KÖK HÜCRE ( Stem cell ) TEDAVİSİKök hücre temelli rejeneratif ve trofik

tedaviler

Dr. Emin ÖZMERTAnkara Üniversitesi

Vehbi Koç Göz HastanesiRetina Günleri – 2013 / İSTANBUL

RETİNA PİGMENT EPİTELİ• Dış retinanın çoğu hastalığında, RPE dejenerasyonu önemli anahtar 

( Stargardt, RP, geografik atrofi – YBMD )• İleri aşamalarda fotoreseptör kaybı, ganglion hücreleri canlı• RPE; nisbeten basit, polarize, tek katlı  epitelial tabaka• Çok yüksek metabolik aktivite gösteren

frajil PR tabakası için temel destek dokusu:* Retinol siklusu* Besin maddelerinin transportu* Büyüme faktörü üretimiapikal: PEDGF, basal: VEGF 

* Apikal mikrovilliler, kon‐roddış segmentlerinin fagositozu

* Sıkı bağlantılar ile  dış kan‐retina bariyeri

* Bazal membran çok katlantılı,sıvı ve iyon transportu

Normal RP

Kök hücre tedavisi için hedef hastalıklar• Yaşa bağlı maküla dejenerasyonu:

* Kuru tipin ileri aşaması: geografik atrofi* Kompleks dejeneratif hastalık, poligenik herediter komponenti var* Santral dış retinada kronik / low‐grade inflamasyon ( yıllar boyunca, sistemik )* Lipofuscin birikimi, Bruch’s membranının 2 kat kalınlaşmasıBazal membran, Bruch’s membranı,RPE dejenerasyonu

• Stargardt’s maküler distrofi:* Çocuklardaki maküla hastalıklarının en sık nedeni* STGD 1: en yaygın formu, OR, ABCA 4 genindeki mutasyon* PR dış segmentindeki transporter proteinini kodlar

• Retinitis pigmentosa:* Çoğunlukla rod görme sistemini etkileyen bir grup herediter retinal dejenerasyonlar* RP yapan 100’ den fazla genetik mutasyon ( OD, OR, X‐linked )* Çoğu RP tipleri, primer RPE yetersizliği olarak başlar* RPE spesifik genler ( RPE 65, MERTK ), RP’ ya dahil olur

YBMD’ nda maküladeki RPE’ nin değiştirilmesi çabaları

• Submaküler cerrahi ile kan + CNV alınması• Maküler translokasyon cerrahisi: • Maküla altına yeni RPE greftleri:

* Periferik RPE‐koroid saplı fleplerin kaydırılması* Otolog serbest RPE‐koroid grefti* Otolog periferik RPE hücre süspansiyonları

‐ İmplante edilebilir minyatür teleskop ( 2010 )‐ Gen tedavileri –RPE 65‐ Kök hücre ( 2009, USA’ da onay )‐ Retinal implantlar ( 2011 )

( epiretinal, subretinal, suprakoroidal )

Göz, kök hücre çalışmaları için çok uygun bir organdır

* Modern VRC teknikleri ile retinaya  kolay  ulaşılabilir* Retinanın belirli bir bölgesine, hücrelerin direkt transplantasyonu      yapılabilir

* Gözün immün ayrıcalığı, verilen hücrelerin reddini azaltabilir ( Hastalıklı gözde immün ayrıcalıkda değişme ? )

* Retinanın yapısını ve fonksiyonlarını ölçmek ve kayıt için uygun  yöntemler  var  ( OCT, FFA, FAF, mikroperimetri, multifokal ERG )

* Transplante edilmiş hücrelerin emniyeti ve etkinliği  kolayca test    edilebilir

Terminoloji• Farklılaşma ( differentiation ):  

Bir hücrenin, daha özelleşmiş hücre  tipine dönmesi• Kök hücre ( Stem cell ):

* Kendi  indiferansiye ( farklılaşmamış ) durumlarında, kendi kendini sonsuz yenileme yeteneği

* Pek çok hücre tipine farklılaşabilme özelliği• Potansiyeline / etki gücüne göre kök hücreler:

* Omnipotent: embriyonik ve ekstra‐embriyonik dokulara  farklılaşma

* Pluripotent:  sadece embriyonik dokuları oluşturma yeteneği    ( ektoderm, mesoderm, endoderm )

* Multipotent: sınırlı sayıda hücre tipine farklılaşma

Kök hücrelerin tedavide kullanılma şekilleri

• Rejeneratif yaklaşım( hücreyi yerine koyma ):* Kök hücrelerden farklılaştırılmış RPE, PR gibi fonksiyonel hücrelerin hasarlı dokuya verilmesi

* Hastalıklı dokuyla bütünleşme, fonksiyonunu onarma

• Trofik yaklaşım ( kök hücresinin paracrine etkisi ):* Farklılaşmamış veya kısmen farklılaşmış kök hücrelerin hasarlı  dokuya verilmesi

* Sitokin / trofik faktörlerin salınması ‐‐‐‐‐‐ hasarlı dokunun uyarılması  proliferasyon, restorasyon

* Kök hücrelerin, mevcut hasarlı hücrelerle kaynaşması?* Yeterli çalışma yok

Orijinlerine göre kök hücreler• Human Embriyonik kök hücreler ( hESC ):

* Pluripotent* Blastosit (5 günlük) evre aşamasında, implantasyon öncesi  embriyonun iç hücre  kümelerinden elde edilir

* Nisbeten kolay büyür* Red olasılığı fazla ( allogenik ise, HLA  uygun değilse )* Donörün hastalık yapan genlerini barındırır

• Fötal kök hücreler:* Multipotent* Fötus dokusundan elde edilir

• Adült kök hücreler: * Multipotent* Kemiğin iliğinde  hematopoetik ,  stromasında mezanşimal kök hücreler bulunur

* Göbek bağı dokusu* Elde edilmeleri nisbeten zor* Donörün hastalık yapan genlerini barındırır

Embriyonik kök hücreler ( h ESC )• Anlaşmış çiftler tarafından bağışlanır, artan in vitro fertilizasyon

embriyolarından elde edilir ‐‐‐‐‐‐‐‐ etik, hukuki sorunlar• Kültür ortamında devamlı olarak genişletilerek, pluripotent durumları idame 

ettirilir• ESC  serileri, multiple hücre tipleri için kullanılır. 

RPE‐like hücrelerin üretilmesi:* Spontan

* Yönlendirilmiş: Hasılat ve hız fazla‐ DKK1, LEFTY faktörleri ile ile Wnt ve Nodal signalling yollarının bloke  edilmesi ( bu faktörler, hayvan ve bakteriden elde edilir )

‐ Nikotinamid ve activin‐A ile ardaşık inkubasyon‐ Bu dış faktörler pahallıdır, hücre kültür teknikleri zahmetli, metot komplike

Kök hücre tedavisinde immün reddin önlenmesiHücre temelli tedavide, transplante edilen hücrelerin immünolojik  

red potansiyeli, hedef doku ile bütünleşememeBunların önlenebilmesi:

• Alıcılara immünosupresan tedavi  verilmesi• Hücrelerin, HLA uygun şahıslardan alınması• Hücrelerin, hastanın kendisinden alınması ( IPSC ):

* Hastanın deri fibroblastları , IPC olması için yönlendirilir( transfection gen teknikleri, özel küçük moleküllerle kültür )

* Hastanın genetik defekti varsa, düzeltilmesi( hedeflenmiş gen tamiri , farmakolojik tedavi ile )

* Fonksiyonel olarak restore edilmiş IPSC’ lerin ‐‐‐‐‐‐‐‐ PR, RPE ‘ ye       yönlendirilmesi

IPSC ( induced pluripotent kök hücre ) • Bireyselleştirilmiş tıbbın bir  başlangıcı olabilir• Nisbeten daha kolay büyürler• Embriyo‐derived kök hücredeki etik sorunlar yok• Farklılaşmamış hücrelerin bankasını kurmak , arzulanan hücre 

tipinin farklılaştırılması ve transplantasyonu ( HLA tipleme ile )• ESC’ ye eşdeğer olarak düşünülse de, İPSC’ ler klinikte  yaygın 

olarak kullanılmadan önce bazı sorunlar aydınlatılmalı:* DNA ile ilgili emniyet sorunları * Kromozomal telomerleri çok kısa ‐‐‐ yaşlanan DNATekrarlanan tedavi seansları gereksinimi ?

* Pluripotent otolog İPSC’ ler immünojenik olabilir* Bilinen proto‐oncogen genlerin uzun süreli etkileri ?* Güncel teknolojilerle yüksek tedavi maliyeti 

2x10(6) / 0.2ml   kök hücre PAHAD  13

İşlem sonrası 6. saat

İşlem sonrası 3. gün

RP’ da submaküler alana süspansiyon halindeki kök hücrelerin verilmesi

Kök hücrelerinin göze verilme şekli• Hücre süspansiyonu enjeksiyonu: intravitreal, subretinal

* Hücrelerin, enjeksiyon öncesi saline içinde ayrıştırılması ve süspanse edilmesi

* Sorunlar:‐ Farklılaşması bozulur ; fonksiyonel tek tabaka oluşturabilmesi için, invivo tekrar farklılaştırılmalı

‐ Çözülmüş hESC hücreleri, transplantasyondan sonra  teratoma oluşturmaz, ama nöral rosetlere farklılaşır

‐ Çözülmüş hücrelerin etkinliğini ve lokalizasyonunu değerlendirmek zor

• Yapay tabaka üzerinde hücre kültürü : Terapötik greft olarak subretinal alana konması

Human embriyonik kök hücreler ( h ESC )‐1

hESC’ den geliştirilen RPE hücreleri, endojen doku morfolojisini ve fonksiyonlarını kopya eder

• RCS ratlarında subretinal enjeksiyon: PR dejenerasyonunda yavaşlama, görme performansı artar, retinalelektrik aktivitesinin idamesi

• 45 tane NIH III mice’ de emniyet değerlendirilmesi: Teratoma veya displazi gelişmedi( hESC‐derived RPE çok diferansiye )

• Diğer mice çalışmalarında: hESC‐derived nöral prekursor, subretinal alana verildi. % 50 tümör oluşumu var ( bu hücreler daha az diferansiye )

Human embriyonik kök hücreler ( h ESC )‐2

İlk klinik Sonuçlar• Subretinal, dissociated hESC‐derived RPE süspansiyonu kullanıldı• 1 Stargardt, 1 geografik atrofi• 2012‐ Advanced Cell Technology, California / USA• 4. ayda: Teratoma yok, enjeksiyon yerinin

kenarında yeni pigmentasyon• hESC‐derived RPE hücreleri,

transplantasyon için ideal kaynak olabilir. • Kaynağı etik olarak tartışmalı, 

diğer kök hücre kaynakları çalışılmalı

Human Fötal Kök Hücreleri

• Human fötal nöral kök hücreler, enzimatik olarak beyin dokusundan isole edildi( 16‐20 haftalık gestasyonu olan, bağışlanmış düşük fötus )

• Bu hücre süspansiyonu RCS ratlarında subretinal alana enjekte edildi. Visual parametreler ve histolojide düzelme

• Bu hücreler ( HuCNS‐SC ), Stem Cell Inc. / Newark – USA tarafından geliştirildi. 16 kuru  ‐ARMD’ lu hastada çalışma başlatıldı ( subretinalenjeksiyon )

Adult kök hücreler‐1Otolog kemik iliğinden geliştirilen kök hücreler

• Hematopoetik kök hücreler* 3 RP’ lı hastada intravitreal enjeksiyon* Yan etki yok, visual parametreler önemli oranda düzelmedi* YBMD, retinal iskemi yapan vasküler retinopatilerde de  deneniyor

• Mezanşimal kök hücreler* Subretinal enjekte edilen hayvanlarda  RPE ve PR  morfolojisinde düzelme, visual parametrelerde iyileşme

* Daha az immünojeniktir.  RPE hastalıklarının hücresel tedavisi için   faydalı bir kaynak olabilir

* Görmeyi restore etme potansiyelleri ? 

Adult kök hücreler‐2Human Umbilical tissue‐derived kök hücre

• Multipotent adült kök hücreleri bulundurur• Enzimatik sindirme ile elde edilme, kültürde geliştirme• 80 RCS ratında subretinal enjeksiyon, kontrole göre iyi 

sonuçlar• Tamirin mekanizması paracrine ?

Morfolojiyi değiştirmedi, braid‐derived nörotrofik faktör salımı• Janssen Research and Development – USA, kuru‐ARMD’ da faz 

I / II klinik çalışma başlattı. Katater ile sklera ve koroidden geçilerek submaküler alana verildi.

Trofik kök hücre tedavisi• Ciliary neurotrophic faktor implant: intravitreal enjeksiyon

Encapsulated cell teknolojisi Nörotrofik sitokin ‐‐‐‐ PR kaybını azaltma , geografik atrofide görme  kaybını  

yavaşlatma• Fötal kök hücreler

• Otolog kemik iliğinden geliştirilen kök hücre:  intravitreal enjeksiyonİnterlökin ‐‐‐‐‐‐‐ damar stabilizasyonu, konların korunması 

Faz I klinik çalışma: 3 RP, 2 cone‐rod distrofisi10. ayda toksisite yok, 4 hastada 1 sıra görme artışı, ilave çalışmalar gerekli

• İnsan umbilical dokusundan ( hUTC ) geliştirilen hücreler: subretinal enjeksi.Rat modelinde: PR hücrelerin kurtarılması, korunması,, idamesinde faydalı

Faz  I /II çalışma: human adult UTC’ nin mikrokatater ile verilmesi,  geografik atrofi

YÜRÜTÜLMEKTE OLAN KLİNİK ÖNCESİ  KÖK HÜCRE ÇALIŞMALARI

ESC’ den, in‐vitro 3 boyutlu retina oluşturma( mouse modeli )

Tek hücre tipinin naklinden  ziyade,  farklılaştırılmış kökhücreler ile tüm retinanın yerine konması

• ESC + ekstraselüler matriks komponentleri ile kültür• Optik vezikül, iki  tabakalı optik cup oluşumuna giden dinamik morfogenezis• Retinal progenitor ( ata ) hücreler ‐‐‐‐ ana retinal nöral hücre tipleri oluşur 

( yapay retinal doku yaprakları )• Son çalışmalarda: uygun kültür ortamlarında, hESC ve IPSC’ lerden optik 

veziküle benzer yapılar oluşturuldu ( çok katlı retinal tabakalar )• Farmakolojik tedavilerin test edilmesi

h ESC‐derived RPE’ nin monolayer olarak transplantasyonu

• Hücre süspansiyonunun kullanıldığı yöntemde hücreler, Bruch’smembranına dezorganize olarak yapışırlar. Hücreler monolayer olarak gelişmez ve red olma ihtimalleri var. 

• “ London Project to Cure Blindness “ klinik deneyler başlatıyor:* hESC’ nin, ince bir polyester membran üstünde monolayer olarak kültürü * Yaşlanmış ve kalınlaşmış Bruch’s membranının değiştirilmesi için plastik polymer geliştirildi ( RPE patch graft )

Kök hücre kaynaklı transplante edilebilir fotoreseptörler

• İleri evre ARMD, STGD, RP’ da: hastalanmış RPE sonucu PR tahribatı• Fötal retina, retinal öncü hücrelerin kaynağıdır, dejenere retina ile 

birleşme potansiyeline sahiptir• İnsandaki uygulamaların sakıncası:

* Fötal dokunun sınırlı tedariği* Etik sorunlar: Gestasyondan sonra 13. haftadaki fötus olmalı

Fotoreseptörlerin üretilmesi:* Pluripotent kök hücre kullanımı * hESC‐derived embryoid cisimler ( IGFI, noggin, DKK 1 katılmış nöral kültür  ortamında büyütüldü )

* Mouse ESC’ lerden PR oluşumu,çoğaltma: DKK 1, LEFTY, activin A + relatifhipoksi ( % 2 )

SONUÇ• Preklinik araştırmalardan, faz I / II klinik deneylere geçildi• Hem rejeneratif hem de trofik kök hücre tedavileri, çeşitli klinik çalışmalar ile 

araştırılıyor• Bunların ilk, kısa süreli sonuçları: emniyetli, görme fonksiyonlarını 

düzeltmede faydalı

Açıklığa kavuşturulması gerekenler:* Gerekli immün supresyon seviyesinin belirlenmesi* RPE yerleştirme ile, paracrine model arasındaki fark* Transplante ediliş yolu* RPE süspansiyon / monolayer ?* İPSC, hESC’lerin immünojenik durumları , malign potansiyelleri* Nöral retina tamiri  için, kök hücreden PR geliştirilmesi * İleri ARMD’ da: PR + hESC‐derived RPE nakli gerekli ( dual RPE + PR graft )* ESC’ lerden,  bütün  optik cup’ ın oluşturulması

Good Manufacturing Practices – USA / FDA + protokoller