klinička biokemija - propisi

Klinička biokemija Propisi

1

R U T I N S K I P R E G L E D M O K R A Ć E

Za ispitivanje se uzima prva jutarnja, svježa mokraća uzeta nakon noćnog sna, toalete vanjskog spolovila, prije doručka i drugih aktivnosti, koja se zadržavala u mokraćnom mjehuru najmanje 4 sata a najviše 8 sati. Uzima se u spremnike sa širokim grlom i poklopcem koji služe za sakupljanje i prijenos uzoraka. Ako je uzorak pohranjen na 20°C mora se obraditi unutar 30 minuta. Pohrana na +4°C dozvoljava obradu unutar 4 sata. U svakodnevnom radu , rutinski pregled mokraće sastoji se od:

� fizikalnih mjerenja i z g l e d b o j a m i r i s s p e c i f i č n a t e ž i n a r e a k c i j a - pH v o l u m e n

� kemijskog ispitivanja sastava mokra će testnom trakom p r o t e i n a k r v n o g p i g m e n t a g l u k o z e i r e d u k t i v n i h t v a r i k e t o n s k i h s p o j e v a u r o b i l i n o g e n a b i l i r u b i n a n i t r i t a

� mikroskopskog pregleda supravitalno obojenog ili na tivnog

m o k r a ć n o g s e d i m e n t a U slučaju pozitivnih nalaza neki sastojci se odreñuju kvantitativno: p r o t e i n i (pirogalol, biuret) g l u k o z a (enzimski) Rezultati rutinskog pregleda upotpunjuju se specifičnim pretragama:

i z g l e d (mikroorganizmi) b o j a (homogentizinska kiselina, melanogen, porfirini, lijekovi) m i r i s (amonijak, sumporovodik) p r o t e i n i (paraproteini, elektroforeza proteina) k r v n i p i g m e n t (lijekovi) r e d u k t i v n i s p o j e v i (laktoza, galaktoza, pentoze, melanogen, kromatografija šećera, homogentizinska kiselina, lijekovi) k e t o n s k i s p o j e v i (melanogen, lijekovi) b i l i r u b i n (žučne kiseline) u r o b i l i n o g e n (urobilin) s e d i m e n t (aminokiseline, mikroorganizmi, lijekovi)


2

IZGLED, BOJA I MIRIS

Svježa mokraća je bistra, žučkasto smeñe boje, bez neugodnog mirisa. SPECIFIČNA TEŽINA MOKRAĆE (relativna volumna masa)

Specifična težina mokraće odreñuje se pomoću areometra, urometra, koji je graduiran za područje od 1.000 do 1.060 i temperaturu od 15°C. Mokraća se ulijeva u prikladni cilindar, pjena ukloni filter papirom i urometar uroni da slobodno pliva. Očita se brojka na donjem rubu meniskusa. Ako temperatura mokraće nije 15°C, potrebno je korigirati izmjerenu specifičnu težinu. Za 3°C ispod 15°C treba očitanom rezultatu oduzeti 0.001, a za svaka 3°C iznad 15°C treba dodati 0.00l. Korekcije su potrebne i u slučajevima kada su u mokraći prisutni glukoza ili proteini. Za 1 g % proteina oduzima se 0.003, a za 1 g % (55 mmol/L) glukoze oduzima se 0.004. Primjer: Očitana specifična težina ispitivane mokraće je 1.020, temperatura mokraće je 21°C i odreñeno je 3 % glukoze. Za 6°C iznad 15°C treba dodati 0.002, a za 3 g % glukoze treba oduzeti 0.012, pa korigirana specifična težina iznosi 1.010. Mokraća zdravih osoba ima u većini slučajeva specifičnu težinu od 1.015 do 1.025, a krajnje granice su izmeñu 1.002 i 1.035. REAKCIJA (pH) MOKRA ĆE

Reakcija mokraće zdravih osoba kreće se od 4.8 do 7.4; a najčešće je slabo kisela (oko 6.0). Razni proizvoñači proizvode trake impregnirane s indikatorom. Pomoću ovih test traka može se vrlo jednostavno i približno odrediti pH mokraće. Traka s indikatorom uroni se u mokraću a nastala boja usporedi sa priloženom skalom. Reagens papir polja za odreñivanje pH na traci sadržava smjesu metilnog crvenila i bromtimol plavila. Tako se u području od pH 5-9 dobivaju različite boje od narančaste-zelene-plave. Stajanjem mokraća postaje alkalna stoga pH vrijednost odstajale mokraće nema dijagnostičku vrijednost. Rezultat na traci se očitava odmah. Sumnja na infekciju mokraćnih organa postavlja se ako je pH mokraće stalno od 7 do 8.


3

VOLUMEN MOKRAĆE

Pri rutinskom pregledu obično se ne mjeri volumen. Ako se mokraća koristi za ispitivanje izlučivanja pojedinih sastojaka tijekom 24 sata, tada se i jutarnjem uzorku mjeri volumen. Referentne vrijednosti 24-satnog volumena mokraće: Odrasli 800 do 2.000 ml Djeca oko 10 g 700 do 1.500 ml Djeca oko 5 g 500 do 1.000 ml Djeca oko 1 g 300 do 600 ml Dojenčad s 6 mj 250 do 500 ml Dojenčad oko 1 mj 150 do 400 ml Volumen mokraće ovisi o količini primljene vode i hrane, intenzitetu metaboličkih procesa, fizičkoj aktivnosti i vodi, koja se izlučuje znojenjem, fecesom i dahom. Odrasli čovjek izluči tokom 24 sata 800 do 1500 ml a krajnje granice se kreću izmeñu 500 do 2000 ml. Kod izvjesnih patoloških stanja izlučuju se povećane količine mokraće. P o l i u r i j a je popratna pojava loše liječene šećerne bolesti, kada se izlučuje 3 do 4 L mokraće dnevno. Znatno veće količine izlučuju osobe s nedostatkom antidiuretskog hormona (diabetes insipidus). Izlučivanje manje količine mokraće, o l i g u r i j a, a posebno prestanak izlučivanja, a n u r i j a, su popratne pojave oštećenja i funkcionalnog zastajenja bubrega.

K E M I J S K E P R E T R A G E M O K R A Ć E

Kemijskim pretragama se dokazuje i ispituje da li mokraća sadrži sastojke kojih u mokraći zdravih osoba nema ili su prisutne u tako malim količinama i koncentracijama, da ih se ne može dokazati uobičajenim reakcijama. Tako se ispituje prisutnost proteina, krvnog pigmenta, šećera, ketonskih spojeva, bilirubina, nitrata. Za neke spojeve, kojih ima i u mokraći zdravih osoba (urobilinogen), ispituje se da li ih ima više ili manje nego normalno. Kemijske pretrage se vrše pomoću testnih traka i rijetko klasičnim kemijskim postupcima u epruveti. Klasični postupci traže vlastitu pripravu manjih ili većih količina reagensa uz veliki utrošak radnog vremena za vaganje, otapanje, filtriranje i održavanje stalnosti reakcijskih otopina. Pri tom se troši mnogo kemikalija, vrlo mnogo laboratorijskog posuña i pribora. Na ishod reakcije s testnim trakama utječu razni faktori. Najviše neprilika može izazvati vlaga, a manje svjetlo i toplina. Zbog toga treba trake čuvati u dobro zatvorenim posudama na suhom i od svjetla zaštićenom mjestu.

Testne trake raznih proizvoñača izrañene su u obliku uskih traka od celuloze i prozirne plastike. Na plastičnom nosaču veličine 8 x 0.5 cm nalazi se jedna ili više kvadratića od celuloznog materijala, koji su impregnirani odgovarajućim reagensima.


4

Reagensi na testnim trakama obično su isti ili kemijski vrlo slični onima, koji su se koristili u klasičnim reakcijama u epruveti. Ipak, neki od njih su znatno osjetljiviji i mnogo specifičniji. Pretrage se izvode uranjanjem trake u ispitivani uzorak mokraće i nakon odreñenog vremena (10, 20, 30 ili 60 sekunda) promatra se, da li je došlo do promjene boje. Intenzitet te boje usporeñuje s priloženom skalom (vizualno očitavanje) ili .se rezultat očitava instrumentalno prema načelu refleksne fotometrije.

Testne trake za pretragu mokraće omogućuju jednostavnim postupkom brzo i pouzdano dobivanje podataka o patološkom nalazu u mokraći.

Zbog toga je rutinska pretraga mokraće testnim trakama u ambulanti i u bolnici prvi korak na putu postavljanja dijagnoze, koja će se kasnije potvrditi detaljnim kliničkim pregledom i složenijim kvantitativnim laboratorijskim pretragama. Testne trake su vrlo pogodne i za sistematske preglede, za rano otkrivanje bolesti te za epidemiološke studije. Polja na testnoj traci sastoje se od reagens papira koji se nalazi iznad papira za upijanje. Tanka najlonska mrežica napeta je preko ta dva sloja i tako pričvršćuje test polja na bijelu foliju; ujedno ih zaštićuje od dodira i onečišćenja, a uz to osigurava brzo i ravnomjerno prodiranje mokraće čime se postiže homogena obojenost polja. Sloj za upijanje uklanja suvišnu mokraću i time sprečava lažne rezultate. Test polje veličine 6 x 6 mm omogućuje lako i točno očitavanje rezultata jer su na njemu vidljive i najmanje promjene boje (Slika 3.2) Slika 1. Graña testne trake

Pretraga mokraće testnom trakama vrlo je jednostavna (Slika 2) 1. uranjanje u mokraću 2. odstranjivanje suvišnog mokraće 3. očitavanje nakon 30 do 60 sekundi


5

Slika 2. Pretraga mokraće testnom trakom

Suvišna mokraće se jednostavno otrese. Upotreba enzima i drugih novih metoda temelj je specifičnog dokazivanja patoloških promjena mokraće. Važan kriterij u procjeni testnih traka za mokraću je stupanj osjetljivosti reakcije. Pod tim se razumijeva ona koncentracija tražene tvari kod koje je u najmanje 90 od 100 različitih uzoraka nalaz pozitivan. Granica je osjetljivosti pojedinih testova praktički takva da i vrlo male promjene u sastavu mokraće izazivaju promjenu boje. Testne trake su u aluminijskoj tubi zatvorenoj specijalnim čepom u kome je sredstvo za upijanje vlage iz zraka. Uz propisano čuvanje (od +4oC do 30oC) i pravilnu upotrebu (nakon vañenja trake tubu treba odmah zatvoriti) rok je valjanosti testnih traka pouzdan do datuma otisnutog na pakovanju. Testne trake za mokraću mogu se upotrijebiti za:

� rutinske pretrage � kontrola za vrijeme terapije i kontrolu zbog mogućnosti recidiva � samokontrolu � sistematske preglede

Za dnevne rutinske preglede mokraće u bolnici, ambulantnoj praksi ili uz

krevet bolesnika najracionalnije je odreñivanje kompletnog kemijskog statusa mokraće pomoću univerzalne testne trake koja obuhvaća slijedeće parametre:

∗ nitrite ∗ pH ∗ glukozu ∗ ketonska tijela ∗ ∗ urobilinogen ∗ proteine ∗ bilirubin ∗ krv ∗ leukociti

Jednom testnom trakom moguće je otkriti rane simptome triju velikih grupa bolesti:

∗ poremećaje metabolizma ugljikohidrata ∗ bolesti bubrega i urogenitalnog trakta ∗ hemolitičke bolesti i bolesti jetre. Za kontrolu tokom terapije prikladne su specijalne test trake za odreñenu

indikaciju. U mokraći dijabetičara valja izvršiti pretrage na glukozu i ketonska tijela. Tim se testom mogu otkriti promjene u stanju metabolizma ili pogreške u dijeti. U mokraći bolesnika s bolesti bubrega i urogenitalnog trakta značajne su pretrage


6

mokraće na nitrite, pH, proteine i krv. Dokazivanje žučnih boja, urobilinogena i bilirubina, u mokraći omogućuje ciljani pregled u bolesti jetre. Specijalne testne trake upotrebljavaju se za ∗ opći pregled (prosijavanje) u sistematskim pregledima ∗ za opće i ciljani pregled u epidemiološkim istraživanjima ∗ rano otkrivanje odreñenih patoloških stanja ∗ za vrijeme odreñivanja individualne doze antidijabetika ∗ za kontrolu terapije Tablica 1. Moguće jedinice označene na spremnicima testnih traka

Parametar Konvencionalne jedinice

SI Arbitrarne jedinice

glukoza

mg/dl

mmol/L

neg/0 1/+

2/++ 3/+++

4/++++

bilirubin

mg/dl

µmol/L

neg/0 1/+

2/++ 3/+++

4/++++

ketonski spojevi

mg/dl

mmol/L

neg/0 1/+

2/++ 3/+++

4/++++

eritrociti/hemoglobin

Erc/µL

Erc x 106/L

neg/0 1/+

2/++ 3/+++

4/++++

proteini

mg/dl

g/L

neg/0 1/+

2/++ 3/+++

4/++++

urobilinogen

mg/dl

mmol/L

neg/0 1/+

2/++ 3/+++

4/++++

nitriti

neg/poz

neg/poz

neg/poz

leukocitna esteraza

Lkc/µL

Lkc x 106 /L

neg/0 1/+

2/++ 3/+++

4/++++


7

DOKAZIVANJE PROTEINA U MOKRA ĆI

a) Dokazivanje s indikatorskom testnom trakom Reagens papir polja za odreñivanje proteina sadrži smjesu pufera i indikatora (3′,3″,5′,5″-tetraklorfenol-3,4,5,6-tetrabrom-sulfoftalein) koji uz stalni pH mokraće mijenja boju u prisutnosti proteina od žute-svjetlozelene-zelene. Posebno je osjetljiv na albumine dok nije naročito osjetljiv na ostale proteine (globulini, Bence-Jones protein). P o s t u p a k Traka se uroni u svježu mokraću i promjena boje odmah usporedi s priloženom skalom na kutiji. Lažno pozitivni rezultat javlja se u jako alkalnoj mokraći (pH oko 9), ako su prisutne kvarterne amonijeve soli (dezinficijensi), te niz lijekova i njihovih metabolita (kinina, kinidini, fenazopiridini, trimetoprim). Uvjerljivu obojenost test trake daju već koncentracije od 6 mg/100 ml albumina u mokraći. Test za proteine je jednako osjetljiv kao test kuhanjem s acetatnim puferom. Izvori pogrešaka su infuzije polivinil pirolidona ili ostaci dezinfekcijskih sredstava koji sadrže kvarterne amonij baze ili klorheksidin te uzimanje lijekova. Granica osjetljivosti metode: 0.02 - 0.46 g/L b) Dokazivanje sa sulfosalicilnom kiselinom

Češto se koristi reakcija sa 20%-tnom sulfosalicilnom kiselinom, koja raskida hidratacijski omotač oko proteinskih molekula, oslobaña polarne skupine i kemijski se za njih veže. U reakciji se povezuju ogoljele molekule u aglomerate, koji se zapažaju kao zamućenje ili talog. Reakcija sa sulfosalicilnom kiselinom je vrlo osjetljiva i njen pozitivni ishod se mora potvrditi i drugim reakcijama. R e a g e n c i j e Sulfosalicilna kiseliina, 0.80 mol/L (200 g/L) P o s t u p a k U epruvetu se ulije oko 5 ml bistre slabo kisele mokraće i dokapa najviše 10 kapi sulfosalicilne kiseline. Ako su u mokraći prisutni proteini u mjerljivim količinama (iznad 100 mg/L), svaka kap reagensa izazvat će oblačić zamućenja ili čak stvaranje taloga. Reakcija sa sulfosalicilnom kiselinom je vrlo osjetljiva, pa se djelomično pozitivni rezultat, opalescencija, dobiva uz fiziološku koncentraciju proteina u mokraći (oko 20 mg/L). Zbog toga je negativni rezultat reakcije sa sulfosalicilnom kiselinom siguran podatak da u ispitivanoj mokraći nema proteina. Ako je rezultat reakcije pozitivan, treba ga provjeriti drugim reakcijama.


8

Lažno pozitivni rezultat pri dokazivanju proteina sa sulfosalicilnom kiselinom mogu izazvati velike količine mokraćne kiseline, metaboliti organskih kontrastnih sredstava za rendgensko snimanje, tolbutamid, neki sulfonamidi. c) Dokazivanje kuhanjem Često se izvodi reakcija kuhanja. Povećanjem temperature dolazi do raskidanja hidratacijskog omotača, proteinske molekule se denaturiraju i povezuju u aglomerate, što se zamjećuje kao zamućenje. Ova reakcija se mora provoditi u kiseloj sredini (pH oko 5), jer se u alkalnom mediju talože tercijarni fosfati i karbonati. R e a g e n c i j e Octena kiselina, 0.83 mol/L (50 g/L) P o s t u p a k U epruvetu se ulije 10 do 15 ml bistre mokraće i gornji dio tekućine zagrije do vrenja direktnim plamenom. Ako ima proteina, zamutit će se zagrijani dio tekućine i jasno će se uočiti razlika izmeñu zamućenog vrućeg i bistrog hladnog sloja. Mokraća mora biti slabo kisela (pH oko 5), jer se iz alkalne mokraće izlučuju uz grijanje tercijarni fosfati i karbonati kalcija i magnezija. Ako je prilikom ispitivanja došlo do zamućenja, oprezno se kapne 1 do 2 kapi octene kiseline i pri tom se fosfati i karbonati otope, a istovremeno pojača mutež istaloženih proteina. DOKAZIVANJE ERITROCITA I HEMOGLOBINA U MOKRA ĆI

Dokazivanje eritrocita najsigurnije se vrši pregledom sedimenta svježe, slabo kisele mokraće. Stajanjem dolazi do morfoloških promjena. Eritrociti se mogu smežurati i skupiti u hipertoničnoj ili nabubriti i lizirati u hipotoničnoj mokraći. Kemijske reakcije za dokazivanje hemoglobina temelje se na njegovom pseudoperoksidaznom djelovanju, jer hemoglobin posjeduje svojstvo oksidacije kromogenih spojeva (aromatskih amina i polifenola) u prisutnosti vodik peroksida. Za kemijski način dokazivanja hemoglobina potrebno je mokraću prethodno promiješati, da se eritrociti ravnomjerno raspodjele i zatim prokuhati radi inaktiviranja pravih peroksidaza iz eventualno prisutnih leukoocita. a) Dokazivanje pomoću testne trake Test se temelji na pseudoperoksidativnom djelovanju hemoglobina odnosno mioglobina, koji kataliziraju oksidaciju indikatora s organskim peroksidom (2,5-dimetiheksan-2,5-dihidroperoksid) u plavo-zeleni kromogen koji na žutom polju izaziva sve prijelaze žute boje prema zelenom. Dodatkom aktivatora povećana je osjetljivost reakcije. Intaktni eritrociti se hemoliziraju a osloboñeni hemoglobin uzrokuje nastajanje boje oko eritrocita stvarajući uočljive zelene točke.


9

P o s t u p a k Testna traka se uroni u ispitivanu mokraću i nakon 30 sekundi usporeñuje promjena boje s priloženom skalom. Osjetljivost reakcije je 5 eritrocita/µLmokraće. Osjetljivost reakcije se proteže gotovo do normalnog područja (0-3 eritrocita/µL). Ako je prisutno dosta eritrocita, polje na traci može jednolično poprimiti zelenu boju kao u slučaju hemoglobinurije pa je pretragu potrebno ponoviti nakon razrijeñivanja mokraće. Reakcija je specifična za hemoglobin i mioglobin. Lažno pozitivnu reakciju uvjetuje prisustvo jakih oksidansa koji neposredno oksidiraju aromatski amin, dok lažno negativni rezultat može izazvati veća količina askorbinske kiseline. b) Reakcija s aminopirinom N a č e l o Hemoglobin uz pomoć vodik peroksida oksidira aminopirin na ljubičasto obojeni spoj (rubazonska kiselina). R e a g e n c i j e 1. Octena kiselina, glacijalna 2. Aminopirin u 96%-tnom etanolu, 60 g/L 3. 10%-tna otopina vodik peroksida P o s t u p a k 3 ml mokraće zakiseli se s 2 do 3 kapi koncentrirane octene kiseline, prokuha i ohladi, a zatim nadsloji s 3 ml otopine aminopirina. Dokapanjem nekoliko kapi svježe pripravljene l0%-tne otopine vodik peroksida stvara se ljubičasto crveni prsten u dodirnoj zoni, ako je prisutan krvni pigment. Peroksidaze iz leukocita mogu uzrokovati lažno pozitivnu reakciju. DOKAZIVANJE ŠE ĆERA U MOKRAĆI

a) Dokazivanje testnom trakom N a č e l o Dio testne trake impregniran je puferiranom smjesom glukoza oksidaze, peroksidaze i aromatskog amina (tolidin, ABTS-diamonijeva sol 2,2-azino-di/3-etil-benzotiazolin/sulfonska kiselina). Katalitičkim djelovanjem glukoza oksidaze pregrañuje se glukoza u glukonolakton uz stvaranje vodik peroksida, koji s peroksidazom prevodi aromatski amin u obojeni oksidirani produkt. P o s t u p a k Testna traka se uroni u ispitivanu mokraću i nakon 30 sekundi usporeñuje promjena boje s priloženom skalom.


10

Slabu ali zamjetljivu promjenu boje (svijetlo zeleno) izaziva 0.7 mmol glukoze/L mokraće. Lažno pozitivni rezultat izazivaju oksidansi (hipoklorit, klor, jod), koji mogu direktno oksidirati aromatski amin. Enzimsko odreñivanje glukoze u mokraći ometa askorbinska kiselina. DOKAZIVANJE KETONSKIH SPOJEVA U MOKRA ĆI

a) Dokazivanje testnom trakom N a č e l o Dio trake impregniran je s natrij nitroprusidom i puferom. Acetoctena kiselina i aceton reagiraju s natrij nitroprusidom i glicinom u alkalnom mediju dajući ljubičasto obojeni spoj. β-hidroksimaslačna kiselina ne reagira. P o s t u p a k Testna traka se uroni u ispitivanu mokraću i nakon 15 sekundi usporeñuje promjena boje s priloženom skalom. Granica osjetljivosti testne trake je 0.15-1.0 mmol/L acetoctene kiseline odnosno 7-12 mmol/L acetona u mokraći. Pozitivni rezultat za ketonske spojeve s test trakama i tabletama daju isti lijekovi kao i kod kemijskih reakcija.

DOKAZIVANJE BILIRUBINA U MOKRA ĆI

a) Dokazivanje testnom trakom Dio trake impregniran je mješavinom pufera i stabilne diazonij soli (2,6-diklor-benzoldiazonijumfluoroborat) koja s bilirubinom u kiselom stvara crvenoljubičastu azo-boju. P o s t u p a k Testna traka se uroni u ispitivanu mokraću i nakon 20 sekundi usporeñuje promjena boje sa priloženom skalom. Granica osjetljivosti je 3.5 -14 µmol bilirubina/L. Lažno pozitivni rezultat daju lijekovi koji su crveno obojeni u kiselom mediju (fenazopiridini). Lažno negativni rezultat daju nitriti i askorbinska kiselina. Dokazivanje bilirubina mora se vršiti u svježoj mokraći jer stajanjem na zraku bilirubin oksidira. DOKAZIVANJE UROBILINOGENA U MOKRA ĆI

a) Ispitivanje s testnom trakom


11

Dio trake impregniran je s stabilnom diazonijevom soli (p-metoksibenzendiazonijum fluoroborat) koja s urobilinogenom daje u kiselom crvenu azoboju. P o s t u p a k Testna traka se uroni u ispitivanu mokraću i nakon 10 sekundi usporeñuje promjena boje sa priloženom skalom. Granica osjetljivosti je oko 1.7 - 17µmol/L. Reakcija je specifična za urobilinogen. Ne reagiraju ostale diazo pozitivne tvari kao u reakciji po Ehrlichu (indikan, porfobilinogen sulfonamidi i druge). Lažno pozitivni rezultat daju razni lijekovi i metaboliti (fenazopiridin, neki sulfonamidi, aminosalicilna kiselina, antipirin, BSP). DOKAZIVANJE NITRITA U MOKRA ĆI

a) Dokazivanje s testnom trakom N a č e l o U kiseloj otopini sulfanilna kiselina i nitriti nastali djelovanjem bakterija stvaraju diazobenzen-sulfonsku kiselinu, koja reagira s alfa-naftilaminom stvarajući crveno obojeni azo-spoj. P o s t u p a k Traka se uroni u sasvim svježu mokraću i nakon 30 sekundi usporeñuje promjena boje s priloženom skalom. Granica osjetljivosti trake je 3 - 17 µmol/L nitrita u mokraći. Lažno pozitivni rezultat daju biljne boje (cikla) ili lijekovi (piridazol).

PRETRAGA MOKRAĆNOG SEDIMENTA

Jednostavni rutinski pregled mokraće završava važnim mikroskopskim pregledom sedimenta. Ova pretraga je naročito vrijedna u slučajevima, kada su u mokraći dokazani proteini ili hemoglobin, jer se prema sastavu sedimenta mogu donijeti zaključci o mjestu i vrsti oboljenja mokraćnih organa. Iz svake, pa i najbistrije, mokraće taloži se stajanjem nešto sedimenta. Normalno se sediment mokraće sastoji od različitih teško topivih tvari, staničnih elemenata, i raznih primjesa. Sastojci sedimenta dijele se na dvije skupine, na organizirani i neorganizirani dio sedimenta.

N e o r g a n i z i r a n i dio sedimenta čine kristali teško topivih spojeva, ponajčešće mokraćne kiseline, kalcijevog oksalata, raznih fosfata, amorfni urati i fosfati, te rijeñe kristali teško topivih aminokiselina, prirodnih spojeva, te lijekova i njihovih metabolita.


12

O r g a n i z i r a n i dio sedimenta sačinjavaju eritrociti, leukociti, epitelne stanice, mikroorganizmi, paraziti i njihova jajašca, spermiji i dijagnostički neobično važni cilindri. Ponekad se nailazi na slučajne primjese (dlačice, vlakanca, kapljice masti, zrnca škroba i dr.).

Za pregled sedimenta preporučuje se uzeti svježa jutarnja, najkoncentriranija mokraća. Mokraća mora biti slabo kisela (pH niži od 6), a specifična težina veća od 1.010. 5-12 ml promiješane mokraće ulije se u centrifugirku i centrifugira 5 minuta uz manji broj okretaja (400 x g) (do 1500 u minuti), da se ne unište krhki elementi. Bistra mokraća iznad taloga se najvećim dijelom odlije, a uz sediment ostaje 20-ti dio početnog volumena mokraće (npr. ukupni volumen mokraće 10 mL - volumen sedimentamokraće 0.5 mL) (bistra mokraća služi za ispitivanje prisutnosti proteina).

Danas je preporuka svježe pripremljeni sediment bojati vodenim otopinama boja kako bi se postigla dobra vidljivost staničnih struktura. Za takovo bojanje mogu se koristiti slijedeće boje: Steinheimerova boja koja sadrži Alcian plavilo i pironin B ili Toluidinsko plavilo O.

Od tako pripremljenog sedimenta mokraće uzima se uvijek isti volumen (10-

12 µl) i nanosi na predmetno stakalce te pokrije pokrovnicom uvijek iste površine (npr. 18 x 18) i promatra pod mikroskopom:

� pod malim povećanjem objektiva - za grubu procjenu sadržaja sedimenta pregledava se cijeli preparat, uključujući i rubove pokrovnice

� pod velikim povećanjem objektiva - za kvantificiranje prisutnih elemenata u pažljivo pretraženih 20 vidnih polja

Obilati talozi urata, amorfnih fosfata ili karbonata smetaju pri pregledu sedimenta, pa ih treba ukloniti. Crvenkasti uratni talog lako se otapa zagrijavanjem na 37°C. Mokraća se zagrije na 40°C, centrifugira i dekantira od sedimenta, dok je još topao. Gusti amorfni talog od kalcij i magnezij fosfata otapa se dodatkom 10%-tne octene kiseline do pH 5.

Najuobičajenije je izražavanje staničnih elemenata po vidnom polju velikog povećanja (x400), a preporuka je je izražavanje staničnih elemenata u SI sustavu (stanični element x 106/L) U sedimentu mokraće zdravog čovjeka normalno se nalaze kristali mokraćne kiseline, kalcij oksalata i ponekad fosfata, ako je mokraća alkalna. Uz to se nailazi na sluzne niti, poneku pločastu epitelnu stanicu i naročito kod žena, poneki leukocit. Ako se pregled sedimenta ne može izvršiti u svježoj mokraći, ako su u sedimentu nañeni rijeñi ili čak nedovoljno jasni elementi, sediment treba konzervirati i pretragu ponoviti u drugo vrijeme ili drugom laboratoriju. Kao konzervans se dodaje 1 ml 40%-tnog formalina u 10 ml mokraće.


13

ODREðIVANJE KONCENTRACIJE NATRIJA I KALIJA

PLAMENIM FOTOMETROM

N a č e l o Razrijeñeni uzorak seruma (ili mokraće) rasprši se u plamenu smjese propana, butana ili gradskog plina i zraka. Natrij i kalij karakteristično oboje plamen - natrij žuto, a kalij ljubičasto. Svjetlosna energija koju emitiraju u plamenu pobuñeni ioni tih elemenata prolazi kroz odgovarajući filtar i prevodi se u fotostanici (fotoelement, fotoumnoživač) u električnu energiju koja se opaža pomoću galvanometra. Intenzivnost emitiranog svjetla razmjerna je koncentraciji natrija odnosno kalija u ispitivanoj otopini. Kako intenzivnost emitiranog svjetla, osim same koncentracije iona, ovisi još i o nekim drugim faktorima, prije svega o jačini plina i dovodu zraka (natrij i kalij potrebna temperatura iznosi 1900°C, to se istodobno pod istim uvjetima mjere i otopine poznatih koncentracija natrija i kalija (standardi). R e a g e n c i j e 1. Standardna otopina za odreñivanje natrija i kalija u serumu, natrij 140 mmol/L, kalij 5 mmol/L 2. Standardna otopina za odreñivanje natrija i kalija u mokraći, natrij 100 mmol/L, kalij 5 mmol/L 3. Nulta otopina. U plastičnu bocu od razrijeñivača stavi se 5 ml koncentriranog aspiracijskog standarda i dopuni do 500 ml redestiliranom vodom. Tako pripremljena otopina sadrži 3 mmol/L LiCl. Ova otopina služi za podešavanje nule i kao unutarnji standard instrumenta. Otopina je stabilna 3 dana. P o s t u p a k A. Uključivanje plamenog fotometra RADIOMETAR FLM 3 1. otvoriti ventil za dovod propana 2. uključiti kompresor za zrak 3. uključiti glavni prekidač (POWER) Upale se diode za plin, zrak i plamen. Plameni fotometar je spreman za rad. B. Kalibracija Na/K kanala 1. Okrenuti sklopku na odgovarajuću oznaku (Na, K, Li) prema tome što se hoće mjeriti. 2. Mjerenje se vrši u posebnim čašicama. Pritisnuti prekidač razrijeñivača. (slijedi faza uzimanja uzorka u ovom slučaju zraka, ponovno pritisnuti prekidač razrijeñivača (slijedi izbacivanje otopine za razrijeñivanje). Podizanjem prekidača na kojem se nalazi nulta otopina ispod raspršivača započinje mjerenje, potrebno je podesiti za Na:000 a za K:0.0 3. Kalibracija uz pomoć stnadardne otopine za natrij i kalij u serumu (140 i 5 mmol/L). Pritiskom na prekidač razrijeñivača uzima se 50 µl standarda (1), uz ponovljenu aktivaciju prekidača izbaci se razrijeñeni standard (1:200) u čistu čašicu. Staviti raspršivač u čašicu sa standardom i kalibrirati instrument, (namjestiti na


14

digitalnom mjerilu 140 za natrij i 5.0 za kalij). Sada je aparat spreman za mjerenje uzoraka. C. Mjerenje natrija i kalija u serumu Razrijeñeni uzorak (1:200) staviti pod raspršivač i očitati na digitalnom mjerilu izmjerenu koncentraciju. Stabilne vrijednosti se dobivaju za 5 do 7 sekundi. Kako plameni fotometar radi uz unutarnji standard (Litij, 3 mmol/L), tokom rada nije potrebno provjeravati nulu. D. Isključivanje instrumenta Nakon završenog mjerenja, instrument ispirati 10 minuta s destiliranom vodom. Zatvoriti dovod plina, isključiti kompresor i pritisnuti glavni prekidač (POWER). N a p o m e n a Više faktora utječe na točnost mjerenja plamenom fotometrijom: Za razliku od izvora svjetlosti kod fotometra (lampa), ovdje je izvor svjetla plamen, a njegova stabilnost i intenzivnost ovise o jednoličnom dotoku i tlaku plina i zraka. Zato je bolje raditi s plinom iz boce (propanom ili butanom) nego s gradskim plinom. Čistoća plina je takoñer važna. Kompresor za zrak mora jednolično opskrbljivati aparat zrakom, pa se zato kompresor mora održavati u besprijekornom stanju. Moderniji aparati stoga rade uz upotrebu internog standarda. Kao interni standard koriste se litijeve soli. Litijeva sol dodaje se standardima i probama. Promjene u stabilnosti automatski se izravnavaju, čime se povećava preciznost mjerenja. Plamenik i raspršivač moraju biti uvijek čisti, da bi se osigurao jednoličan protok otopine. U raspršivaču se s vremenom istalože proteini koji mogu smanjiti prohodnost, i time protok probe, ili ga potpuno začepiti. Zato se raspršivač mora povremeno čistiti tankom žicom. Iz istog razloga se probe i standardi razrijeñuju otopinom koja sadrži deterñent slobodan od iona (npr. Exstran), jer to pogoduje jednoličnom dotoku otopina u plamen i stvara jednolične i male kapljice prilikom raspršivanja tekućine koja se mjeri. Stupanj razrijeñenja probe ovisi o svojstvima aparata i koncentraciji elektrolita u otopini koja se mjeri. Razrijediti treba toliko da se dobije optimalna osjetljivost i točnost instrumenta. Zato se valja dosljedno držati uputa proizvoñača aparata. Razrijeñivanjem se smanjuje koncentracija proteina u tekućini i viskoznost, a to pogoduje jednoličnom protoku u raspršivaču. Zbog blizine spektralnih linija natrija i kalija, ovi kationi smetaju jedan drugom prilikom mjerenja. Zato, da bi se ta greška svela na što manju mjeru, a kako se mjerenje izvodi usporeñivanjem intenzivnosti emisije svjetla probe sa standardima, dobro je da i standardi sadrže oba kationa. L i t e r a t u r a Propisi tvrtke Radiometar


15

ODREðIVANJE KALCIJA U SERUMU

metoda s o-k r e z o l f t a l e i n o m

N a č e l o O-krezolftalein komplekson s kalcijem u alkalnom daje ljubičasto obojeni helatni kompleks čiji je intenzitet proporcionalan s koncentracijom kalcija u uzorku. R e a g e n c i j e Priprema i stabilnost otopine reagensa Radni reagens: Prema broju odreñivanja pomiješati pufer i kolor reagens u odnosu 1+1. Stabilnost: 8 sati na 20-25°C. R1 Kolor reagens o-krezolftalein 8-hidroksikinolin polivinilpirolidin R2 Pufer 2-amino-1-metilpropanol R3 standard Kalcij R4 EDTA

0.16 mmol/L 6.90 mmol/L 0.07 mmol/L 260 mmol/L 2.50 mmol/L 150 mmol/L

P o s t u p a k

Slijepa Standard Proba proba reagensa ml ml ml

H20 0.020 - - Uzorak - - 0.020 Standard - 0.020 - Radni reagens 1.0 1.0 1.0

Promiješati. Izmjeriti absorbancije standarda i proba prema slijepoj probi reagensa na 575 nm (540-600 nm)..

R a č u n Serum Aprobe ------------ x 2.5 = mmol kalcija/L Astandarda


16

N a p o m e n a Uzorak za analizu je nehemolizirani serum, Li-heparinat plazma ili mokraća. Boja je stabilna 50 minuta. Linearnost metode je do 3.4 mmol/L. Iznad ove vrijednosti uzorak treba razrijediti s fiziološkom otopinom (0.9% NaCl) u odnosu 1+1, ponoviti odreñivanje a rezultat pomnožiti sa 2. Antikoagulancije EDTA, citrat i oksalat se ne smiju upotrebljavati. Izbjegavati stazu i kontraminaciju s tkivnom tekućinom. Po mogućnosti ispitanik treba ležati 15 minuta i u tom položaju izvaditi krv (inače 10% više vrijednosti). Koncentracija kalcija u serumu se ne mijenja 8 sati na 20-25°C, 10 dana u hladnjaku, 12 mjeseci na -20°C. 24-satna mokraća: U posudu za sakupljanje mokraće stavi se 10 ml 6 M HCL. Skupljena mokraća u toku 24 sata, dobro se promiješa, odfiltrira, uzme 10-12 ml za analizu, razrijedii s fiziološkom otopinom (0.9% NaCl) ili destiliranom vodom u odnosu 1+2, a rezultat pomnožiti s 3. Kalcij je često prisutan u mnogim materijalima pa se preporučuje testiranje plastičnih ili staklenih epruveta i kiveta. Sav pribor se treba prati razrijeñenom HCl (1:4), te isprati s redestiliranom ili deioniziranom vodom. Za serume koji sadrže 2 g/L hemoglobina, >300 µmol/L bilirubina ili su jako lipemični nakon odreñivanja dodati u slijepu probu i probe po 1 kap EDTA, te nakon 5 minuta ponovo očitati absorbancije. L i t e r a t u r a Sarkar R, Chandan UPC. Anal Biochem 1967; 20: 155.


17

ODREðIVANJE UKUPNIH PROTEINA U SERUMU

b i u r e t m e t o d a

N a č e l o Proteini i peptidi reagiraju s bakrenim ionima u alkalnom mediju stvarajući ljubičasto obojeni produkt. Intenzitet boje je proporcionalan s brojem peptidnih vezova odnosno s koncentracijom proteina u ispitivanom uzorku. R e a g e n c i j e 1. Biuret reagens 45 g kalij natrij tartarata otopi se u 200 ml 0.2 mol/L NaOH, zatim se otapa 5 g CuSO4 x 5H2O i konačno 5 g KI, te dopuni lužinom na 1 L. Tartarat stabilizira reagens, a jodid sprečava spontanu redukciju bakra. Reagens se sprema u tamnoj boci koja je iznutra parafinirana i dobro začepljena gumenim čepom. Upotrebljiv je 2 do 3 mjeseca. Kada se zamuti uz dodatak seruma reagens je neupotrebljiv. 2. Natrij hidroksid, 0.20 mol/L (8 g/L) 8 g NaOH otapa se u 1 L destilirane vode 3. Natrij klorid, 0.154 mol/L (9 g/L) 4. Standardna otopina proteina, 70 g/L 7 g albumina otopi se u 100 ml 0.02 mol/L kalij klorida (KCl, Mr 74.56) čiji je pH podešen na 6.5-6.8 natrij bikarbonatom. Pod sterilnim uvjetima otopina je na +4°C stabilna nekoliko mjeseci. Najbolje je otopinu razdijeliti u ampule koje služe samo za dnevnu upotrebu. P o s t u p a k

Slijepa Proba Standard ml ml ml

NaCl (3) 5.0 4.8 4.8 Serum - 0.2 - Standard (4) - - 0.2 Biuret reagens (1) 5.0 5.0 5.0

Pomiješa se i fotometrira 30-90 minuta nakon dodavanja biuret reagensa na 546 nm ili uz zeleni filter s maksimumom propustljivosti od 546 do 565 nm.

R a č u n Aprobe -------------- x koncentracija standarda = g proteina/L seruma. Astandarda

Ako se usporedo ne radi standard rezultati se očitavaju iz baždarnog dijagrama, koji se izrañuje na slijedeći način: U miješanom serumu odredi se ukupni i neproteinski dušik mikrokjeldahl postupkom i izračuna koncentracija proteina prema formuli (UN - NPN) x 6.25 = g proteina/L.


18

Serum s poznatom koncentracijom proteina razrijedi se s fiziološkom otopinom 10 puta. Za analizu se uzima 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 i 2.5 ml razrijeñenog seruma, dopunjava se fiziološkom otopinom do 5.0 ml i dodaje 5.0 ml biuret reagensa, a nakon 30 minuta izmjere se absorbancije. Primjer: UN = 12.0 g/L NPN = 0.45 g/L (12.0 - 0.45) x 6.25 = 72 g proteina/L. volumen razrijeñenog seruma, ml

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

g proteina u uzetom volumenu 0.0036 0.0072 0.0108 0.0144 0.018 odgovara koncentraciji proteina u g/L (∗)

18

36

54

72

90

absorbancija 0.075 0.16 0.26 0.32 0.40

(∗) količine proteina treba množiti sa 5000, jer se u postupku uzima 0.2 ml seruma, a rezultat se izražava na 1 L. N a p o m e n a Odreñivanje proteina pomoću jednostavnog biuret reagensa otežano je u lipemičnim serumima. U svrhu izbjegavanja grešaka dodaje se ureja i miješa matična otopina biureta s otopinom za razrjeñivanje. Takva otopina biureta je nestabilnija i treba je pripravljati svaki tjedan. Jedan od provjerenih je biuret reagens prema Richterichu, 1971. a) Matična otopina kalij natrij tartarata 159 mmol/L, bakar(II) sulfata 60 mmol/L, kalij jodida 30 mmol/L i natrij hidroksida 200 mmol/L 4.5 g kalij natrij tartarata otopi se u 40 ml 0.2 M natrij hidroksida. Zatim se otapa 1.5 g CuSO4 x 5H2O, te 0.5 g KJ i nadopuni s NaOH na 100 ml. Čuva se u tamnoj boci na sobnoj temperaturi. b) Otopina za razrijeñivanje: kalij jodid, 30 mmol/L i natrij hidroksid, 200 mmol/L 5 g KJ otopi se u 1000 ml 0.2 mol/L NaOH. Drži se na sobnoj temperaturi. c) Konačni biuret reagens: kalij natrij tartarat 31.8 mmol/L, bakar(II) sulfat 12 mmol/L, natrij hidroksid 200 mmol/L, kalij jodid 30 mmol/L i ureja 6 mol/L 180 g ureje stavlja se u smjesu od 100 ml matične otopine (a) i 250 ml otopine za razrijeñivanje (b) i konačno nadopuni otopinom za razrijeñivanje na 500 ml. Drži se na sobnoj temperaturi a stabilan je 7 dana. L i t e r a t u r a Wolfson WA., Cohn C., Calvary E., Ichiba F.: Am.J.Clin.Path., 18, 723 (1948) Richterich P.: Klinische Chemie, III izd., Karger, Basel, 1971. str. 305


19

RAZDVAJANJE PROTEINA SERUMA e l e k t r o f o r e z o m n a c e l o g e l t r a k a m a

N a č e l o Putovanje nabijenih čestica u električnom polju naziva se eklektroforeza. Brzina putovanja ovisi o naboju čestica. Da bi se naboj održao konstantnim, potrebno je da se tijekom elektroforeze održava stalnost sredine u kojoj se ona odvija. To se postiže tako da elektroforeza teče u puferu odreñenog pH, ionske jakosti i vodljivosti. Proteini su amfoterni jer naboj aminokiselina zavisi od pH sredine. Nanošenjem seruma na vlažnu celogel traku, elektroforetski se razdvajaju proteinske skupine, bojaju, suvišak boje ukloni a obojene zone izrežu, boja eluira i absorbancije mjere fotometrijski. Češće se traka učini providnom i kvantitativno mjerenje izvrši direktno denzitometrijski. R e a g e n c i j e i p r i b o r 1. Veronal pufer, 40 mmol/L, pH 9.2 8.24 g natrij dietilbarbiturata (C8H11N2O2Na) (Mr 206) otopi se u 1 L 2. Otopina za bojanje, Ponceau S, 5 g/L 0.5 g boje Ponceau S otopi se u 100 ml 0.3 mol/L trikloroctene kiseline CCl3COOH (Mr 163) 3. Otopina za odbojavanje 5 ml glacijalne octene kiseline razrijedi se na 100 ml 4. Otopina za otapanje celogela, octena kiselina, 80 % (v/v) 5. Otopina za postizavanje prozirnosti traka Pomiješa se 86 ml metanola, 14 ml octene kiseline i 0.1 ml glicerola 6. Celogel trake veličine 2.5 x 14 ili 2.5 x 17 cm Trake se moraju čuvati u zatvorenom paketu, a otvoreno pakovanje se mora držati u vertikalnom položaju. Ako se trake upotrebe u roku 7 dana, potrebno je dodati vodu, a ako se koriste duže od 15 dana, trake se stavljaju u pokrivenu posudu s 30 %-tnim (v/v) metanolom. Prosušene trake gube karakteristiku gela. P o s t u p a k Pufer se ulije u kadicu za elektroforezu i nivo tekućine izjednači. Celogel trake se stavljaju u pufer najmanje 10 minuta, a najdulje preko noći. Suvišak tekućine uklanja se stavljanjem traka izmeñu dva filter papira, ali traka se ne smije pritiskati. Trake se stavljaju na most kade za elektroforezu i to tako da penetrantna strana traka bude okrenuta na gore. Slobodne krajeve traka treba prekriti filter papirom. Trake moraju biti napete i postupak nanošenja treba izvoditi što brže da bi se izbjeglo prosušivanje traka. Normalna elektroforeza vrši se na trakama veličine 2.5 x 17 cm, koje su razapete na mostu od 11 cm. Nanaša se 3 do 4 µl seruma 1.5 cm od katodnog kraja. Uključi se struja, podesi napon od 200 V, stavi pokrov na kadu i elektroforetsko razdvajanje provodi 75 minuta. Uz navedene uvjete proteini se pomaknu maksimalno 6 cm i dobivaju se frakcije albumina, alfa-1, alfa-2, beta- i gama-globulina. Ponekad se beta-globulinska frakcija razdvaja u dvije polufrakcije.


20

Po završetku elektroforetskog razdvajanja trake se označe brojevima pomoću pera umočenog u razrijeñeni serum. Trake se stavljaju 5 minuta u otopinu boje, zatim se suvišak boje odstranjuje trokratnim stavljanjem u razrijeñenu otopinu octene kiseline. Obojene frakcije mogu se izrezati i staviti u 5 epruveta. U svaku se dodaje smjesa za otapanje celogela, 80%-tna octena kiselina i to 3 ml za globulinske frakcije i 6 ml za albuminsku frakciju. Absorbancija svjetla otopina proteinskih frakcija mjeri se prema eluatu dijela trake bez proteina na 520 nm. Na temelju očitanih absorbancija izračunavaju se relativni postoci proteinskih frakcija. Mjerenje relativnih postotaka proteinskih frakcija može se vršiti i na trakama koje su učinjene transparentnima. Trake se nakon bojanja proteina i uklanjanja suviška boje stavljaju u metanol, da se izvrši dehidratacija. Nakon samo 30 sekunda odlije se metanol i doda otopina za postizanje prozirnosti traka, a nakon jedne minute trake se stavljaju na staklenu ploču i suvišak tekućine ukloni filter papirom. Trake se zagriju na 50 do 60°C kroz 5 minuta i postaju sasvim prozirne. Preokrenuta staklena ploča se stavi na komad bijelog papira, hladi se oko 20 minuta i zatim se trake skidaju i stavljaju u plastični ili papirnati omot. Prozirne trake mogu poslužiti za denzitometrijsko odreñivanje relativnih postotaka proteinskih frakcija.

ODREðIVANJE UREJE U SERUMU I MOKRA ĆI

Metoda s u r e a z o m i Berthelot-reakcijom (f e n o l i h i p o k l o r i t)

N a č e l o Djelovanjem ureaze razgrañuje se ureja na ugljični dioksid i amonijak, koji u reakciji s fenolom i hipokloritom u prisutnosti nitroprusida stvara plavo obojeni indofenolni spoj, koji se mjeri na 540 nm. R e a g e n c i j e 1. Fosfatni pufer, 0.10 mol/L, pH 7.4 a) otopina natrij hidrogen fosfata, 0.1 mol/L 14.2 g Na2HPO4 ili 17.8 g Na2HPO4 x 2H2O otopi se u 1L destilirane vode b) otopina kalij hidrogen fosfata, 0.10 mol/L 13.6 g KH2PO4 otopi se u 1 L destilirane vode c) fosfatni pufer, 0.l0 mol/L, pH 7.4 pripravlja se miješanjem 808 ml otopine natrij hidrogen fosfata (a) i 192 ml otopine kalij hidrogen fosfata (b) 2. Puferirana otopina ureaze 100 mg kupovne ureaze razmuti se u 100 ml pufera, pH 7.4 (1c), filtrira se, konzervira s nekoliko kapi kloroforma, te čuva na +4°C. Otopinu ureaze može se pripremiti suspendiranjem 200 mg bezmasnog sojinog brašna u 100 ml pufera. Razriba se u tarioniku i profiltrira nakon 20 minuta. 3. Standardna otopina ureje, 5 mmol/L (300 mg/ml) 4. Koncentrirani fenolni reagens, fenol 540 mmol/L, nitroprusid 0.85 mmol/l


21

50 g fenola (bezbojnog) i 0.25 g nitroprusida Na2Fe(CN)5NO x 2H2O otopi se u 1 L destilirane vode (pazite - fenol stvara opekotine ako doñe u doticaj sa kožom). 5. Koncentrirani hipokloritni reagens: natrij hipoklorit NaOCl, 28 mmol/L u natrij hidroksidu, 625 mmol/L 2.1 g NaOCl i 25 g NaOH otopi se u destiliranoj vodi i nadopuni do 1 L 6. Razrijeñeni fenolni reagens, 106 mmol/L 100 ml koncentrirane otopine fenola razrijedi se do 500 ml sa destiliranom vodom 7. Razrijeñeni hipoklorit reagens - 5.6 mmol/L 100 ml koncentriranog reagensa razrijedi se do 500 ml sa destiliranom vodom P o s t u p a k

Slijepa Standard Proba ml ml ml

Ureaza (2) 0.10 0.10 0.10 Standard (3) - 0.20 - Serum ili mokraća (1:100) - - 0.20

Pomiješa se, inkubira 15 minuta na 37°C, a nakon toga dodaje

Otopina fenola (6) 5.0 5.0 5.0 Otopina hipoklorita (7) 5.0 5.0 5.0

Promiješa se i ostavi 20 minuta na 37°C ili 30 minuta na 25°C. Apsorbancija slijepe, probe i standarda očita se prema vodi na 540 nm ili uz zeleni filter.

R a č u n Aprobe - Aslijepe

----------------------------- x 5 = mmol/L seruma Astandarda - Aslijepe

Aprobe - Aslijepe ------------------------------ x 0.5 = mol/L mokraće Astandarda - Aslijepe

ili se preračuna na 24-satni volumen mokraće N a p o m e n a Nove modifikacije postupka koriste salicilat umjesto fenola, reakcija se provodi kod sobne temperature, a osjetljivost reakcije je bitno povećana. Aminofenol, asparagin i hemoliza daju lažno veće rezultate, a klorpromazin i inhibitori ureaze (fluoridi, spojevi žive, timol) lažno smanjene rezultate. L i t e r a t u r a Fawcett JK, Scott JE. J Clin Path 1960; 13: 156.


22

ODREðIVANJE UREJE U SERUMU I MOKRA ĆI

u r e a z a - GLDH N a č e l o Djelovanjem ureaze razgrañuje se ureja na ugljik dioksid i amonijak, koji u reakciji s α-ketoglutaratom i reduciranim koenzimom (NADH) djelovanjem glutamat dehidrogenaze stvara glutamat i oksidirani oblik koenzima. Pad absorbancije reduciranog koenzima na 340 nm proporcionalan je koncentraciji ureje u uzorku.

Ureja + H2O ⇒ Ureaza ⇒ 2NH3 + CO2

NH3+α-ketoglutarat+NADH ⇒ GLDH ⇒ Glutamat + NAD+

R e a g e n c i j e R1 Reagens Tris pufer pH 8.5 ± 0.1 (20°C) α-ketoglutarat NADH Ureaza GLDH R2 Standard Ureja

70 mmol/L 5.2 mmol/L >0.14 mmol/L > 5600 U/L > 400 U/L 17.81 mmol/L

Priprema otopine reagensa i stabilnost Sadržaj bočice reagensa (TR-1055) otopiti u 20 ml destilirane vode. Otopljeni reagens stabilan 90 dana na2 – 8 °C. P o s t u p a k

Proba Standard ml ml

Reagens 2.0 2.0 Uzorak 0.02 - Standard - 0.02

Promiješati. Na 340 nm izmjeriti A1 nakon 30 sekundi i A2 nakon 90 sekundi od početka reakcije. O-instrumenta: destilirana voda Izračunati ∆A / min = A1 – A2


23

R a č u n Serum (plazma) ∆A / min uzorka --------------------------- x 17.81= mmol ureje / L ∆A / min standarda N a p o m e n a Uzorak za analizu može biti nehemolizirani serum, plazma (sa EDTA ili Natrij heparinom), ili mokraća razrijeñena 1+20 sa vodom. Linearnost metode je do 40 mmol/L. Iznad ove vrijednosti uzorak treba razrijediti s destiliranom vodom koja ne sadrži amonijeve ione i ponoviti analizu. Rezultat množiti s faktorom razrijeñenja. Mora se izbjegavati zagañenje s amonijakom i amonij ionima. Fluorid je poznati inhibitor ureaze te smanjuje brzinu reakcije a prisutnost amonij iona u antikoagulancijama (naprimjer amonij heparin) uzrokuje lažno povišene vrijednosti. L i t e r a t u r a Talke H, Schubert GE. Klin Wochenschr. 1965; 43: 17. Fearon WR. Biochem 1931; 331: 802. Fawcett JK, Scott JE. J Clin Path 1960; 13: 156. Westgard JO, Hunt MR. Clin Chem 1973; 19: 49.

ODREðIVANJE KREATININA U SERUMU I MOKRA ĆI

d i r e k t n a m e t o d a N a č e l o Serum (ili razrijeñena mokraća 1:50) deproteinizira se trikloroctenom kiselinom. Kreatinin s alkalnom otopinom pikrata stvara kompleks narančaste boje, koji se mjeri na 546 nm. R e a g e n c i j e 1. Trikloroctena kiselina, 3.0 mol/L 490 g trikloroctene kiseline CCl3COOH (Mr 163) otopi se u 1 L destilirane vode 2. Pikrinska kiselina, 40 mmol/L 9.3 g pikrinske kiseline, trinitrofenola (Mr 229) otopi se u 500 ml destilirane vode uz zagrijavanje do 80°C. Otopina se ohladi i nadopuni destiliranom na 1 L 3. Natrij hidroksid, 4.1 mol/L 164 g NaOH otopi se u 1 L destilirane vode 4. Matični standard kreatinina, 10 mmol/L 113 mg kreatinina (Mr 113) otopi se u 100 ml 0.1 mol/L HCl 5. Radni standard kreatinina, 100 µmol/L 1.0 ml matičnog standarda (4) razrijedi se s 0.1 mol/L HCl na 100 ml


24

P o s t u p a k

Proba Standard Slijepa ml ml ml

Serum (ili mokraća 1:50) 2.0 - - Radni standard (5) - 1.0 - Destilirana voda 2.0 1.0 2.0 Trikloroctena kiselina (1) 2.0 1.0 1.0

Promiješa se i proba centrifugira 10 minuta na 3000 okretaja/minuta. U daljnji postupak uzima se ukupni sadržaj u epruvetama za standard i slijepu, te alikvot bistre tekućine - probe

Bistra tekućina (proba) 3.0 - - Pikrinska kiselina (2) 1.0 1.0 1.0 Natrij hidroksid (3) 1.0 1.0 1.0

Promiješa se i nakon 15 minuta mjeri absorbancija probe i standarda prema slijepoj na 546 nm ili uz zeleni filter (530 do 550 nm).

R a č u n Serum

Aprobe

------------ x 100 = µmol kreatinina/L Astandarda

Mokraća Aprobe 100 -------------- x ---------- x 50 = mmol/L mokraće Astandarda 1000

Rezultat se preračuna na 24-satni volumen mokraće. N a p o m e n a Pri odreñivanju kreatinina direktnim postupkom s pikratom u alkalnoj sredini reagiraju mnogi prirodni supstrati (glukoza, fruktoza, proteini, hemoglobin), lijekovi i njihovi metaboliti (PSP, BSP, askorbinska kiselina), a naročito intenzivno acetoacetat i aceton. Zbog toga postoji mnogo modifikacija reakcije s pikratom u kojima se kreatinin adsorbira na aluminij silikat (tonzil, Lloydov reagens, Fullerova zemlja) ili ionske izmjenjivače. Zadnjih godina razvijene su i kinetičke metode za koje je važno to što ostali kromogeni sporije reagiraju s alkalnim pikratom od kreatinina, pa se mjeri početna brzina razvijanja boje. Potpuno enzimske metode odreñivanja kreatinina su specifične, ali vrlo skupe. L i t e r a t u r a Modifikacija postupka Owen JA et al. Biochem J 1954; 58: 426.


25

ODREðIVANJE UKUPNOG BILIRUBINA U SERUMU

m e t o d a Jendrassik-Grof N a č e l o Nakon dodatka puferirane otopine akceleratora, konjugirani i nekonjugirani bilirubin reagiraju s diazo reagensom (sulfanilna kiselina i natrij nitrit) stvarajući azoboju. Dodatkom askorbinske kiseline razgradi se preostali reagens a s alkalnom otopinom tartarata (Fehlingova otopina), crvena boja azobilirubina prelazi u plavu boju, koja se mjeri na 600 nm. R e a g e n c i j e 1. Otopina akceleratora Kofein 260 mmol/L, natrij acetat 914 mmol/L, natrij benzoat 520 mmol/L i EDTA 2.69 mmol/L 7.5 g natrij benzoata otopi se u približno 80 ml destilirane vode, zagrije na 60°C, te doda 5.0 g kofeina, 7.5 g bezvodnog natrij acetata ili 12.5 g CH3COONa x 3H2O i 0.1 g Na2EDTA x 2H2O. Bistra otopina ohladi se na sobnu temperaturu i dopuni destiliranom vodom do 100 ml 1.a) Još bolji akcelerator je: Difilin 194 mmol/L, natrij acetat 914 mmol/L i EDTA 2.69 mmol/L 5.0 g difilina (2,2,,3,-dihidroksipropil teofilina), 7.5 g bezvodnog natrij acetata i 0.1 g Na2EDTA x 2H2O otopi se u približno 80 ml destilirane vode i zagrije na 50°C. Otopina se ohladi na sobnu temperaturu i dopuni destilirantom vodom do 100 ml. 2. Diazo reagens Otopina A - sulfanilna kiselina, 29 mmol/L 5 g sulfanilne kiseline (anilin-p-sulfonska kiselina) (Mr 173) otopi se u 800 ml destilirane vode uz dodatak 15 ml koncentrirane HCl i zagrije do 60°C. Otopina se ohladi na sobnu temperaturu i dopuni destiliranom vodom do 1 L. Otopina B - natrij nitrat, 72 mmol/L 0.5 g NaNO2 otopi se u 100 ml destilirane vode. Otopina je stabilna 14 dana u tamnoj boci na +4°C. Konačni diazo reagens Pomiješa se 10 ml otopine A - sulfanilna kiselina s 0.25 ml otopine B - natrij nitrit. Reagens je stabilan 30 minuta. 3. Askorbinska kiselina, 227 mmol/L 0.4 g askorbinske kiseline otopi se u 10 ml destilirane vode. Priprema se svaki dan svježa otopina. 4. Fehlingova otopina, kalij natrij tartarat, 1.24 mol/L, NaOH 2.5 mmol/L. 350 g kalij natrij tartarata x 4H2O i 100 g NaOH otopi se u 1 L destilirane vode.


26

P o s t u p a k

Proba Slijepa ml ml

Serum 1.0 1.0 Askorbinska kiselina - 0.1 Akcelerator (1) 2.0 2.0 Konačni diazo reagens (2) 0.5 0.5

Promiješa se i nakon 10 minuta dodaje

Askorbinska kiselina (3) 0.1 - Fehlingov reagens (4) 1.5 1.5

Promiješa se i mjeri absorbancija probe i slijepe prema destiliranoj vodi na 600 nm ili uz crveni filter u kiveti s debljinom sloja 10 mm.

Rezultat se očita iz baždarnog dijagrama ili se istovremeno vrši postupak sa standardnim serumom.

ODREðIVANJE KONJUGIRANOG BILIRUBINA

m e t o d a Jendrassik-Grof

N a č e l o Konjugirani bilirubin reagira s diazo reagensom (sulfanilna kiselina i natrij nitrit) bez dodataka akceleratora, stvarajući azoboju. Reakcija se prekida s askorbinskom kiselinom, a uz alkalnu otopinu tartarata crvena boja azobilirubina prelazi u plavu boju koja se mjeri na 600 nm. R e a g e n c i j e Iste kao za odreñivanje ukupnog bilirubina P o s t u p a k

Proba Slijepa ml ml

Serum 1.0 1.0 Askorbinska kiselina - 0.1 Akcelerator (1) - 2.0 Konačni diazo reagens (2) 0.5 0.5

Promiješa se, i nakon 10 minuta dodaje

Askorbinska kiselina (3) 0.1 - Akcelerator (1) 2.0 - Fehlingova otopina (4) 1.5 1.5

Promiješa se i mjeri absorbancija probe i slijepe prema destiliranoj vodi na 600 nm ili uz crveni filter.

N a p o m e n a


27

Odreñivanje bilirubina vrši se u svježem serumu, jer svjetlo, a posebno sunčeve zrake razgrañuju bilirubin. U pravilu serum se razrijeñuje s fiziološkom otopinom u omjeru 1:10. Lažno viši rezultat daju tirozin, histidin, askorbinska kiselina, aminofenol, rifampicin, DOPA i metil-DOPA. Snižene vrijednosti javljaju se pri jakoj hemolizi. L i t e r a t u r a Michaelssonova modifikacija metode Jendrassik L. Grof P. Biochem J 1938; 297: 81. razrañena u Verley H, Gowenlock AH, Bell M. Practical Clinical Biochemistry, vol.1, W.Hainmann Medical Books LTD, London, 1980, str. 1022.


28

ODREÐIVANJE GLUKOZE U SERUMU

enzimska metoda s g l u k o z a o k s i d a z o m i p e r o k s i d a z o m

N a č e l o Glukoza se katalitičkim djelovanjem glukoza oksidaze (GOD) oksidira u glukonsku kiselinu i pri tom nastaje vodikov peroksid, koji reagira s kromogenom tvari (aromatskim aminom) u prisutnosti peroksidaze (POD) stvarajući obojeni produkt. Intenzitet boje mjeri se fotometrijski.

Glukoza + O2 + H2O ⇒ GOD ⇒ glukonska kiselina +H2O2

2H2O2 + fenol + 4-aminoantipirin ⇒ POD ⇒ kinonimin + 4H2O

R e a g e n c i j e R1 Reagens 4-aminoantipirin Glukoza oksidaza (GOD) Peroksidaza (POD) R2 Pufer Fosfatni pufer pH 7.4 ± 0.05 Fenol R3 Standard Dodatni reagens

0.40 mmol/L >300 µkat/L > 17 µkat/L 100 mmol/L 10 mmol/L 5.56 mmol/L 0.4 mmol/L uranilacetat ili 0.33 mol/L perklorna kiselina

Priprema i stabilnost otopina Sadržaj bočice reagensa (TR-2000 otopiti u 250 ml pufera, TR-2001 otopiti u 500 ml pufera, TR-2002 otopiti u 1000 ml pufera) otopiti u puferu i sadržaj vratiti u bočicu pufera. Stabilnost: 4 tjedna na 2-8°C, 2 tjedna na 20-25°C. Čuvati na tamnom mjestu. P o s t u p a k

Standard Probe ml ml

Standard 0.01 - Serum - 0.01 Otopina reagensa 1.0 1.0

Promiješa se i inkubira 30 minuta na 20-25°C, 25 minuta na 30°C ili 15 minuta na 37°C. Očitaju se absorbancije standarda i proba prema slijepoj reagensa na 500 nm (492-550 nm).


29

R a č u n Aprobe ------------ x koncentracija standarda = mmol glukoze/L Astandarda N a p o m e n a Uzorak za analizu može biti kapilarna krv, serum, heparinizirana plazma, likvor. Linearnost metode je do 27.8 mmol/L. Iznad ove vrijednosti, uzorak se mora razrijedi destiliranom vodom u odnosu 1+2 (0.1 ml uzorka + 0.2 ml destilirane vode) ponoviti odreñivanje a rezultat množiti sa 3. Glukoza je u serumu i plazmi stabilna 8 sati na 20-25°C ili 3 dana na 2-8°C. Kod korištenja kapilarne krvi za inhibiciju glikolize upotrebljava se natrij ili kalij fluorid. Glukoza je u takvom uzorku stabilna 1 dan na 20-25°C ili 7 dana na 2-8°C (ako se čuva u zatvorenoj epruveti). Glukoza je u nadsloju (kapilarna krv s uranil acetatom) stabilna 3 dana na 2-8°C u zatvorenoj epruveti. Mokraćna kiselina, askorbinska kiselina, glutation, antikoagulancije, bilirubin i kreatinin u fiziološkim koncentracijama ne utječu na test. Otopina reagensa sadrži natrij azid. L i t e r a t u r a: Trinder P. Ann Clin Biochem 1969; 6: 24.


30

ODREðIVANJE KOLESTEROLA U SERUMU

e n z i m s k a CHOD-PAP metoda

N a č e l o Kolesterol esteri se djelovanjem kolesterol esteraze hidroliziraju, a ukupni kolesterol oksidira uz kolesterol oksidazu u kolestenon i vodik peroksid koji s aminofenazonom i fenolom u prisustvu peroksidaze (POD) stvara obojeni fenazonkinonimin koji se mjeri na 500 nm.

kolesterol-esteri+H2O ⇒ kolesterol esteraza ⇒ kolesterol + masna kiselina kolesterol+O2 ⇒ kolesterol oksidaza ⇒ 4- kolestenon + H2O2

2 H2O2 + 4-aminoantipirin + HBA ⇒ POD ⇒ kinonimin + 4 H2O HBA – hidroksibenzojeva kiselina R e a g e n c i j e R1 Reagens Kolesterol esteraza (KE) Kolesterol oksidaza (KO) Peroksidaza (POD) 4-aminoantipirin HBA Pufer, pH 6.7 ± 0.1 (20°C) R2 Standard

>500 U/L >200 U/L >300 U/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 50 mmol/L 5.17 mmol/L

Priprema otopine reagenasa i stabilnost Sadržaj bočice reagensa TR-1032 otopiti u 20 ml destilirane vode, TR-1033 otopiti u 100 ml destilirane vode. Stabilnost je 14 dana na 2-8°C, 2 dana na 20-25°C. P o s t u p a k

Slijepa Standard Proba reagensa ml ml ml

Standard - 0.010 - Serum - - 0.010 Otopina reagensa 1.0 1.0 1.0

Promiješa se i inkubira 15 minuta na 25°C, 10 minuta na 30°C ili 5 minuta na 37°C. Izmjeri absorbancije proba (Ap) i standarda (As) prema slijepoj reagensa na 500 nm (500-550 nm).

R a č u n Aprobe ------------ x 5.17 = mmol kolesterola/L Astandarda


31

N a p o m e n a Uzorak za analizu može biti serum, heparinizirana ili EDTA plazma.

Kolesterol je u uzorku stabilan 6 dana na 20-25°C ili na 2-8°C (6 mjeseci ako se zamrzne). Stabilnost boje je 20 minuta. Linearnost metode je do 20 mmol/L. Ako je apsorbancija slijepe probe > 0.200, reagens može biti zagañen. Standardi kolesterola ili kalibratori koji sadrže tvari kao što su octena kiselina, deterdženti ili surfaktanti mogu inhibirati enzime u reagensu i ne mogu se koristiti. L i t e r a t u r a: Allain CC, Poom L,.Chan SG, Richmond W, Pu F. Clin Chem.1974; 20: 470.


32

ODREðIVANJE KATALITI ČKE KONCENTRACIJE

ALANIN AMINOTRANSFERAZE (ALT)

Metoda kontinuiranog mjerenja Modifikacija metode po Karmenu

N a č e l o

L-alanin + α-ketoglutarat ⇒ ALT ⇒ piruvat + L-glutamat Piruvat + NADH + H+

⇒ LDH ⇒ laktat + NAD+ R e a g e n c i j e R1 reagens α-ketoglutarat L-alanin Reducirani nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH2) Laktat dehidrogenaza (LDH) Etilendiamin tetraoctena kiselina (EDTA) Pufer (pH 7.4 ± 0.1) Tris-(hidroksimetil) aminometan

12 mmol/L 400 mmol/L 0.15 mmol/L 33.3 µkat/L 5 mmol/L 80 mmol/L

P o s t u p a k

Proba ml

Otopina reagensa 2.0 (ugrijana na 30°C ili 37°C) Serum (ili plazma) 0.2

Promiješati, inkubirati 90 sekundi na 30°C ili 37°C. Očitati absorbanciju probe prema destiliranoj vodi nakon 1,2,3 minute. Izračunati ∆A/minuta.

R a č u n ALT (U/L) = ∆A/minuta x 1746 N a p o m e n a Nehemolizirani serum ili plazma su najčešći uzorci za odreñivanje katalitičke koncentracije ALT. Katalitička koncentracija ALT u serumu stabilna je tjedan dana na 2-8°C. Fluoridi, EDTA i heparin u uobičajenim koncentracijama ne utječe na analizu. Linearnost metode je do 350 U/L. Iznad ove vrijednosti potrebno je uzorak razrijediti s fiziološkom otopinom (0.9% NaCl) i to uzeti u obzir kod računa. Young i suradnici objavili su popis lijekova i drugih tvari koje utječu na ALT u cirkulaciji i koje smetaju mjerenju katalitičke koncentracije ovog enzima.


33

L i t e r a t u r a Kamen A. J Clin Investigation 1955; 34: 131. Committee on Enzymes, Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical Physiology: Scand J Clin Lab Invest. 1974; 33: 291. International Federation of Clinical Chemistry, Committee on Standards, Special Report: Clin Chem 1977; 23: 887. Young DS, Pestaner LC, Gibberman V. Clin Chem 1975; 21:


34


ASPARTAT AMINOTRANSFERAZE (AST)

Metoda kontinuiranog mjerenja Modifikacija metode po Karmenu

N a č e l o

L-aspartat + α-ketoglutarat ⇒ AST ⇒ oksalacetat + L-glutamat oksalacetat + NADH+ + H+ ⇒ MDH ⇒ malat + NAD+

R e a g e n c i j e R1 reagens α-ketoglutarat L-aspartat Reducirani nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH2) Malat dehidrogenaza (MDH) Laktat dehidrogenaza (LDH) Etilendiamin tetraoctena kiselina (EDTA) Pufer (pH 7.7 ± 0.1) Tris-(hidroksimetil) aminometan

12 mmol/L 200 mmol/L 0.15 mmol/L 10 µkat/L 22 µkat/L 5 mmol/L 80 mmol/L

P o s t u p a k

Proba ml

Otopina reagensa 2.0 (ugrijana na 30°C ili na 37°C) Serum (ili plazma) 0.2

Promiješati, inkubirati 90 sekundi (na 30°C ili 37°C). Očitati absorbanciju probe prema destiliranoj vodi nakon 1,2,3 minute na 340 nm (334 nm; 356 nm). Izračunati ∆A/minuta.

R a č u n AST (U/L) = ∆A/minuta x 1746 N a p o m e n a Nehemolizirani serum (katalitička koncentracija AST u serumu stabilna je tjedan dana na 2-8°C) ili plazma (fluoridi, EDTA i heparin u uobičajenim koncentracijama ne utječe na analizu) su pogodni uzorci. Linearnost metode je do 350 U/L. Iznad ove vrijednosti potrebno je uzorak razrijediti s fiziološkom otopinom (0.9% NaCl) i to uzeti u obzir kod računa. Young i suradnici su objavili popis lijekova i drugih tvari koje utječu na AST u cirkulaciji i koje smetaju mjerenju katalitičke koncentracije enzima.


35

L i t e r a t u r a Karmen AJ. Clin Investigation 1955; 34: 131. Committee on Enzymes, Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical Physiology: Scand J Clin Lab Invest 1974; 33: 291. International Federation of Clinical Chemistry, Committee on Standards, Special Report: Clin Chem 1977; 23: 887. Young DS, Prestaner LC, Gibberman V. Clin Chem 1975; 21:


36


ALKALNE FOSFATAZE (ALP)

Metoda jedne to čke

N a č e l o Alkalna fosfataza u prisutnosti magnezijevih iona djeluje na p-nitrofenilfosfat pri pH 10.2 i temperaturi reakcijske smjese od 30°C stvarajući p-nitrofenol. Intenzitet žučkastog obojenja je proporcionalan koncentraciji osloboñenog produkta odnosno aktivnosti alkalne fosfataze i mjeri se na 405 nm. R e a g e n c i j e 1. Puferirani supstrat p-nitrofenilfosfat, 4.0 mmol/L, amino metil propanol 840 mmol/L, magnezij sulfat 0.5 mmol/L 1.052 g dinatrij p-nitrofenilfosfata C6H4NO2PNa2 (Mr 263.1) i 123.3 mg magnezij sulfata MgSO4 x 7H2O (Mr 246.5) se otopi u destiliranoj vodi, doda 74.9 ml 2-amino-2-metilpropanola (Mr 89.1), podesi pH 10.2 i nadopuni destiliranom vodom na 1 L. Reagens je postojan 2 mjeseca uz čuvanje u hladioniku. 2. Natrij hidroksid, 50 mmol/L (2 g/L) 2 g NaOH se otopi i nadopuni destiliranom vodom do 1 L. 3. Matični standard p-nitrofenola 0.36 mmol/L (50 mg/L) 5.0 mg p-nitrofenola (Mr 139) se otopi u 50 mmol/L NaOH i dopuni s NaOH u odmjernoj tikvici na 100 ml. 4. Radni standard p-nitrofenola, 45 µmol/L 2.5 ml matičnog standarda (3) razrijedi se s 50 mmol/L NaOH na 20 ml. Radni standard pripravlja se svakodnevno. P o s t u p a k Proba Slijepa ml ml

Puferirani supstrat (1) 1.0 1.0

Predinkubira se u vodenoj kupelji na 30°C tijekom 5 minuta i zatim doda

Serum 0.050 -

Drži se 30 minuta na 30°C i zatim prekida inkubacija dodatkom

NaOH (2) 10.0 10.0 Serum - 0.050

Mjeri se absorbancija probe prema slijepoj na 405 nm.

Rezultat se izračunava iz baždarnog dijagrama koji se pripravlja miješanjem različitih volumena radnog standarda p-nitrofenola s otopinom natrij hidroksida (2).


37

ml radnog standarda 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 ml NaOH (2) 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 odgovara katalitičkoj 60 120 180 240 300 koncentraciji ALP-U/L U epruvetu se stavi s 1.0 ml radnog standarda koji sadrži 4.5 x 10-2 µmol p-nitrofenola u volumenu od 5.5 ml. Ako se ta količina p-nitrofenola stvori tokom 30 minuta, tada je katalitička koncentracija alkalne fosfataze u 50 µl ispitivanog uzorka koji je konačno razrijeñen na 11.0 ml slijedeći: 11.0 1 1000 ------- x 4.5 x 10

-2 µmol x ------- x ------------ = 60 µmol/minuta/L = 60 U/L

5.5 30 0.05 L i t e r a t u r a Modifikacija postupka s gotovim reagencijama i postupka koji preporuča Britanska asocijacija kliničkih biokemičara, 1980.

klinička biokemija - propisi

Documents