250 và 251bp. Giữa các chủng V.

parahaemolyticus có các gen độc tố khác nhau. Hầu như tất cả các mẫu lâm sàng có

tdh hoặc trh, hoặc cả hai, trong khi gần như tất cả các mẫu từ môi trường không có

(Shirai và cộng sự, 1990; Suthienkul và cộng sự, 1995; Iida và cộng sự, 1997) hoặc

có với tỉ lệ thấp 1-5% (Nishibuchi và Kaper, 1995, Robert và cộng sự, 2004).

Các chủng V. parahaemolyticus gây bệnh là các chủng KP dương tính, có

chứa gen tdh và gen trh mã hóa các protein độc tố TDH, TRH nằm trên operon độc

tố V. parahaemolyticus toxRS (Vp-toxRS), được điều hòa bởi gen toxR. Operon Vp-

toxRS có tên này là do cấu trúc và chức năng của nó tương tự với operon của V.

cholerae là toxRS, là bộ mã hóa cho gen nội độc tố tả. Giữa hai operon của hai loài

V. parahaemolyticus và V. cholerae chiếm lần lượt 52% và 62% trình tự tương

đồng. Giống operon toxRS của V. cholerae, operon Vp-toxRS không chỉ điều khiển

sự phiên mã của gen độc tố ruột tdh mà còn các gen khác nữa. Trình tự của operon

Vp-toxRS còn được phát hiện có trong tất cả các chủng V. parahaemolyticus

(Nishibuchi và cộng sự, 1995).

Ở các loài V. mimicus, V. cholerae, V. hollisae (Nishibuchi và Kaper, 1995)

có trình tự gen độc tố tdh, trh giống với gen độc tố tdh, trh ở chủng V.

16

parahaemolyticus gây bệnh nên trong nghiên cứu, Sujeewa và cộng sự (2009)

không chỉ xác định mỗi gen tdh, trh mà còn xác định gen toxR để chỉ ra chính xác

đây là loài V. parahaemolyticus. Gen toxR là gen điều hòa kiểm soát sự biểu hiện

của các gen mã hóa cho các nhân tố độc lực ngoại bào quan trọng và các gen liên

quan đến các độc tố khác. Gen toxR có kích thước 368 bp là gen điều hòa cho

operon Vp- toxRS (Zulkifli và cộng sự, 2009), tồn tại ở tất cả các chủng V.

parahaemolyticus.

Ở loài V. cholerae, gen toxR được biết là gen điều hòa dịch mã của gen ctx-

mã hóa cho độc tố tả. Các nghiên cứu sau đó cũng chỉ ra gen toxR là gen mã hóa

protein màng đóng vai trò chủ chốt trong điều hòa gen ctx và nhiều gen khác, bao

gồm gen tcp mã hóa độc tố lông mao (toxin-coregulated pili) và gen ompU, ompT

mã hóa các protein màng phía ngoài (OMPs) ở V. cholerae. Theo thống kê, gen toxR

biểu hiện đồng thời gen phá hủy tế bào máu và điều hòa biểu hiện OMP ở loài V.

vulnificus. Trình tự nucleotide được xác định tương đồng giữa ba gen toxR của ba

loài V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus là 52- 63%. Những điều này chỉ

ra rằng gen toxR là gen điều hòa kiểm soát sự biểu hiện của nhiều gen mã hóa cuả

nhiều loài trong chi Vibrio (Jun và cộng sự, 2001).

Chủng V. parahaemolyticus có hai nhiễm sắc thể I và II lần lượt có kích

thước 3,2 và 1,9 Mb, hoàn thành giải trình tự vào ngày 10 tháng 3 năm 2003, so

sánh với bộ gen của V. cholerae đã chỉ ra nhiều điểm tái sắp xếp trong mỗi nhiễm

sắc thể và giữa hai nhiễm sắc thể (Kozo và cộng sự, 2003).

Nhiễm sắc thể I dạng vòng có 3223 gen, chiều dài gồm 3.288.558 nucleotide,

mã hóa 3080 protein, hàm lượng GC 45%, số gen mã hóa là 86%.

Nhiễm sắc thể II có 1769 gen mã hóa nên 1752 protein, chiều dài gồm

1.877.212 nucleotide hàm lượng GC trong nhiễm sắc thể là 45%. Nhiễm sắc thể II

có chứa các gen độc tố tdh, trh.

17

Hình 1.2. Hai nhiễm sắc thể dạng vòng của V. parahaemolyticus

(Từ ngoài vào trong, mỗi một vòng tròn và mỗi một màu sắc là các vùng gen

quy định các chức năng riêng của gen trong nhiễm sắc thể)

T3SS (Type III Secretion System) là một trong những hệ thống bài tiết ra các

protein của vi khuẩn vào môi trường ngoại bào hoặc vi khuẩn cũng có thể tiêm

những protein này vào tế bào vật chủ eucaryote của chúng. T3SS cần thiết cho phát

sinh bệnh ở các loài vi khuẩn gây bệnh. T3SST không xuất hiện ở bộ gen vi khuẩn

Nhiễm sắc thể số 2

Nhiễm sắc thể số 1

18

V. cholerae. Qua các thí nghiệm phân tích về bộ gen, người ta cho thấy ở loài V.

parahaemolyticus có hai hệ thống T3SS (Thomson và cộng sự, 2004), chúng đóng

vai trò trong phát sinh bệnh của vi khuẩn này (Honda và cộng sự, 2006). Đó là

T3SS1 và T3SS2, mỗi một hệ thống phân bố lần lượt ở hai nhiễm sắc thể I và II. Jun

và cộng sự (2001) đã báo cáo một đảo gen gây bệnh Vp-PAI dài 80 kp trên nhiễm

sắc thể II bảo tồn trong các chủng KP (+) và không có trong KP (-) (Kodama và

cộng sự, 2010). Vp-PAI không chỉ chứa gen tdh mà còn chứa cụm gen T3SS2. Do

vậy, Vp-PAI liên quan đến phát sinh bệnh của V. parahaemolyticus gây ra ở người.

1.3. Mục tiêu và tính cấp thiết của đề tài

1.3.1. Mục tiêu

Phân lập và định danh loài V. parahaemolyticus ở các chợ thành phố Nha

Trang có mặt trong một số hải sản tươi sống (tôm, mực, cá, cua…).

Xác định gen độc tố của vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật PCR, tạo cơ sở

khoa học cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh sớm.

1.3.2. Tính cấp thiết

Hiện nay hải sản đang là món ăn được nhiều người chú ý đến bởi thành phần

dinh dưỡng và khẩu vị của nó. Người ta cũng đã chế biến ra rất nhiều món hải sản

mới lạ như nướng, tái,… để kích thích nhu cầu đó. Đi đôi với việc tiêu thụ các món

này ngày càng nhiều thì các vụ ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng. Tuyet và cộng

sự (2002) báo cáo đã có 548 ca nhiễm bệnh do V. parahaemolyticus gây ra được xác

định giữa 1/1995 đến 9/2001 ở Khánh Hòa. Tình hình ngộ độc thực phẩm do ăn hải

sản tươi sống không được chế biến kĩ đã được các phương tiện truyền thông đưa tin

nhiều, nhưng bản chất sinh học của nó vẫn chưa được quan tâm đầy đủ. Khi ngộ độc

xảy ra, bệnh nhân không được đưa đi cấp cứu kịp thời có thể dẫn tới tử vong. Các

nghiên cứu cơ bản trong nước còn rất ít, vì vậy, việc nghiên cứu về gen độc tố tạo

cơ sở cho việc xây dựng phương pháp chẩn đoán để kiểm soát bệnh và để sản xuất

ra thuốc điều trị kịp thời, tiện dụng là rất cần thiết.

Đề tài tiến hành nghiên cứu ở mức độ phân tử, là bước đầu tạo cơ sở khoa

học để nghiên cứu chẩn đoán và điều trị (sản xuất thuốc) đáp ứng nhu cầu về bệnh

học thực phẩm.

19

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Mẫu

Mẫu hải sản (tôm bạc, tôm sú, cua biển, mực ống) được thu mua từ các chợ ở

Nha Trang: chợ biển (Bãi Dương), chợ Vĩnh Hải, chợ Vĩnh Thọ từ 15/03 đến

15/04.

Bảng 2.1. Các mẫu hải sản thu mua từ một số chợ ở thành phố Nha Trang

dùng để phân lập vi khuẩn Vibrio

STT Ngày lấy mẫu Địa điểm Số lƣợng mẫu lấy

Tôm Cua Mực

1 15.03.2010 Vĩnh Hải 3 2

2 08.04.2010 Vĩnh Thọ 3 2

3 15.04.2010 Chợ biển

(Bãi Dương)

3 3

2.1.2. Thiết bị chuyên dụng

Máy ly tâm ( Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ)

Máy PCR ( IQTM

5Biorad, Mỹ)

Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)

Thiết bị điện di (Biorad, Mỹ)

Kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300, Mỹ)

Máy định lượng protein bằng quang phổ hấp thụ phân tử (UV/VIS)

(Carry 100 Bio, Úc)

Máy lắc (GFL 3005, Đức)

Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha)

Tủ sấy (Binder, Đức)

Nồi khử trùng autoclave (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan)

Lò vi sóng phá mẫu (LG, Hàn Quốc)

20

Máy chụp và phân tích ảnh gel (VWRTM

, Mỹ)

Máy block nhiệt (VWRTM

, Mỹ)

2.1.3. Hóa chất, môi trƣờng và thuốc thử

Các hóa chất chuyên dụng :

DNA marker 100 bp (Biorad, Mỹ), Ethidium bromide 10 mg/ml, proteinase

K 20 mg/ml; Rnase 4 mg/ml.

Môi trƣờng tăng sinh: Ankaline Peptone Water (APW)

Pepton : 10 g; Natri clorua (NaCl) : 30 g

Nước cất : 1 lít ; pH = 8,5 ± 0,2

Hoà tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình tam

giác. Hấp ở nhiệt độ 121oC trong 10 phút. Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để

tránh bay hơi nước và pH bị thay đổi.

Môi trƣờng phân lập: Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS)

Pepton : 10 g; Cao nấm men : 5 g;

Natri xitrat : 10 g; Natri thiosunphat (Na2S2O3): 10 g;

Mật bò : 5 g; Sucrose : 20g;

NaCl : 10 g; Sắt (III) citrate (FeC6H5O7) : 1 g;

Natri cholate : 3 g; Xanh bromthymol :0,04 g;

Xanh thymol : 0,04 g; Thạch : 15 g ;

Nước cất vô trùng: 1 lít pH = 8,6 ± 0,2

Đun sôi môi trường trong bình tam giác ở 100oC trong lò vi sóng cho đến khi

tan hoàn toàn các thành phần môi trường.

Môi trƣờng nuôi cấy Luria Bertani (LB)

Trypton : 10 g; Natri clorua (NaCl) : 30 g;

Cao nấm men : 5 g; Nước cất : 1 lít

21

pH = 7 ± 0,2

Hoà tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình chứa

thích hợp. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút. Khi bảo quản phải vặn chặt nắp

bình, để tránh bay hơi nước và pH bị thay đổi.

Môi trƣờng kiểm tra khả năng chịu muối: muối trypton có giải nồng độ

NaCl là 0; 3; 6; 8 và 10 % NaCl (ký hiệu lần lượt là: T1N0; T1N3; T1N6; T1N8 và

T1N10).

Hoà tan 10 g trypton trong 1 lít nước cất. Sau đó, thêm lần lượt : 30, 60, 80

và 100 g NaCl để được các canh thang trypton có giải nồng độ NaCl 0; 3; 6; 8 và 10

%. Sau đó, khuấy đều, rồi chỉnh pH sao cho môi trường sau khi hấp có pH = 7,2 ±

0,2. Tiến hành rót 5 ml môi trường vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C

trong 15 phút. Các ống môi trường phải được nút chặt trong quá trình bảo quản để

tránh bốc hơi nước làm thay đổi nồng độ muối.

Môi trƣờng thử decarboxylase (Môi trƣờng cơ bản)

Pepton : 5 g; NaCl : 30 g;

Cao nấm men : 3 g; Glucose : 1 g ;

Phenol đỏ : 0,02 g; Nước cất : 1 lít

pH = 7,0 ± 0,2

Tuỳ theo loại môi trường cần pha, thêm 5 g của một trong các loại amino

acid: L-lysin hoặc L-arginin hoặc L-ornithin vào môi trường cơ bản trên. Sau đó, rót

5 ml môi trường vào các ống nghiệm, nới lỏng nắp. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10

phút. Các ống phải được nút chặt trong khi bảo quản và sau khi cấy.

Môi trƣờng lên men đƣờng (Môi trƣờng cơ bản)

Pepton : 10 g; NaCl : 30 g;

Cao thịt bò : 3 g; Phenol đỏ : 0,04 g;

Nước cất : 1 lít; pH = 7,0 ± 0,2

22

Hoà tan các thành phần trên, chỉnh pH rồi rót 2,5 ml vào các ống nghiệm.

Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút.

Pha các loại dung dịch cacbonhydrat 50% (như: sucrose, lactose, arabinose,

D-mannitol và mantose) trong nước cất rồi lọc vô trùng. Thêm 0,278 ± 0,002 ml

dung dịch này vào ống nghiệm chứa 2,5 ml môi trường cơ bản. Môi trường cuối

cùng có nồng độ carbohydrat là 5%.

Dung dịch nƣớc muối sinh lý

Hoà tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nước cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C

trong 15 phút rồi để nguội.

Thuốc nhuộm Tím Violet

Tím violet : 1 g

Rượu ethylic : 1 g

Phenol tinh thể : 2g

Nước cất : 100 ml

Pha chế:

Hòa tan 1 g tím violet vào trong 10 ml cồn (dung dịch 1)

Hòa tan 2 g phenol tinh thể vào 10 ml nước cất (dung dịch 2)

Trộn chung dung dịch 1 và dung dịch 2 lại với nhau ta có dung dịch thuốc

nhuộm tím violet

Thuốc nhuộm Liugol

Iod tinh thể : 1 g

KI : 2 g

Nước cất : 200 ml

Pha chế: Hòa tan iod vào nước cất, sau đó cho KI vào, bảo quản trong lọ tối màu.

Thuốc nhuộm Fuschin

Fuschin kiềm : 1g

Rượu ethylic 95% : 10 ml

Phenol tinh thể : 5g

23

Nước cất : 100 ml

Pha chế:

Hòa tan Fuschin vào trong 10 ml cồn 95% (dung dịch 1).

Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nước cất (dung dịch 2).

Trộn đều dung dịch 1 và dung dịch 2 đem lọc, ta có thuốc nhuộm Fuschin.

Dung dịch xanh methylen

Rượu ethylic :300 ml

Xanh methylen : 25 g

Hòa tan xanh methylen vào rượu rồi lọc (dung dịch 1).

Dịch lọc 1 thêm 1 ml KOH 1% và 1000 ml nước cất.

24

2.2. Nội dung nghiên cứu

Quy trình thực hiện được sơ đồ hóa trong hình 2.1:

Hình 2.1. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài

Đồng nhất

mẫu

Ủ Pha

loãng

Cấy

trang

Cấy

ria

Khuẩn lạc

thuần chủng

Khả năng

ưa muối

Khả năng

lên men

đường

Khả năng sử

dụng lysin

Giữ giống

ở -80OC

Xác định gen độc tố bằng

kỹ thuật PCR

Tuyển chọn vi khuẩn

V. parahaemolyticus

Nhuộm Gram Soi tươi

Phân lập Vibrio

Mẫu

Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn

Kiểm tra các đặc tính sinh hóa

25

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phân lập vi khuẩn V. parahaemolyticus

Xử lý mẫu:

- Mẫu:

+ Tôm: Thu lấy phần nội tạng (ruột, gan, tụy,…) của từng mẫu cho vào túi

PE vô trùng.

+ Cua: Lột vỏ, thu lấy phần nội tạng (gạch, ruột, gan, tụy,…) cho vào túi PE

vô trùng.

+ Mực: Rút đầu, thu lấy phần nội tạng (ruột,…) cho vào túi PE vô trùng.

Tùy vào khối lượng của từng mẫu thêm vào dung dịch APW với thể tích

thích hợp theo tỉ lệ 1:9.

- Đồng nhất mẫu: Chuẩn bị mẫu xong, cho vào túi PE có chứa mẫu và APW,

đem đi đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Thời gian đồng nhất mỗi mẫu từ 90 đến

120 giây.

- Ủ mẫu đã dập với APW ở 370C trong thời gian 6-8 giờ trong tủ ấm.

- Pha loãng dịch ủ:

+ Rót 9 ml dung dịch nước muối sinh lý đã hấp khử trùng vào các ống

nghiệm.

+ Hút 1ml dịch mẫu đã ủ từ các túi PE vào ống nghiệm, thu được dịch mẫu

pha loãng với nồng độ 10-1

, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều.

+ Từ ống nghiệm 10-1

, pha loãng ra ống nghiệm có nồng độ thấp hơn 10-2

bằng cách hút 1ml từ ống nghiệm 10-1

cho vào 9 ml dung dịch nước muối sinh lý đã

hấp khử trùng ở ống nghiệm khác, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều, thu được ống

nghiệm có độ pha loãng mẫu 10-2

, tiếp tục làm tương tự, ta có các ống nghiệm có độ

pha loãng mẫu 10-3

, 10-4

, 10-5

, 10-6

.

- Cấy trang:

+ Thao tác trong tủ cấy vô trùng, môi trường vô trùng, các dụng cụ đã sấy

tiệt trùng ở 1600C/120 phút và các thao tác vi sinh làm bên cạnh ngọn lửa đèn cồn.

26

+ Ðun sôi môi trường TCBS để hoà tan hoàn toàn các thành phần rồi để

nguội tới nhiệt độ khoảng 400C. Rót 15 - 20 ml vào các đĩa petri vô trùng. Để khi

thạch trong đĩa nguội hoàn toàn rồi bắt đầu cấy.

+ Hút 100 µl dịch mẫu các nồng độ từ ống nghiệm cho vào các đĩa Petri có

thạch đã đánh dấu tương ứng.

+ Dùng que cấy trang trang đều dịch mẫu ra bề mặt thạch, sau đó lật úp các

đĩa Petri lại.

+ Dùng giấy báo bao gói kín các đĩa Petri lại, đem đặt trong tủ ấm trong tư

thế các đĩa Petri nằm úp.

+ Sau 24 giờ, quan sát các khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch.

- Cấy ria khuẩn lạc trên TCBS:

+ Môi trường TCBS đã nấu sẵn, đợi nguội khoảng 40-45OC, đổ 10-15 ml ra

các đĩa petri đã sấy sẵn, đợi cho thạch nguội và đông lại.

+ Sau khi cấy trang, chọn các khuẩn lạc có hình thái đặc trưng với vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus trên môi trường thạch TCBS, khuẩn lạc có màu xanh, rìa

tròn xanh nhạt, tâm xanh đậm, đường kính khuẩn lạc khoảng 2- 4 mm.

+ Dùng que cấy thu sinh khối các khuẩn lạc đã chọn, cấy ria thành 3 đường

trên đĩa thạch cho đến khi các khuẩn lạc thuần chủng được tạo ra.

+ Sau khi cấy, lật ngược đĩa thạch lại, bao gói bằng giấy báo và để tư thế đĩa

thạch như vậy trong tủ ấm 37OC trong 24 giờ.

2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn Vibrio

a. Soi tƣơi

Mục đích: Quan sát hình thái, sự chuyển động của vi khuẩn.

Tiến hành:

- Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001 % lên phiến kính.

- Nhỏ một giọt canh trường lên thuốc nhuộm.

- Đậy lamen.

Đem quan sát với vật kính (X-40), (X-100).

27

b. Nhuộm Gram

Mục đích: Xác nhận vi khuẩn Gram âm.

Tiến hành:

- Dùng bút viết kính vẽ 1 đường tròn lên lam kính để giới hạn vùng phết vi

khuẩn.

- Nhỏ 1 giọt nước từ bình tia vào vòng tròn đã vẽ.

- Dùng que cấy thu sinh khối từ khuẩn lạc chọn lọc, rồi đưa vào lam kính,

dàn đều vi khuẩn, để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn, tránh để lâu quá

nóng sẽ làm tế bào vi khuẩn vỡ ra, làm lệch kết quả quan sát.

- Nhỏ vài giọt tím tinh thể (tím violet) lên tiêu bản, để trong 30 giây đến 1 phút.

- Nghiêng đổ rồi rửa lại nước.

- Nhuộm màu tiêu bản bằng thuốc nhuộm Lugol trong thời gian 30 giây đến

1 phút, rồi rửa nhẹ với nước bằng bình tia.

- Rửa tiêu bản vừa nhuộm với cồn 90o

cho đến khi phiến kính bạc màu trong

khoảng 10-15 giây, rồi rửa lại với nước.

- Nhuộm tiếp tiêu bản với Fuchsin trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa

lại với nước.

- Để khô tự nhiên hoặc dung giấy thấm lau tiêu bản cho sạch xung quanh

vùng vi khuẩn, sau đó đưa lên vật kính dầu quan sát X -100.

2.3.3. Xác định khả năng sinh trƣởng

Mục đích:

- Xây dựng đường cong sinh trưởng (đường chuẩn) của vi khuẩn Vibrio.

- Test sinh hóa.

- Giữ giống.

Nguyên lý:

Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bằng cách đo mật độ

quang (OD) ở bước sóng 600 nm. Dựa vào đường chuẩn để xác định các pha sinh

trưởng của vi khuẩn, từ đó tiến hành các bước giữ giống, test sinh hóa cho đúng với

các giai đoạn phát triển của tế bào.

28

Tiến hành:

- Pha môi trường tăng sinh vi khuẩn APW 3% NaCl.

- Cấy các chủng vi khuẩn đã chọn lọc vào môi trường.

- Nuôi cấy tĩnh các chủng vi khuẩn trên máy lắc ở 150 vòng/ phút trong vòng 36 giờ.

- Tiến hành đo OD600 từ lúc cấy vào và cứ mỗi 2-3 giờ đo một lần.

- Dựng đường cong sinh trưởng của các chủng Vibrio.

2.3.4. Xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng Vibrio

a. Xác định khả năng chịu muối của vi khuẩn Vibrio

Mục đích: Kiểm tra khả năng sống của vi khuẩn ở các nồng độ muối, đặc

biệt là nồng độ 3% vì đây là nồng độ thích hợp để vi khuẩn phát triển.

Bố trí thí nghiệm:

- Môi trường canh thang trypton muối được pha ở các nồng độ muối 0%,

3%, 6%, 8%, 10% và được kí hiệu tương ứng thành T1N0, T1N3, T1N6, T1N8, T1N10

đem hấp khử trùng ở 121OC trong thời gian 15 phút.

- Rót 10ml môi trường đã hấp vào các ống nghiệm đã sấy để nguội, ta có

mỗi chủng cần 5 ống nghiệm (5 ống chứa môi trường ở mỗi nồng độ muối) và 1

ống đối chứng âm.

- Dùng que cấy vô trùng thu sinh khối khuẩn lạc của các chủng, cấy vào môi

trường trypton muối khác nhau trong các ống nghiệm tương ứng.

- Ủ các ống nghiệm đã cấy trong tủ ấm 37OC. Quan sát từng ngày trong 5 ngày.

- Các thao tác vi sinh được làm vô trùng trong tủ cấy vô trùng, bên cạnh

ngọn lửa đèn cồn.

b. Xác định khả năng lên men đƣờng của các chủng Vibrio

Mục đích:

Kiểm tra khả năng lên men các loại đường lactose, arabinose, sucrose,

mantose, mannitol của vi khuẩn.

29

Nguyên lý:

Sản phẩm của quá trình lên men có thể là các loại acid hữu cơ, các loại rượu

hay các loại khí, các sản phẩm này sẽ làm thay đổi pH môi trường. Dựa vào sự thay

đổi màu của chỉ thị để đánh giá khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn.

Bố trí thí nghiệm:

- Pha môi trường cơ bản và pha các loại carbonhydrate 50%: sucrose,

lactose, mantose, arabinose, mannitol trong nước cất, đem hấp khử trùng 121OC

trong 10 phút.

- Môi trường cơ bản chứa chất chỉ thị là phenol đỏ, chất này có màu đỏ khi pH

nằm trong khoảng 7,4 ± 0,2. Màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH dưới 6,8.

- Rót 5 ml môi trường cơ bản vào các ống nghiệm. Thêm 0,5 ml dung dịch

từng loại đường vào từng ống nghiệm tương ứng sao cho môi trường cuối cùng có

nồng độ carbonhydrate là 5%.

- Đậy nút bông và giấy bạc lại ở mỗi ống nghiệm cho kín.

- Dùng que cấy vô trùng thu sinh khối khuẩn lạc các chủng, cấy vào các ống

nghiệm môi trường chứa các loại đường.

- Ủ các ống nghiệm đã cấy trong tủ ấm 37OC. Quan sát từng ngày trong 5 ngày.

- Các thao tác vi sinh được làm vô trùng trong tủ cấy vô trùng, bên cạnh

ngọn đèn cồn.

- Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.

c. Xác định khả năng sử dụng decarboxylase lysin (LCD) của các chủng Vibrio

Mục đích: Kiểm tra khả năng sử dụng lysin.

Nguyên lý:

Enzyme xúc tác thủy phân lysin sẽ được cảm ứng tổng hợp, chúng xúc tác

loại bỏ CO2 khỏi lysin, dẫn đến sự tạo thành cadaverine. Khí CO2 được phóng thích

sẽ làm thay đổi pH môi trường. Dựa vào sự thay đổi màu của chỉ thị để đánh giá

khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn. Môi trường cơ bản chứa chất chỉ thị

là phenol đỏ, chất này có màu đỏ khi pH nằm trong khoảng 7,4 ± 0,2. Màu đỏ sẽ

chuyển thành màu vàng khi pH dưới 6,8.

30

Bố trí thí nghiệm:

- Pha môi trường cơ bản chứa lysin rồi rót 5 ml môi trường vào các ống nghiệm.

- Đậy nút bông và giấy bạc lại ở mỗi ống nghiệm cho kín, đem hấp khử trùng

121OC trong 10 phút.

- Dùng que cấy vô trùng thu sinh khối khuẩn lạc các chủng, cấy vào các ống

nghiệm môi trường

- Ủ các ống nghiệm đã cấy trong tủ ấm 37OC. Quan sát từng ngày trong 5 ngày.

- Các thao tác vi sinh được làm vô trùng trong tủ cấy vô trùng, bên cạnh

ngọn đèn cồn.

2.3.5. Bảo quản chủng vi khuẩn.

Mục đích: Bảo quản các chủng vi khuẩn để sử dụng trong thời gian dài (3-6 tháng).

Tiến hành:

Nuôi cấy vi khuẩn trong các bình tam giác chứa môi trường lỏng, lắc 150

vòng/phút trong 24 giờ. Chia nhỏ huyền phù tế bào vào trong từng ống eppendorf

1,5 ml sau đó thêm vào glycerol theo tỉ lệ 7: 3. Vortex nhẹ cho đều hỗn hợp, rồi

đem bảo quản ở -80OC.

2.3.6. Tách chiết DNA hệ gen từ tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus

Mục đích:

Thu được dung dịch DNA hệ gen tinh sạch có nồng độ đáp ứng cho yêu cầu

chạy PCR.

Tiến hành:

- Từ 3 chủng vi khuẩn chọn lọc ta nuôi cấy riêng lẻ trong môi trường LB 3%

NaCl lỏng lắc trong 18 giờ nhằm tăng sinh sinh khối vi khuẩn.

- Chuyển 1,5 ml huyền phù tế bào vào eppendorf 1,5 ml

- Ly tâm dịch huyền phù ở 13.000 vòng trong 2 phút ở 4OC

- Loại bỏ dịch nổi, thêm vào 275 µl dung dịch phá mẫu, vortex

Dịch phá mẫu gồm (proteinase K 20mg/ml 10µl, Rnase 4mg/ml 5µl;

đệm TE 1X 210 µl )

31

- Ủ mẫu trên block nhiệt 56oC trong 30 phút, vortex

- Ly tâm huyền phù tế bào ở 13.000 vòng trong 3 phút ở 4OC

- Thu dịch nổi, chuyển sang ống mới chứa cột lọc DNA.

- Rửa DNA: Thêm vào 650 µl dung dịch rửa mẫu (chứa 95% ethanol) vào

mỗi ống. Ly tâm dịch ở 13.000 vòng trong 1 phút ở 4OC. Loại bỏ chất lỏng trong

ống, giữ lại cột lọc chuyển sang ống mới. Lặp lại bước này một lần.

- Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml mới. Thêm vào 250 µl dung dịch Nuclease

– Free Water để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Ly tâm eppendorf có ống cột lọc

chứa DNA ở 13.000 vòng trong 2 phút để để thôi DNA từ cột lọc xuống đáy ống.

- Thu được DNA mẫu, bảo quản ở 40C cho đến khi chạy phản ứng PCR.

2.3.7. Xác định gen độc tố bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Nguyên lý phản ứng:

Phương pháp PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1986 – đây là một

quy trình dựa trên sự hoạt động của enzyme Taq polymerase hoạt động tổng hợp

mạch DNA mới từ mạch khuôn và mồi đặc hiệu, số lượng DNA đích sẽ tăng theo

mỗi chu kì của phản ứng.

Một chu kì gồm 3 bước: bước đầu tiên là biến tính ở 91°–97°C, là bước làm

biến tính mẫu DNA kép thành các chuỗi đơn; bước thứ hai là bắt cặp mồi ở 40°–

65°C, các đoạn mồi oligonucleotide ngắn gắn với các chuỗi DNA đơn; bước thứ 3

là kéo dài ở 68°–73°C, enzyme Taq polymerase (thermostable DNA polymerase)

xúc tác tổng hợp một chuỗi DNA mới bằng sự kéo dài chuỗi mồi.

Phản ứng đòi hỏi hai đoạn mồi ngắn (oligonucleotides) để khuyếch đại trình

tự DNA đích. Trong suốt phản ứng, sự có mặt của các dNTP tự do: dATP, dCTP,

dGTP và dTTP sẽ liên kết với đầu 3’OH đã được hoạt hóa mang năng lượng ở mồi.

Cuối cùng, số lượng các bản DNA sao chép tăng lên gấp đôi ở mỗi chu kỳ.

Đây là sự khuyếch đại theo cấp số nhân. Theo lý thuyết, kết quả sau n chu kỳ của

phản ứng sẽ có 2n bản sao phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi.

Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR được thiết kế theo Marlina và cộng

sự (2007) và có các đặc điểm được trình bày trong bảng 2.2.

32

Cặp mồi 1: ToxR

toxR-F: 5´-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3´

toxR-R: 5´-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3´

Cặp mồi 2: Tdh

tdh-F: 5´-GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC-3´

tdh-R: 5´-TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC-3´

Bảng 2.2. Đặc điểm các mồi sử dụng cho phản ứng PCR

S

T

T

Tên mồi

Kích

cỡ

(bp)

Trọng

lượng

(g/mole)

Nồng độ

(nmoles )

Thể tích đệm

thêm

vào (µl)

Nồng độ

gốc

(mM)

Nồng độ

cuối

(µM)

1 toxR-F 20 6099,0 31,4 62,8 0,5 10

toxR-R 21 6492,3 25,8 51,6 0,5 10

2 Tdh-F 23 7069,6 33,0 66,0 0,5 10

tdh-R 24 7271,8 31,4 62,8 0,5 10

Phản ứng PCR được chuẩn bị trong một thể tích 50 µl với các thành phần

được trình bày trong bảng 2.3 và được chạy theo chu kì nhiệt trong hình 2.2.

Bảng 2.3. Các thành phần sử dụng trong phản ứng PCR

Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl)

Nước cất (dH20) 38

MgCl2 50 mM 2 mM 2

dNTP 10 µM 0,4 µM 2

Mồi F 10 µM 0,1 µM 0,5

Mồi R 10 µM 0,1 µM 0,5

Đệm Taq 10X 1X 5

DNA hệ gen vi khuẩn 2-20 ng 2

Taq polymerase 1,25 đơn vị 0,25

Tổng 50 µl

33

Hình 2.2. Sơ đồ chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR

2.3.8. Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di

Mục đích: Phân tách các sản phẩm PCR từ gen toxR, tdh trên gel agarose.

Nguyên lý:

Dưới tác động của điện trường, các phân tử DNA (tích điện âm) khác nhau

về kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch

vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực âm (cathode) sang cực dương

(anode) với tốc độ di chuyển khác nhau nên chúng dần dần tách nhau ra trên trường

điện di. Qua đó ta có thể phân tách được từng đoạn DNA hoặc gen riêng rẽ. Trên

điện trường các phân đoạn DNA có kích thước càng nhỏ thì có tốc độ di chuyển

trên điện trường nhanh hơn.

Sau khi điện di kết thúc, các phân tử DNA có thể quan sát thấy nhờ sử dụng

thuốc nhuộm phát huỳnh quang ethidium bromide. Chất này vào sau khi gel đã nấu

để nguội đến 45oC, nó có tác dụng gắn kết với DNA bằng cách cài vào khe ở giữa

các nucleotide và chúng sẽ được phát sáng khi soi dưới tia UV. Mỗi một băng điện

di phản ánh một tập hợp các phân tử DNA có cùng kích thước.

Tiến hành

Lấy 0,6 g agarose và thêm vào 40 ml đệm TBE 0,5X (gel agarose 1,5%) vào

trong bình tam giác 100ml, đun đến sôi và tan hoàn toàn. Sau đó để nguội khoảng

34

50oC, rồi thêm 2µl ethidium bromide 10mg/ml vào gel, lắc đều bình. Khi nhiệt độ

hạ xuống khoảng 40 – 45oC, đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lược. Khi gel nguội hoàn

toàn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lược ra. Cho gel vào bồn điện di và thêm đệm

TBE 0,5X cho đến khi ngập bản gel. Trộn đều 10 µl mẫu vừa chạy PCR với 2 µl

chất nhuộm tải mẫu (loading dye 6X) cho nhẹ vào các giếng thứ 2, 3 cho đến giếng

thứ 7. Giếng đầu tiên cho marker 1kp. Tiến hành chạy điện di với nguồn 120 V

trong 40 phút. Đọc kết quả trên máy chụp và phân tích hình ảnh gel.

35

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập vi khuẩn vi khuẩn Vibrio từ thực phẩm hải sản

Hình 3.1. Các khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio sau một ngày (24 giờ) nuôi trên

môi trƣờng thạch TCBS ở điều kiện pH 8,5 và nhiệt độ 37O

C

Các khuẩn lạc vi khuẩn được phân lập từ mẫu tôm (A) có tỉ lệ khuẩn lạc màu

xanh cao trong khi các khuẩn lạc được phân lập từ cua (B) có tỉ lệ khuẩn lạc màu

vàng cao hơn.

Hình 3.2. Các khuẩn lạc chủng C2 màu xanh (A) và khuẩn lạc chủng

C13 màu vàng sữa (B)

A B

A B

36

Bảng 3.1. Mật độ tế bào và đặc điểm hình thái của các chủng Vibrio đƣợc phân

lập từ các mẫu hải sản ở chợ Vĩnh Hải, Vĩnh Thọ, chợ biển (Bãi Dƣơng)

S

T

T

Tên chủng Nguồn gốc

Mật độ tế

bào

(CFU/gam )

Đặc điểm hình thái

1 Chủng 1

(C1)

Tôm bạc

(Matapenaeu) 0,6.10

7

Khuẩn lạc có màu xanh: viền xanh

nhạt, tâm xanh đậm, trơn bóng, bờ

tròn đều, đường kính 1-2 mm.

2 Chủng 2

(C2)

Tôm bạc

(Matapenaeu) 7,7. 10

6

Khuẩn lạc có màu xanh: viền xanh

nhạt, tâm xanh đậm, trơn bóng, bờ

tròn đều, đường kính 1-2 mm.

3 Chủng 3

(C3)

Cua biển

(Scylla serrata) 7,4.107

Khuẩn lạc có màu vàng, to, trơn

láng, bờ tròn đều, đường kính

khoảng 3-4 mm.

4 Chủng 4

(C4)

Cua biển

(Scylla serrata) 5,3.107

Khuẩn lạc có màu xanh nhạt, bờ

tròn đều, láng, đường kính nhỏ 1,5

mm.

5 Chủng 5

(C5)

Cua biển

(Scylla serrata) 0,6. 107

Khuẩn lạc hình tròn, viền vàng nhỏ,

tâm đen, trơn bóng, đường kính

khuẩn lạc khoảng 1mm.

6 Chủng 6

(C6)

Tôm sú

(Penaeus

monodon)

9,1.107

Khuẩn lạc hình tròn, nhỏ, có màu

vàng nhạt, trơn bóng, đường kính

khuẩn lạc khoảng 1mm.

7 Chủng 7

(C7)

Tôm bạc

(Matapenaeu) 0,4.10

8

Khuẩn lạc có màu xanh đậm, trên bề

mặt khuẩn lạc có các những chấm

cùng màu xanh này, trơn bóng 3-4

mm.

8 Chủng 8

(C8)

Tôm sú

(Penaeus

monodon)

1,62.108

Khuẩn lạc có màu vàng tối , trơn

bóng, đường kính khoảng 2-3 mm.

9 Chủng 9

(C9)

Tôm sú

(Penaeus

monodon)

0,11. 106

Khuẩn lạc có màu vàng xanh, bờ

tròn đều, láng, đường kính nhỏ.

10 Chủng 10

(C10)

Tôm bạc

(Matapenaeu) 6,6.10

7

Khuẩn lạc có viền vàng, tâm đỏ,

trơn, nhầy, đường kính 2-3 mm.

11 Chủng 11 Tôm bạc

(Matapenaeu 2,5.10

7

Khuẩn lạc có viền xanh vàng, tâm

xanh nhỏ, đường kính 2-3 mm.

37

(C11)

12 Chủng 12

(C12)

Tôm sú

(Penaeus

monodon)

1,4.108

Khuẩn lạc màu vàng nhạt, đường

kính rất nhỏ, trơn bóng.

13 Chủng 13

(C13)

Tôm bạc

(Matapenaeu 1,2.10

8

Khuẩn lạc có màu vàng sữa, bờ

tròn đều, láng, đường kính 1-2 mm.

14 Chủng 14

(C14)

Tôm bạc

(Matapenaeu 1,1.10

8

Khuẩn lạc rất nhỏ, màu đen.

15 Chủng 15

(C15)

Tôm sú

(Penaeus

monodon)

0,92. 106

Khuẩn lạc có dạng rìa xanh tâm đen,

trơn bóng, đường kính khoảng 0,5-1

mm.

16 Chủng 16

(C16)

Tôm sú

(Penaeus

monodon)

4,6.107

Khuẩn lạc có màu đỏ, tâm đen,

đường kính khuẩn lạc nhỏ.

17 Chủng 17

(C17)

Mực ống

(thuộc Bộ

Loligo)

8,6. 106

Khuẩn lạc màu xanh, rất nhỏ.

18 Chủng 18

(C18)

Mực ống

(thuộc Bộ

Loligo)

7,4. 105

Khuẩn lạc có màu vàng tối , trơn

bóng, đường kính khoảng 2-3 mm.

19 Chủng 19

(C19)

Mực ống (thuộc

Bộ Loligo) 0,4. 10

6

Khuẩn lạc có màu vàng, to, trơn

láng, bờ tròn đều, đường kính

khoảng 3-4 mm.

20 Chủng 20

(C20)

Cua biển

(Scylla serrata) 10,2. 106

Khuẩn lạc có màu vàng sữa, trơn

bóng, đường kính nhỏ.

21 Chủng 21

(C21)

Cua biển

(Scylla serrata) 5. 104

Khuẩn lạc có viền xanh vàng, tâm

xanh nhỏ, ướt bóng, đường kính to

2-3 mm.

22 Chủng 22

(C22)

Cua biển

(Scylla serrata) 5,2.107

Khuẩn lạc có màu đỏ tía, nhỏ li ti.

23 Chủng 23

(C23)

Tôm sú

(Penaeus

monodon)

7,8.107

Khuẩn lạc có màu xanh đậm, từ rìa

cho đến tâm, bờ tròn đều, nhầy khi

dùng que cấy thu lấy sinh khối.

24 Chủng 24

(C24)

Mực ống (thuộc

Bộ Loligo) 4,6.10

7

Khuẩn lạc có màu vàng đậm, sần

sùi, đường kính 2-3 mm.

38

Kết quả phân lập các chủng Vibrio từ các mẫu hải sản thu được từ các chợ

của thành phố Nha Trang và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc TCBS đã thu được

24 chủng vi khuẩn có mật độ tế bào và đặc điểm hình thái khác nhau (bảng 3.1).

Một số chủng có một vài đặc điểm tương tự nhau, có lẽ chúng thuộc chung cùng

một loài. Dựa theo khóa phân loại của Bergy và các nghiên cứu của Tetsuya và

cộng sự (1998), Fujino và cộng sự (1974), Zulkifli và cộng sự (2009) khi mô tả hình

thái của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, ta chọn lọc các chủng có đặc điểm như

sau: tế bào hình phẩy khuẩn, khuẩn lạc hình tròn, bờ đều, màu xanh hoặc xanh đậm.

Trên các mẫu mực, thu được rất ít khuẩn lạc có đặc điểm hình thái giống loài

V. parahaemolyticus, chứng tỏ vi khuẩn này phân bố ít trên loài hải sản này. Ngược

lại với loài này là tôm, hầu như mẫu nào cũng cho tỉ lệ các loài V. parahaemolyticus

rất cao, chứng tỏ đây là loài ưa thích cho loài vi khuẩn này sinh sống.

Từ kết quả từ bảng 3.1 còn cho thấy tình trạng hiện diện của vi khuẩn V.

parahaemolyticus trên hải sản đáng báo động ở tôm, bởi ở mật độ 106 – 10

8 có thể

gây ra ngộ độc thực phẩm đối với loài mang gen độc tố (Daniel và cộng sự, 2000).

Ở các loài khác như mực, cua, ghẹ thì sự phân bố của chúng không cao, đa phần là

các chủng màu vàng và màu đen. Tuy không kiểm tra thấy các loài gây độc trong

mẫu thu thập được từ một số chợ Nha Trang nhưng theo Cục an toàn vệ sinh thực

phẩm VFA hàng năm nước ta vẫn có rất nhiều ca ngộ độc thực phẩm do ăn hải sản.

Điều này có thể do môi trường, mầm bệnh hay do sự trôi dạt của các chủng gây

bệnh mà các chủng không gây bệnh có thể biến chủng, thay đổi kiểu gen thành

chủng gây bệnh và mẫu thu thập nằm trong phạm vi nhỏ nên chưa thể bao quát hết

tình hình thực tế. Vì vậy, chúng ta không nên chủ quan trong việc lực chọn và bảo

quản, chế biến thực phẩm hải sản, các thực phẩm này cần phải được mua tươi sống

và ăn chín uống sôi để tránh các nguy cơ rủi ro ngoài ý muốn.

Trong các bước nuôi cấy tiếp theo, các chủng chọn lọc được quan sát hình

thái tế bào và kiểm tra các phản ứng sinh hóa như khả năng lên men đường, khả

năng sử dụng nguồn amino acid và khả năng chịu muối để định danh vi khuẩn.

39

3.2. Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng Vibrio

a. Soi tƣơi

Tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus được nuôi cấy trên môi trường LB

trong 24 giờ. Kiểm tra tính di động của chúng bằng cách cho một giọt xanh

methylen 0,001% lên lam kính, sau đó thêm một giọt canh trường lên trên đó rồi

đem quan sát dưới kính hiển vi (hình 3.3).

Hình 3.3. Tế bào chủng vi khuẩn C2 đƣợc soi tƣơi

(Tế bào vi khuẩn có màu xanh, hình phẩy khuẩn)

Dưới vật kính X-100, cho thấy, tế bào vi khuẩn được nhuộm bằng màu xanh

của xanh methylen, chúng chuyển động trong môi trường. V. parahaemolyticus có

thể đi vào cơ thể thụ động cùng với thức ăn hoặc chủ động qua vết thương và di

chuyển tới cơ quan đích bằng tiêm mao này. Trên bề mặt của tiêm mao, có nhiều

proton để điều khiển phương của nó, vi khuẩn chuyển động trong chất lỏng với

động cơ được cung cấp bởi động lực của Natri (Stewart và McCarter, 2003), điều

này cũng giải thích cho nhu cầu của vi khuẩn đối với Natri là bắt buộc. V.

parahaemolyticus có tiêm mao đơn cực nên kiểu di động của nó là tiến tới chứ

không quay vòng.

40

b. Nhuộm Gram

Sau khi chọn lọc các chủng Vibrio có màu xanh khi nuôi trên môi trường

thạch TCBS ở 24 giờ, tiến hành nhuộm Gram rồi quan sát dưới kính hiển vi, ta thấy

khuẩn lạc có màu hồng của Fuchsin chứng tỏ đây là vi khuẩn Gram âm. Điều này

-

i (outer (gồm lipoprotein và

96o

(+

- -

).

Hình 3.4. Tế bào của chủng vi khuẩn Vibrio C7 sau khi nhuộm Gram

(Tế bào vi khuẩn có hình dấu phẩy, bắt màu hồng của Fuschin, và được

quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100)

41

3.3 Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng Vibrio

Các chủng Vibrio được nuôi cấy trong môi trường APW 3% NaCl ở pH 8,5

± 0,2 ở nhiệt độ phòng, được lắc với tốc độ 150 vòng/phút để xây dựng đường cong

sinh trưởng. Kết quả chỉ ra rằng các chủng có tốc độ phát triển đồng đều nhau cho

thấy khả năng sử dụng dinh dưỡng trong môi trường ngang nhau của các chủng ở

các giai đoạn nuôi cấy.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25

Thời gian (giờ)

Mật

độ

tế b

ào

(O

D600)

C1

C2

C7

C15

C23

Hình 3.5. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng Vibrio (C1, C2, C7, C15, C23)

nuôi trên môi trƣờng APW, ở pH 8,5 ± 0,2, nhiệt độ phòng và lắc ở

150 vòng/phút

Quan sát các chủng trong quá trình nuôi cấy cho thấy chúng sinh trưởng và

phát triển tạo nên đường cong sinh trưởng với 4 pha sinh trưởng là pha lag, pha

logarit, pha cân bằng và pha suy vong. Khi cấy các chủng vào môi trường, mật độ tế

bào rất thấp (OD600= 0,02-0,03). Lúc này do mới cấy chuyển từ môi trường thạch

TCBS sang môi trường lỏng nên các chủng Vibrio phải thích nghi và làm quen với

môi trường, sau đó chúng mới cảm ứng và sinh ra các loại enzyme phân giải thành

phần môi trường. Vì vậy ở pha lag này, mật độ tế bào tăng rất chậm bởi sau 1 giờ

42

nuôi cấy chủng C23 có OD600 tăng lên 0,12 và chủng C2 tăng lên 0,15. Đến pha log,

mất độ tế bào tăng đột ngột vì các enzyme phân giải môi trường đã sẵn có, dinh

dưỡng môi trường giàu và ổn định nên các thành phần môi trường được tổng hợp

với tốc độ đều và quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ nhất. Số lượng tế bào tăng

theo lũy thừa, thời gian thế hệ đạt tới hằng số. Sau 5 giờ nuôi cấy OD600 tăng lên

đến 0,48 đối với chủng C23 và 0,49 đối với chủng C2. Ở pha này OD600 tăng liên

tục, sau 1 đến 1 giờ 30 phút thì OD600 tăng khoảng 0,2-0,3, đến khi các chủng vi

khuẩn phát triển chậm lại sau 10 giờ nuôi cấy. Bước sang giai đoạn cân bằng thì tốc

độ sinh trưởng cũng như khả năng trao đổi chất giảm. Số lượng tế bào chết cân bằng

với số tế bào sinh ra. Một số nguyên nhân khiến vi khuẩn chuyển sang pha cân bằng

như: chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm, các chất độc tích lũy, pH thay

đổi...Theo số liệu đo được, OD600 ở pha cân bằng cao hơn so với các pha khác, độ

đục này có thể vừa bao gồm sinh khối, xác tế bào và cả sản phẩm trao đổi chất của

vi khuẩn. Chủng C2 có OD600 đạt 2,02 là cao nhất trong tất cả các chủng, còn chủng

C15 đạt thấp nhất là 1,83 sau hơn 20 giờ nuôi cấy. Tiếp tục nuôi cấy, sau 21 và 25

giờ tiến hành đo OD600 thấy rằng chúng giảm mạnh đối với tất cả các chủng, chỉ sau

hơn 4 giờ mà OD600 của chủng C15 chỉ còn 1,4, còn của chủng C2 là 1,73. Điều

này cho thấy vi khuẩn đã đến giai đoạn suy vong, vi khuẩn chứa các enzyme tự

phân giải tế bào, môi trường hết chất dinh dưỡng,…vì vậy vi khuẩn không tổng hợp

các thành phần tế bào, các quá trình đình trệ và chúng bị chết.

Như vậy các chủng Vibrio đang nuôi cấy, bước sang giai đoạn cuối pha sinh

trưởng thì mật độ tế bào (OD600) đạt 0,75-0,9. Ở giai đoạn này các chủng vi khuẩn

đã tổng hợp đủ các thành phần tế bào và các enzyme phân giải cần thiết cho tế bào.

Vì vậy nên lấy mẫu ở giai đoạn này để thực hiện các phản ứng sinh hóa và giữ

giống vi khuẩn.

3.4. Một số đặc tính sinh hóa của V. parahaemolyticus

a. Khả năng chịu muối của các chủng Vibrio

Từ các chủng chọn lọc ta kiểm tra khả năng chịu muối của các chủng (bảng 3.2)

43

Bảng 3.2. Khả năng chịu muối của các chủng Vibrio

Chủng

Nồng độ

NaCl (%)

C1 C2 C7 C15 C23

0 − − − − −

3 + + + + +

6 + + + + +

8 − + + − +

10 − − − − −

Các chủng Vibrio nuôi trong môi trường chứa trypton và muối NaCl ở các nồng

độ khác nhau 0%, 3%, 6%, 8%, 10% ở pH 7,2 ± 0,2 nhiệt độ 37oC. Khả năng sống

(làm đục môi trường và tạo váng) được quan sát sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ nuôi cấy.

Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy tất cả các chủng không sống được trong môi trường

không có NaCl nên ở các khu vực nước ngọt (sông, hồ) vi khuẩn không sinh trưởng,

phát triển và nhu cầu của chúng đối với Na+ là bắt buộc.

Nồng độ muối các chủng vi khuẩn này sinh trưởng nằm trong khoảng 3-8%,

có chủng không mọc ở nồng độ 8% như chủng là C15 và C1. Các chủng phát triển

mạnh nhất ở nồng độ 3%, gây đục môi trường, chứng tỏ nhóm vi khuẩn này sống

tốt ở ngoài vùng biển có độ mặn không quá cao. Vì các chủng vi khuẩn sống được ở

các nồng độ muối như trên, nên hải sản như: tôm, cua và cá biển là các đối tượng

chính để phân lập vi khuẩn này. Ở nồng độ muối 6%, các chủng phát triển nhưng

gây đục ít hơn 3% chứng tỏ đây chỉ là vùng lân cận, gần như là giới hạn trên đối với

khả năng chịu muối của chúng . Ở 10% không có chủng vi khuẩn nào phát triển

bởi nồng độ muối quá cao. Vì vậy ở các nghiên cứu tiếp theo, các môi trường đều

được bổ sung 3% muối vào.

a. Khả năng lên men đƣờng của các chủng Vibrio

Các chủng phân lập được nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường để lên

men một trong các loại đường như mannitol, sucrose, lactose, arabinose, mantose ở

44

pH 7,4 và nhiệt độ 370C. Kết quả quan sát sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ cho thấy các

chủng đều lên men đường arabinose, mantose, mannitol và không lên men đường

lactose, sucrose. Kết quả được thể hiện ở hình 3.6 và bảng 3.3.

Hình 3.6. Thí nghiệm lên men đƣờng của chủng vi khuẩn C15 (A) và C2 (B)

(1-mannitol, 2-sucrose, 3-lactose, 4-arabinose, 5-mantose, 6- đối chứng âm)

Bảng 3.3. Khả năng lên men đƣờng của các chủng vi khuẩn Vibrio

Chủng

Loại đƣờng C1 C2 C7 C15 C23

Lactose _ _ _ _ _

Arabinose + + + + +

Sucrose _ _ _ _ _

Mantose + + + + +

Mannitol + + + + +

Đối với đường arabinose, mantose, mannitol khả năng lên men của các

chủng phân tích là khác nhau, biểu thị qua màu sắc môi trường sau lên men. Kết

quả cho thấy màu sắc trong môi trường sau lên men là khác nhau, ở chủng C15 làm

canh trường manitol chuyển sang màu cam đục và canh trường mantose, sucrose có

màu cam trong. Có sự khác nhau như vậy là do các sản phẩm (rượu, các acid hữu

B

A

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6

45

cơ, CO2) trong quá trình lên men sinh ra khác nhau về hàm lượng, tốc độ, làm pH

ôi trường cũng khác nhau nên chúng làm thay đổi màu chỉ thị. Đối với hai loại

đường còn lại là lactose và sucrose, do không có enzyme phân giải nên kết quả lên

men là âm tính vì vậy môi trường vẫn giữ nguyên màu đỏ ban đầu của môi trường

lên men.

b. Khả năng sử dụng lysin của các chủng Vibrio

Các chủng vi khuẩn Vibrio nuôi ở 370C trong môi trường cơ bản chứa lysin.

Khả năng sử dụng lysin được đánh giá qua sự đổi màu của môi trường nuôi. Nếu

các chủng vi khuẩn có enzyme phân giải thì enzyme này sẽ xúc tác cắt bỏ nhóm

carboxyl (-COOH), phóng thích CO2, tạo ra các sản phẩm có tính acid làm thay đổi

màu môi trường chứa chỉ thị phenol đỏ. Sau thời gian nuôi cấy là 24 giờ, 48 giờ và

72 giờ kết quả quan sát từ hình 3.7 và bảng 3.3 cho thấy có sự đổi màu môi trường

nuôi đối với các chủng C1, C2, C7, C15 và không đổi màu ở môi trường nuôi

chủng C23.

Hình 3.7. Thí nghiệm sử dụng lysin của các chủng Vibrio

( 1-C23, 2- C7, 3- C15, 4-C2, 5-C1, 6-đối chứng âm)

Bảng 3.4. Khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn

Chủng giám định Kết quả

C1 +

C2 +

C7 +

C2 +

C23 -

1 2 3 4 5 6 1 3 4 2 5 6

46

Đối với chủng C23, các đặc tính sinh hóa đã kiểm tra đều cho kết quả giống với

chủng Vibrio parahaemolyticus nhưng khi kiểm tra khả năng sử dụng lysin thì trái

ngược. Không chỉ vì chúng không sử dụng lysin mà có thể kết luận ngay rằng

chúng không thuộc loài này, có thể các quá trình chuyển hóa các chất trong tế bào

đã bị thiếu hụt hay bị khuyết con đường chuyển hóa lysin. Vì vậy tiếp tục nuôi cấy

và tách DNA, thực hiện phản ứng PCR để xác nhận.

3.5. Xác định gen độc tố của các chủng Vibrio bằng kỹ thuật PCR

Các chủng Vibrio chọn lọc được nuôi cấy trong môi trường LB 3% NaCl, rồi

đem nhân sinh khối trên máy lắc trong vòng 18 giờ với tốc độ 150 vòng/phút. Sau

đó đem dịch nuôi cấy đi ly tâm thu cặn tế bào. DNA tổng số được tách chiết từ tế

bào vi khuẩn Vibrio bằng cách sử dụng proteinase K, đệm phân giải tế bào. Sau đó

thực hiện phản ứng PCR theo quy trình Wizard®SV Genomic DNA Purification

System cải tiến để nhân lên các đoạn gen độc tố toxR và tdh. Cuối cùng tiến hành

điện di sản phẩm của phản ứng PCR trong đệm TBE 0,5X dưới nguồn điện 120V.

Hình 3.8. DNA tổng số của các chủng vi khuẩn đƣợc điện di và soi dƣới tia UV

(M: marker 100bp; 1-2: chủng C23 ; 3-4: chủng C2; 5-6: chủng C7)

M 1

3 4 2 5 6

47

Hình 3.9. Sản phẩm khuếch đại gen toxR đƣợc điện di và soi dƣới tia UV

(M: marker 100 bp;1: chủng23; 2: chủng2; 3: chủng7 )

Kết quả điện di từ hình 3.9 cho thấy, một sản phẩm PCR dài khoảng 370 bp

tương ứng với một đoạn gen toxR dài 368 bp đã được phát hiện ở tất cả các chủng

phân tích. Đây là gen bảo tồn đặc trưng của loài V. parahaemolyticus (Zulkifli và

cộng sự, 2009). Đầu tiên chúng được xác định là gen điều hòa operon độc tố nhưng

sau đó được nghiên cứu và chỉ ra điều hòa thêm nhiều gen khác trong bộ gen (Miller

và cộng sự, 1987). Xác định các gen độc tố nhằm xác định các chủng gây bệnh,

nhưng gen toxR lại được sử dụng để xác định tất cả các chủng không gây bệnh và

chủng gây bệnh cũng như chức năng điều hòa sự biểu hiện của các gen độc tố trong

loài V. parahaemolyticus (Zulkifli và cộng sự, 2009).

Gen tdh chỉ có mặt trong các chủng Vibrio gây độc. Theo báo cáo Takeda và

cộng sự (1978) tất cả các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập từ các mẫu

lâm sàng (mẫu bệnh phẩm) đều có 100% gen độc tố tdh nhưng chỉ có 1-5% các

chủng từ môi trường có mang gen này. Đáng chú ý là ở các loài V. mimicus, V.

cholerae và V. hollisae cũng có gen độc tố tương tự gen tdh.

Một đoạn gen dài 251 bp nằm giữa 2 cặp mồi chiếm tỉ lệ gần 1/10 đoạn gen

tdh - đã thường được sử dụng để xác định gen độc tố (Lee và Pan, 1993; Luan,

≈ 370 bp

100 bp

300 bp

400 bp

100bp 1000 bp

1 2 3 M

48

2006). Tuy nhiên, tất cả các mẫu phân tích thu được đều không phát hiện thấy đoạn

gen này. Điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus được phân lập

trong khu vực nghiên cứu có tỉ lệ gây bệnh không cao. Để xác nhận điều này, trong

những nghiên cứu tiếp theo, đề tài cần mở rộng phạm vi lấy mẫu và số lượng mẫu

trong môi trường. Việc phân lập các chủng từ các mẫu bệnh phẩm ở các bệnh viện

địa phương cũng là một sự bổ sung rất quan trọng.

49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

1. Đề tài đã phân lập được 24 chủng vi khuẩn Vibrio trên các loài tôm, cua,

mực được thu mua từ các chợ Vĩnh Hải, Vĩnh Thọ, chợ Biển (Bãi Dương) ở thành

phố Nha Trang.

2. Mật độ tế bào vi khuẩn Vibrio trên các loài hải sản này tương đối cao (106-

108 tế bào/gam), có thể là mối nguy về vấn đề ngộ độc thực phẩm hải sản ở địa

phương.

3. Tỉ lệ tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập trên các loài cua, mực

thấp hơn rất nhiều so với phân lập từ tôm.

4. Dựa trên các đặc điểm hình thái tế bào và các đặc tính sinh hóa đề tài đã

tuyển chọn được 5 chủng có đặc điểm tương tự với V. parahaemolyticus.

5. Sử dụng kỹ thuật PCR đã xác định được gen điều hòa gen độc tố toxR có

mặt trong tất cả chủng trên. ToxR là gen bảo tồn đặc trưng cho loài V.

parahaemolyticus nên có thể kết luận tất cả 5 chủng này đều thuộc loài V.

parahaemolyticus. Có thể sử dụng toxR như là một gen đích để xây dựng phương

pháp phát hiện nhanh V. parahaemolyticus trong các mẫu hải sản bằng kỹ thuật

PCR.

6. Không xác định được gen độc tố tdh có trong cả 5 loài V.

parahaemolyticus nói trên. Điều này cho thấy vi khuẩn V. parahaemolyticus có

nguồn gốc từ mẫu môi trường chủ yếu là các loài không mang gen độc tố.

Kiến nghị

1. Cần mở rộng phạm vi nghiên cứu lấy mẫu trên nhiều khu vực, kể cả lấy

các mẫu bệnh phẩm.

2. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình phát hiện nhanh các vi khuẩn V.

parahaemolyticus trên hải sản bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho các

gen độc tố, trong đó có toxR.

50

3. Cơ chế gây bệnh của loài vi khuẩn V. parahaemolyticus, cụ thể là các

protein độc tố tác động vào các tế bào vật chủ chưa được hiểu rõ nên cần tiếp tục

nghiên cứu để tìm ra biện pháp điều trị bệnh kịp thời.

4. Trong đề tài chỉ thực hiện phản ứng PCR đối với hai gen toxR và tdh.

Ngoài ra còn có gen trh mã hóa nên protein TRH, là hemolysin thứ hai gây nên ngộ

độc thực phẩm vì vậy cần thực hiện cả phản ứng PCR để nhân gen trh.

5. Vi khuẩn V. parahaemolyticus không chỉ gây ngộ độc trên người mà

chúng còn gây bệnh trên các loài hải sản (tôm, cá,…) nên cần mở rộng nghiên cứu

cho các vật chủ khác nhau.

6. Tích cực tuyên truyền nguy cơ ngộ độc thực phẩm do ăn nướng, tái hải sản

và cách phòng bệnh tốt nhất là ăn chín uống sôi để đảm bảo vệ sinh an toàn thực

phẩm tránh rủi ro cho người tiêu dùng.

51

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ, Nguyễn Thị Thùy Giang

(2008) Nghiên cứu bệnh mòn vây, cụt đuôi ở cá mú Epinephelus spp. nuôi ở Khánh

Hòa. Tạp chí KHCN số 01/2008 trường Đại học Nha Trang. 6-13 tr.

2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (1998) Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo

Dục, Hà Nội, 300 tr.

3. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hƣơng (2008) Thí nghiệm vi sinh vật thực

phẩm. Nhà xuất bản đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, thành phố Hồ Chí

Minh. 152 tr.

4. Trần Linh Thƣớc (2007) Phương pháp phân tích vi sinh vật trong

nước, thực phẩm và mĩ phẩm; Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội, 230 tr.

5. Võ Văn Nha, Đỗ Thị Hòa (2006) Nghiên cứu tác nhân gây bệnh đỏ

thân ở tôm Hùm Bông (Panulirus ornatus) nuôi lồng tại Phú Yên, Khánh Hòa. Tạp

chí KHCN số 03-04/2006 trường Đại học Nha Trang, 18-23 tr.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

6. Alcaide E., Amaro C., Todoli R. and Oltra R. (1999) Isolation and

characterization of Vibrio parahaemolyticus causing infection in Iberian toothcarp

(Aphanius iberus). Diseases Of Aquatic Organisms Vol. 35, p. 77-80.

7. Bockemuhl J. and Triemer A. (1974) Ecology and epidemiology of

Vibrio parahaemolyticus on the coast of Togo. Bull World Health Organ, 51(4), p.

353–360.

8. Cabrera-Garcıa M.E., Vazquez-Salinas C., and Quinones-Ramırez

E. I. (2004) Serologic and Molecular Characterization of Vibrio parahaemolyticus

52

Strains Isolated from Seawater and Fish Products of the Gulf of Mexico. Applied

and environmental microbiology. Vol. 70, No.11, p.6401-6406.

9. Chowdhury N.R., Chakraborty S., Ramamurthy T., Nishibuchi M.,

Yamasaki S., Takeda Y., and Nair G.B.. Molecular Evidence of Clonal Vibrio

parahaemolyticus Pandemic Strains. Emerging Infectious Diseases, Vol. 6, No. 6, p.

631-636.

10. Chan S.S.W., Ng K.C., Cheung W.L., Rainer T.H. (2002) Vibrio

parahaemolyticus: a leading cause of infectious diarrhoea in Hong Kong. Hong

Kong Journal of Emergency Medicine. Vol. 9(1).p. 23 – 29.

11. Dupray E. and Cormier M. (1983) Optimal Enrichment Time For

Isolation Of Vibrio parahaemolyticus From Seafood. Appl Environ Microbiol. Vol.

46, No. 5, p. 1234-1235.

12. Fujino T., Sakazaki R., and Tamura K. (1974) Designation of the

Type Strain of Vibrio parahaemolyticus and Description of 200 Strains of the

Species. International Journal of systematic bacteriology, Vol.24, No.4, p. 447-449.

13. Karunasagar I., Sam T., Joseph W., Robert M.T., Hada T.H. and

Rita R.C. (1994) Enhancement of Vibrio parahaemolyticus Virulence by Lysed

Erythrocyte Factor and Iron. Infection and Immunity, Vol. 46, No. 1, p. 141-144.

14. Kodama T., Gotoh K., Hiyoshi H., Morita M., Izutsu K. (2010) Two

Regulators of Vibrio parahaemolyticus Play Important Roles in Enterotoxicity by

Controlling the Expression of Genes in the Vp-PAI Region. PLOS ONE, Volume 5,

Issue 1, p. 1-12.

15. Lee C. and Pan C. (1993) Rapid and specific detection of the

thermostable direct haemolysin gene in Vibrio parahaemolyticus by the

polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology, 139, p. 3225-3231.

16. Makino K., Oshima K., Kurokawa K., Yokoyama K., Uda T.,

Tagomori K., Iijima Y., Najima M., Nakano M., Yamashita A., Kubota Y.,

53

Kimura S., Yasunaga T., Honda T., Shinagawa H., Hattori M., Tetsuya I..

Genome sequence of Vibrio parahaemolyticus: a pathogenic mechanism distinct

from that of V cholerae. Lancet; 361, p. 743–749.

17. Marlina E., Radu S., Kqueen C. Y., Napis S., Zakaria Z., Mutalib S.

A. and Nishibuchi M. (2007) Detection of tdh and trh genes in Vibrio

parahaemolyticus isolated from Corbicula moltkiana prime in West Sumatera,

Indonesia. Southeast Asian J Trop Med Public Health. Vol 38 No. 2, p. 349-355.

18. Miwa N., Kashiwagi M., Kawamori F., Masuda T., Sano Y., Hiroi

M. and Kurashige H. (2005) Levels of Vibrio parahaemolyticus and Thermostable

Direct Hemolysin Gene-positive Organisms in Retail Seafood Determined by the

Most Probable Number-polymerase Chain Reaction (MPN-PCR) Method. J. Food

Hyg. Soc. Japan, Vol. 47, No. 2, p. 41-45.

19. McCarter L. (1999) The Multiple Identities of Vibrio

parahaemolyticus. J Trop Med Public Heal, Vol 38 No. 2, p. 51-57.

20. Nishibuchi M. and Kaper J. B. (1995) Thermostable direct hemolysin

gene of Vibrio parahaemolyticus a virulence gene acquired by a marine bacterium.

Infection and immunity, Vol. 63, No. 6, p. 2093–2099.

21. Nishibuchi M. and James K. P. (1985) Nucleotide sequence of the

thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus. Journal of

Bacteriology, Vol. 162, No. 2, p. 558-564.

22. Okuda J., Nakai T., Chang P. S., Takanori O., Nishino T.,

Koitabashi T. and Nishibuchi M. (2001) The toxR Gene of Vibrio (Listonella)

anguillarum Controls Expression of the Major Outer Membrane Proteins but Not

Virulence in a Natural Host Model. Infection and Immunity, No 10, Vol 6, p. 6091–

6101.

54

23. Rujiwat A. (2007) Thesis entitled Identificcation of Vibrio Cholerae,

Vibrio parahaemolyticus, V. Vulnificus by Multiplex Polymerase Chain Reaction.

Mahidol University, ThaiLand, p. 114.

24. Tanil G. B., Radu S., Nishibuchi M., Napis R. A. R. S., Maurice L.

and Gunsalam J. W. Characterization Of Vibrio parahaemolyticus Isolated From

Coastal Seawater In Peninsular Malaysia, Southeast Asian J Trop Med Public

Health, Vol 36 No. 4, p. 940-945.

25. Tetsuya I., Park K. S., Suthienkul O., Kozawa J., Yamaichi Y.,

Yamamoto K. and Honda T. (1998) Close proximity of the tdh, trh and we genes

on the chromosome of Vibrio parahaemolyticus. Microbiology, 144, p. 2517-2523.

26. Tuyet D.T., Thiem V.D., Von Seidlein L., Chowdhury A., Park E.,

Canh D.G., Chien B.T., Van Tung T., Naficy A., Rao M.R., Ali M., Lee H., Sy

T.H., Nichibuchi M., Clemens J. and Trach D.D. (2006) Clinical,

epidemiological, and socioeconomic analysis of an outbreak of Vibrio

parahaemolyticus in Khanh Hoa Province, Vietnam. Infect Dis, 186(11), p. 1615–

1620.

27. Vesth T., Wassenaar T. M., Hallin P. F., Snipen L., Lagesen K.

and Ussery D. W. (2010) On the Origins of a Vibrio Species. Microb Ecol 59. p1–

13.

28. Wong H. C., Liu S. H., Wang T. K., Lee C. L., Chiou C. S., Liu D.

P., Nishibuchi M., and Lee B. K. (2000) Characteristics Of Vibrio

parahaemolyticus O3:K6 From Asia. Applied And Environmental Microbiology,

Vol. 66, No. 9, p. 3981–3986.

29. Yamaichi Y., Tetsuya I., Park K. S., Yamamoto K. and Honda M.

(1999) Physical and genetic map of the genome of Vibrio parahaemolyticus:

presence of two chromosomes in Vibrio species. Molecular Microbiology 31(5), p.

1513-1521.

55

30. Zhang X. H. and Austin B. (1998) Haemolysins in Vibrio species.

Journal Applied of Microbiology 2005, 98, p.1011-1019.

31. Zulkifli Y., Alitheen N. B., Son R., Yeap S. K., Lesley M. B. and

Raha A. R. (2009) Identification of Vibrio parahaemolyticus isolates by PCR

targeted to the toxR gene and detection of virulence genes. International Food

Research Journal 16, p: 289-296.

32. Stewart B. J. and McCarter L. (2003) Lateral Flagellar Gene System

of Vibrio parahaemolyticus. Journal of Bacteriology, Vol. 185, No. 15, p. 4508-

4518.