KLİNİK MİKROBİYOLOJİDE BİR YIL

NASIL GEÇTİ? Prof. Dr. A. Arzu Sayıner

Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD

Tıbbi Viroloji BD

2017

Klinik Mikrobiyoloji

Bakış açımızı değiştirebilecek

gelişmeler

• PubMed

• ESCMID 2017

• FEMS 2017

• DSÖ

Larry Smarr, The Human Microbiome, 2016

Mikroorganizmalardan oluşan bir dünyada yaşıyoruz… Dünyada 100 milyon x evrendeki yıldız sayısı kadar mikroorganizma bulunuyor.

NASA, Hubble Deep Field

Buradasınız

Yaşamın Filogenetik Ağacı

Carl Woese - 16S rRNA Dizisine göre Yaşam Ağacı

Postler & Ghosk, Cell Metabolism, 2017 Illustration © Charis Tsevis

• Çoğunluk prokaryot ve barsakta

İnsan hücresi 30 trilyon Mikroorganizma 38 trilyon

• Dışkıda mikrobiyal gen sayısı 3 milyon (1150 tür)

• Kor: her insanda 160 tür bulunur. • Kandaki metabolitlerin %10’nu barsak mikrobiyotasından gelir.

Mutualizm / Kommensalizm / Patojenizm Tek patojenli hastalık Holobiont Toplum Sağlığı

HOLOBİONT (Bir ekolojik birim olarak konak ve mikrobiyotası)

Barsakta Mikrobiyomun İşlevleri

Sindirim, Metabolizma ve Enerji Sağlama

Koruyucu Bariyer- Kolonizasyon Direnci

İmmünitenin Gelişmesi ve Düzenlenmesi

“The Prolongation of Life: Optimistic Studies”

Yoğurt Teorisi

• Bulgar köylülerinin uzun yaşamı – yoğurt ilişkisi

• Barsaktaki toksik bakteriler yaşlanmaya yol açar.

• Laktik asit (Lactobacillus

delbrueckii subsp. bulgaricus) ile önlenebilir.

Ilya Ilyich Mechnikov 1845 - 1916

Barsak Mikrobiyotası • Sıklık sırası ile bakteri

şubeleri – Firmicutes (çoğu Gram +)

– Bacteroidetes (Gram -)

– Proteobacteria

– Actinobacteria

– Fusobacteria

– Verrucomicrobia

– Spirochaetes

>%90

3000 – 5000 tür

• 16S ile saptanan bakterilerin çoğunun kültürü yok. • Çoğu bakterinin hastalık ilişkisi yok.

Kim var ?

Ne yapıyorlar?

Anne – bebek ilişkisi In-utero kolonizasyon Amniyon sıvısı ve plasenta (Proteobacteria) Fetusun gelişimi Doğum Vajinal Sezeryan – cilt mikrobiyomu Anne sütü • 50 cins, 200 tür bakteri

– 103-4 cfu/ml

• Kompleks oligosakkaridler Bifidobacterium Lactobacillus Bacteroides

Katı gıdalar Erişkin tarzı mikrobiyom

Annemizden aldığımız en önemli miras Mikrobiyom

Nuriel-Ohayon et al, Front Microbiol, 2016 Younes et al, Trends Microbiol, 2017

Mikrobiyomun Yaşam Boyu Değişimi

Rook et al, Lancet, 2017 Buford, Microbiome, 2017

Yaşlanma = Düşük düzey kronik enflamasyon

DİYET

(Barsak Mikrobiyomuna En Etkili Faktör)

• Diyet değişikliği – Lumende hızla ve dinamik

değişim

– Geri dönüşümlü

• Bazı türler için mukozal rezervuar

– Mukoza ile temasdaki mikroorganizmalar stabil

Müsindeki glikan çeşitleri

Mo’ların müsin gen

ekspresyonuna etkisi

Glikanları kullanabilen mo seçilmesi

Sağlıklı Mukoza

Selber-Hnatiw et al, Front Microbiol, 2017

Diyetin barsak mikrobiyomu üzerine etkileri

Çeşitliliği azaltanlar Çeşitliliği arttıranlar

www.lifelines.nl

LifeLines kohort, Hollanda

• 167 000 kişi, >10 yıl izlem

• “LifeLines-Deep” çalışması

– 1135’inde barsak mikrobiyomu araştırması

Bakteriyal Metabolitler

Kısa zincirli yağ asidleri • Lifli gıdaların mikrobiyota ile

fermentasyonu sonucu oluşur.

– İmmun sistemin her aşamasına etki – Mukozayı koruyucu – Anti-enflamatuar

• Azalması Enflamasyon, ca?

Postler & Ghosh, Cell Metabolism, 2017

Sekonder safra asidleri – Enflamatuar sitokinlerin

ekspresyonu

Front Med, 2017

İnsan Hayvan yetiştiriciliği Tarım Gıda endüstrisi

Kanalizasyon

- Gıda zinciri - Direkt temas

Toprak Akarsular Deniz Yaban hayvanları Göçmen kuşlar - Rüzgar - Su

Doğaya Geçiş

Doğadan Geçiş

Antimikrobiyal Direnç = Ekolojik Sorun

TEK SAĞLIK

Toprak Mikrobiyomu

Toprak: 40 000 tür/gr • Earth Microbiome Project

• TerraGenome

• Brazilian Microbiome Project

• China Soil Microbiome Initiative

• EcoFINDERS

• MicroBlitz

• Bitkisel yaşam

• Gıda zincirinin oluşması

• Karbon ve nitrojen döngüsü

• Zararlı maddelerin parçalanması

• Yaşamın oluşması

Teixobactin • Teikoik asid ve peptidoglikan sentezine etki • MRSA & M.tuberculosis

Okyanus mikrobiyomu

• TaraOceans

• Global Ocean Sampling Expedition

Atmosfer Mikrobiyomu

Uzayda Mikrobiyom

• Astronotlarda mikrobiyom

• Dünya benzeri ortamlar yaratmada mikrobiyom

• Zor koşullarda bulunan yaşam formlarını anlamada mikrobiyom

• Yeryüzünün %70’i su

• Oksijen üretimi

• CO2 döngüsü

• Metan temizlenmesi

Disbiyoz – Hastalık İlişkisi • Enflamatuar barsak hastalığı ve sendromu

– Firmicutes (Clostridium grup XIVa ve IV) – Bakteriyal çeşitlilik Patobiont

• Obezite – Mikrobiyal çeşitlilik mukoza hasarı enflamasyon – Firmicutes (Batı tipi diyet)/Bacteroidetes (lifli/bitkisel diyet)

• Tat reseptörleri + nörotransmiter üzerine etki yeme değişiklikleri

• Diyabet, ateroskleroz/kardiyovasküler hastalık, inme • Kanser (kolorektal ve diğer) • Kronik karaciğer hastalığı (barsak – KC aksı) • Enfeksiyonlar

– C. difficile enfeksiyonu – Tifo, gıda zehirlenmesi, diyareler, sepsis

Korelasyon çalışmaları Neden – sonuç ilişkisi

Vücuttaki Serotononin %90’ı Dopaminin %50’si

barsakta, mikrobiyota tarafından sentezlenir. Budden et al. Nat Rev Microbiol, 2017

Quigley, Curr Neurol Neurosci Rep. 2017

Çocuklukta astım İlk aylarda mikrobiyal çeşitlilik

Disbiyoz – Kr KC Hastalığı Hepatik ensefalopati

• Fekal mikrobiyom – Minimal değişiklikler

• Kolon - mukozal mikrobiyom Bilinç bozukluğu,

enflamasyon, hastalığın şiddeti ile ilişkili • Roseburia spp

• Enterococcus, Veillonella, Megasphaera, Burkholderia, Bifidobacterium spp

Kronik B hepatiti – Yenidoğan ile erişkin

dönemdeki HBV enfeksiyonu farkı • Barsak mikrobiyomu ile

ilişkili

– Farklı HBV enf dönemleri • Mikrobiyomun farklı

Hepatik ensafalopati Mukozal disbiyoz ile ilişkili

Kang & Cai. J Hosp Infect, 2017 Tsai et al. Trends Microbiol, 2017

Disbiyoza Yönelik Tedavi

• Fekal mikrobiyota transplantasyonu (FMT) – Normal kompozisyonu ve fonksiyonu sağlamak – Sekonder yağ asidi metabolizmasını düzeltmek – Mukoza hasarını iyileştirmek

• Diyet / prebiyotik / probiyotik • Antibiyotik C.difficile, hepatik ensefalopati tedavisinde Rifaximin

Nagao-Kitamoto, Immune Network, 2017 Peled et al, Nature Microbiology, 2016

Fekal Transplantasyon

• 7 yıllık ülseratif kolit öyküsü • Ev yapımı - fekal transplantasyon sonrası ateş + kanlı ishal + lökositoz

Mikrobiyota tx

• Kolonizasyonun önlenmesi (KİT)

• Enfeksiyon tedavisi

– C.difficile

– VRE

– K.pneumoniae

Mikrobiyota kompozisyonu nasıl olmalı?

• Yararlılar?

• Zararlılar?

Donor seçimi - Özgeçmiş

– Enfeksiyon hastalıkları: Diğer organ / kan donörlerindeki kriterler

– GIS, metabolik, nörolojik hastalıklar

– İlaç kullanımı

• Ab, immunsüpresan, kemoterapi (3 ay)

• Kronik PPI kullanımı

Cammarota et al. Gut 2017 Browne et al. Nat Rev Microbiol, 2017

Woodworth et al. J Clin Microbiol 2017

Cammarota et al. Gut 2017

• Uygulama – Alt GIS yolu ile

• Kolonoskopi

• Lavman

– Üst GIS yolu ile

• Multidisipliner ekip – Gastroenteroloji

– Mikrobiyoloji

– Enfeksiyon hastalıkları

• Dışkı bankası kurulması – ABD ve Hollanda

Cammarota et al. Gut 2017

Cabalerro et al. Cell Host Microbe, 2017

• İki komensal bakteri içeren kokteyl ile VRE kolonizasyonu temizlenebilir.

– “Clostridium cluster XIVa” (Blautia producta and Clostridium bolteae)

• Lanthipeptid (“lantibiyotik”)

Mikrobiyota – Fonksiyon ilişkisi • Bireyler arasında türler

değişken ama biyokimyasal yolaklar (fonksiyon) benzer olabilir.

– Taksonomi

– Fonksiyon

– Konak genomu

bilgilerini birlikte değerlendiren biyoinformatik sistemleri

Manor & Borenstein, Cell Host Microbe, 2017 Postler & Ghosh, Cell Metabolism, 2017

“Functional shifts ‘ taxonomic contributors”

Mikrobiyom – Yanıt bekleyen sorular

• Mikroptan arınmış farede 53 farklı intestinal bakteri ile monokolonizasyon – Her birinin immunmodülatör

etkisi (+)

• Mikrobiyotanın birlikte etkisi ? – Birbirleri üzerine etkileri – Konağa etkileri – Konağın mikrobiyota üzerine

etkisi – Virom?

• Dışkı incelemek uygun mu? • Yeni deney modelleri

– Organ kültür sistemleri

Shaffer. Transl Res, 2017

Mikrobiyom Pazarı

• Mikrobiyom analizi

– 2019 300 milyon $

• Performans arttırma

• Risk belirleme

• Pre/probiyotik

– 2022 80 milyar $

$99 “Find out who’s in your gut”

$180 “Microbes for two: see what you’re sharing”

$320 “Microbes for four”

$500 “A week of feces”

$1,500 “All in the family”

$2,500 “Beyond bacteria”

$3,750 “Functional feces”

$5,000 “A genome from your gut”

$15,000 “What are they actually doing”

$25,000 “Hundreds of genomes from your gut”

Sirkadiyan Ritm

Sirkadiyan saat = Fizyolojik adaptasyon

Merkezi saat: Hipotalamus

Periferik saatler: Her dokuda

• Enfeksiyon riski – patojen ile karşılaşma riski ile ilişkili

• Antibiyotik ve immunsupresiflerin kullanımı için saat önemli

Tognini et al. Cell Host & Microbe, 2017

• Sitokin ve kemokin ekspresyonu

• Antijen sunumuna yanıt

• Lenfosit proliferasyonu

• Lökositlerin dağılımı

Yeni Nesil Sekanslama – Klinikte kullanım

Tam genom sekanslama

• Patojenin karakterizasyonu

• Antimikrobiyal direnç analizi

• Genomik sürveyans

Metagenomik sekanslama

• Sendromik yaklaşım

• Enfeksiyöz olan ve olmayan üveit ayırımı zor

• Kültür temelli yöntemler ile başarı %40-70

• Metagenomik YNS - 20 ul intraoküler sıvı

Rutin Kullanımda Etken Belirlemede Metagenomik

Virüs Numune Tx Klinik

Astrovirus VA1/HMO-C-UK1

BOS plazma dışkı

HCT Ansefalopati

Kene ilişkili ansefalit virusu

Beyin BOS Böbrek, KC

Ateşli hst, ansefalopati

Dandenong virus Doku, kan, BOS

Böbrek, KC

Ateşli hst, ansefalopati

New Jersey polyomavirus

Kas, cilt Pankreas Körlük, deri plakları

Yeni Poxvirus Cilt Böbrek Ülseratif deri lezyonları

İnsan mastadenovirus tip 70

Dışkı HCT Diyare

Numune Tx Virome Bulgu

Plazma Kalp, Akc

DNA İmmunsupresyon ile Torque Teno Virus ↑

BAL Akc DNA Torque Teno Virus ↑ Graft fonksiyon bzk’da

İdrar Böbrek DNA - BKV, JCV, TTV subtipleri - Polyoma, anello, adeno, herpes, papillomaviridae

Lewandowska et al, PlosOne, 2017

Yeni patojenler Eski patojenler – yeni enfeksiyonlar

Hastalıkla ilişki • Etken ? • Reaktivasyon ? • Kontaminasyon ?

• 200 makale, organizma (n: 9) temelli değerlendirme – M.tuberculosis – ümit verici – Diğerleri için yeterli kalitede veri eksik, pahallı, uzun – Moleküler sürveyans için kullanılabilir.

• Kalite kontrol gerekli • Biyoinformatik yöntemlerin ve gen/mutasyon veri tabanlarının

standardizasyonu gerekli • Rutin klinik kullanımda, tam genom temelli AMR henüz uygun değil. • Değerlendirme 1-2 yıl ara ile tekrarlanmalı.

Yeni Nesil Sekanlama “Universal Tanı”

• Klinisyenin değişen rolü – Etken öngörmeden test

isteyebilme

– “Test seçici” yerine “veri “yorumlayıcı”

• Etken arama – Çoklu etken saptayabilme

– Kültürü yapılamayan mo tanı

– Etken & virülans faktörleri & AMR

– Konak hakkında bilgi • İmmun yanıt, mikrobiyota

Kişiselleştirilmiş Tıp

Allcock et al, J Clin Microbiol, 2017 Oakeson et al, Emerg Infect Dis, 2017

Yeni Nesil Sekanslama - Sorunlar • Süre & fiyat

• Analitik duyarlılık

– Gerekli verinin büyüklüğü • Virus: 1/1 000 000 okuma

• Bkt: %0.016-%2 okuma

• Kantitasyon

• Kontaminasyon (reaktif, kit, örnekler arası, ..)

• Validasyon & kalite kontrolü

• Biyoinformatik - ara yüz

• Yorumlama – klinik anlam

Schlaberg et al. Arch Pathol Lab Med. 2017

Yeni Teknolojiler Yeni nesil sekanslama

• Tek molekülde uzun okuma

• Amplifikasyona gerek duymadan sekanslama

– Hata olasılığı

– Hızlı

• Taşınabilir olma

• Idantifikasyon, R analizi, filogenetik analiz 7.5 saat • Tüm direnç testleri için + 5 saat

Yeni Teknolojiler

• 2020’de dünya nüfusunun %80’ni cep telefonu kullanacak.

– Sitometre - mikroskop • Gıda analizi

• Hücre, parazit, bakteri, yumurta, protein , DNA saptama

• AMR testleri

– Kolorimetrik / florometrik okuyucu • EIA temelli testler

www.innovate.ee.ucla.edu

Aydoğan Özcan

SHERLOCK “Specific High-Sensitivity Enzymatic

Reporter UnLOCKing”

• CRISPR-Cas13a proteinin ribonükleaz aktivitesi

• Izotermal amplifikasyon

Gootenberg et al. Science, 2017 www.youtube.com/watch?v=TkcCBRqtvDA

• Hızlı

• Ucuz (61 sent/test)

• Duyarlı

• Attomolar (10-18) duyarlılık

• Tek DNA molekülünü saptayabilme

• Tek baz farkını yakalayabilme

• Liyofilize edilebilir, kağıt üzerinde kullanılabilir.

Hızlı Testler - Hasta Başı Testler

• Laboratuvarlar üzerinde baskı

– Daha çok test (sendromik)

– Daha hızlı sonuç

– Personel sıkıntısı

– Merkezi laboratuvardan uzakta klinik hizmet

• Teknolojik gelişme

– Kolay uygulanabilir

– Hızlı ve doğru sonuç (NAT)

– Referans yöntemle kıyaslanabilir performans

Hızlı Testler KULLANIM ÖNCESİ

• Test kriterleri

– Hangi etken/ler?

– Duyarlılık, özgüllük, …

– Hızlı sonuç (<20 dk)

• Teste ilişkin eğitim (video, vb..)

• Testin onaylanması

• Sonuçların hasta dosyasına kaydedilmesi

• Surveyans programlarının sürdürülmesi

İZLEM

• Maliyet-etkinlik analizi

(hastaya ve topluma etki)

– Antibiyotik kullanımı

– Enfeksiyon yayılımı

• Tanı – izlem rehberleri

Ev Toplum PLK Perifer lab HST

KULLANIM

• Testin validasyonu ve kalite kontrolü

• Testin kısıtlılıklarının anlaşılması

- Yapan ve kullanan için sertifikasyon

NAT Temelli Hızlı Testler

15 – 20 dk

• Strep A

• İnfluenza A&B

• İnfluenza A&B ve RSV

• İnfluenza A&B – 15 dk

• RSV – 13 dk

• Strep A – 8 dk

FDA 510(k) onaylı, CLIA waived, CE-IVD

Yeni

antimikrobiyal

geliştirmede

ciddi sıkıntılar

• TBC

• C.difficile

• PPL

2023’e dek en az 4 yeni ilaç geliştirilmesi

• Gonore • Neonatal sepsis • Pediyatrik

enfeksiyonlar

Antimikrobiyal Direnç İnsanlığa yönelik en büyük tehditlerden biri

Mücadelede ortak hareket etmenin gerekliliği

Bakteriyal enfeksiyonların kontrolü için ucuz, doğru, kolay kullanılabilir, hızlı test üretmek

Antibiyotik Direnç Sorunu “Global Burden of Disease AMR Project”

• İlaca dirençli mikroorganizmalara bağlı hastalıkların ve sonuçlarının haritasının çıkarılması

• 4 yıl – 195 ülke

• 1990’dan günümüze

• 3.2 milyon $ • Wellcome

• İngiltere Hükümeti

• Bill ve Melinda Gates Vakfı

https://wellcome.ac.uk/

• University of Oxford - Big Data Institute and Centre for Tropical Medicine and Global Health

• University of Washington - Institute for Health Metrics and Evaluation.

HCV • Viral hepatit – 2030 hedefi

– Yeni enfeksiyonlar %90 – Mortalite %65 – 9 ülke – hedef eradikasyon Avusturalya, Brezilya, Mısır, Almanya,

İrlanda, Japonya, Hollanda, Katar, Gürcistan

• HCV – 70 milyon kr C hepatiti – Tanıya ulaşım = %20 – Tedaviye ulaşım = %7

• %10’u DEA

• DEA tedavi – 2-3 ayda %90-100 kür – Jenerik ilaç kullanımı

• Mısır’da 900$ 200$ • Pakistan’da 100$

– Mart 2017 DSÖ, sofosbuvir jenerik aktif maddesine ön yeterlik

2017 - SALGINLAR

Dünya Sağlık Örgütü

ETKEN ÜLKE

H7N9 Çin

MERS-CoV Suudi Arabistan, Katar, BAE, Lübnan, Umman

HEV Çad, Nijer, Nijerya

HAV Avrupa, ABD

Seoul virus Kanada

Lassa virus Benin, Togo, Burkina Faso, Nijerya

Ebola virus Kongo

Marburg virus Uganda

Polyovirus tip 2 (aşı) Suriye, Kongo

Dengue virus Sri Lanka, Fildişi Sah.

Sarı Humma Brezilya, Surinam

Chikungunya Fransa, İtalya

Zika Hindistan

ETKEN ÜLKE

Veba Madagaskar, Seyşeller

Meningokok Togo, Nijerya

Kolera Nijerya

Zika

Wolbachia spp.

İnsektlerin %60’da (+)

Avusturalya deneyimi - Dengue

DSÖ desteği, 2016

Brezilya ve Kolombiya, 2016

Florida, Nisan 2017

• Enceladus’da tuzlu su, organik moleküller, hidrotermal aktivitenin varlığı

• Titan’da nitrojenden zengin bir atmosfer, yağmur, akarsu, göl, denizlerin varlığı

- Satürn etrafında 200 devir - Satürn aylarının etrafında 132 yakın uçuş - 500 gigabaytlık veri - > 3000 bilimsel yayın

Alexandra Elbakyan En etkili 10 kişi, Nature Publishing Group, 2016