Klinická cytogenetika - metody

OLG FN Brno

Cytogenetické barvící metody

Bandy=pruhy-části chromozomů, které jsou zřetelně odlišeny od sousedních segmentů za použití více metod

Metody diferencující po celé délce:

Q-pruhy: fluorescenční barvení, jasné pruhy=oblasti s DNA bohatou na AT,

AT oblasti zvyšují fluorescenci, GC ji potlačují, nevýhoda metody-rychlé blednutí preperátů, foto

G-pruhy: mechanismus nejasný, důl. role Giems. barviva, enzymat. působení trypsinu, afinita u histonů bohatých na arginin, DNA ani proteiny nemizí při působení trypsinu, trvalé preparáty

R-pruhy: reverzní ke G, princip-vysoká teplota (85C), denaturace proteinů a DNA bohaté na AT, GC oblasti zůstávají v nativní konfiruraci (delece koncových úseků)

Metody selektivní

C-pruhy: barvení konstitutivního heterochromatinu, denaturace NaOH,

vyplavení fragmentů DNA z chromozomu do roztoku 2xSSC

NOR: barvení oblastí, které v interfázi tvoří jadérko (nukleolární organizátor jadérka)-mnohonásobné kopie genů pro rRNA, akrocentr. chr., AgNo3

SCE: výměny sesterských chromatid, reciproké výměny, nemění morfologii Ch.

výměny v homologních místech, mechanismus neznámý, vznik během replik. DNA, vztah k reparaci DNA, nesouvisí se vznikem strukturních aberací

inkukce: alkylačními činidly, UV zářením

použití: citlivý indikátor mutagenů

výskyt: Bloomův sy.

princip metody: inkorporace BrdU 2x buněčný cyklus, afinita fluorescenčního barviva Hoechst 33258

FISH - fluorescenční in situ hybridizace

Použití sondy komplementární ke sledovanému úseku DNA, denaturace, hybridizace

Sondy značené: radioaktivně ( zač. 70. let )

fluorescenčně 1990

Typy sond: centromerické, telomerické , celochromozomové (malovací), genově specifické, multisondy, genomové

Hodnocení: fluorescenční mikroskop

počítačová analýza obrazu

Princip FISH

Typy sond

Satelitní-hybridizace se satelitními sondami - centromerické

satelitní: centromery, tandemově se opakující monomer 171 bp (numerické

aberace, interfázní jádra)

satelitní: pericentrické oblasti akrocentr. , tandemově se opakující monomer 68 bp (13,14,15,21,22,9)

telomerické: specifické sekvence TTAGGG (telomer. delece PMR)

Celochromozomové: hybridizují po celé délce chromoz. (translokace)

Genově specifické: hybridizují jedinečné sekcence (mikrodelece, onko)

Genomové: tvořeny celkovou DNA (CGH), detekce jen delecí a amplifikací, klon v 50%zastoupení, k upřesnění cílená FISH celochrom.

Modifikace metody FISH

Sekvenční FISH: po sobě se opakující hybridizace na stejném preparátu (PGD)

Multisondový systém: podložní sklo s 24 sondami ve 24 polích-mitozy

Multicolor: vizualizace jednotlivých párů v oblišných barvách (24 specifických celochromozomových sond- obrazová analýza, pseudobarvy

princip: kombinace 5 sond spektrálně se nepřekrývajících, postupné snímání obrazů a jejich syntéza

požadavek: spec. software (pseudobarvy), komplexní hodnocení chromos. Aberací

nevýhoda: sada úzkopásmových filtrů

Spektrální karyotypování SKY: současná vizualizace všech chr. , emisní spektrum (Furierova transformace)

výhoda: získání obrazu v 1 kroku, ekonomická úspora

mFISH: -X,+del(1p),t(2;15),+8,+8,-9,t(9;15),-10,- 11,+del(13q),+20,-22

t(2;13), t(4;8), t(6;16), t(8;11)

Nejnovější metody

cenM-FISH: identifikace všech centromer současněcentromerické sondy značené 5 různými fluorochromy

použití: malé marker chromozomy

MCB (multicolor banding): chromoz. charakterizovány barevnými pruhy po celé délce