KLASICKKLASICKÉÉ A MOLEKULA MOLEKULÁÁRNRNÍÍ

METODY V KLINICKMETODY V KLINICKÉÉ A A

ONKOLOGICKONKOLOGICKÉÉ CYTOGENETICE.CYTOGENETICE.

Zuzana ZemanovZuzana Zemanováá

CENTRUM NCENTRUM NÁÁDOROVDOROVÉÉ CYTOGENETIKYCYTOGENETIKYÚÚstav klinickstav klinickéé biochemie a laboratornbiochemie a laboratorníí diagnostiky diagnostiky

VFN a 1. LF UKVFN a 1. LF UKPRAHAPRAHA

CYTOGENETIKACYTOGENETIKA

velmi velmi úúzce specializovanzce specializovanáá vvěědeckdeckáá discipldisciplíínana

zabývzabýváá se studiem struktury, funkce a evoluce se studiem struktury, funkce a evoluce chromosomchromosomůů a jejich chova jejich chováánníím v prm v průůbběěhu dhu děělenleníí

zzáároderodeččných i somatických bunných i somatických buněěkk

sleduje zmsleduje změěny a nepravidelnostiny a nepravidelnosti ttěěchto proceschto procesůů, , kterkteréé vedou ke vzniku povedou ke vzniku poččetnetníích a strukturnch a strukturníích ch odchylek chromosomodchylek chromosomůů v bunv buněčěčných jných jáádrechdrech

ZZáákladnkladníí meznmeznííky v rozvoji lidskky v rozvoji lidskéécytogenetiky:cytogenetiky:

StanovenStanoveníí ppřřesnesnéého poho poččtu lidských chromosomtu lidských chromosomůů -- 19561956

PrvnPrvníí popsaný syndrom spojený s trisomipopsaný syndrom spojený s trisomiíí chromosomu 21 chromosomu 21 -- 19591959

PrvnPrvníí popsanpopsanáá specifickspecifickáá chromosomovchromosomováá aberace u aberace u nnáádorovdorovéého onemocnho onemocněěnníí (CML, Ph(CML, Ph--chromosom) chromosom) -- 19601960

PruhovacPruhovacíí techniky barventechniky barveníí chromosomchromosomůů -- 1968 a1968 ažž 19701970

MolekulMolekuláárnrníí cytogenetikacytogenetika a rozvoj metody fluorescena rozvoj metody fluorescenččnníí in in situsitu hybridizace (FISH) hybridizace (FISH) -- 19881988

CytogenetickCytogenetickéé vyvyššetetřřeneníí::

KlinickKlinickáá cytogenetikacytogenetika →→→→→→→→ stanovenstanoveníí karyotypu nemocných s karyotypu nemocných s vrozenými vývojovými vadami, geneticky podmvrozenými vývojovými vadami, geneticky podmíínněěnými nými syndromy apod.syndromy apod.

PrenetPrenetáálnlníí diagnostika diagnostika →→→→→→→→ ururččeneníí chromosomovchromosomovéé výbavy plodvýbavy plodůů

In vitroIn vitro fertilizacefertilizace →→→→→→→→ vyvyššetetřřeneníí oocytoocytůů, spermi, spermiíí, , blastomerblastomera a blastocystblastocyst

NNáádorovdorováá cytogenetikacytogenetika →→→→→→→→ zpzpřřesnesněěnníí diagndiagnóózy a urzy a urččenenííprognprognóózy nzy něěkterých nkterých náádorových onemocndorových onemocněěnníí

LaboratoLaboratořře hygienicke hygienickéé sluslužžby by -- testovtestováánníí mutagennmutagenníích ch úúččinkinkůůchemických lchemických láátek na lidský organismus na tek na lidský organismus na úúrovni chromosomrovni chromosomůů; ; radiaradiaččnníí cytogenetikacytogenetika..

VYVYŠŠETETŘŘOVANOVANÉÉ TKTKÁÁNNĚĚ::

••lymfocyty perifernlymfocyty periferníí krvekrve

••bubuňňky plodovky plodovéé vodyvody••bubuňňky ky choriovýchchoriových klkklkůů

••bubuňňky placentyky placenty••perifernperiferníí krev plodukrev plodu

••kokožžnníí fibroblastyfibroblasty••bubuňňky vyky vyššetetřřovaných orgovaných orgáánnůů

••bubuňňky kostnky kostníí ddřřeneněě••bubuňňky solidnky solidníích nch náádordorůů

analýza chromosomanalýza chromosomůů-- ve svve svěětelntelnéém mikroskopum mikroskopu

-- mitosa mitosa -- bunbuněčěčnnéé dděělenleníí-- stadium metafstadium metafáázeze

SomatickSomatickáá bubuňňka:ka:DiploidnDiploidníí sada chromosomsada chromosomůů: : 22 p22 páárrůů autosomautosomůů

2 pohlavn2 pohlavníí chromosomychromosomymumužž 46,XY46,XYžžena 46,XXena 46,XX

ChromosomovChromosomovéé aberace:aberace:odchylky v poodchylky v poččtu nebo struktutu nebo struktuřře chromosome chromosomůů

(vrozen(vrozenéé x zx zíískanskanéé))

ChromosomovChromosomovéé aberace:aberace:

I. VrozenI. Vrozenéé (konstitu(konstituččnníí)) odchylkyodchylky jsou zjsou záákladem pkladem přři i vzniku vzniku chromosomchromosomáálnlněě podmpodmíínněěných klinických ných klinických syndromsyndromůů (nap(napřř. . DownDownůůvv syndrom); obvykle jsou syndrom); obvykle jsou ppřříítomny ve vtomny ve vššech buech buňňkkáách tch těěla.la.

II. ZII. Zíískanskanéé odchylkyodchylky chromosomchromosomůů nalnaléézzááme v me v nnáádorových budorových buňňkkáách; majch; majíí klonklonáálnlníí charakter charakter (postihuj(postihujíí jen urjen urččititéé bunbuněčěčnnéé klony).klony).

heterochromosomovheterochromosomovéé x x autosomovautosomovéé

CHROMOSOMOVCHROMOSOMOVÉÉ ABERACEABERACE

I. I. NUMERICKNUMERICKÉÉ ODCHYLKYODCHYLKY -- aneuploidieaneuploidie

•• zmnozmnožženeníí jednotlivých chromosomjednotlivých chromosomůů -- napnapřř. trisomie apod.. trisomie apod.(n+1)(n+1)

•• ztrztrááta jednotlivých chromosomta jednotlivých chromosomůů -- monosomiemonosomie(n(n--1)1)

CHROMOSOMOVCHROMOSOMOVÉÉ ABERACEABERACEI. I. NUMERICKNUMERICKÉÉ ODCHYLKYODCHYLKY -- euploidieeuploidie

= po= poččetnetníí zmzměěny, kterny, kteréé postihujpostihujíí celou chromosomovou sadu celou chromosomovou sadu ((triploidietriploidie, , tetraploidietetraploidie apod.)apod.)

CHROMOSOMOVCHROMOSOMOVÉÉ ABERACEABERACE

II. II. STRUKTURNSTRUKTURNÍÍ PPŘŘESTAVBYESTAVBY

translokacetranslokace

reciprokreciprokáá nereciproknereciprokáá

inserceinserce delecedelece inverseinverse

KLINICKKLINICKÁÁ CYTOGENETIKACYTOGENETIKA

stanovenstanoveníí karyotypu nemocných s vrozenými karyotypu nemocných s vrozenými vývojovými vadamivývojovými vadami

ururččeneníí chromosomovchromosomovéé výbavy plodvýbavy plodůů --prenatprenatáálnlníí diagnostikadiagnostika

stanovenstanoveníí karyotypu nemocných s karyotypu nemocných s genetickýmygenetickýmypodmpodmíínněěnými syndromy nými syndromy

poruchy fertilityporuchy fertility

NNÁÁDOROVDOROVÁÁ CYTOGENETIKACYTOGENETIKA

•• ZabývZabýváá se studiem zse studiem zíískaných chromosomových zmskaných chromosomových změěn n v buv buňňkkáách benignch benigníích a malignch a maligníích tumorch tumorůů..

•• V souV souččasnasnéé dobdoběě byly u vbyly u věěttššiny lidských neoplasiiny lidských neoplasiííprokprokáázzáány buny buňňky se strukturnky se strukturníími mi čči poi poččetnetníími mi zmzměěnami karyotypu.nami karyotypu.

•• VVěěttššinu studovaných lidských neoplasiinu studovaných lidských neoplasiíí ppřředstavujedstavujííhemoblastozyhemoblastozy. .

•• Teprve v poslednTeprve v posledníích letech se objevujch letech se objevujíí i výsledky i výsledky vyvyššetetřřeneníí bunbuněěk solidnk solidníích nch náádordorůů u vu věěttšíších souborch souborůůnemocných. nemocných.

CHROMOSOMOVCHROMOSOMOVÉÉ ABERACE V ABERACE V NNÁÁDOROVÝCH BUDOROVÝCH BUŇŇKKÁÁCH:CH:

I. NI. NÁÁHODNHODNÉÉ

•• postihujpostihujíí nnááhodnhodněě kterýkoliv chromosom nkterýkoliv chromosom náádorovdorovéébubuňňkyky

•• objevujobjevujíí se nse nááhodnhodněě u ru růůzných nemocných s rzných nemocných s růůznými znými diagnosamidiagnosami

II. NENII. NENÁÁHODNHODNÉÉ -- SPECIFICKSPECIFICKÉÉ

•• vyskytujvyskytujíí se u urse u urččitých konkritých konkréétntníích typch typůů nnáádordorůů•• mohou se podmohou se podíílet na vzniku a vývoji nlet na vzniku a vývoji náádorudoru•• slousloužžíí jako nezjako nezáávislý diagnostický a prognostický vislý diagnostický a prognostický

ukazetelukazetel

CHROMOSOMOVCHROMOSOMOVÉÉ ABERACE:ABERACE:

I. I. ZTRZTRÁÁTA GENETICKTA GENETICKÉÉHO MATERIHO MATERIÁÁLULUmonosomie, delecemonosomie, delece

II. II. ZMNOZMNOŽŽENENÍÍ GENETICKGENETICKÉÉHO MATERIHO MATERIÁÁLULUtrisomie, tetrasomie atd.trisomie, tetrasomie atd.duplifikaceduplifikace, amplifikace, amplifikacetriploidietriploidie, tetraploidie atd., tetraploidie atd.

III. III. PPŘŘEMEMÍÍSTSTĚĚNNÍÍ GENETICKGENETICKÉÉHO MATERIHO MATERIÁÁLULUtranslokace (reciproktranslokace (reciprokéé, nereciprok, nereciprokéé))inverse, inserce atd.inverse, inserce atd.

PotvrzenPotvrzeníí diagndiagnóózyzy

StanovenStanoveníí prognprognóózyzy

MonitorovMonitorováánníí úúspspěěššnosti lnosti lééččbyby potvrzenpotvrzeníí remise remise

vvččasný zasný zááchyt relapsuchyt relapsu

MonitorovMonitorováánníí úúspspěěššnosti transplantace bunnosti transplantace buněěk kostnk kostníí ddřřeneněě

(d(dáárci oparci opaččnnéého pohlavho pohlavíí, markery, chromosomov, markery, chromosomovéé polymorfismy)polymorfismy)

KonvenKonvenččnníí cytogenetickcytogenetickáá analýza v analýza v onkohematologiionkohematologii::

V dneV dneššnníí dobdoběě je nezbytnou souje nezbytnou souččááststíí vyvyššetetřřeneníínemocných s nemocných s hemoblastozamihemoblastozami..

METODY:METODY:KONVENKONVENČČNNÍÍ CYTOGENETICKCYTOGENETICKÁÁ ANALÝZA:ANALÝZA:

kultivace bunkultivace buněěk a zpracovk a zpracováánníí bunbuněčěčných kultur ných kultur (nap(napřř. lymfocyty perifern. lymfocyty periferníí krve 72h, bukrve 72h, buňňky kostnky kostníí ddřřeneněě 24h atd.)24h atd.)

barvenbarveníí chromosomchromosomůů -- do r.1969 do r.1969 GiemsovoGiemsovo barvivo nebo barvivo nebo orceinorcein

od r.1970 pruhovod r.1970 pruhováánníí chromosomchromosomůů -- rrůůznznéé techniky techniky (nej(nejččastastěěji tzv. Gji tzv. G--pruhy; dpruhy; dáále Rle R--pruhy, Cpruhy, C--pruhy atd.)pruhy atd.)

vyhodnocenvyhodnoceníí chromosomových aberacchromosomových aberacíí aberacaberacíí podle ISCN podle ISCN nomenklatury (1995), standardizovannomenklatury (1995), standardizovanéé zzáápisypisy

MOLEKULMOLEKULÁÁRNRNĚĚ CYTOGENETICKCYTOGENETICKÉÉ METODY (FISH)METODY (FISH)

Ph1

PruhovPruhováánníí chromosomchromosomůů::

→→→→→→→→ zzáávisvisíí na na spiralizacispiralizaci a stupni kondenzace chromosoma stupni kondenzace chromosomůůprofprofáázeze -- aažž 2000 pruh2000 pruhůů, , prometafprometafáázeze -- 850 pruh850 pruhůů, , metafmetafáázeze -- 400 400

aažž 450 pruh450 pruhůů na haploidnna haploidníí sadu (1 pruh = 5 asadu (1 pruh = 5 ažž 10 Mb DNA)10 Mb DNA)

International Standardization and Cytogenetic NomenclatureISCN

p

q

6

medium kolchicin hypotonie fixace preparace

kre

v, k

ostn

í dřeň

barv

en

í

inkubace při 37°C

Postup při kultivaci a přípravě preparátů k cytogenetickému vyšetření

POPOČČÍÍTATAČČOVOVÁÁ ANALÝZA OBRAZU ANALÝZA OBRAZU -- IKAROSIKAROS

46,XX,t(9;22)(q34;q11)46,XX,t(9;22)(q34;q11)

38,X,-Y,del(2)(q33q35),der(6)r(6)(p25q21)ins(6;?)(q13;?),add(8)(p11),der(9)t(9;17)(p11;q11),der(10)t(10;17)(p11;q11),-

13,der(14;22)(q10;q10),-15,-17,-18,der(19;21)(q10;q10)del(19)(q13),-21/37,idem,-der(6)r(6)ins(6;?)/37-39,idem,del(1)

(q11)/35-38,idem,add(7)(q32)/38,idem,del(7)(q32)/38,idem,dup(11)(q13q23)/38-39,idem,der(X)t(X;7)(p22;p11),der(6)t(6;19)(p21;q13),-7,der(7)t(6;7)(p21;q36),-der(14;22),+r1,+mar1/38-39,idem,der(7)del(7)(q32)ins(7;7)(q32;q11q22)

ins(7;7)(q22;q11q32)ins(7;7)(q32;q32q22)t(7;?)(q22;?)t(?;19)(?;q11)/37-38,idem,-der(6)r(6)ins(6;?),der(7)/39-40,idem,

i(5)(p10),-der(10)t(10;17),+i(10)(q10),+der(16)t(5;16)(q22;q13),+add(17)(p11),-20/38,idem,-der(10)t(10;17),+der(17;20)

(q10;q10),+der(18)t(10;18)(q11;q11),-20/38,idem,-der(10)t(10;17),-der(14;22),+der(14;22)add(22)(q13),+der(17;20),

+der(18)t(10;18),-20/40,idem,-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?)(q13;?),-der(10)t(10;17),+i(10)(q10),+12,+add(17)(p13),-20, der(22)t(20;22)(q11;p11),+mar2/40,idem,-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?),-der(10)t(10;17),+i(10)(q10),+12,+der(17) r(17;?)

(p13q25;?),-20,der(22)t(20;22),+mar2/39-40,idem,inv(4)(p11q27),-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?), der(10)t(10;17),+i(10)

(q10),+12,+der(17)r(17;?),-20,der(22)t(20;22),+mar2/39,idem,der(3)r(3;?),-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?),-der(10)t(10;17),

+i(10)(q10),+der(17;20),-20,+mar2/76-77,idemx2/73-75,idemx2,der(X)t(X;7)x2,der(6)t(6;19)x2,-7,-7,der(7)t(6;7)x2,-

der(14;22)x2,+r1x2/73-76,idemx2,der(7)x2/73-74,idemx2,der(7)x2,-der(6)r(6)ins(6;?)/78-80,idemx2,-der(6)r(6)ins (6;?)x2,+ins(6;?)x2,-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10)x2,+12,+12,+add(17)(p13)x2,-20,-20,der(22)t(20;22)x2,+mar2x2/79-

80,idemx2,-der(6)r(6)ins(6;?)x2,+ins(6;?)x2,-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10)x2,+12,+12,+der(17)r(17;?)x2,-20,-20,der(22)

t(20;22)x2,+mar2x2/66-74,idemx2,-1,del(4)(q21),-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10),-der(14;22),+add

(17)(p11)x2/72-74,idemx2,-1,del(4),-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10),-der(14;22)x2, +i(14)(q10)/73-74,idemx2,-1,del(4),-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10),-der(14;22),+i(17)(q10)/72-73,idemx2,-1,-der(6)

r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+der(10)t(10;19)(p11;q11),-der(14;22)/69-73,idemx2,-1,-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)

t(10;17)x2,+der(10)t(10;19),-der(14;22),t(16;17)(q24;q21)/72-73,idemx2,-1,-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,

+der(10)t(10;19),-der(14;22),+mar3,+mar4/72-73,idemx2,-1,-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+der(10)t(10;19),-

der(14;22)x2,+i(14)(q10)/150-300,idemx4-8/150-200,idemx4-5,del(4),-der(10)t(10;17)x4-5,+i(10)(q10)x2-3,-der(14;22)x4-5,+i(14)(q10)x2-3/160-400,idemx4-10,der(7) del(7)(q32)ins(7;7)(q32;q11q22)ins(7;7)(q22;q11q32)ins(7;7)(q32;q32

q22)t(7;?)(q22;?)t(?;19)(?;q11) x4-10/158-300,idemx4-8,-der(6)r(6)ins(6;?)x4-8,+ins(6;?)x4-8,-der(10) t(10;17)x4-8,

+i(10)(q10) -x4-8,+12,+12,+12,+12,+12,+12,+add(17)(p13)x2-4,+der(17)r(17;?)x2-4,-20,der(22)t(20;22)x4-8,+mar2x4-

8/150-400,idemx4-10,-der(10)t(10;17)x4-10,+der(10)t(10;19)x2-5,-der(14;22)x2-5,+t(16;17)x2-5,+mar3x2-5,+mar4x2-5

Adenokarcinom pankreatu

Gorunova et al., Genes Chromosomes Cancer 26:312-321, 1999

VÝHODY KONVENČNÍ CYTOGENETICKÉANALÝZY:

UmoUmožňžňuje buje běěhem jednoho experimentu analyzovat hem jednoho experimentu analyzovat celý genomcelý genom

PPřřispispěěla k identifikaci vla k identifikaci věěttššiny geniny genůů zahrnutých ve zahrnutých ve specifických pspecifických přřestavbestavbááchch

LIMITY KONVENČNÍ CYTOGENETICKÉANALÝZY:

TechnickTechnickéé faktory (rozlofaktory (rozložženeníí chromosomchromosomůů v v mitose, kvalita pruhovmitose, kvalita pruhováánníí))

NNíízký mitotický indexzký mitotický index

KryptickKryptickéé bunbuněčěčnnéé klony (patologickklony (patologickéé bubuňňky se v ky se v kultivaci kultivaci ččasto nedasto neděěllíí))

KryptickKryptickéé translokace a inserce, subtilntranslokace a inserce, subtilníí ppřřestavby estavby

KomplexnKomplexníí ppřřestavbyestavby

Metody molekulMetody molekuláárnrníí cytogenetiky:cytogenetiky:RadioaktivnRadioaktivníí in in situsitu hybridizace (ISH) hybridizace (ISH) –– od roku 1969od roku 1969

FluorescenFluorescenččnníí in situin situ hybridizace (hybridizace (FFIISSHH) ) –– 19861986jednobarevnjednobarevnáá / dvoubarevn/ dvoubarevnáá

MnohobarevnMnohobarevnáá FISHFISH ((NederlofNederlof et al.)et al.) -- 19891989

KomparativnKomparativníí genomovgenomováá hybridizace (hybridizace (CCGGHH) ) -- 19921992

„„24 barevn24 barevnáá FISH (FISH (mmFFIISSHH,, SSKKYY )) -- 19961996

MnohobarevnMnohobarevnéé pruhovpruhováánníí s vysokou resolus vysokou resoluččnníí

schopnostschopnostíí ((mmBBAANNDD) ) -- 19981998

MICROCHIPS, MICROARRAYS MICROCHIPS, MICROARRAYS -- 19981998

FLUORESCENFLUORESCENČČNNÍÍ IN SITUIN SITU HYBRIDIZACEHYBRIDIZACE(FISH)(FISH)

•• velmi citlivvelmi citliváá molekulmolekuláárnrněě--cytogenetickcytogenetickáá metodametoda

•• umoumožňžňuje hodnotit karyotyp a detekovat uje hodnotit karyotyp a detekovat numericknumerickéé a strukturna strukturníí chromosomovchromosomovéé odchylky v odchylky v bubuňňkkáách v mitose i v nedch v mitose i v neděěllííccíích se ch se interfinterfáásnsnííchchjjáádrechdrech

•• dopldoplňňuje a upuje a upřřesesňňuje výsledky zuje výsledky zíískanskanéé konvenkonvenččnníícytogenetickou analýzoucytogenetickou analýzou

FLUORESCENFLUORESCENČČNNÍÍ IN SITUIN SITU HYBRIDIZACE (FISH)HYBRIDIZACE (FISH)

METAFMETAFÁÁZEZE INTERFINTERFÁÁZEZE

FLUORESCENFLUORESCENČČNNÍÍ IN SITUIN SITU HYBRIDIZACE (FISH)HYBRIDIZACE (FISH)

Cytogenetický preparátDvouřetězcová značená DNA

Denaturace buněčné DNA fixovanéna cytogenetickém preparátu Denaturace DNA sondy

Hybridizace DNA sondy ke komplementárním úsekůmcílové DNA fixované na cytogenetickém preparátu

Analýza fluorescenčních signálůve fluorescenčním mikroskopu

MOMOŽŽNOSTI APLIKACE FISHNOSTI APLIKACE FISH

RRůůznznéé biologickbiologickéé materimateriáály:ly:

•• histologickhistologickéé řřezyezy

•• tktkááňňovovéé preparpreparááty (rty (růůznzněě zpracovanzpracovanéékultivovankultivovanéé i nekultivovani nekultivovanéé bubuňňky)ky)

•• izolovanizolovanáá bunbuněčěčnnáá jjáádradra

•• chromosomovchromosomovéé preparpreparáátyty

FISH V ONKOCYTOGENETICEFISH V ONKOCYTOGENETICE

Diagnostika leukemiDiagnostika leukemiíí a preleukemia preleukemiíí::

•• detekce podetekce poččetnetníích a strukturnch a strukturníích odchylekch odchylek•• ururččeneníí ppůůvodu marker chromosomvodu marker chromosomůů•• monitorovmonitorováánníí úúččinkinkůů terapieterapie•• detekce residudetekce residuáálnlníích leukemických bunch leukemických buněěk po k po

terapiiterapii•• ururččeneníí ppůůvodu bunvodu buněěk po transplantaci kostnk po transplantaci kostníí

ddřřeneněě

Diagnostika solidnDiagnostika solidníích nch náádordorůů

Centromerickésondy

Malovací sondy pro celéchromosomy (wcp)

nebo jejich části (pcp)

Lokusspecifické

sondy

Mnohobarevnémalovací sondy

Telomerickésondy

DNA sondy pro FISHDNA sondy pro FISH

Sondy pro specifickSondy pro specifickéé chromosomovchromosomovééstruktury:struktury:

StanovenStanoveníí numerických odchylek, ovnumerických odchylek, ověřěřeneníí ppůůvodu vodu centromercentromer markermarker--chromosomchromosomůů, ur, urččeneníí ppůůvodu bunvodu buněěk po TKD od dk po TKD od dáárcrcůů opaopaččnnéého pohlavho pohlavíí

αα--satelitnsatelitníí DNA DNA -- centromerycentromery

metafmetafááze x interfze x interfáázeze

CENTRUM NCENTRUM NÁÁDOROVDOROVÉÉ CYTOGENETIKY VFN A 1.LF UKCYTOGENETIKY VFN A 1.LF UKCENTRUM NÁDOROVÉ CYTOGENETIKY ÚKBLD, VFN a 1.LF UK Praha

UroVysionUroVysion –– Abbott Abbott VysisVysis

TELOMERICKTELOMERICKÉÉ / SUBTELOMERICK/ SUBTELOMERICKÉÉ SONDYSONDY

TELOMERICKTELOMERICKÉÉ SONDYSONDY

SUBTELOMERICKSUBTELOMERICKÉÉ SONDYSONDY

Sondy pro jedineSondy pro jedineččnnéé genovgenovéé sekvence:sekvence:tzv. lokustzv. lokus--specifickspecifickéé sondysondy

MapovMapováánníí polohy genpolohy genůů na chromosomech, detekce strukturnna chromosomech, detekce strukturníích pch přřestavebestaveb

metafmetafááze x interfze x interfáázeze

detekce strukturndetekce strukturníích pch přřestavebestaveb

translokactranslokacíí

inzercinzercíí

amplifikacamplifikacíí

delecdelecíí

inverzinverzíí

LokusLokus--specifickspecifickéé sondysondy

TRANSLOKACETRANSLOKACE

ASS ASS locuslocus

ABL ABL locuslocus

PhPh--chromosomchromosom

LSI BCR/ABL ES Dual Color Translocation ProbeLSI BCR/ABL ES Dual Color Translocation Probe

CENTRUM NÁDOROVÉ CYTOGENETIKY ÚKBLD, VFN a 1.LF UK Praha

MLL MLL -- 11q2311q23

TRANSLOKACETRANSLOKACE

DELECEDELECE

DELECEDELECE

DELECEDELECE

INVERZEINVERZE

AMPLIFIKACEAMPLIFIKACE

Sondy pro mnohoSondy pro mnohoččetnetnéé chromosomovchromosomovéé sekvence sekvence (tzv. malovac(tzv. malovacíí sondy):sondy):

obsahujobsahujíí sekvence z celých chromosomsekvence z celých chromosomůů nebo jejich nebo jejich ččááststíí (parci(parciáálnlníí sondy)sondy)

UrUrččovováánníí strukturnstrukturníích pch přřestaveb (translokace a delece vestaveb (translokace a delece věěttšíšího rozsahu), ho rozsahu), identifikace pidentifikace půůvodu markervodu marker--chromosomchromosomůů

pouze metafpouze metafááze ze

CENTRUM NÁDOROVÉ CYTOGENETIKY ÚKBLD, VFN a 1.LF UK Praha

VÝHODY FISH:

RelativnRelativněě rychlý procesrychlý proces

Detekce specifických aberacDetekce specifických aberacíí

VysokVysokáá specifitaspecifita a citlivosta citlivost

InterfInterfáázickzickáá FISHFISH

Detekce Detekce delecdelecíí spojených se vznikem spojených se vznikem ffúúznznííchch gengenůů

AutomatickAutomatickéé systsystéémy pro analýzu obrazu z my pro analýzu obrazu z fluorescenfluorescenččnníího mikroskopuho mikroskopu

LIMITY KLASICKÉ JEDNOBAREVNÉ ADVOUBAREVNÉ FISH:

UmoUmožňžňuje sledovat jen omezený pouje sledovat jen omezený poččet cet cíílových lových sekvencsekvencíí fixovaných na preparfixovaných na preparáátutu

Neposkytuje informace o celNeposkytuje informace o celéém m genomugenomu

ZZáávisvisíí na dostupnosti DNA sondna dostupnosti DNA sond

UmoUmožžnnňňujeuje detekci pouze omezendetekci pouze omezenéého poho poččtu tu specifických aberacspecifických aberacíí

VVÍÍCEBAREVNCEBAREVNÁÁ FISHFISH

Princip kombinatoriPrincip kombinatoriáálnlníího znaho značčeneníí::

simultsimultáánnnníí poupoužžititíí nejmnejméénněě ttřříí rrůůzných zných fluorochromfluorochromůů ke ke specifickspecifickéému znamu značčeneníí DNA sond (kromDNA sond (kroměě DAPI) DAPI)

PrvnPrvníí úúspspěěššný mFISH experiment:ný mFISH experiment:

NederlofNederlof P.M., Robinson D., P.M., Robinson D., AbukneshaAbuknesha R., R., WiegantWiegant J., J., HopmanHopmanA.H., A.H., TankeTanke H.J., H.J., RaapRaap A.K.:A.K.: ThreeThree--colorcolor fluorescence in situ fluorescence in situ hybridizationhybridization for the for the simultaneoussimultaneous detectiondetection of of multiplemultiple nucleicnucleicacidacid sequencessequences. . CytometryCytometry 10: 2010: 20--27, 1989.27, 1989.

AminoAmino methyl methyl coumarincoumarin aceticacetic acidacid –– AMCAAMCATetramethylrhodamineTetramethylrhodamine isothiocyanateisothiocyanate –– TRITCTRITCFluoresceine Fluoresceine isithiocyanateisithiocyanate -- FITCFITC

mnohobarevnmnohobarevnáá FISH (FISH (mmFFIISSHH):):

Princip kombinatoriPrincip kombinatoriáálnlníího znaho značčeneníí::

mmFFIISSHH

CENTRUM NCENTRUM NÁÁDOROVDOROVÉÉ CYTOGENETIKY, III. INTERNCYTOGENETIKY, III. INTERNÍÍ KLINIKA VFN A 1.LF UKKLINIKA VFN A 1.LF UK

KombinatoriKombinatoriáálnlníí znaznaččeneníí::smsmííchcháánníímm n n fluorochromfluorochromůů zzíískskááme me 22nn--11 rrůůzných barevných kombinaczných barevných kombinacíí

FLUOROCHROMY PRO FLUOROCHROMY PRO mmFFIISSHH::

• DIETHYLAMINOKUMARIN (DEAC, NEN Life

Science Products)

• SPECTRUM ORANGE (VYSIS)

• TEXAS RED (Molecular Probes)

• ALEXA 488 (Molecular Probes)

• CY 5 (Amersham Life Sciences)

• DAPI (4,6 diamidino 2-phenylindol)

X

Ycolor

47,XY,+X,t(1;5),t(3;6),t(9;22)47,XY,+X,t(1;5),t(3;6),t(9;22)

45,X,45,X,--X,t(3;11),del(5)(q13q33),der(10)t(X;10),del(10)(q),der(17)t(X;10X,t(3;11),del(5)(q13q33),der(10)t(X;10),del(10)(q),der(17)t(X;10;17) ;17)

CEN mFISHCEN mFISH

Figures by Dr. L. Kearney,

Oxford/ London, UK

Tel mFISHTel mFISH

LSI mFISHLSI mFISH

mmBBAANNDD

LabelingLabeling schemescheme of chromosome 5:of chromosome 5:

mmBBAANNDD

CENTRUM NÁDOROVÉ CYTOGENETIKY ÚKBLD, VFN a 1.LF UK Praha

inv(11)(p11.2q13.3)

4 11 18

dup

der(4)t(4;11)

der(11)t(4;11)

der(18)t(11;18)

p15

MLL

p15MLL

KOMPARATIVNÍ GENOMOVÁ HYBRIDIZACE (CGH)

Celková genomová DNAz testovaných buněk

Celková genomová DNAz normálních buněk

Kohybridizace na cytogenetickýpreparát s normálními chromosomy

Detekce a vizualizace

Buňky s normálním karyotypem

Buňky s amplifikací nebo polysomií Buňky s delecí nebo monosomií

MICROCHIPSMICROCHIPS

ArrayArray CGHCGH

VÝHODY MOLEKULVÝHODY MOLEKULÁÁRNRNĚĚ--CYTOGENETICKÝCH METOD:CYTOGENETICKÝCH METOD:

•• UmoUmožňžňujujíí hodnocenhodnoceníí i velmi nekvalitni velmi nekvalitníích mitos, kterch mitos, kterééjsou jinak pro cytogenetickou analýzu nevhodnjsou jinak pro cytogenetickou analýzu nevhodnéé..

•• PoskytujPoskytujíí informace i z nedinformace i z neděěllííccíích se nebo terminch se nebo termináálnlněědiferencovaných bundiferencovaných buněěk.k.

• Výrazně zkracují dobu nutnou k získání a interpretaci výsledků.

Metody FISH tak významnMetody FISH tak významněě ppřřispispíívajvajíí ke zpke zpřřesnesněěnníícytogenetickcytogenetickéého nho náálezu a ke zleplezu a ke zlepššeneníí a zrychlena zrychleníídiagnostiky a pdiagnostiky a přříípadnpadněě llééččby nemocných s rby nemocných s růůznými znými typy geneticky podmtypy geneticky podmíínněěných onemocnných onemocněěnníí..