kÖlcsÖnhatÁs És dinamika az nmr spektroszkópia, mint...

KÖLCSÖNHATÁS ÉS DINAMIKA

az NMR spektroszkópia, mint a modern szem

Bodor Andrea

ELTE Szerkezeti Kémiai és Biológiai Laboratórium

A Magyar Tudomány Ünnepe, 2012.11.08.

Edvard Munch: A Nap (1911-1916)

1018 1015 1012 109 106

hullámhossz: frekvencia: energia:

1μm 1mm 1m 1km 1nm

1GHz 1MHz

γ-

sugarak X-

sugarak UV IR távoli

IR mikro-

hullámok rádió-

hullámok

mag

átmenetek belső

elektronok külső

elektronok

rezgések

forgások e- - mágneses

átmenetek mag - mágneses

átmenetek

Mössbauer Optikai spektroszkópia

ESR NMR

AZ ELEKTROMÁGNESES SUGÁRZÁS

AZ NMR SPEKTROSZKÓPIA ÉS A PERIÓDUSOS RENDSZER

ALKALMAZÁSI TERÜLETEK -omika:

metabolomika

Analitika: eredet, minőség

Kémia: szerkezet, konformáció

Gyógyszer kutatás

MRI Szerkezeti biológia

dinamika

AZ NMR SPEKTROSZKÓPIA A BIOLÓGIAI RENDSZEREK SZOLGÁLATÁBAN

OLDAT fiziológiás körülmények pH, ionkoncentráció, (NaCl, Mg2+, Ca2+) hőmérséklet, ...

nem invazív módon: atomi szintű információ

Fehérje szerkezet: feltekeredés –

letekeredés denaturáló közegek (8M urea, 6M GdCl)

FUNKCIÓ Fehérje dinamika: ps – 103 s skálán

szerteágazó mozgások

Mérések: 2D, 3D, nD

AZ NMR MINTA

Térerő: 11,7 – 23,5 T 500 MHz – 1GHz Egyéb NMR aktív magok: 31P, 19F szelektív jelölés, ...

Izotóp jelölés: fehérje expresszió 13C, 15N, 2D jelölés

A maximális mérettartomány: kb. 255 kDa

AZ NMR IDŐSKÁLA

ps ns μs ms s 103s

NOE, R1,R2 R1ρ,CPMG ZZ, STD, csere

vibráció

rotáció diffúzió domén mozgás, kinetika

feltekeredés

OR P

O

O-

O P

O

O-

P

O

O-

OHO

NH

N

N

O

N

O

OH

NH2

+ H2O OR P

O

O-

O P

O

O-

OH + H2PO4-

OH

ahol R=

GTP GDP Pi

Enzim-katalizált foszfoészter kötés hidrolízise

TPPP/P25

I) KÉMIAI KINETIKA

TPPP/p25: p20

(2JRF.pdb)

- Tubulin Polimerization Promoting Protein - 219 aminosav - rendezett és rendezetlen részek - Zn2+ kötő helyek - GTP kötő helyek - GTPáz aktivitás

Zotter, Bodor et al. FEBS Lett, (2011), Biochemistry (2011)

GMP Pi γ GDP GDP α β

200 μM TPPP/p25; 1,36 mM GTP; 4,0 mM Mg2+; 50 mM Tris; pH= 7,0; 300 K

31P{1H} NMR, 250 MHz

reak

ció

idő

I) KÉMIAI KINETIKA β

α γ

OR P

O

O-

O P

O

O-

P

O

O-

OHO

k1 = 0.093 ± 0.001 mM h-1

k2 = 0.178 ± 0.009 mM h-1

k3 = 0.119 ± 0.019 mM h-1

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

átlag reakció idő (h)

kon

cen

trác

ió (

mM

)

GTP GDP + Pi

GDP GMP + Pi

GMP GMP koord.

k1

k2

k3

I) KÉMIAI KINETIKA

KÖLCSÖNHATÁS - FUNKCIÓ

Fehérje kcat (min-1)

Rac1 H-Ras Rap1A Ran TPPP/p25

0.11 0.028 0.0031 0.0032 0.0155 NMR 0.018 malachitzöld

-a TPPP/p25 GTPáz aktivitása: a kis G fehérjék aktivitásához hasonló - 31P NMR mérések: a reakció teljes útvonala

sebességi állandók meghatározása

I) KÉMIAI KINETIKA

II) TRANSZLÁCIÓS DIFFÚZIÓ

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0

Gradiens (G/cm)

Inte

nzi

tás


I = I(0) exp[-D (2 π γ Gi δ)2 (Δ – δ/3)]

Stokes – Einstein: rH = kT/6 π η D


Rendezetlen fehérjék (IUP, IDP) Más módszerekkel nehezen tanulmányozhatók Szerkezeti vonások: NMR - kémiai eltolódás - hidrodinamikai sugár

RENDEZETLEN – DENATURÁLT – FELTEKEREDETT FEHÉRJÉK HIDRODINAMIKAI SUGARA?

Tompa et al. FEBS Lett, (2005), Uversky et al. Annu. Rev. Biophys. (2008), Jensen et al. Structure (2009)

8.00E-11

1.10E-10

1.40E-10

1.70E-10

2.00E-10

1500 2500 3500 4500 5500

Molekula tömeg (g/mol)

D (

m2 /s

)

rendezetlen

feltekeredett

8M urea

TC5B mutánsok

MPK szubsztrátok

MIIA fragmens

Tb4

AnTx



8

10

12

14

16

18

20

22

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Molekula tömeg (g/mol)

r H (

Å)

rendezetlen

feltekeredett

8M ureaTC5B mutánsok

MPK szubsztrátok AnTx

MIIA fragmens

Tb4

1H NMR: rH denaturált > rH rendezetlen > rH feltekeredett

15N: R1, R2, hetnoe -NH – H2O csere

H2O

III) A PEPTID GERINC DINAMIKÁJA

A molekulák oldatbeli ún. ‘bukdácsoló’ mozgása τc rotációs korrelációs idővel jellemezhető. 1/τc – rotációs frekvencia J(ω) - spektrális sűrűség függvény: J(ω) = 2 τc / [1 + (ωτc)

2]

Mért dinamikai paraméterek: R1, R2, hetnoe = f [J(0), J(ωN), J(ωH)]

0

0.5

1

1.5

2

0 10 20 30 40 50

R1 (

s-1)

0

1

2

3

4

5

6

0 10 20 30 40 50

R2 (

s-1)

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 10 20 30 40 50

HET

NO

E

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

0 10 20 30 40 50

clea

nex

5ms10ms

45 aminosav hosszú IUP MIIA:


0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

J(0) / ns rad-1

J(ω

N)

/ n

s ra

d-1


Redukált spektrális sűrűség analízis

Középső régió: legkevésbé mozgékony, inherens helicitás N-terminus:K3-D11 C-terminus: D33-K45

Krisova et al. J. Biomol. NMR (2006), Lefèvre et al., Biochemistry (1996)

KÖLCSÖNHATÁS - SZERKEZET

N71

L8

E26

S47

S17

V73 L32

N33

D74

K29

E91

F30

G27

S23

E44

G50

T42

1H-15N HSQC, 300 K 15N:S100A4d - Ca2+

homodimer

Gingras et al. FEBS Lett, (2008)


N71

L8

V73 L32

N33

D74

K29

E91

E26

S47 S17

F30

G27

S23

E44

G50

T42

15N: S100A4d - Ca2+ MIIA – 15N: S100A4d - Ca2+ a két monomer nem egyenértékű

Kiss et al. PNAS, (2012), Elliot et al. Structure (2012)

D74


Ca2+ - S100A4

Ca2+ - S100A4 - MIIA- A Ca2+ - S100A4

Ca2+ - S100A4 - MIIA- A Ca2+ - S100A4

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

G S H M A C P L E K A L D V M V S T F H K Y S G K E G D K F K L N K S E L K E L L T R E L P S F L G K R T D E A A F Q K L M S N L D S N R D N E V D F Q E Y C V F L S C I A M M C N E

Δδ(ppm) A

Δδ(ppm) B


átlagolt kémiai eltolódás:

22 )(17.0)(NHN

KÖLCSÖNHATÁS - SZERKEZET - FUNKCIÓ

1894 YRKLQRELEDATETADAMNREVSSLKNKLR RGDLPFVVPR RMARK 1937

MIIA:

Komplex: filamentum bontó

NMR

SZERKEZET

DINAMIKA

KÖLCSÖNHATÁS

FUNKCIÓ

Végh Ádám

Stráner Pál

Pálfy Gyula

Taricska Nóra

Pintér István

Rovó Petra

Jákli Imre

Farkas Viktor

Hudáky Ilona

Perczel András

Náray-Szabó Gábor

Zsoldosné Mády Virág

Láng András

Dudás Erika

Papp Dóra

Kovács Bertalan

Csordás Barbara

Karancsiné Menyhárd Dóra

Harmat Veronika

Ángyán Annamária

Kiss-Szemán Anna

Vajda Tamás

Felméry Anna

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

SZKBL:

GTP: Ovádi Judit (MTA/Enzimológiai Intézet) Bányai István (Debreceni Egyetem)

MIIA/S100A: Nyitray László (ELTE, Biokémiai Tszk)

Edvard Munch:Önarckép - fotó

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

kÖlcsÖnhatÁs És dinamika az nmr spektroszkópia, mint...

Documents