klinische relevanz der mdr1-, mrp1- und mrp2-genexpression
TRANSCRIPT
Aus der Klinik für kleine Haustiere
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression beim
malignen Lymphom des Hundes
THESE
Zur Erlangung des Grades eines
Philosophical Doctor
-Ph.D.-
im Fachgebiet
Kleintierkrankheiten
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Katja Culmsee
aus Köln
Hannover 2004
2
Supervisor: Univ.-Prof. Dr. I. Nolte
Betreuungsgruppe: Univ.-Prof. Dr. J. Bullerdiek
Univ.-Prof. Dr. W. Löscher
Univ.-Prof. Dr. I. Nolte
1. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. J. Bullerdiek, Zentrum für Humangenetik,
Universität Bremen
Univ.-Prof. Dr. W. Löscher, Institut für Pharmakologie,
Tierärztliche Hochschule Hannover
Univ.-Prof. Dr. I. Nolte, Klinik für kleine Haustiere,
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. M. Reinacher, Institut für Veterinärpathologie,
Justus Liebig Universität Giessen
Tag der mündlichen Prüfung: 10. November 2004
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MEINEN ELTERN
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Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG ..................................................................................................................... 11
2 LITERATURÜBERSICHT................................................................................................ 13
2.1 MALIGNES LYMPHOM DES HUNDES ................................................................................ 13
2.2 P-GLYKOPROTEIN ........................................................................................................... 16
2.3 MULTIDRUG RESISTANCE-ASSOCIATED PROTEIN (MRP) ................................................. 21
2.3.1 MRP1....................................................................................................................... 21
2.3.2 MRP2....................................................................................................................... 22
2.4 APOPTOSE UND ZYTOSTATIKARESISTENZEN ................................................................... 23
2.4.1 Survivin.................................................................................................................... 24
2.5 WEITERE MECHANISMEN ................................................................................................ 26
3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN........................................................................ 27
3.1 TIERE .............................................................................................................................. 27
3.2 DIAGNOSE UND KLINISCHE STADIENEINTEILUNG ............................................................ 29
3.3 CHEMOTHERAPIE............................................................................................................. 30
3.3.1 Beurteilung des Therapieerfolges ........................................................................... 32
3.4 ENTNAHME UND LAGERUNG DER PROBEN ...................................................................... 33
3.5 IMMUNPHÄNOTYPISIERUNG............................................................................................. 33
3.6 IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS VON P-GLYKOPROTEIN ....................................... 35
3.7 MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN............................................................... 37
3.7.1 Isolierung von Gesamt-RNA.................................................................................... 37
3.7.2 DNase-Behandlung ................................................................................................. 38
3.7.3 Reinigung der Gesamt-RNA.................................................................................... 38
3.7.4 Reverse Transkription (RT)..................................................................................... 39
3.7.5 Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression ........................... 40
3.7.6 Nachweis von Survivin mRNA in kaninem Gewebe ................................................ 45
3.8 STATISTISCHE AUSWERTUNG .......................................................................................... 46
3.9 REAGENZIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN ............................................................... 47
3.9.1 Probenentnahme und Lagerung .............................................................................. 47
6
3.9.2 Immunphänotypisierung.......................................................................................... 47
3.9.3 Immunhistochemische Untersuchung...................................................................... 48
3.9.4 Molekularbiologische Untersuchungen .................................................................. 49
4 ERGEBNISSE ..................................................................................................................... 50
4.1 ALLGEMEINE PATIENTENCHARAKTERISTIKA .................................................................. 50
4.2 KLINISCHE STADIENEINTEILUNG..................................................................................... 51
4.3 IMMUNPHÄNOTYPISIERUNG............................................................................................. 52
4.4 KALZIUMPLASMASPIEGEL ............................................................................................... 52
4.5 CHEMOTHERAPIE............................................................................................................. 53
4.5.1 Initiale Chemotherapie............................................................................................ 53
4.5.2 Zweite Chemotherapie............................................................................................. 55
4.6 REAL-TIME RT-QPCR..................................................................................................... 56
4.6.1 Sensitivität der qPCR .............................................................................................. 56
4.6.2 MDR1-Genexpression ............................................................................................. 57
4.6.3 MRP1- und MRP2-Genexpression .......................................................................... 67
4.7 RT-PCR ZUM NACHWEIS VON SURVIVIN MRNA............................................................ 76
4.8 IMMUNHISTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNG DER P-GLYKOPROTEINEXPRESSION.............. 77
5 DISKUSSION ...................................................................................................................... 79
6 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................... 88
7 SUMMARY.......................................................................................................................... 90
8 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................... 92
9 ANHANG ........................................................................................................................... 126
9.1 RASSE UND ALTER DER AN LYMPHOM ERKRANKTEN HUNDE........................................ 126
9.2 REZEPTUREN DER VERWENDETEN LÖSUNGEN UND GELE.............................................. 128
9.3 VERWENDETE FORMELN UND GLEICHUNGEN................................................................ 129
9.4 ERGEBNISSE DER RT-QPCR-MESSDURCHGÄNGE ......................................................... 130
7
Abkürzungsverzeichnis
® ...................................................eingetragenes Warenzeichen
A ...................................................Adenin
ADM .............................................Doxorubicin
AP .................................................Antisense-Primer
Art.-Nr. .........................................Artikelnummer
bp ..................................................Basenpaare
C ...................................................Cytosin
ca ..................................................kanine
CD ................................................cluster of differentiation
cDNA ...........................................komplementäre DNA
CR .................................................komplette Remission
Ct ..................................................cycle threshold
CTX ..............................................Cyclophosphamid
CV ................................................Variationskoeffizient
DAB .............................................3,3 Diaminobenzidin
DEPC ............................................Diethylpyrocarbonat
dest. ..............................................destilliert
DNA .............................................Deoxyribonukleinsäure
DNase ...........................................Deoxyribonuclease
dNTP ............................................Desoxynucleotidtriphosphat
dR .................................................Grundlinien korrigierte Fluoreszenz
dRn ...............................................Grundlinien korrigierte normalisierte Fluoreszenz
dt.....................................................deutscher
DTT ..............................................Dithiothreitol
Fa. .................................................Firma
FAM .............................................6-Carboxy-Fluorescein
FITC .............................................Fluoreszeinisothiocyanat
FNA ..............................................Feinnadelaspirat
g ....................................................Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/sec²)
8
G ...................................................Guanin
GSH ..............................................Gluthation
h ....................................................Stunde
HPRT ............................................Hypoxanthinphosphoribosyltransferase
i.v. ................................................. intravenös
kDa ...............................................Kilodalton
kg ..................................................Kilogramm
KGW ............................................Körpergewicht
KOF ..............................................Körperoberfläche
kum. ..............................................kumulativ
L-Asp ............................................L-Asparaginase
LCS ................................................Lymphonodus cerficalis superficialis dexter
LCSS ............................................Lymphonodus cerficalis superficialis sinister
LJ ..................................................Lymphonodus jejunalis
LMD .............................................Lymphonodus mandibularis dexter
LMS ..............................................Lymphonodus mandibularis sinister
LPD ..............................................Lymphonodus popliteus dexter
LPS ...............................................Lymphonodus popliteus sinister
MDR .............................................multidrug resistance
mg .................................................Milligramm
MGB .............................................minor groove binder
MRP .............................................Multidrug Resistance Associated Protein
MTX .............................................Methotrexat
MW ...............................................arithmetischer Mittelwert
n ....................................................Anzahl an Tieren / Proben
Nr. .................................................Nummer
OD ................................................optische Dichte
p ....................................................Irrtumswahscheinlichkeit
PBS ...............................................Phosphat gepufferte Kochsalzlösung
PCR ..............................................Polymerase-Kettenreaktion
PE .................................................Phycoerythrin
9
PerCP ............................................Peridin-Clorophyll-a-Prpteinkomplex
PR .................................................partielle Remission
Pred ...............................................Prednisolon
qPCR ............................................quantitative Polymerasekettenreaktion
R ...................................................Korrelationskoeffizient nach Pearson
Real-time RT-qPCR .....................Real-time Reverse Transcription- quantitative PCR
RFI ................................................rezidivfreies intervall
RNA .............................................Ribonukleinsäure
RNase ...........................................Ribonuclease
ROX .............................................6-Caboxy-X-Rhodamin
RT .................................................Reverse Transkription
s.c. .................................................subkutan
SD...................................................Standardabweichung
SP .................................................Sense-Primer
T ...................................................Thymin
tägl. ............................................... täglich
TAMRA .......................................6-Carboxy-tetramethylrhodamin
Tm .................................................Schmelzpunkt
™ ..................................................Warenzeichen
u ....................................................units
VCR ..............................................Vincristin
WHO ............................................Weltgesundheitsorganisation
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1 EINLEITUNG
Die Chemotherapie ist ein wichtiger Bestandteil der Tumortherapie beim Kleintier. Sie wird
mit dem Ziel der Heilung (z.B. beim Stiker-Sarkom des Hundes (CALVERT et al. 1982)), zur
Verbesserung der Lebensqualität und Verlängerung des Überlebens (z.B. bei multiplen
Myelomen, Mastozytomen oder Lymphomen (MATUS et al. 1986; MCCAW et al. 1997;
LINK u. HIRSCHBERGER 1999; THAMM et al. 1999)) sowie im Anschluss an eine
chirurgische Tumortherapie zur Vernichtung okkulter Mikrometastasen und Verbesserung der
lokalen Tumorkontrolle (z.B. bei Hunden mit Osteosarkomen (STRAW et al. 1991))
durchgeführt.
Die Wirksamkeit der Chemotherapie wird häufig durch Resistenzen der Tumoren gegen die
verfügbaren Zytostatika begrenzt (STEWART u. GORMAN 1991; BERGMAN u. OGILVIE
1995). Grundsätzlich wird in der Onkologie zwischen intrinsischen und erworbenen
Zytostatikaresistenzen unterschieden. Tumoren mit intrinsischer Resistenz sind von
vornherein chemotherapeutisch nicht beeinflussbar. Als Beispiele hierfür werden beim
Kleintier hepatozelluläre und gastrointestinale Karzinome genannt (STEWART u. GORMAN
1991). Tumoren mit erworbener Zytostatikaresistenz reagieren dagegen zunächst auf eine
Chemotherapie mit einer Regression. Nach einer gewissen Zeitspanne entwickelt sich jedoch
unter der Chemotherapie eine Resistenz gegen die eingesetzten Zytostatika. Es kommt zur
Ausbildung eines Rezidivs, und die Tumorzellen werden therapierefraktär (LEHNERT 1996).
Diese erworbene Zytostatikaresistenz treten beim Kleintier vor allem in der Therapie von
lymphoproliferativen Neoplasien auf (MADEWELL 1999).
Eine gleichzeitige Resistenz von Tumorzellen gegen verschiedene, strukturell
unterschiedliche Chemotherapeutika wird als Vielfachresistenz oder multidrug resistance
(MDR) bezeichnet (BIEDLER u. RIEHM, 1970; DANO 1973). In vitro können
Vielfachresistenzen durch eine intermittierende oder langanhaltende Exposition von
Tumorzellen mit nur einem Zytostatikum induziert werden (TURKER et al. 1991).
Häufig geht eine MDR mit der Überexpression bestimmter Zellmembranproteine, wie zum
Beispiel des sogenannten P-Glykoproteins, und einer herabgesetzten Akkumulation der
Zytostatika in der Zelle einher (KARTNER et al. 1983). Beim individuellen Patienten können
jedoch auch Veränderungen der Pharmakokinetik (Absorption, Verteilung, Metabolisierung
12
und Elimination) der eingesetzten Zytostatika den Behandlungserfolg beeinträchtigen
(BERGMAN u. OGILVIE 1995).
Das maligne Lymphom zählt zu den beim Kleintier am häufigsten chemotherapeutisch
behandelten Tumoren. Die überwiegende Mehrheit der an malignem Lymphom erkrankten
Hunde entwickelt im Therapieverlauf eine Vielfachresistenz (MADEWELL 1998). In ersten
Studien wurde bereits ein Zusammenhang zwischen der Expression von P-Glykoprotein und
der Überlebenszeit bei an malignem Lymphom erkrankten Hunden beschrieben (BERGMAN
et al. 1996; Lee et al. 1996). Seit langem ist bekannt, dass neben der Expression von
P-Glykoprotein zahlreiche weitere Mechanismen, wie z.B. die Expression von Mitgliedern
der Familie der multidrug resistance-associated proteins (MRPs) oder Inhibitoren der
Apoptose zur Ausprägung von Vielfachresistenzen in vitro führen können.
Im Gegensatz zu vielfachresistenten Zelllinien exprimieren in vivo viele Tumoren die eine
Vielfachresistenz vermittelnden Zellmembranproteine nur verhältnismäßig niedrig
(BROXTERMAN et al. 1996). Als sehr sensitives Verfahren zum Nachweis einer Expression
von P-Glykoprotein und Mitgliedern der Familie der MRPs auf Nukleinsäureebene wird die
Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) angesehen (MURPHY et al.
1990).
Ziel der vorliegenden Studie war es, eine RT-PCR zu entwickeln, mit der P-Glykoprotein,
MRP1, MRP2 und Survivin auf Nukleinsäureebene beim Hund sicher quantifiziert werden
können, mit diesem Verfahren die Expression der Gene in malignen Lymphomen zu
bestimmen sowie den Zusammenhang zwischen der Höhe der jeweiligen Genexpression und
der chemotherapeutischen Beeinflussbarkeit in vivo zu untersuchen.
13
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Malignes Lymphom des Hundes
Maligne Lymphome sind Tumoren des lymphoretikulären Gewebes und verlaufen fast immer
systemisch (ETTINGER 2003). Häufig nehmen sie ihren Ursprung im Lymphknoten, seltener
in extranodalen lymphoretikulären Geweben (FAN 2003).
Entsprechend der anatomischen Lokalisation des Lymphoms werden multizentrische (etwa
80% der Fälle beim Hund), gastrointestinale, mediastinale, kutane und sogenannte „sonstige“
Formen unterschieden (OWEN 1980; CROW 1987).
Die Ätiologie ist unbekannt (MADEWELL 1999). In verschiedenen Studien wurde ein
Zusammenhang zwischen der Entstehung von Lymphomen beim Hund und einer Infektion
mit Retroviren (TOMLEY et al. 1983), Herbizid- (HAYES et al. 1991) oder
Magnetfeldexposition (REIF et al. 1995), dem Leben in Industriegebieten (GAVAZZA et al.
2001), Chromosomenaberrationen (HAHN et al. 1994) sowie einer Störung des
Immunsystems (WEIDEN et al. 1974; OWEN et al. 1975) vermutet. Jedoch konnte keine der
Hypothesen bisher ausreichend bewiesen werden.
Unterbleibt eine adäquate Therapie, ist die Prognose schlecht, die Patienten versterben
durchschnittlich vier bis sechs Wochen nach Diagnosestellung (MACEWEN et al. 1981).
Durch hochdosierte Kortikosteroidgaben kann zwar bei etwa 50 % der Patienten ein
Tumorrückgang erreicht werden, jedoch rezidivieren die Tumoren zum Großteil innerhalb
von 4 bis 8 Wochen (SQUIRE et al. 1973; CROW 1982). Die Therapie der Wahl bei Hunden
mit Lymphomen ist heute im allgemeinen die Chemotherapie (ROSENTHAL 1996).
Chemotherapie
Bei an malignem Lymphom erkrankten Hunden wird die Chemotherapie in erster Linie
palliativ zur Verbesserung der Lebensqualität und Verlängerung der Überlebenszeit eingesetzt
(CROW 1987; ETTINGER 2003).
Die Zahl der in den letzten 30 Jahren eingesetzten Therapieprotokolle ist relativ beträchtlich
(Tabelle 1). Neben der Monochemotherapie mit Doxorubicin haben sich vor allem
Kombinationschemotherapien bewährt (ROSENTHAL 1996).
14
Tabelle 1: Ergebnisse einiger in den letzten Jahrzehnten durchgeführten Studien zur Wirksamkeit verschiedener Chemotherapieprotokolle bei an malignem Lymphom erkrankten Hunden
Substanzen (Kurzname) n CR PR Remissionsdauer (Median) Ref.
ASP, CTX, VCR, MTX 59 90% 7% 132 Tage bei CR 1
77 75% 14% 180 Tage bei CR 2 CTX, VCR, Pred (COP)
20 70% 100 Tage bei CR 3
21 76% 206 Tage bei CR 3 DOX
37 59% 22% 151 Tage bei CR 4
VCR, CTX, DOX, Pred (COPA) 45 84% 7% 210 Tage bei CR 5
41 76% 12% 330 Tage bei CR 5
112 73% 25% 238 Tage bei CR 6 ASP, VCR, CTX, Dox, Pred (ACOPA)
34 94% - 214 Tage bei CR 7
ASP, VCR, CTX, CBL, DOX, MTX, Pred (Madison-Wisconsin)
55 84% 7% 252 Tage 8
Abkürzungen und Fußnoten ASP: L-Asparaginase 1 MACEWEN et al. 1981 DOX: Doxorubicin 2 COTTER 1983 CBL: Chlorambucil 3 CARTER et al. 1987 CR: komplette Remission 4 POSTORINO et al. 1989 CTX: Cyclophosphamid 5 STONE et al.1991 MTX: Methotrexat 6 GREENLEE et al. 1990 n: Patientenanzahl 7 MACEWEN et al. 1992 PR: partielle Remission 8 KELLER et al. 1993 Pred: Prednison Ref.: Referenzen VCR: Vincristin
15
Je nach verwendetem Chemotherapieprotokoll kann bei bis zu 90% der behandelten Patienten
ein Rückgang des Tumors erreicht werden (MACEWEN et al 1981; KELLER et al. 1993;
VALERIUS et al. 1997). Heilungen sind jedoch sehr selten (MADEWELL 1999).
Die Hälfte der Patienten entwickelt innerhalb der ersten sieben bis neun Monate nach
Therapiebeginn ein Tumorrezidiv (Tabelle 1). Bei einem Teil der Patienten, die ein Rezidiv
entwickeln, kann durch eine Wiederholung der Chemotherapie der Tumor zurückgedrängt
und eine erneute Remission induziert werden. Die Dauer der zweiten Remission ist zumeist
jedoch deutlich kürzer als die Dauer der ersten Remission. Die Lymphome werden
zunehmend gegen die eingesetzten Zytostatika resistent (ETTINGER 2003).
Durch Verwendung von Zytostatika, die nicht Bestandteil der ursprünglichen Chemotherapie
waren (sogenannte Rettungsprotokolle), können bestehende Zytostatikaresistenzen teilweise
umgangen werden (MADEWELL 1999). Bei fast allen bisher erprobten Rettungsprotokollen
liegen die Remissionsraten jedoch unter 50% (26-65%) und die mittlere Remissionsdauer
unter vier Monaten (61 bis 126 Tage) (VANVECHTEN et al. 1990; MOORE et al. 1994;
LUCROY et al. 1998; MOORE et al. 1999; RASSNICK et al. 2002).
Letztendlich entsteht bei fast allen Patienten nach einer unterschiedlichen Anzahl an
Remissionen eine Vielfachresistenz (multidrug resistance) des Tumors und die Patienten
versterben infolge der Lymhomerkrankung (VANVECHTEN et al. 1990). Die 1-Jahres- und
2-Jahres-Überlebensraten liegen bei Hunden mit multizentrischen Lymphomen in der Regel
unter 45% bzw. 25% (ETTINGER 2003).
Die zellulären Mechanismen, die zur Ausprägung einer multidrug resistance (MDR) in vitro
führen, sind zahlreich. Häufig geht eine MDR mit der Überexpression bestimmter
Zellmembranproteine und einer herabgesetzten Akkumulation der Zytostatika in der Zelle
einher (KARTNER et al. 1983). Zu den Zellmembranproteinen, die eine MDR vermitteln,
zählen u.a. das P-Glykoprotein und Mitglieder der Familie der Multidrug resistance-
associated proteins (MRPs). Aufgrund der großen Bedeutung der MDR für den Erfolg
chemotherapeutischer Behandlung wurden diese Proteine nach ihrer Erstbeschreibung in
zahlreichen Studien untersucht (RAPPA et al. 1999).
16
2.2 P-Glykoprotein
Der bisher am weitesten erforschte Mechanismus, der zur Ausprägung einer MDR führen
kann, ist die Expression eines 170 kDa schweren Zellmembranproteins, des sogenannten
P-Glykoproteins (KARTNER et al. 1983; UEDA et al. 1987b; SIKIC 1997). Das
P-Glykoprotein wurde erstmals 1976 von Victor Ling und Mitarbeitern in Colchicin-
resistenten Ovarzelllinien von Hamstern beschrieben (JULIANO u. LING 1976). Es gehört
zur Familie der ABC (adenosine triphosphate (ATP)-binding cassette) Transporterproteine
und ist eine ATP-abhängige Efflux-Pumpe, welche die Substratmoleküle aus dem Zytoplasma
hinauspumpt und sie damit wirkungslos macht (OBST 2000; DEAN et al. 2001). Substrate für
das P-Glykoprotein sind zahlreiche Substanzen, darunter verschiedene hydrophobe
Zytostatika (Tabelle 2).
Tabelle 2: Zytostatika, die beim Menschen durch das P-Glykoprotein transportiert werden (modifiziert nach GOLDSTEIN 1996)
Anthracycline Taxane Doxorubicin Docetaxel Daunomycin Sonstige
Vinkaalkaloide Actinomycin-D Vincristin Mitoxantron Vinblastin
Epiphylotoxine Etoposide
Bei Säugetieren wird das P-Glykoprotein von einer kleinen Gen-Familie kodiert (RIORDAN
et al. 1985). Bisher sind beim Menschen zwei, beim Hamster, bei der Maus und Ratte drei
und beim Schwein fünf Isoformen des P-Glycoproteins beschrieben worden (DG et al. 1989;
DEUCHARS et al. 1992; CHILDS u. LING 1996; DEAN et al. 2001). Die mit der
Ausbildung der MDR in Zusammenhang stehende Isoform des P-Glykoproteins wird beim
Menschen vom MDR1-Gen kodiert (GROS et al. 1986; UEDA et al. 1987a). Bei Hund und
17
Katze wurde das MDR1-Gen mittlerweile ebenfalls sequenziert (STEINGOLD et al. 1998;
OKAI et al. 2000). Die Sequenzhomologie zum MDR1-Gen des Menschen beträgt beim Hund
93% (STEINGOLD et al. 1998). Über weitere Isoformen des P-Glykoproteins ist bei diesen
Tierarten, soweit aus der Literatur ersichtlich, bisher nichts bekannt.
Physiologische Funktion
Das P-Glykoprotein wird beim Menschein und Hund vor allem in der Leber
(Gallengangskanäle), in den Nebennierenrinden, im Pankreas und Kolon, in den Nieren
(proximale Tubulusepithelien) und im Gehirn (Kapillarendothelien) exprimiert (FOJO et al.
1987; GINN 1996).
Es wird vermutet, dass das P-Glykoprotein sowohl am Transport exogener als auch endogener
Metaboliten, wie zum Beispiel Cortisol, in verschiedenen Geweben beteiligt ist (WOLF u.
HURVITZ 1992; VAN KALKEN et al. 1993; FISHER et al. 1996; LEONARD et al. 2003).
Eine Bedeutung des P-Glykoproteins für die Funktion der Blut-Hirnschranke konnte anhand
von mdr1a/1b (-/-) Knockout-Mäusen nachgewiesen werden (SCHINKEL et al. 1997). Die
Mäuse waren vital und fertil, wiesen jedoch eine erhöhte Sensitivität gegen das neurotoxische
Pharmakon Ivermectin sowie gegen Vinblastin auf (SCHINKEL et al. 1994).
Ähnliche neurologische Nebenwirkungen wie bei mdr1a/1b (-/-) Knockout-Mäusen treten
nach Gabe von Ivermectin bei etwa 1/3 der Hunde der Rasse Collie auf (PAUL et al. 1987).
In verschiedenen Studien konnte bei Collies mit einer Überempfindlichkeit gegen Ivermectin,
Loperamid oder Zytostatika eine Mutation des MDR1-Gens nachgewiesen werden (MEALY
et al. 2001; ROULET et al. 2003; MEALEY et al. 2003; SARTOR et al. 2004). Bei der
Mutation handelt es sich um eine 4 Basenpaare umfassende Deletion, die zur Verschiebung
des Leserasters und vorzeitigem Abbruch der Proteinsynthese führt (MEALY et al. 2001).
Der Anteil an Collies, bei denen beide Allele des MDR1-Gens mutiert sind, liegt in den USA
nach einer ersten Studie bei 36% (MEALEY et al. 2002).
Neben seiner Bedeutung für die Funktion der Blut-Hirn-Schranke konnte mittels Knockout-
Mäusen auch eine Beteiligung des P-Glykoproteins an der Absorption und Elimination
verschiedener Medikamente sowie beim Schutz vom Knochenmark gegen zytotoxische
Chemotherapeutika aufgezeigt werden (SCHINKEL et al. 1997).
18
Modulation der Expression durch Zytostatika und Glukokortikoide
Nach dem derzeitigen Erkenntnisstand ist davon auszugehen, dass die Expression von P-
Glykoprotein und anteren Mitgliedern der ABC Transporterfamilie umfangreichen
Regulationsmechanismen unterliegt (SCOTTO 2003). Grundsätzlich kann die Genexpression
auf verschiedenen Ebenen (Transkrption, RNA posessing, Translation und Proteinaktivität)
reguliert werden (PASSARGE 2001).
Schon länger ist bekannt, dass verschiedene Steroidhormone Substrate für das P-Glykopotein
sind (UEDA et al. 1992). Auch synthetische Glukokortikoide, wie zum Beispiel Prednisolon
und Dexamethason, werden durch das P-Glykoprotein transportiert (UEDA et al. 1992,
KARSSEN et al. 2002). Sowohl in vitro als auch in vivo kann in verschiedenen Geweben
durch Dexamethason die Höhe der P-Glykoproteinexpression beeinflußt werden (ZHAO et al.
1993, DEMEULE et al. 1999). So führte die Gabe von Dexamethason bei Ratten zu einer
Erhöhung der P-Glykoproteinexpression in Leber und Lunge, aber einer Reduktion der
Erxpression in den Nieren (DEMEULE et al. 1999).
Auch durch eine Exposition mit Zytostatika kann die Transkription des MDR1-Gens in vitro
induzieren werden (SCOTTO 2003). Desweiteren wurde in Leukämiezellen eine MDR1-
Überexpression durch mRNA Stabilisierung und Translationsinduktion beschrieben (YAGUE
et al. 2003). SCOTTO (2003) vermutet daher die Existenz multipler, in verschiedenen
Zellarten vorkommender Mechanismen, welche die MDR1-Genexpression regulieren.
Klinische Relevanz bei Tumorerkrankungen
Eine Expression von P-Glykoprotein wurde beim Menschen und Hund in zahlreichen
Tumoren beschrieben (FOJO et al. 1987; GINN 1996). Insbesondere in Tumoren, die von
Ursprungsgewebe mit physiologisch hoher P-Glykoproteinexpression abstammen, wie z.B.
Lebertumoren, ist P-Glykoprotein relativ konstant nachweisbar (CHENIVESSE et al. 1993;
ITSUBO et al. 1994; GINN 1996). Bei anderen Tumoren lässt sich P-Glykoprotein
immunhistochemisch dagegen nur inkonstant darstellen. Beim Hund werden maligne
Lymphome (BERGMAN et al. 1996, GINN 1996, LEE et al. 1996), kutane Mastozytome
(MIYOSHI et al. 2002) und Harnblasenkarzinome (ROCHA et al. 2000) zu dieser Gruppe
gezählt.
19
Für zahlreiche Tumoren des Menschen, wie z.B. myeloische Leukämien oder Non-Hodgkin-
Lymphome, wurde eine klinische Relevanz der Expression von P-Glykoprotein nachgewiesen
(PILERI et al. 1991; YUEN u. SIKIC 1994; KANG 1995; SONNEVELD 2000). So kann eine
Expression von P-Glykoprotein in Tumoren mit einer herabgesetzten Anreicherung von
verschiedenen Zytostatika in der Zelle und einer erhöhten Chemotherapieresistenz
einhergehen (LING, 1989). In ersten Untersuchungen beim Hund konnte ebenfalls ein
Zusammenhang zwischen der Expression von P-Glykoprotein im Tumorgewebe und dem
Erfolg einer chemotherapeutischen Behandlung aufgezeigt werden (BERGMAN et al. 1996;
LEE et al. 1996).
Therapeutische Beeinflussbarkeit
Seit über 20 Jahren ist bekannt, dass die Transportfunktion des P-Glykoproteins in vitro durch
verschiedene Substanzen, darunter viele zugelassene Arzneimittel, nicht-selektiv gehemmt
wird (ECKER u. CHIBA 1995). Zu diesen als P-Glykoproteinantagonisten der 1. Generation
bezeichneten Substanzen zählen u.a. Verapamil, Ciclosporine und Steroide (TSURO et al.
1981; YANG et al. 1989; TWENTYMAN 1992). Zur Umgehung bestehender
Vielfachresistenzen in vivo erwiesen sich die P-Glykoproteinantagonisten der 1. Generation
jedoch als wenig geeignet. So liegt die zur Modulation der P-Glykoproteinfunktion
erforderliche Plasmakonzentration dieser Substanzen häufig über ihrer therapeutischen Breite
(FISHER 1996; SIKIC 1997; COVELLI 1999).
Beim Hund wurde in einer Phase-I Studie die Wirksamkeit von Tamoxifen, einem
Antiöstrogen, zur Hemmung der P-Glykoproteinfunktion geprüft (WADDLE et al. 1999).
Plasmakonzentrationen von Tamoxifen, die in vitro zu einer Hemmung der
P-Glykoproteinfunktion führen, konnten in der Studie nur bei einer hochdosierten
Tamoxifengabe (600 mg/m²) erreicht werden (WADDLE et al. 1999). Bei einer kombinierten
Gabe von Tamoxifen (600 mg/m², zweimal täglich per os) und Doxorubicin (1,25 mg/kg i.v.)
traten bei Hunden mit verschiedenen Tumoren jedoch bei etwa 50% gastrointestinale
Nebenwirkungen auf (WADDLE et al. 1999). In früheren Studien beschriebene
östrogenähnliche Nebenwirkungen von Tamoxifen (MORRIS et al. 1993) wurden in der
Studie von Waddle und Mitarbeiter (WADDLE et al. 1999) nicht beobachtet.
20
Im Gegensatz zu den P-Glykoproteinantagonisten der 1. Generation wurden die Antagonisten
der 2. Generation, wie z.B. Valspodar (PSC 833), gezielt zur Umgehung von
Vielfachresistenzen entwickelt (BOESCHE et al. 1991; LEONARD u. BATES 2003). Es hat
sich jedoch gezeigt, dass Valspodar und andere P-Glykoproteinantagonisten der 2. Generation
nicht nur die Transportfunktion von P-Glykoprotein sondern auch den Cytochrom P450 3A4
vermittelten Metabolismus vieler Zytostatika hemmen (WANDEL et al. 1999). Aufgrund der
verzögerten Elimination der Zytostatika ist bei Gabe von P-Glykoproteinantgonisten der 2.
Generation daher zumeist eine Reduktion der Zytostatikadosis zur Vermeidung schwerer
Nebenwirkung erforderlich (DORR et al. 2001).
Im Gegenstaz zu den Antagonisten der 2. Generation hemmen die Antagonisten der 3.
Generation das Cytochrom P450 3A4-Isoenzym nicht (DANTZIG et al. 1999). Zu den P-
Glykoproteinantagonisten der 3. Generation zählen Tariquidar und Laniquidar. Sie werden
derzeit beim Menschen klinisch erprobt (THOMAS u. COLEY 2003).
Weitere sich in Prüfung befindliche Therapieansätze beruhen auf der nicht kompetitiven
Hemmung der P-Glykoproteinfunktion durch monoklonale Antikörper oder der Beeinflussung
der MDR1-Genexpression mittels Antisense-MDR1-Oligonukleotiden (WAGNER 1995;
ALAHARI et al. 1996; BOUFFORD et al. 1996).
Gentherapie
Auch für die Gentherapie ist das P-Glykoprotein bzw. das MDR1-Gen von Interesse
(SORRENTINO et al. 1995; LICHT et al. 2000). Eine Therapiestrategie ist es Zytostatika-
sensitives Gewebe, wie das Knochenmark, durch Gentranfer vor den toxischen Effekten einer
Chemotherapie zu schützen und somit die Verträglichkeit der Chemotherapie zu verbessern
bzw. die Gabe höherer Zytostatikadosen zu ermöglichen (SORRENTINO et al. 1995).
21
2.3 Multidrug resistance-associated protein (MRP)
In den Jahren nach der Entdeckung des P-Glykoproteins wurden von verschiedenen
Arbeitsgruppen vielfachresistente Zelllinien, bei denen P-Glykoprotein nicht nachweisbar
war, beschrieben. Auf der Suche nach weiteren Mechanismen, die zur Ausprägung einer
MDR führen können, entdeckten Cole und Mitarbeiter 1992 in einer Lungenzelllinie
(H69AR) ein weiteres Membrantransporterprotein, das eine Vielfachresistenz gegen
Zytostatika vermitteln kann (COLE et al. 1992). Es wurde als multidrug resistance-associated
protein (MRP) bezeichnet. Wie das P-Glykoprotein gehört das MRP zur Familie der ABC
Transporterproteine und fungiert als Efflux-Pumpe (COLE et al. 1992; ZAMAN et al. 1994,
DEAN et al. 2001). Mittlerweile sind beim Menschen sieben (MRP1 bis MRP7) und beim
Hund zwei (MRP-1 und MRP-2) Isoformen des MRP beschrieben worden (BORST et al.
2000; CONRAD et al. 2001).
2.3.1 MRP1
Das MRP1 ist ein 190-kDa schweres Zellmembranprotein (KRISHNAMACHARY u.
CENTER 1993). Es wurde erstmals 1992 in vielfachresistenten Lungenzelllinien beschrieben
(COLE et al. 1992). Später durchgeführte Transfektionsexperimente belegten, dass eine
Überexpression des MRP1 beim Menschen in vitro u.a. eine Resistenz gegen Vincristin,
Doxorubicin, Etoposid und Methotrexat vermitteln kann (COLE et al. 1994; GRANT et al.
1994; HOOIJBERG et al. 1999).
Das kanine MRP1-Gen wurde erstmals 2001 sequenziert (CONRAD et al. 2001). Bisher
konnte in vitro eine durch canine MRP-1 vermittelte MDR gegen Vincristine und Etoposide,
aber im Gegensatz zum Menschen nicht gegen Doxorubicin nachgewiesen werden (MA et al.
2002).
Auch wenn das MRP1 und das P-Glykoprotein zum größten Teil Resistenzen gegen dieselben
Zytostatikaklassen vermitteln, unterscheiden sie sich in ihrer Substratspezifität (LOE et al.
1996). Studien belegen, dass durch das MRP1 vor allem Konjugate lipophiler Substanzen mit
Gluthation (GSH), Glukuronsäure- und Schwefelsäure transportiert werden (JEDLITSCHKY
et al. 1994, LEIER et al. 1994; MÜLLER et al. 1994; ZAMAN et al. 1995; JEDLITSCHKY
22
et al. 1996). Einige nicht konjugierte hydrophobische Substanzen, wie z.B. Vincristin oder
Daunorubicin, scheinen ebenfalls, jedoch nur in Anwesenheit von reduziertem GSH, durch
das MRP1 transportiert werden zu können (ZAMAN et al. 1995; RENES et al. 1999).
Beim Menschen und Hund wird MRP1 in zahlreichen Organen und Geweben exprimiert
(FLENS et al. 1996; HIPFNER et al. 1999; CONRAD et al. 2001). Die höchsten
mRNA-Gehalte werden beim Menschen in der Skelettmuskulatur, dem Herz, den Nieren, der
Lunge und den Hoden nachgewiesen.
Studien haben gezeigt, dass verschiedene endogene Substanzen, wie z.B. Leukotrin C4, und
Metabolite exogener Substanzen, wie z.B. Aflatoxin B1, durch das MRP1 transportiert werden
(JEDLITSCHKY et al. 1994; LEIER et al. 1994; LOE et al. 1996; JEDLITSCHKY et al.
1996; LOE et al. 1997). Zusätzlich zu der Transporterfunktion wird eine Beteiligung des
MRP1 an der Regulation verschiedener Ionenkanäle vermutet (LOE et al. 1999). Eine
Einschränkung der Vitalität und Fertilität bestand bei mrp(-/-) Knockout-Mäusen, ähnlich
wie bei mdr1a/1b (-/-) Knockout-Mäusen, nicht (RAPPA et al. 1999).
Zwar wurde MRP1 beim Menschen in zahlreichen Tumoren nachgewiesen (FLENS et al.
1996), die klinische Relevanz der Expression ist jedoch noch relativ unbekannt (BORST et al.
2000) Ein Zusammenhang zwischen der Expression und dem Erfolg chemotherapeutischer
Behandlung wurde u.a. bei Patienten mit Retinoblastom aufgezeigt. So wiesen
Retinoblastome, die trotz der Gabe von Ciclosporin zum Zwecke der Umgehung einer
P-Glykoprotein induzierten MDR nicht auf eine Chemotherapie reagierten, eine Expression
von MRP1 auf (CHAN et al. 1997).
2.3.2 MRP2
MRP2 wurde aufgrund seiner Funktion als Transporter organischer Anionen in der
kanikulären Membran von Hepatozyten ursprünglich als canicular multispecific anion
transporter (cMOAT) bezeichnet. 1996 gelang es Paulusma und Mitarbeiter zu zeigen , dass
das cMOAT der Ratte dem humanen MRP1 entspricht (PAULUSMA et al. 1996).
Das MRP2 wird beim Menschen und anderen Spezies vor allem in der Leber, in der Niere
und im Darm exprimiert (PAULUSMA et al. 1996; BORST et al. 2000). Seine Lokalisation
in der Zelle ist apikal (KÖNIG et al. 1999).
23
Als wichtigste physiologische Funktion des MRP2 wird die hepatobiliäre Exkretion von
verschiedenen organischen Anionen angesehen. So führt bei Ratten eine Mutation des
MRP2-Gens (TR- Ratten) zu einem Defekt der hepatobiliären Exkretion verschiedener
organischer Anionen und dem klinischen Bild einer chronischen Hyperbilirubinämie
(PAULUSMA et al. 1996). In den Nieren ist MRP2 vermutlich an der Exkretion organischer
Anionen in den Harn beteiligt (KÖNIG et al. 1999). Im Darm wird aufgrund von
Untersuchungen an Ratten eine Rolle des MRP2 bei der Sekretion von Glutathionkonjugaten
vermutet (GOTOH et al. 2000).
Die Bedeutung des MRP2 in der Vermittlung von Zytostatikaresistenzen ist noch relativ
unbekannt. In Transfektionsexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass MRP2 in
Zellkulturen eine Resistenz gegen Methrotrexat, Etoposid, Vincristin, Cisplatin, Doxorubicin
und Epirubicin vermitteln kann (CUI et al. 1999, HOOIJBERG et al. 1999). In einer weiteren
Studie wiesen Taniguchi und Mitarbeiter in drei Cisplatin-resistenten Tumorzellinien eine
vier- bis sechsfach erhöhte Expression des MRP2-Gens nach (TANIGUCHI et al. 1996).
Beim Menschen wurde eine Expression von MRP2 in Nierenkarzinomen, Lungen-, Kolon-,
Rektum- und Magentumoren sowie hepatozellulären Karzinomen beschrieben (SCHAUB et
al. 1997; NARASAKI et al. 1997). Die klinische Relevanz der Expression ist jedoch unklar.
Beim Hund wurde das MRP2-Gen im Jahre 2001 sequenziert (CONRAD et al. 2001). Die
Sequenzhomologie zum Menschen beträgt 83%. Über die Expression von MRP2 in kaninen
Tumoren ist, soweit aus der Literatur ersichtlich, nichts bekannt.
2.4 Apoptose und Zytostatikaresistenzen
Als Apoptose wird ein genetisch programmierter, geregelter physiologischer Zelluntergang
bezeichnet (HOCKENBERRY 1995). Eine Apoptose kann sowohl durch physiologische
Stimuli, exogene Insulte (z.B. DNA-Schädigung durch γ-Strahlen) als auch durch Entzug von
Vitalitätsfaktoren ausgelöst werden (REED 1997).
Viele derzeit in der Tumortherapie gängigen Zytostatika lösen durch ihre zellschädigende
Wirkung eine Determination der Apoptose aus (REED 1997). Eine herabgesetzte Fähigkeit
der Zellen zur Apoptose kann somit die Empfindlichkeit gegenüber Zytostatika einschränken
und zur Ausprägung von Zytostatikaresistenzen führen. Über die Bedeutung der Apoptose für
die chemotherapeutische Beeinflussbarkeit von Lymphomen beim Hund ist wenig bekannt. In
24
einer 2000 veröffentlichten Studie wiesen Hunde mit einer relativ niedrigen Apoptoserate im
Tumor ein etwas längeres rezidivfreies Intervall (Median 202 Tage) auf als die restlichen
Patienten (Median 162 Tage). Der Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant.
(PHILIPS et al. 2000).
An der Regulation der Apoptose sind verschiedene Gene und Genprodukte beteiligt (REED
1997). Das sogenannte BCL-2-Genprodukt war der erste in Säugetierzellen nachgewiesene
Apoptoseinhibitor (TSUJIMOTO et al. 1985) und ist Namensgeber einer Familie strukturell
verwandter Proteine, die neben Inhibitoren der Apoptose auch pro-apoptotisch wirkende
Proteine beinhalteten (REED 1997). Ein weiteres Mitglied der BCL-2 Familie, das
sogenannte BCL-XL Gen, wurde kürzlich beim Hund kloniert und sequenziert (SANO et al.
2003). Das BCL-XL Protein ist wie das BCL-2-Genprodukt ein Apoptoseinhibitor.
Neben der BCL-2 Familie spielt auch das Tumorsuppressorgen P53 bei der Induktion der
Apoptose durch DNA schädigende Zytostatika eine Rolle (LOWE et al. 1994; HICKMAN
1996; MANFREDI 2003). Eine erste Studie beim Hund weist darauf hin, dass sowohl
germinative als auch somatische Mutationen des P53-Gens bei Hunden mit malignen
Lymphomen vorkommen (VELDHOEN et al. 1998).
Weitere bisher bekannte Inhibitoren der Apoptose gehören zur IAP (inhibitor of apoptosis)
Familie (LACASSE et al. 1998).
2.4.1 Survivin
1997 wurde von Ambrosini und Mitarbeitern beim Menschen ein bis dahin unbekanntes Anti-
Apoptosegen beschrieben (AMBROSINI et al. 1997). Das sogenannte Survivingen gehört zur
Familie der Apoptosenhibitoren (inhibitor of apoptosis, IAPs) und besteht aus drei Introns
und vier Exons, wobei das 3. Intron und das 4. Exon bei der Maus länger sind als beim
Menschen (AMBROSINI et al. 1997). Das zugehörige Protein ist 16,5 kDa schwer
(AMBROSINI et al. 1997).
Survivin wird als bifunktionales Protein angesehen, da es sowohl Apoptose unterdrückt als
auch bei der Regulierung der Zellteilung beteiligt ist (ALTIERI u. MARCHISIO 1999; REED
2001). Survivin bindet und hemmt die Caspase-3 und Caspase-7, welche Apoptose in Zellen
induzieren (TAMM et al. 1998). Es wird während der G2/M-Phase des Zell-Zyklus exprimiert
(LI et al. 1998). In Transfektionsexperimenten konnte gezeigt werden, dass Survivin sowohl
25
einer Apoptose durch Entzug von Vitalitätfaktoren als auch einer durch Fas (CD95), Bax,
Etoposid oder UVB-Strahlen induzierten Apoptose entgegenwirkt (AMBROSINI et al. 1997;
TAMM et al. 1998; GROSSMAN et al. 2001).
Survivin wird beim Menschen in den meisten Geweben nur während der Fetalphase
exprimiert. Beim erwachsenen Menschen konnte Survivin bisher nur in wenigen Geweben
(Thymus, Plazenta, Kolon) nachgewiesen werden (AMBROSINI et al. 1997).
Im Gegensatz zu unveränderten Geweben wurde eine Expression von Survivin beim
Menschen bereits in verschiedenen Tumoren nachgewiesen (ALTIERI u. MARCHISIO 1999)
(Tabelle 3). In menschlichen Nierenkarzinomzelllinien konnten zwei Splicevarianten
identifiziert werden. Der Isoform Survivin-∆Ex3 fehlt das Exon3, wohingegen die Isoform
Survivin-2B ein Stück des Intron 2 als kryptisches Exon enthält. Im Gegensatz zur
Spilcevarante Survivin-∆Ex3 ist bei der Isoform Survivin2B die antiapoptotische Wirkung
reduziert (MAHOTKA et al. 1999). Eine prognostische Relevanz der Expression von
Survivin wurde beim Menschen u.a. bei Übergangszellkarzinomen, hepatocellulären
Karzinomen und Lungentumoren beschrieben. (MONZO et al. 1999; SWANA et al. 1999;
IKEGUCHI et al. 2002).
Tabelle 3: Häufigkeit der Expression von Survivin in verschiedenen Tumoren beim Menschen (modifiziert und erweitert nach ALTIERI u. MARCHISIO 1999)
Tumor n Methode Survivin positiv Referenzen
Magenkarzinom 174 IHC 34% LU et al. 1998 Kolonkarzinom 171 IHC 53% KAWASAKI et al. 1998 Blasenkarzinom 36 IHC 78% SWANA et al. 1999 Neuroblastom 72 IHC / IB 47% ADIDA et al. 1999 B-Zell-Lymphom 222 IHC 60% ADIDA et al. 2000 Kolonkarzinom 20 IHC 100% GIANINI et al. 2001 Astrozytom 18 70% Glioblastom 20
RT-PCR 90%
KAJIWARA et al. 2003
Mammakarzinom 293 IHC 60% KENNEDY et al. 2003
Abkürzungen: IB: Immunoblot IHC: Immunhistochemie RT-PCR: Reverse Transkription- Polymerasekettenreakton
26
2.5 Weitere Mechanismen
Neben der Überexpression von P-Glykoprotein und Mitgliedern der MRP-Familie sind
weitere zelluläre Mechanismen beschrieben worden, die in vitro eine Zytostatikaresistenz
vermitteln können (TEW 1994; NITISS u. BECK 1996; LIST 1997 (Tabelle 4). Die
Bedeutung dieser Mechanismen für die Ausprägung von Zytostatikaresistenzen beim Hund ist
weitestgehend unbekannt.
Tabelle 4: Mechanismen, die zur Ausprägung von Zytostatikaresistenzen führen können (modifiziert nach DALTON 1997 und LIST 1997)
Membrantransportmechanismen
P-Glykoprotein
multidrug resistance-associated proteins (MRPs)
lung-resistance protein (LRP)
protein transporter of antigenic peptides (TAP)
DNA-Reparaturmechanismen
Hemmung der Apoptose
P53
BCL-2
Survivin
Alteration der Topoisomerasen
Topoisomerase I
Topoisomerase II
Metabolische Zytostatika-Detoxifikation
Glutathion-S-Transferase-System
27
3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
3.1 Tiere
An malignem Lymphom erkrankte Hunde
In die Studie wurden 50 an malignem Lymphom erkrankte Hunde (Tier-Nr. P1 bis P50) aus
dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule
Hannover aufgenommen. 11 Hunden war im Vorfeld der Studie durch den Haustierarzt eine
Behandlung mit Glukokortikoiden erfolgt (Tabelle 5). Keiner der Patienten hatte vor
Aufnahme in die Studie Zytostatika erhalten.
Tabelle 5: Mit Glukokortikoiden vorbehandelte Hunde. Tier-Nr., verabreichter Wirkstoff, Dosis und Behandlungsdauer
Tier-Nr. Wirkstoff Dosis Dauer
P04 Prednisolon unbekannt 2 Tage
P07 Prednisolon 0,5 mg/kg KGW jeden 2. Tag per os unbekannt
P10 Prednisolon 0,5 mg/kg KGW einmal tägl. per os 4 Tage
P16 unbekannt alle drei Tage parenteral 20 Tage
P27 Dexamethason unbekannt unbekannt
P28 Prednisolon unbekannt 7 Tage
P29 Prednisolon unbekannt >7 Tage
P34 Prednisolon unbekannt 21 Tage
P41 Prednisolon 0,05 mg/kg KGW einmal tägl. per os unbekannt
P44 unbekannt unbekannt unbekannt
P48 Prednisolon unbekannt 8 Tage
28
Kontrolltiere
Als Kontrolltiere standen 9 etwa ein Jahr alte, gesunde Beagle aus dem Institut für
Parasitologie (Tier-Nr. K1 bis K9) sowie 10 zwischen 3 Monate und 9 Jahre alte an
verschiedenen Krankheiten leidende Hunde aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine
Haustiere (Tier-Nr. K10 bis K19) zur Verfügung. (Tabelle 6). Keiner der Kontrolltiere wies
klinische oder anatomisch-pathologische Anzeichen einer Veränderung der Leber bzw. der
Lymphknoten auf. Alle Kontrolltiere wurden vor Aufnahme in die Studie aus einem nicht mit
der Studie im Zusammenhang stehenden Grund mit Pentobarbital euthanasiert.
Tabelle 6: Kontrolltiere aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere. Tier-Nr., Rasse, Alter, diagnostizierte Erkrankungen und verabreichte Medikamente
Tier-Nr. Rasse Alter Diagnosen Medikamente
K10 Neufundländer 4 Jahre Kardiomyopathie -
K11 Boxer 5 Monate Beckenfraktur Antibiotika
K12 Dt. Kurzhaar 8 Jahre Nasentumor Antibiotika
K13 Border Collie 9 Jahre Ösophagusdilatation Antibiotika
K14 Dt. Schäferhund 4 Jahre Darmdrehung Infusion
K15 Rauhaardackel 9 Jahre Mammatumor -
K16 Malteser 6 Jahre Perianalhernie Antibiotika, Caprofen
K17 Berner Sennenhund 4 Jahre Niereninsuffizienz Infusion, Furosemid
K18 Dt. Schäferhund 9 Jahre Analfissur -
K19 Bordeuxdogge 3 Monate Darminvagination Infusion
29
3.2 Diagnose und klinische Stadieneinteilung
Die Diagnose des malignen Lymphoms erfolgte bei 28 der Patienten zytologisch und bei
22 Hunden histopathologisch. Anhand der Befunde der röntgenologischen Untersuchung des
Thorax und Abdomens, Blutbildbestimmung, klinisch-chemischer Blutuntersuchung,
sonographischer Untersuchung des Abdomens und Knochenmarkuntersuchung wurden die
anatomische Form und der Ausbreitungsgrad der Erkrankung bestimmt.
Bei Hunden mit einem multizentrischen Lymphom wurde das klinische Erkrankungsstadium
entsprechend der TNM-Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation (WHO) (OWEN,
1980) (Tabelle 7) beurteilt. Zusätzlich wurde bei allen Patienten das klinische Substadium
bestimmt. Dabei wurden Patienten mit einer Hyperkalzämie, Fieber, Hyphema, Uveitis,
gastrointestinalen und / oder respiratorischen Symptomen in Anlehnung an die Studie von
Moore und Koautoren (MOORE et al. 2001) dem klinischen Substadium b zugeordnet.
Tabelle 7: Klinische Stadieneinteilung beim malignen Lymphom des Hundes nach WHO (OWEN, 1980)
Stadium Definition
I Befall nur eines Lymphknotens oder Organs (mit Ausnahme des Knochenmarks)
II Befall zahlreicher Lymphknoten einer Körperregion (± Tonsillen)
III generalisierter Lymphknotenbefall
IV Befall von Milz und/oder Leber (± Stadium III)
V Befall von Blut und / oder Knochenmark und / oder anderen Organsystemen (± Stadium I-IV)
Substadium a ohne Allgemeinsymptome
Substadium b mit Allgemeinsymptomen
30
3.3 Chemotherapie
Eine Chemotherapie erfolgte bei 25 der an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Initial
wurde bei allen Patienten eine Kurzzeit-Kombinationtherapie (Tabelle 8) durchgeführt. Von
den Hunden, die im Verlauf der Studie ein Tumorrezidiv entwickelten, wurden 7 erneut
chemotherapeutisch behandelt. 3 Patienten erhielten eine Kurzzeit-, 3 eine Langzeit-
Kombinationschemotherapie (Tabelle 9, Seite 31) und ein Hund Cytarabin und Carboplatin.
Tabelle 8: Kurzzeit-Kombinationstherapie der Spezialistengruppe für Onkologie der Fachgruppe für Kleintierkrankheiten (FK) der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG)
Woche L-Asp1 VCR CTX2 ADM1, 3 Pred
1 X X X
2 X X
3 X X
4 X X
5 X X
6 X X
7 X X
8 X X
9 X X
10 X X
11 X X
12 X X
ADM: Doxorubicin; 30 mg/m² KOF, einmalig i.v. L-Asp: L-Asparaginase; 400 I.E./kg KGW, einmalig s.c. CTX: Cyclophosphamid; 200 mg/m² KOF, einmalig i.v. Pred: Prednisolon; 50 mg/m² KOF, einmal täglich per os über drei Tage VCR: Vincristin; 0,7 mg/m² KOF, einmalig i.v. 1 30 min vor der Injektion: Dexamethason 1mg/kg KGW i.v. 2 in Kombination mit Mesna (40% der Cyclophosphamid-Einzeldosis; 0, 4 und 8 h nach Gabe von Cyclophosphamid, einmalig per os) 3 bei Patienten mit Anzeichen einer dilatativen Kardiomyopathie oder bei Erreichen einer Doxorubicin-Gesamtdosis von 180 m² KOF alternativ Mitoxantron 6 mg/m² KOF, einmalig i.v.
31
Tabelle 9: Langzeit-Kombinationstherapie der Spezialistengruppe für Onkologie der Fachgruppe für Kleintierkrankheiten (FK) der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG)
Woche L-Asp1 VCR CTX ADM1, 2 MTX Pred
Induktion
1 X X X
2 X X
3 X X
4 X
5 X
6 X
Erhaltung: Zyklus 1
8 X
10 X
12 X
14 X
Zyklus 2: Zyklus 1 bis Woche 52 wiederholen
Zyklus 3: Zyklus 1 im 3-Wochen-Abstand bis Woche 104 wiederholen
Zyklus 4: Zyklus 1 im 4-Wochen-Abstand bis Woche 130 wiederholen
ADM: Doxorubicin; 30 mg/m² KOF, einmalig i.v. L-Asp: L-Asparaginase; 400 I.E./kg KGW, einmalig s.c. CTX: Cyclophosphamid; 200 mg/m² KOF, einmalig i.v. Pred: Prednisolon; Woche 1: 30 mg/m² KOF, einmal täglich per os Woche 2: 20 mg/m² KOF, einmal täglich per os Woche 3: 10 mg/m² KOF, einmal täglich per os VCR: Vincristin; 0,7 mg/m² KOF, einmalig i.v. MTX Methotrexat: 0,7 mg/kg KGW i.v., maximale Gesamtdosis 25 mg 1 30 min vor der Injektion: Dexamethason 1mg / kg KGW i.v. 2 bei Patienten mit Anzeichen einer dilatativen Kardiomyopathie oder bei Erreichen einer Doxorubicin-Gesamtdosis von 180 mg/m² KOF alternativ Mitoxantron 6 mg/m² KOF, einmalig i.v.
32
3.3.1 Beurteilung des Therapieerfolges
Therapieantwort
Die Therapieantwort wurde als komplette Remission (CR), partielle Remission (PR) oder
keine Remission (stationäres Tumorverhalten oder Progression) beurteilt (Tabelle 10). Zur
Bewertung der Therapieantwort wurde bei Hunden mit einem multizentrischen Lymphom
eine Palpation der oberflächlichen Körperlymphknoten, bei Patienten mit einem
gastrointestinalen Lymphom zusätzlich eine sonographische Untersuchung des Abdomens
durchgeführt.
Tabelle 10: Schema und Kriterien zur Beurteilung der Therapieantwort (modifiziert nach WILMANNS 2001)
Therapieantwort Definition
Komplette Remission (CR) Vollständiger Rückgang aller Tumorzeichen. Bestätigung nach 3 Wochen erforderlich.
Partielle Remission (PR) Rückgang aller Tumorparameter um mindestens 50% der initialen Größe. Bestätigung nach 3 Wochen erforderlich.
Stationäres Tumorverhalten Tumorrückgang um weniger als 50 % oder Zunahme um weniger als 25 %. Keine neuen Tumormanifestationen.
Progression Tumorzunahme um über 25 % oder Auftreten neuer Tumormanifestationen.
Rezidivfreies Intervall (RFI) Bei Patienten mit einer kompletten oder partiellen Remission wurde das rezidivfreie Intervall
(RFI) als Zeitspanne zwischen dem Tag der ersten chemotherapeutischen Behandlung und der
Diagnose eines Tumorrezidivs bestimmt.
33
3.4 Entnahme und Lagerung der Proben
Die Entnahme der Proben für die Untersuchung der Genexpression erfolgte unter sterilen
Kautelen mittels Feinnadelaspiration oder mittels Inzisionsbiopsie unter Allgemeinanästhesie
(Tier-Nr. P19 und P20) bzw. nach Euthanasie mit Pentobarbital (Tier-Nr. K1 bis K20, P02 bis
P06, P21 und P25). Bei den Kontrolltieren und den Lymphompatienten P02 bis P06, P21 und
P25 wurden die Gewebeproben innerhalb von 20 min nach Eintritt des Todes im Rahmen
einer Sektion entnommen. Die Proben wurden unmittelbar nach der Entnahme in 1,5 ml
Kryoröhrchen überführt, in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bis zur weiteren
Bearbeitung bei -80 °C gelagert.
Für die Immunphänotypisierung der Lymphome wurden Feinnadelaspirate entnommen,
umgehend in 1 ml RPMI suspendiert und bei Raumtemperatur gelagert.
Die Entnahme der Proben für die histologische und immunhistologische Untersuchung
erfolgte mittels Tru-cut-Biopsie bzw. Inzisionsbiopsie im Rahmen der initialen Diagnostik.
Die Proben wurden in 10 %igem, neutral gepuffertem Formalin (Rezeptur siehe Anhang S.
128) fixiert. Die Entwässerung in einer aufsteigenden Alkoholreihe und Paraffineinbettung
erfolgte automatisiert. Die Paraffinblöcke wurden bis zur weiteren Bearbeitung bei
Raumtemperatur gelagert.
3.5 Immunphänotypisierung
Zur Immunphänotypisierung der Lymphome wurden hundespezifische Antikörper gegen
verschiedene T-Lymphozytenantigene (CD3, CD4, CD5, CD8) sowie hundespezifische B-
Lymphozytenmarker (anti B-cells, anti IgM) verwendet. Die Tumorzellen wurden in drei
verschiedenen Ansätzen (zwei Doppel-, eine Dreifachfärbung) gefärbt (Tabelle 11).
Pro Färbeansatz wurden 100 µl der Probensuspension (5 bis 10 x 105 Zellen) mit jeweils 5 µl
der unverdünnten Primärantikörper für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln in einem
Plastikzentrifugenglas inkubiert. Die Proben wurden mit 1 ml Cellwash® (Fa. Becton
Dickinson) für 5 min bei 300 x g gewaschen. Der Ansatz der Dreifachfärbung wurde
anschließend mit 5 µl des unverdünnten Sekundärantikörpers (PerCP-konjugiertes anti Maus
IgG1) für 15 min im Dunklen inkubiert. Etwaige Erythrozyten wurden mittels
einfachkonzentrierter FACS Lysing Solution® (Fa. Becton Dickenson) für 10 min lysiert.
34
Die Proben wurden für 5 min bei 300 x g zentrifugiert, der Überstand verworfen und die
Zellen einmal mit 1 ml Cellwash® gewaschen. Die Zellen wurden in 250 µl 1x CellFix™ (Fa.
Becton Dickinson) fixiert. Pro Ansatz wurden mindestens 5.000 Zellen analysiert
(FACSCalibur®, Fa. Becton Dickinson).
Die Messdaten wurden mit Hilfe der Software Cellquest® (Fa. Becton Dickinson)
ausgewertet. Zunächst wurden die Zellen anhand der gemessenen Vorwärts- und
Seitwärtsstreulichtintensitäten als Punkthistogramm (Streulichtdiagramm) dargestellt.
Anschließend wurde ein Auswertungsfenster (engl. gate) um die Zellen gelegt (Ausschluss
von Zelltrümmern). Anhand der mitgeführten Negativkontrolle (Ansatz 1) wurde die
Autofluoreszenz bzw. die durch unspezifische Bindung verursachte Fluoreszenz der Zellen
bestimmt. Bei der Auswertung der nachfolgenden Färbungen (Ansatz 2 bis 4) wurden alle
Zellen mit einer höheren Fluoreszenzintensität als der in der Negativkontrolle gemessenen
Intensität (Ansatz 1) als positiv bewertet. Lymphome, bei denen über 80 % der Zellen mit
Antikörpern gegen caCD3, caCD4, caCD8 und /oder caCD5 reagierten, wurden der T-Zell-
Linie zugeordnet. Als B-Zell-Lymphome wurden Tumoren klassifiziert, bei denen über 80 %
der Zellen mit Antikörpern gegen kanine B-Zellen und / oder IgM reagierten.
Tabelle 11: Durchgeführte Färbungen zur Immunphänotypiesierung der Lymphome
Ansatz Antikörperspezifität Fluorochrom
1 Maus IgG1 PerCP
caCD45 PE 2
caIgM FITC
caCD4 FITC
caCD8 PE 3
caCD3 PerCP
caCD5 FITC 4
caB cells PE
Abkürzungen: ca: kanine PE: Phycoerythrin CD: cluster of differentiation PerCP: Peridin-Clorophyll-a-Proteinkomplex FITC: Fluoreszeinisothyocyanat
35
3.6 Immunhistochemischer Nachweis von P-Glykoprotein
Probenaufbereitung
Das Schneiden der in Paraffin eingebetteten Gewebeproben erfolgte mit einem
Schlittenmikrotom (Mikrotom HM400, Fa. Microm) bei einer eingestellten Schnittdicke von
2 µm. Die Paraffinschnitte wurden in 40 °C warmem, destilliertem Wasser gestreckt (Paraffin
Streckbad TFB45, Fa. Medite Medizintechnik), auf Objektträger (Superfrost® Plus, Fa.
Menzel-Gläser) aufgezogen und für 60 min bei 65 °C im Trockenschrank getrocknet.
Immunhistochemische Färbung
Die getrockneten Schnitte wurden dreimal für 5 min in Roticlear® (Fa. Roth) entparaffiniert,
in einer absteigenden Alkoholreihe (5 min in 100%igem Isopropanol, je 2 bis 3 min in
96%igem Ethanol und 70%igem Ethanol) rehydriert und in 0,05 molarer phosphatgepufferter
Kochsalzlösung (PBS) (Herstellung und Zusammensetzung siehe Anhang, Seite 128) dreimal
für 5 min gewaschen.
Zur Antigendemaskierung wurden die Schnitte 10 min in Citratpuffer (0,01 molar, pH-Wert
6,0) bei 600 Watt in einem Mikrowellenherd gekocht. Nach einer Abkühlungszeit von 15 min
bei Raumtemperatur wurden die Schnitte dreimal in PBS für 5 min gewaschen. Zur
Hemmung der endogenen Peroxidase wurden die Schnitte für 30 min in 1,5%igem
Wasserstoffperoxid in Methanol (≤99,8%) inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte
dreimal für 5 min in PBS gewaschen, in Coverplates (Fa. Shandon) überführt und für 20 min
bei Raumtemperatur mit 1:5 mit PBS verdünntem Ziegennormalserum überschichtet.
Die Inkubation der Schnittpräparate mit dem Primärantikörper erfolgte über Nacht (12 - 18 h)
bei 4 °C. Als Primärantikörper zum Nachweis von P-Glykoprotein wurde ein monoklonaler
Antikörper gegen menschliches P-Glykoprotein (Klon C219) verwendet. Seine Anwendung
zum P-Glykoproteinnachweis beim Hund wurde erstmals von GINN 1996 beschrieben. Der
Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:200 eingesetzt. Als Verdünnungsmedium wurde
PBS plus 0,05 % Tween-20 plus 1 % bovines Serumalbumin (BSA) verwendet. Am nächsten
Tag wurden die Schnittpräparate dreimal für 5 min in PBS plus 0,05 % Tween-20 gewaschen
36
und mit dem biotinylierten Sekundärantikörper (Ziege anti Maus IgG, Fa. Vektor
Laboratories; 1:200 mit PBS verdünnt) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach
wurden die Schnitte erneut dreimal für 5 min in PBS gewaschen.
Die Ansetzung des Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes (Fa. Vector Laboratories) erfolgte
nach Herstellerangaben (siehe Anhang, Seite 128). Die Schnitte wurden 30 min bei
Raumtemperatur mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex inkubiert, dreimal für 5 min in
PBS gewaschen und in Küvetten überführt.
Als Chromogen wurde 3,3 Diaminobenzidin (DAB) verwendet. Die Schnitte wurden in
0,05%iger Diaminobenzidin-Lösung mit Wasserstoffperoxid als Katalysator (Rezeptur siehe
Anhang, Seite 128) für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und mindestens 20 min unter
fließendem Leitungswasser gewaschen. Zur Gegenfärbung wurden die Schnitte anschließend
5 min in Hämalaun nach MEYER (Rezeptur siehe Anhang, Seite 128) eingestellt und 10 min
unter fließendem Leitungswasser gebläut. Zuletzt wurden die Schnitte in einer aufsteigenden
Alkoholreihe (70%iges Ethanol, 96%iges Ethanol, 100%iges Isopropanol) dehydriert, dreimal
für 5 min in Roticlear® (Fa. Roth) eingestellt und mit Roti® Histokitt (Fa. Roth) eingedeckt.
Kontrollen
Als positive Gewebekontrolle wurde in jeder Serie unverändertes Lebergewebe mitgeführt.
Zur Überprüfung unspezifischer Reaktionen wurde der Primärantikörper durch eine negative
Reagenzienkontrolle (Maus IgG2a) ersetzt.
Lichtmikroskopische Beurteilung
Die Auswertung der immunhistochemischen Reaktionsergebnisse erfolgte mit einem
Standard-Binokular-Lichtmikroskop bei 100-, 200- und 400-facher Vergrößerung.
37
3.7 Molekularbiologische Untersuchungen
3.7.1 Isolierung von Gesamt-RNA
Inzisionsbiopsien
Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den Inzisionsbiopsien wurde das Verfahren der Phenol-
Chloroform-Extraktion verwendet. Etwa 100 mg der Gewebeprobe wurden in einem
Porzellantiegel in flüssigem Stickstoff mit einem Pistill zerrieben und in 2 ml TRIzol®
Reagent (Fa. Invitrogen) suspendiert. Zum Scheren der DNA wurde die Gewebesuspension
zehnmal durch eine 18’Einmalkanüle in eine Einmalspritze aufgezogen. 1 ml des
Homogenisates wurde mit 0,2 ml Chloroform (99%) in einem 1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß
vermischt, für 3 min bei Raumtemperatur inkubiert und für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C
zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde unter Vermeidung der Interphase in ein neues
1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß überführt, mit 0,5 ml Isopropanol (≥99,7%) für 10 min bei
Raumtemperatur inkubiert und für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C zentrifugiert. Das RNA-
Pellet wurde in 75%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 100 µl DEPC behandeltem
destilliertem Wasser (siehe Anhang S. 129) für 2 min im Wasserbad bei 70 °C gelöst. Die
Proben wurden in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bei -80 °C gelagert.
Feinnadelaspirate (FNA)
Zur Isolierung der Gesamt-RNA aus den Feinnadelaspiraten wurde ein von der Firma Qiagen
entwickelter Kit (RNeasy® Mini Kit) verwendet. Die FNA wurden in 600 µl Buffer RLT
(RNeasy® Mini Kit) suspendiert. Die Probensuspension wurde auf eine QIAshredder™-
Spinsäule pipettiert und für 3 min bei 10.000 x g in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen
zentrifugiert. Das Lysat wurde mit 600 µl 70%igem Ethanol in einem
1,5-ml-Mikroreaktionsgefäß vermischt. 700 µl der Probe wurden auf eine Rneasy®-Spinsäule
(RNeasy® Mini Kit) pipettiert und bei 10.000 x g 15 sec bei Raumtemperatur in einem
2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Das Lysat wurde verworfen und der Vorgang
mit dem restlichen Probenvolumen wiederholt.
38
Die Säule wurde in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und nacheinander mit
700 µl RW1 Puffer (RNeasy® Mini Kit) für 15 sec, mit 500 µl RPE Puffer (RNeasy® Mini
Kit) für 15 sec und mit 500 µl RPE Puffer für 2 min bei 10.000 x g gewaschen. Nach jedem
Waschschritt wurde das Mikrozentrifugenröhrchen gewechselt. Anschließend wurde die
Säule für 1 min bei 10.000 x g getrocknet. Zur Elution der Gesamt-RNA wurde 50 µl DEPC
behandeltes destilliertes Wasser auf die Säule pipettiert und die Säule für 1 min bei 10.000 x g
zentrifugiert. Das Eluat wurde in ein 0,5-ml-Mikroreaktionsgefäß überführt, in flüssigem
Stickstoff kryokonserviert und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.
Bestimmung der Konzentration an Gesamt-RNA
Die Bestimmung der Gesamt-RNA-Konzentration erfolgte über die Messung der optischen
Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels Absorptionsspektrophotometrie (siehe
Anhang, Seite 129).
3.7.2 DNase-Behandlung
20 µg Gesamt-RNA wurden mit 10 Units DNase (RQ1 RNase-Free DNase®, Fa. Promega)
und 10 µl RQ1 DNase 10 x Reaction Buffer (Bestandteil des RQ1 RNase-Free DNase®-Kits)
in einem Reaktionsvolumen von 100 µl für 60 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde
durch Zugabe von 10 µl RQ1 DNase Stop Solution (Bestandteil des RQ1 RNase-Free
DNase®-Kits) beendet und die DNase durch Inkubation der Proben für 10 min bei 65 °C
inaktiviert.
3.7.3 Reinigung der Gesamt-RNA
Die Reinigung der Gesamt-RNA erfolgte mittels RNeasy® Mini Kit (Fa. Qiagen). 100 µl der
RNA-Lösung wurden mit 350 µl Buffer RLT (RNeasy® Mini Kit) und 250 µl 96%igem
Ethanol vermischt, in eine RNeasy®-Spinsäule überführt und bei 10.000 x g für 15 sec in
einem 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Die Säule wurde mit je 500 µl Buffer
RPE (RNeasy® Mini Kit) für 15 sec bzw. 2 min bei 10.000 x g gewaschen und anschließend
für 1 min bei 10.000 x g getrocknet.
39
Zur Elution der Gesamt-RNA wurde 50 µl DEPC behandeltes destilliertes Wasser auf die
Säulenmembran pipettiert und die Säule für 1 min bei 10.000 x g zentrifugiert. Das Eluat
wurde in ein 0,5 ml-Mikroreaktionsgefäß überführt und umgehend in flüssigem Stickstoff
kryokonserviert. Die Gesamt-RNA-Konzentration (siehe Anhang, Seite 129) wurde über die
Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels
Absorptionsspektrometrie bestimmt. Die Lagerung der isolierten Gesamt-RNA erfolgte bei -
80 °C.
3.7.4 Reverse Transkription (RT)
Die gereinigte Gesamt-RNA wurde in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Als
Reverse Transkriptase wurde bis November 2001 Superscript II™ Reverse Transcriptase
(Fa. Invitrogen) und anschließend Omniscript™ Reverse Transcriptase (Fa. Qiagen)
verwendet.
Sofern ausreichende Mengen Gesamt-RNA nach der Isolierung vorlagen, wurden pro
20 µl-Reaktionsvolumen 1 µg Gesamt-RNA umgeschrieben. Bei sechs Feinnadelaspiraten
lagen die isolierten Gesamt-RNA-Mengen unter 0,1 µg/µl bzw. 0,05 µg/µl. Bei diesen Proben
wurden 0,5 µg (Tier-Nr. P18, P24, P41 bei Diagnose) bzw. 0,4 µg Gesamt-RNA (Tier-Nr.
P08, P13, P14 bei Diagnose und P09 beim 1. Rezidiv) als Template für die RT eingesetzt.
Für die RT mittels Superscript II Reverse Transcriptase® wurde 1 µg Gesamt-RNA mit
destilliertem Wasser auf 11 µl aufgefüllt und mit 1 µl Random Hexamers (250µg/ml) für
10 min bei 25 °C inkubiert. Anschließend wurde das Reaktionsgefäß wurde auf Eis gestellt,
4 µl 5x First Strand Buffer, 2 µl 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 1 µl RNaseOUT™ (10 units / µl)
und 1 µl 10 mM dNTP zugegeben und für 2 min bei 42 °C inkubiert. Nach der Zugabe von
1 µl Superscript II™ Reverse Transcriptase erfolgte eine weitere Inkubation für 50 min bei
42 °C. Anschließend wurde die Reverse Transkriptase für 15 min bei 70 °C inaktiviert.
Für die RT mittels Omniscript™ Reverse Transcriptase (Fa.Qiagen) wurde 1 µg Gesamt-RNA
mit destilliertem Wasser auf 13 µl aufgefüllt und mit 1 µl Random Hexamers (250µg/ml),
2 µl 10x First Strand Buffer, 1 µl RNaseOUT™ (10 units / µl), 2 µl 5 dNTP und
1 µl Omniscript™ Reverse Transkriptase für 10 min bei 25 °C und anschließend für 60 min
bei 37 °C inkubiert. Die Reverse Transkriptase wurde für 5 min bei 93 °C inaktiviert. Die
cDNA wurde bei -20 °C gelagert.
40
3.7.5 Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression
Die Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression erfolgte mittels real-time
RT-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Als Housekeeping-Gen wurde
Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT) verwendet.
3.7.5.1 Primer- und Sondendesign
Die Primer und Sonden für die RT-qPCR wurden mit Hilfe der Software ABI PRISM®
Primer Express (Fa. PE Applied Biosystems) ausgewählt (Tabelle 12).
Tabelle 12: Sequenzen und Schmelztemperaturen (Tm) der Primer und Sonden für die RT-qPCR
Abkürzungen und Fußnoten: AP: Antisense-Primer FAM: 6-Carboxyfluorescein SP: Sense-Primer TAMRA: 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin * bei 100 mM Na+ MGB: Minor-groove-binder
Oligonukleotid Sequenz (5’→ 3’) Tm*
MDR1 Sonde FAM-CCAGAAAAGGCCGGACTACCATTGTGA-TAMRA 77,1 °C
MDR1 SP CAGTGGTTCAGGTGGCCCCT 68,5 °C
MDR1 AP CGAACTGTAGACAAACGATGAGCT’ 67,0 °C
MRP1 Sonde FAM-AGAAAGAGGCTCCCTGGCAAATCCA– TAMRA 75,7 °C
MRP1 SP TGGAGAGGCTGAAGGAGTAT 61,5 °C
MRP1 AP CGTTGATGGTGATGTTGATGT 64,3 °C
MRP2 Sonde FAM-ATTCACGGCCTCATTT-MGB 56,8 °C
MRP2 SP AAGATGCCTCCTCAAATAATCCAT 66,3 °C
MRP2 AP TCATACCAACTAAACGTAATGCTACTCA 68,1 °C
HPRT Sonde FAM-CTTGATTGGTTGAAGATCTCATTGACACAGGCA-TAMRA 76,9 °C
HPRT SP GAGATGACCTCTCAACTTTAACTGAAAA 66,5 °C
HPRT AP GGGAAGCAAGGTTTGCATTG 69,9 °C
41
Die mRNA-Sequenzen wurden der Genbank entnommen (kanines HPRT: Genbank-Nr.
CFU16661; kanines MDR1: Genbank-Nr. AF045016; kanines MRP1: Genbank-Nr.
AF403241 und kanines MRP2: Genbank-Nr. CFA18220). Für die Messung der MDR-,
MRP1- und HPRT-Genexpression wurden TaqMan®-Sonden, für den Nachweis von MRP2
Minor groove binder-Sonden eingesetzt. Als Reporterfarbstoff wurde 6-Carboxyfluorescein
(FAM), als Quencherfarbstoff 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin (TAMRA) verwendet. Die
Amplikonlänge betrug für den Nachweis von HPRT 89 bp, für MDR1 79 bp, für MRP1
174 bp und für MRP2 70 bp. Alle Sonden und Primer wurden über die Firma Applied
Biosystems bezogen.
3.7.5.2 Herstellung der Standards für die qPCR
Die Herstellung der Standards für die qPCR erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion. Die
erforderlichen Primer (Tabelle 13) wurden so konstruiert, dass die Sequenz des jeweiligen
PCR-Produktes die Zielsequenz der jeweiligen qPCR einschloss. Die PCR-Produkte waren
123 bp (HPRT), 224 bp (MDR1), 369 bp (MRP1) und 616 bp (MRP2) lang.
Tabelle 13: Sequenzen und Schmelztemperatur (Tm) bei 100 mM Na+ der Primer (AP: Antisense-Primer; SP: Sense-Primer) für die Herstellung der Standards für die RT-qPCR
Primer Sequenz (5’→ 3’) Tm*
Standard MDR1 SP CCACAATGACTCCATCATC 62,4 °C
Standard MDR1 AP CAGAGAATCGCCATTGCT 59,4 °C
Standard MRP1 SP AGTGTGTGGGCAACTGCAT 67,2 °C
Standard MRP1 AP CCACGATGCCCACCTTT 65,5 °C
Standard MRP2 SP CCTTGGGTTTCCTTTGGC 65,4 °C
Standard MRP2 AP AACTTGCTGACCAGTGCCTTG 67,7 °C
Standard HPRT SP ATAAAAGTAATTGGTGGAGATG 57,8 °C
Standard HPRT AP ATTATACTGCGCGACCAAG 61,5 °C
42
Die PCR-Reaktion erfolgte für jeden Standard in zehnfachem Ansatz (inklusive
Negativkontrollen). Als Template wurde aus Lebergewebe gesunder Hunde isolierte cDNA
verwendet. In jedem Ansatz waren 200 µM dNTP, 1,6 mM MgCl2, 1 µl des jeweiligen
Templates und 200nM der jeweiligen Primer in 50 µl 1 x Buffer enthalten. Nach der initialen
Denaturierung (2 min bei 94,5 °C) wurden jedem Ansatz 2,5 Units Taq DNA Polymerase (Fa.
Promega) zugesetzt (Hot-Start-PCR). Insgesamt wurden 35 Zyklen (Denaturierung für 45 sec
bei 94,5 C°, Annealing für 45 sec bei 55 °C, Elongation für 2 sec im ersten Zyklus zuzüglich
2 sec Zeitinkrement je Folgezyklus bei 72 °C) durchgeführt. Die PCR wurde mit einer
Elongation (10 min bei 72 °C) beendet.
200 µl des jeweiligen PCR-Produktes wurden mit 20 µl 3 M Natriumacetat (pH-Wert 7) und
550 µl Ethanol (>99,8 %, -20 °C) über Nacht bei -20 °C inkubiert. Anschließend wurde die
Probe für 10 min bei 12.000 x g zentrifugiert und das Pellet in 35 µl autoklaviertem dest.
Wasser gelöst. Die elektrophoretische Auftrennung des PCR-Produkts erfolgte in einem
1%igen Agarosegel (Herstellung des Gels siehe Anhang Seite 129). Die gewünschte DNA-
Bande wurde unter UV-Lichtexposition mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten. Etwa
100 g des ausgeschnittenen Gelstücks wurden mit 300 µl Buffer QG (QIAqick® Gel
Extraction Kit) für 10 min bei 50 °C unter gelegentlichem Mischen in einem Wasserbad
inkubiert. Die Probelösung wurde mit 100 µl Isopropanol (≥99,7%) vermengt, in eine
Glasmilchsäule (QIAquick® Gel Extraction Kit) überführt und für 1 min bei 10.000 x g in
einem Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule
je einmal mit 500 µl Buffer QB und 750 µl Buffer PE (QIAqick Gel Extraction Kit®) für
1 min bei 10.000 x g gewaschen. Der Durchlauf wurde verworfen und die Säule für 1 min bei
10.000 x g getrocknet. Die Säule wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Zur
Elution der DNA wurden 50 µl autoklaviertes dest. Wasser auf die Säulenmembran pipettiert
und die Säule für 1 min bei 10.000 x g zentrifugiert.
Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte über die Messung der optischen Dichte
(OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mittels Absorptionsspektrophotometrie. Aus der
DNA-Konzentration wurde die Anzahl an PCR-Produkten errechnet (Formel siehe Anhang
Seite 129). Für jedes Gen wurden Standardverdünnungsreihen um den Faktor 10 mit einer
Kopienzahl von100 bis 108 Kopien pro µl erstellt. Die internen Standards wurden aliquotiert
und bei -20 °C gelagert.
43
3.7.5.3 Durchführung der RT-qPCR
Die real-time RT-qPCR wurde mittels Mx4000™ Multiplex Quantitative PCR System der Fa.
Stratagene durchgeführt. Zusätzlich zur Expression des jeweiligen Gens wurde in jedem Lauf
die Expression des Housekeeping-Gens HPRT in den Proben gemessen.
In jedem PCR-Lauf wurden Standardverdünnungsreihen für das jeweilige Gen und für HPRT
(MDR1, MRP1 und HPRT: 103 bis 108 Kopien; MRP2: 101 bis 106) mitgeführt. Die Proben
und die Negativkontrollen wurden in jedem Lauf in Dreifach-Ansätzen, die
Standardverdünnungen in Zweifach-Ansätzen gemessen. Alle Messungen wurden einmal
wiederholt.
Als Reaktionsgefäß wurden MicroAmp Optical 96-well plates (Fa. Stratagene) verwendet, die
mit MicroAmp Optical caps (Fa. Stratagene) verschlossen wurden.
Die Komponenten für den Reaktionsansatz wurden einem entsprechenden Kit (Brilliant™
Quantitative PCR Core Reagent Kit, Fa. Stratagene) entnommen. In einem PCR-
Reaktionsvolumen von 25 µl waren 80 µM dNTP mix, 5 mM MgCl2, 300 nM der jeweiligen
Primer, 100 nM der jeweiligen Sonde, 75 nM 6-Carboxy-X-Rhodamin (ROX) als
Referenzfarbstoff und 0,025 units / µl SureStart™ Taq DNA Polymerase in 1x PCR-Puffer
enthalten.
An eine initiale Denaturation über 10 min bei 95 °C schlossen sich 40 PCR-Zyklen mit 15 sec
bei 95 °C (Denaturation) und 1 min bei 61 °C (MDR1) bzw. 60 °C (MRP2) oder 59 °C
(MRP1) an (Anlagerung und Verlängerung).
44
3.7.5.4 Auswertung der RT-qPCR
Die Auswertung erfolgte für jeden PCR-Lauf separat unter Verwendung der dem Gerät
zugehörigen Software.
Zunächst wurde aus den in den ersten PCR-Läufen erhobenen Messdaten für jeden Ansatz
eine Grundlinie (baseline) bestimmt. Die Festlegung der Spannweite der PCR-Zyklen für die
Erstellung der baseline erfolgte Software-gesteuert (Software-Einstellung: adaptive baseline).
Durch Subtraktion des Wertes der Gradenfunktion der baseline von den in den Ansätzen in
den PCR-Zyklen gemessenen Fluoreszenzintensitäten wurden die baseline korrigierte
Fluoreszenz (dR) und hinterher als Quotient der dR von Reporterfarbstoff und
Referenzfarbstoff (ROX) das sogenannte normalisierte baseline-korrigierte Reportersignal
(dRn) berechnet.
Anschließend wurde anhand der in fünf der ersten zehn PCR-Zyklen gemessenen
Fluoreszenzintensitäten (Hintergrundfluoreszenz) der sogenannte Grenzwert (Threshold)
bestimmt und für jeden Ansatz der Threshold Cycle (Ct-Wert), d.h. der PCR-Zyklus, bei dem
die dRn den Grenzwert erstmals übersteigt, ermittelt.
Zur Bestimmung der Ausgangskopienzahl in den Proben wurde mittels der Software eine
Standardkurve erstellt. Die Ct-Werte der jeweiligen Standardverdünnungen wurden gegen die
logarithmierte Kopienzahl aufgetragen und die Standardkurve algorithmisch generiert. Aus
der Gradengleichung wurden die Effizienz der Amplifikation und die Ausgangskopienzahl in
den Proben durch Interpolation bestimmt.
Aus den in der gleichen Probe (dreifacher Ansatz) im selben Lauf ermittelten Ct-Werten bzw.
cDNA Kopienzahlen wurden der arithmetischer Mittelwert (MW) und die
Standardabweichung (SD) berechnet. Die mittlere Kopienzahlen des jeweiligen Gens wurden
durch die im selben Lauf in der gleichen Probe ermittelten Kopienzahlen des
Housekeeping-Gens (HPRT) geteilt. Zuletzt wurde aus den in zwei separaten Läufen
ermittelten normalisierten Kopienzahlen für MDR1, MRP1 bzw.MRP2 der MW und die SD
berechnet.
45
3.7.6 Nachweis von Survivin mRNA in kaninem Gewebe
Die Untersuchung der Survivin-Expression in kaninem Gewebe erfolgte mittels RT-PCR.
Die kanine Survivin mRNA- Sequenz wurde der Genbank (Genbank-Nr. AB095108)
entnommen. Die Primerpaare, SURV1 bis SURV3 (Tabelle 14), wurden aus
Sequenzabschnitten ausgewählt, bei denen gemäß den in der Genbank enthaltenen Sequenzen
eine 100% Homologie zwischen Mensch und Hund besteht.
Als Positivkontrolle dienten menschliches Kolonkarzinomgewebe, kanines Plazentagewebe
sowie genomische DNA (c=50ng/ml) von Mensch und Hund. Für die Negativkontrollen
wurde das jeweilige Template durch ein identisches Volumen an destilliertem Wasser ersetzt.
In jedem PCR-Ansatz waren 200 µM dNTP, 1,6 mM MgCl2, 1 µl des jeweiligen Templates
und 200nM der jeweiligen Primer in 50 µl 1 x Buffer enthalten. Nach der initialen
Denaturierung (2 min bei 94,5 °C) wurden jedem Ansatz 2,5 Units Taq DNA Polymerase
zugesetzt (Hot-Start-PCR). Insgesamt wurden 35 Zyklen (Denaturierung für 45 sec bei
94,5 C°, Annealing für 45 sec bei 55 °C (SURV1 60°C), Elongation für 2 sec im ersten
Zyklus, zuzüglich 2 sec Zeitinkrement je Folgezyklus bei 72 °C) durchgeführt. Die PCR
wurde mit einer Elongation (10 min bei 72 °C) beendet.
Die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in einem 1%igen Agarosegel.
Etwaige Banden wurden unter UV-Lichtexposition (BiodocAnalyserSystem, Biometra)
beurteilt und fotografiert.
Tabelle 14: Primer (SP: Sense Primer; AP: Antisense Primer) für den Nachweis von Survivin mRNA. Sequenz, Produktlänge und Schmelzpunkt (Tm) bei 100 mM Na+
Oligonukleotid Sequenz (5’→ 3’) Produktlänge Tm
SURV1 SP GCATGGGTGCCCCGACGTTG 73,2 °C
SURV1 AP GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA 448 bp
71,3 °C
SURV2 SP TGCCCCGACGTTGCC 62,9 °C
SURV2 AP CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT 69 bp
64,2 °C
SURV3 SP GGTAACAGTGGCTGCTTCTCTC 59,5 °C
SURV3 AP TCTAGCAAAAGGGACACTGCCT 120 bp
60,1 °C
46
3.8 Statistische Auswertung
Zur statistischen Auswertung wurde das Programm SPSS verwendet.
Die in den verschiedenen Stichproben ermittelten normalisierten MDR1, MRP1 und MRP2
mRNA Kopienzahlen wurden mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung
geprüft.
Zum Vergleich der Höhe der Genexpression zwischen den Kontrollgeweben (Leber versus
Lymphknoten) und zwischen den Kontrolltieren (Beagle versus Klinikpatienten) wurde der t-
Test nach Student verwendet.
Mit Hilfe des Korrelationskoeffizienten nach Pearson wurde der Zusammenhang zwischen
der Höhe der MDR1, bzw. MRP1-Genexpression in Leber- und Lymphknotengewebe
bestimmt.
Zum Vergleich der Höhe der MDR1- bzw. MRP1-Genexpression zwischen Patienten mit
unterschiedlichen Krankheitscharakteristika (Immunphänotyp, anatomische Form und
Vorbehandlungsstatus) wurde der U-Test nach Mann und Whitney und zum Vergleich der
Höhe der MDR1- bzw. MRP1-Genexpression zwischen verschiedenen Messzeitpunkten
(Diagnosestellung und 1. Rezidiv) der Wilcoxon-Test verwendet.
Der Zusammenhang zwischen einer Hyperkalzämie und dem Immunphänotyp sowie
zwischen dem Erreichen einer kompletten Remission und der Höhe der MDR1- bzw. MRP1-
Genexpression wurde mit dem Fishers exakter Test evaluiert.
Für die Überlebensanalyse wurden die Hunde, die sich bei Ende der Studie in Remission
befanden bzw. bei denen keine Informationen über den Gesundheitsstatus zum Ende der
Studie vorlagen, zensiert. Zur Darstellung des zeitlichen Verlaufs des rezidivfreien
Überlebens wurden eine Kaplan-Meier-Überlebenskurven erstellt und das mittlere RFI sowie
das zugehörige 95% Konfidenzintervall des Medians nach der Methode von Kaplan-Meier
berechnet (KAPLAN 1958). Zum Vergleich der Dauer des rezidivfreien Überlebens zwischen
verschiedenen Patientengruppen wurde der Lok-Rang-Test verwendet (PETO et al., 1977).
Bei allen angewandten statistischen Testverfahren wurden Aussagen, die mit einer
Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 behaftet waren, als signifikant bewertet.
47
3.9 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien
3.9.1 Probenentnahme und Lagerung
Tru-cut Biopsienadel, Fa. Allegiance Heathcare Cooperation, USA
RPMI 1640, Fa. Promo Cell, Heidelberg, Art.-Nr. C-76010
Formaldehyd 37%ig, stabilisiert in 10% Methanol, Fa. Roth, Karlsruhe, Art.-Nr.4979.2
3.9.2 Immunphänotypisierung
3.9.2.1 Reagenzien und Verbrauchsmaterialien
CellWASH ™, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg, Art.-Nr. 349524
BD FACS ™ Lysing Solution, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg, Art.-Nr. 342003
FALCON® Teströhrchen 12 x 75 mm, Fa. Becton Dickinson
FACS Flow ™, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg, Art.-Nr. 342003
3.9.2.2 Antikörper
Primärantikörper: Fa. Serotec, Düsseldorf
Mouse anti canine CD3: purified, Klon CA17.2A12, Art.-Nr. MCA1774
Rat anti canine CD4: FITC, Klon YKIX 302.9, Art.-Nr. MCA1038F
Rat anti canine CD5: FITC, Klon YKIX 332.3, Art.-Nr. MCA137F
Rat anti canine CD8a: RPE, Klon YCATE 55.9, Art.-Nr. MCA1039PE
Rat anti canine CD45: RPE, Klon YKIX716.13, Art.-Nr. MCA1042PE
Mouse anti canine B-Cells: RPE, Klon CA2.1D6, Art.-Nr. MCA1781PE
Goat anti canine IgM: FITC, Art.-Nr. AA130F
Sekundärantikörper
Rat Anti Mouse IgG1: PerCP, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg, Art.-Nr: 340272
48
3.9.3 Immunhistochemische Untersuchung
Verbrauchsmaterialien
Coverplates, Fa. Shandon, Frankfurt / Main, Art.-Nr. 7210013
Objekträger Superfrost® Plus, Fa. Menzel-Gläser, Art.-Nr. 041300
Deckgläser 24 x 40 mm , Fa. Roth, Art.-Nr. 1870
Reagenzien
Bovines Serumalbumin (BSA), Fa. Serva Feinchemie, Art.-Nr.13182
Citrat-Puffer-Konzentrat pH 6,0, Fa. ProTaqstura, Art.-Nr. 400300692
3,3’-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB), Fa. Fluka, Art.-Nr. 32750
Ethanol ≥ 99,8%, Fa. Roth, Art.-Nr. 9065.1
Hämalaun nach Mayer (Rezeptur siehe S.128)
Isopropanol ≥ 99,7%, Fa. Roth, Art.-Nr. 6752.1
Natriumchlorid (NaCl), Fa. Fluka, CH-9471 Buchs, Art.-Nr. 71381
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4), Fa. Fluka, Art.-Nr. 71496
Natronlauge, 1 mol/l (1 N), Fa. Merck, Art.-Nr. 9137
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,05 molar, pH-Wert 7,25 (Rezeptur siehe S.128)
Roti®-Histokitt, Fa. Roth, Art.-Nr. 6638.1
Roticlear®, Fa. Roth, Art-Nr. A5381
Vectastain® ABC Kit, Fa. Vektor Laboratories Inc, Art-Nr. PK-6100
Tween 20, Fa. Serva Feinbiochemie, Art.-Nr.37470
Wasserstoffperoxid 30% (Perhydrol®), Fa. Merck, Art.-Nr. 1.07209.0250
Antikörper
Maus anti P-Glycoprotein, Klon C219, Fa. Dako., Art.-Nr.M3521
Ziege anti Maus IgG (H+L), biotinyliert, Fa. Vektor Laboratories, Art.-Nr. CA 94010
49
3.9.4 Molekularbiologische Untersuchungen
100 mM dNTP Set, Fa. Invitrogen, Art.-Nr. 10297-018
Agarose NA, Fa Pharmacia LKB; Art.-Nr. 17-0554-02
Borsäure, Fa. Roth, Art.-Nr. 6943.2
Brilliant™ Quantitative PCR Core Reagent Kit, Fa. Stratagene, Art.-Nr.600530
Chloroform, Fa. Sigma, Art.-Nr. C2423
Diethylpyrocarbonat (DEPC), Fa. Aldrich, Art.-Nr. 27238-8
EDTA Dinatriumsalz Dihydrat, Fa. Roth, Art.-Nr. 8043.1
Ethanol ≥ 99,8%, Fa. Roth, Art.-Nr. 9065.1
Ethidiumbromid, Fa. Pharmacia LKB, Art.-Nr.80-1129-13
Isopropanol ≥ 99,7%, Fa. Roth, Art.-Nr. 6752.1
Mercaptoethanol, Fa. Sigma, Art.-Nr.M6250
Mineral oil, Fa. Sigma, Art.-Nr. M5904
Natriumacetat-Trihydrat, Fa. Roth, Art.-Nr. 6779.1
Omniscript™ Reverse Transcriptase, Fa. Qiagen, Art.-Nr. 205110
QIAquick® Gel Extraction Kit, Fa. Qiagen, Art.-Nr. 28704
QIAshredder™, Fa. Qiagen, Art.-Nr. 79654
Random Hexamers, Fa. Promega, Art.-Nr. C1181
RNaseOUT™, Fa. Invitrogen, Art.-Nr. 10777-019
RNeasy® Mini Kit, Fa. Qiagen, Art.-Nr. 74104,
RQ1™ RNase-free DNase, Fa. Promega, Art.-Nr. M6101
Superscript™ II Rnase H- Reverse Transcriptase, Fa. Invitrogen, Art.-Nr. 18064-022
TBE-Puffer (Rezeptur siehe Anhang, S.129)
Taq DNA Polymerase, Fa. Promega, Art.-Nr. M1665
TRIS, Fa. Roth, Art.-Nr. 8043.1
TRIzol® Reagent , Fa. Invitrogen, Art.-Nr. 15596
50
4 ERGEBNISSE
4.1 Allgemeine Patientencharakteristika
Die in die Studie aufgenommenen, an malignem Lymphom erkrankten Hunde (n=50) waren
bei Diagnosestellung zwischen 4 Monate und 13 Jahre alt. Das Durchschnittsalter betrug
7 Jahre. Die Hunde gehörten 24 verschiedenen Rassen an (Tabelle 15). Am häufigsten waren
Mischlinge (n=9), Berner Sennenhunde (n=4) und West Highland White Terrier (n=4)
vertreten. 33 Patienten waren männlich (25 intakt, 8 kastriert) und 17 weiblich (11 intakt, 6
kastriert). Bei 44 Hunden lag ein multizentrisches und bei 6 Patienten ein gastrointestinales
Lymphom vor.
Tabelle 15: Rasseverteilung der an malignem Lymphom erkrankten Hunde
Rasse Anzahl
Mischling 9
Berner Sennenhunde, West Highland White Terrier 4
Bouvier des Flandres, Boxer, Dobermann, Golden Retriever 3
Bobtail, Jack-Russel-Terrier, Schweißhund, Yorkshire-Terrier 2
Collie, Dandie-Diamond Terrier, Deutsch-Drahthaar, Deutscher Schäferhund, Foxterrier, Hovawart, Kleiner Münsterländer, Neufundländer, Pon, Riesen Schnauzer, Rottweiler, Staffordshire-Terrier, Weimaraner
1
Summe 50
51
4.2 Klinische Stadieneinteilung
Bei der Mehrheit der Hunde mit multizentrischem Lymphom (n=44) lag bei Diagnosestellung
ein fortgeschrittenes Erkrankungsstadium (Stadium IV oder V) vor (Tabelle 16). Bei einem
Hund wurde das klinische Stadium als I, bei 3 Patienten als III, bei 20 als IV und bei 9 als V
klassifiziert. Bei den restlichen 11 Hunden war aufgrund des Verzichts auf eine
Knochenmarkuntersuchung keine zuverlässige Stadieneinteilung möglich.
Die Beurteilung des klinisches Substadiums ergab bei 20 der Patienten eine Erkrankung des
Substadiums a und bei 30 Patienten des Substadiums b. Bei allen Hunden mit einem
gastrointestinalen Lymphom (n=6) lag eine Erkrankung des Substadiums b vor (Tabelle 16).
Tabelle 16: Klinische Stadien- und Substadienverteilung der an multizentrischem Lymphom erkrankten Hunde
klinisches Substadium Klinisches Stadium a b
Summe
I 1 - 1
III 3 - 3
IV 11 9 20
V 3 6 9
unbekannt 2 9 11
Summe 20 24 44
52
4.3 Immunphänotypisierung
Eine Immunphänotypisierung des Lymphoms erfolgte bei 36 Hunden. Bei 28 Patienten wurde
das Lymphom der B-Zelllinie und bei 8 Patienten der T-Zelllinie zugeordnet. Bei den
restlichen 14 Hunden konnte aus Mangel an Probenmaterial keine durchflusszytometrische
Immunphänotypisierung durchgeführt werden.
Alle 28 als B-Zell-Lymphom klassifizierten Tumoren reagierten mit den Antikörpern gegen
kanine B-Lymphozyten und kanines IgM, jedoch nicht mit den verwendeten
T-Lymphozytenmarkern (Tabelle 17).
Alle acht als T-Zell-Lymphome klassifizierten Tumoren reagierten sowohl mit dem
Antikörper gegen caCD3 als auch gegen caCD5. Bei sieben T-Zell-Lymphomen war
zusätzlich eine Expression von caCD4 und bei einem Tumor von caCD8 nachweisbar
(Tabelle 17).
Tabelle 17: Ergebnisse der durchflusszytometrischen Immunphänotypisierung
Antigenexpression
B-cell IgM CD3 CD5 CD4 CD8 n
+ + - - - - 28
- - + + + - 7
- + + + - + 1 + positiv - negativ
4.4 Kalziumplasmaspiegel
Bei 6 der Patienten lag der Kalziumspiegel im Plasma über dem Referenzbereich.
Bei 5 der Patienten mit einer Hyperkalzämie lag ein T-Zell-Lymphom vor. Bei dem
verbleibenden Patienten war der Immunphänotyp des Lymphoms unbekannt. Der
Zusammenhang zwischen dem erhöhten Kalziumplasmaspiegel und dem Immunphänotyp
erwies sich als statistisch signifikant (Fishers exakter Test; p<0.001).
53
4.5 Chemotherapie
4.5.1 Initiale Chemotherapie
Eine Chemotherapie (Kurzzeit-Kombinationsprotokoll) wurde bei 25 Patienten durchgeführt.
Die Krankheitscharakteristika (anatomische Form, klinisches Stadium- und Substadium,
Immunphänotyp, Vorbehandlung mit Glukokortikoiden und Kalziumgehalt im Plasma) der
therapierten Patienten sind in Tabelle 18 enthalten.
Tabelle 18: Chemotherapeutisch behandelte Patienten: Anatomische Erkrankungsform, klinisches Stadium und Substadium, Glukokortikoidvorbehandlung und Kalziumgehalt im Plasma
Faktor Anzahl
anatomische Form - multizentrisch 23
- gastrointestinal 2 klinisches Stadium (multizentrische Lymphome)
- I 1 - III 3 - IV 13 - V 3 - unbekannt 3
klinisches Substadium - a 17 - b 8
Immunphänotyp - B-Zell-Lymphom 19 - T-Zell-Lymphom 2 - unbekannt 4
Glukokortikoide - vorbehandelt 7 - nicht vorbehandelt 18
Kalziumgehalt im Plasma - im Referenzbereich 25
54
4.5.1.1 Behandlungsergebnisse
Bei 22 Patienten konnte durch die Kurzeit-Chemotherapie eine komplette Remission und bei
2 Hunden eine partielle Remission erreicht werden. Nur bei einem Hund reagierte der Tumor
nicht auf die Chemotherapie.
Von den 24 Patienten mit einer Tumorremission entwickelten 16 im Beobachtungszeitraum
ein Rezidiv. Ein Hund erfüllte die Studienkriterien aufgrund einer langfristigen Gabe von
Prednisolon nach Abschluss der Chemotherapie nicht mehr. 4 Hunde befanden sich bei
Beendigung der Studie noch in der ersten Remission. Bei den restlichen 3 Hunden waren
keine Angaben über den Gesundheitsstatus bei Studienende verfügbar.
Das rezidivfreie Intervall (RFI) war bei den Patienten, die im Beobachtungszeitraum ein
Rezidiv entwickelten, zwischen 30 und 511 Tage lang. Das mittlere RFI betrug 222 Tage, das
zugehörige 95 % Konfidenzintervall für den Median lag bei 143 bis 301 Tagen.
Ein Zusammenhang zwischen dem klinischen Stadium, Substadium oder einer
Vorbehandlung mit Glukokortikoiden und der Dauer des RFI war bei den Hunden mit einem
multizentrischen B-Zell-Lymphom (n=19) nicht nachweisbar (Tabelle 19). Auf eine
statistische Überprüfung des Einflusses des Immunphänotyps sowie der anatomischen Form
auf die Länge des RFIs wurde aufgrund einer zu geringen Anzahl an Patienten mit einem
T-Zell-Lymphom (n=2) bzw. einem gastrointestinalen Lymphom (n=2) verzichtet.
Tabelle 19: Einfluss des klinischen Stadiums und Substadiums sowie einer Vorbehandlung mit Glukokortikoiden auf die Dauer des rezidivfreien Intervalls (RFI) bei Patienten mit einem multizentrischen B-Zell-Lymphom (n=19)
Faktor n RFI Median Log-Rang-Test
Klinisches Stadium - III und IV 14 222 Tage
- V 3 224 Tage p=0,77
Klinisches Substadium - a 14 224 Tage - b 5 157 Tage
p=0,6
Glukokortikoide - vorbehandelt 6 222 Tage - nicht vorbehandelt 13 273 Tage
p=0,86
55
4.5.2 Zweite Chemotherapie
Bei 7 Patienten, die ein Tumorrezidiv entwickelten, stimmten die Besitzer einer zweiten
Chemotherapie zu. 3 Hunde erhielten eine Langzeitchemotherapie, ein Patient wurde mit
einer Kombination aus Cytarabin und Carboplatin behandelt und bei 3 Patienten wurde das
ursprüngliche Kurzzeit-Kombinationsprotokoll wiederholt.
Durch die erneute chemotherapeutische Behandlung konnte bei 5 Hunden eine komplette und
bei einem Patienten eine partielle Remission erreicht werden. Bei einem Hund reagierte das
Tumorrezidiv nicht mehr auf die Chemotherapie (Tabelle 20). Der Median des zweiten RFI
betrug bei den Patienten mit einem Tumorrückgang (n=6) 139 Tage (95% Konfidenzintervall
59 bis 219 Tage).
Tabelle 20: Behandlungsergebnisse der zweiten Chemotherapie
Tier-Nr. Protokoll Therapie-antwort RFI
P07 Kurzzeitchemotherapie PR 190 Tage
P09 Cytarabin / Carboplatin CR 42 Tage
P11 Langzeitchemotherapie CR 139 Tage
P12 Langzeitchemotherapie CR 128 Tage
P10 Kurzeitchemotherapie CR 94 Tage*
P39 Kurzzeitchemotherapie CR 42 Tage**
P46 Langzeitchemotherapie PD -
Abkürzungen und Fußnoten: CR: komplette Remission PR : partielle Remission PD: progressive Tumorerkrankung RFI: rezidivfreies Intervall * Verlauf nach letzter Vorstellung in der Klinik unbekannt ** bei Studienende in Remission
56
4.6 Real-time RT-qPCR
4.6.1 Sensitivität der qPCR
Zur Überprüfung des sicheren Nachweises geringer Kopienzahlen wurden Verdünnungen der
Standards für MDR1, MRP1 und MRP2 von 106 bis 100 Kopien pro µl erstellt und in
dreifachen Ansätzen gemessen. Bei allen drei etablierten qPCR-Assays waren 10 Kopien pro
µl Reaktionsvolumen noch sicher detektierbar (Tabelle 21).
Tabelle 21: Sensitivitätskontrolle der qPCR. Arithmetischer Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der als Triplikate in verschiedenen Verdünnungsstufen der Standards gemessenen Ct-Werte
Ct-Wert Gen Kopienzahl je PCR-Reaktion MW SD
MDR1 106 19,79 0,50 105 23,09 0,25 104 27,67 0,22 103 30,75 0,45 102 32,90 0,24 101 37,17 1,24 100 kein Ct - 0 kein Ct - MRP1 106 20,31 0,17 105 23,35 0,21 104 26,61 0,25 103 28,65 0,43 102 32,13 0,23 101 34,80 0,47 100 Kein Ct - 0 Kein Ct - MRP2 106 18,59 0,24 105 22,00 0,40 104 25,73 0,30 103 29,35 0,23 102 33,00 0,43 101 37,24 0,65 100 39,36 0,71 0 kein Ct -
57
4.6.2 MDR1-Genexpression
4.6.2.1 Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere
In allen unveränderten Leber- (n=14) und Lymphknotenproben (21 Proben von 15 Hunden)
war mittels der etablierten RT-qPCR eine Expression des MDR1-Gens nachweisbar.
Im Lebergewebe (n=14) waren durchschnittlich 147 (Spannweite 69 bis 246) und im
Lymphknotengewebe (15 Proben von 15 Hunden) 14 (Spannweite 5 bis 28) MDR1 cDNA
Kopien pro HPRT cDNA Kopie nachweisbar. Der Unterschied in der Höhe der
MDR1-Genexpression zwischen den beiden Geweben erwies sich im t-Test nach Student als
hoch signifikant (p<0,001).
Zwischen den Klinikpatienten und den Beaglen unterschied sich die Höhe der MDR1-
Genexpression im Leber- und im Lymphknotengewebe dagegen nur unwesentlich (Leber:
p=0,956; Lymphknoten: p=0,22) (Abbildung 1).
Lymphknoten LeberGewebe
0
50
100
150
200
MD
R1
Kop
ien
pro
HPR
T K
opie
A B
A B
"Sonstige"Beagle
Beagle "Sonstige"
Abbildung 1: MDR1-Genexpression (arithmetischer Mittelwert und Standardabweichung der MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie) im unveränderten Lymphknoten- und Lebergewebe gesunder Beagle (Leber n=6; Lymphknoten n=9) und Hunde aus der Klinik für kleine Haustiere („Sonstige“) (Leber: n=8; Lymphknoten: n=6)
58
Eine statistisch signifikante Korrelation zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression im
Lebergewebe und im Lymphknotengewebe bestand bei Hunden, bei denen Proben aus beiden
Geweben untersucht wurden (n=10), nicht (Korrelationskoeffizient nach Pearson (R) =0,056
p=0,88).
MDR1 Kopien pro HPRT Kopie / Lymphknoten
3020100
MD
R1
Kop
ien
pro
HP
RT
Kop
ie /
Lebe
r
300
200
100
0
Abbildung 2: Korrelation der Höhe der MDR1-Genexpression in Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=10) (R=0,056, p=0,88)
Zum Ausschluss einer relevanten Schwankung in der Höhe der MDR1-Genexpression
zwischen Lymphknoten verschiedener Körperregionen wurde bei einem Beagle (Tier-Nr. K9)
die Höhe der MDR1 Geneexpression in sieben verschiedenen Lymphknoten (ein Popliteal-
sowie je zwei Zervikal-, Mandibular- und Darmlymphknoten) bestimmt. Die gemessene
MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie in den sieben Biopsien schwankte
zwischen 12 und 28 und variierte weniger als zwischen Biopsien aus den
Popliteallymphknoten von 9 verschiedenen Beaglen (Spannweite 5 bis 28).
59
4.6.2.2 Maligne Lymphome
Bei allen 50 an malignem Lymphom erkrankten Hunden war bei Diagnosestellung eine
Expression des MDR1-Gens im Tumorgewebe mittels der etablierten RT-q PCR nachweisbar.
Die Höhe der gemessenen MDR1-Genexpression variierte zwischen den Patienten und reichte
von 0,1 bis 369 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie.
Die Mehrheit der untersuchten Lymphome wies bei Diagnosestellung eine relativ niedrige
MDR1-Genexpression auf (Median 1,7 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie). Nur
bei drei Lymphomen war die MDR1-Genexpression höher als im unveränderten
Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (Abbildung 3). Bei zehn Hunden lag die Höhe der
MDR1-Geneexpression innerhalb des im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen
Wertebereiches. Bei den restlichen 37 Patienten war die MDR1-Genexpression im
Tumorgewebe bei Diagnosestellung niedriger als im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere.
< Ln. = Ln. > Ln.MDR1-Genexpression bei Diagnose
0
10
20
30
Anz
ahl a
n Pa
tient
en
n=37 n=10 n=3
Abbildung 3: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung (n=50). Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=15)
60
Vergleich von multizentrischen und gastrointestinalen Lymphomen
Von den 50 untersuchten Patienten wiesen 44 ein multizentrisches und 6 ein gastrointestinales
Lymphom auf. Bei den Patienten mit einem multizentrischen Lymphom waren
durchschnittlich (Median) 1,4 (Spannweite 0,1 bis 369), bei den Hunden mit einem
gastrointestinalen Lymphom durchschnittlich 11,4 (Spannweite 2,4 bis 50) MDR1 cDNA
Kopien pro HPRT cDNA Kopie im Tumorgewebe bei Diagnosestellung nachweisbar
(Abbildung 4). Im Mittelwertvergleich (U-Test nach Mann und Whitney) erwies sich der
beobachtete Unterschied in der Höhe der MDR1-Genexpression zwischen den beiden
anatomischen Lymphomformen als signifikant (p=0,002).
multizentrisch gastrointestinalanatomische Form
0
100
200
300
MD
R1
cDN
A K
opie
n pr
o H
PRT
cDN
A K
opie
RRRRR RRRRRRRRRRRRR R
R
R
RRRR
RRRRRRRRRRRRRRR
R
RRRRRRRRR
Abbildung 4: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von Hunden mit einem multizentrischen (n=44) und Hunden mit einem gastrointestinalen Lymphom (n=6). (U-Test von Mann und Whitney: p=0,002)
61
Vergleich von B-Zell- und T-Zell-Lymphomen
Zwischen den Patienten mit einem multizentrischem T-Zell-Lymphom (n=8) und den Hunden
mit einem multizentrischem B-Zell-Lymphom (n=18) unterschied sich die Höhe der MDR1-
Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung dagegen nicht deutlich (U-Test von
Mann und Whitney p=0,54).
Durchschnittlich (Median) waren bei den an einem T-Zell-Lymphom erkrankten Hunden im
Tumorgewebe 2,8 (Spannweite 0,1 bis 132) und bei den an einem B-Zell-Lymphom
erkrankten Patienten 1,2 (Spannweite 0,2 bis 10) MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA
Kopie nachweisbar (Abbildung 5).
B-Zell-Lymphom T-Zell-LymphomImmunphänotyp
0
50
100
150
MD
R1
cDN
A K
opie
n pr
o H
PRT
cDN
A K
opie
RRRRRR RRRRRRRR
R
R
RRRR RRRRRR
R
RRRRRRRR R
Abbildung 5: Vergleich der MDR1-Genexpression in multizentrischen T-Zell-Lymphomen (n=8) und B-Zell-Lymphomen (n=18) bei Diagnosestellung (U-Test nach Mann und Whitney p=0,54)
62
Einfluss von Glukokortikoiden auf die MDR1-Genexpression
Ein Einfluss einer Vorbehandlung mit Glukokortikoiden auf die Höhe der MDR1-
Geneexpression war anhand der vorliegenden Daten nicht nachweisbar (U-Test von Mann
und Whitney p=0,52). Der Median der MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie
betrug bei den 11 vorbehandelten Hunden 2,6 (Spannweite 0,2 bis 132) und bei den 33 nicht
vorbehandelten Hunden 1,3 (Spannweite 0,1 bis 369) (Abbildung 6).
ja neinVorbehandlung mit Glukokortikoiden
0
100
200
300
MD
R1
cDN
A K
opie
n pr
o H
PRT
cDN
A K
opie
RR RR RRR RRRRRR RR
R
RRRRRRR RRRRR RRRRRR
R
RRR RRRR RR
Abbildung 6: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von an multizentrischem Lymphom erkrankten Hunden, die mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren (n=11), und von an malignem Lymphom erkrankten Hunden, bei denen keine Vorbehandlung mit Glukokortikoiden durch den Haustierarzt erfolgt war (n=33) (U-Test nach Mann und Whitney p=0,521)
63
Einfluss der MDR1-Genexpression auf die Therapieantwort
Von 3 Patienten, bei denen die MDR1-Genexpression im Tumorgewebe höher als im
unveränderten Lymphknotengewebe der Kontrolltiere war (>Ln.), reagierte keiner auf die
Chemotherapie mit einer Vollremission (CR). Bei einem Hund honnte eine Teilremission
(PR), bei den anderen beiden Hunden kein Rückgang des Tumors (NC) erreicht werden. Im
Vergleich dazu reagierten 27 von 29 Hunden, bei denen die MDR1-Genexpression gegenüber
dem Lymphknotengewebe der Kontrolltiere nicht erhöht war (≤ Ln.), auf die Chemotherapie
mit einer kompletten Remission (Abbildung 7).
Die Überprüfung des beobachteten Zusammenhangs zwischen der Höhe der
MDR1-Genexpression (> Ln. gegenüber ≤ Ln.) und der Therapieantwort (CR gegenüber PR
oder NC) auf statistische Signifikanz ergab eine deutliche Assoziation zwischen dem
Fortbestehen klinischer Anzeichen einer Tumorerkrankung (PR oder NC) und einer erhöhten
MDR1-Genexpression im Tumorgewebe vor Therapiebeginn (Fishers exakter Test; p= 0.002)
MDR1 Genexpression vor Therapiebeginn
> Ln.= Ln.< Ln.
Anz
ahl a
n P
atie
nten
30
20
10
0
NC
PR
CR2
4
23
Abbildung 7: MDR1-Genexpression im Tumorgewebe an malignem Lymphom erkrankter Hunde vor Beginn der ersten (n=25) bzw. zweiten Chemotherapie (n=7) und jeweilige Therapieantwort der Patienten. Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere; NC: kein deutlicher Tumorrückgang; PR: Teilremission; CR: Vollremission
64
Einfluss der MDR1-Genexpression auf das rezidivfreie Intervall
Aufgrund des nachgewiesenen Zusammenhanges zwischen der Remissionsdauer und dem
Immunphänotyp, der anatomischen Form und der Anzahl vorangegangener Chemotherapien
wurden nur Hunde mit einem multizentrischen B-Zell-Lymphom und die Dauer des ersten
RFIs in der Analyse berücksichtigt.
Von den 19 an einem multizentrischen B-Zell-Lymphom erkrankten therapierten Hunden
wiesen 16 zum Zeitpunkt der Diagnosestellung eine in Relation zu unverändertem
Lymphknotengewebe erniedrigte MDR1-Genexpression auf (Gruppe IIb). Bei den restlichen 3
Hunden entsprach die Höhe der MDR1-Genexpression den in den Lymphknoten der
Kontrolltiere gemessenen Werten (Gruppe IIa). Die Spannweite des ersten RFI reichte in der
Gruppe IIa von 30 bis 93 Tagen und in der Gruppe IIb von 126 bis 511 Tagen. Der Log-
Rang-Test ergab einen p-Wert von 0,0001 (Abbildung 8).
RFI in Tagen
6004002000
Kum
. re
zidi
vfre
ies
Übe
rlebe
n
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
Abbildung 8: Dauer des ersten rezidivfreien Intervalls (RFI) der Hunde mit multizentrischem B-Zell-Lymphom (n=19) als Kaplan-Meier Überlebenszeitkurve. Gestrichelte Linie: Patienten, bei denen die MDR1-Genexpression im Tumor niedriger als im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere war (Gruppe IIb, n=16). Durchgezogene Linie: Hunde, bei denen die Höhe der MDR1-Genexpression im Tumor den in den Lymphknoten der Kontrolltiere gemessenen Werten entsprach (Gruppe IIa; n=3)
65
MDR1-Genexpresssion in Tumorrezidiven
Bei 12 Hunden konnte sowohl vor Therapiebeginn als auch bei Ausbildung des ersten
Tumorrezidivs eine Gewebeprobe entnommen werden.
Ein deutlicher (≥ Faktor 2) Anstieg der MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv war bei 7
Hunden nachweisbar (Tabelle 22). Bei einem Hund wurde ein undeutlicher Anstieg (Faktor
1,8), bei 4 Patienten keine nennenswerte Änderung (Faktor 0,6 bis 1,1) der MDR1-
Genexpression vermerkt.
Im Wilcoxon-Test erwies sich der Anstieg der MDR1-Genexpression zum Zeitpunkt des
ersten Rezidivs als signifikant (p=0,032).
Tabelle 22: MDR1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie im Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden (n=12) bei Diagnosestellung und bei Ausbildung des ersten Tumorrezidivs sowie der errechnete Anstiegsfaktor (1.Rezidiv/Diagnose)
MDR1 Kopien pro HPRT Kopie Tier-Nr.
Diagnose 1. Rezidiv Faktor
P07 0,4 0,3 0,8 P09 1,3 0,8 0,6 P11 1,7 3,6 2,1 P12 2,6 2,9 1,1 P22 1,8 1,7 0,9 P26 0,5 5,7 11,4 P28 4,6 8,1 1,8 P30 0,4 1,1 2,8 P32 1,5 7,3 4,9 P39 1,0 2,0 2,0 P42 0,3 0,6 2,0 P46 5,2 39,4 7,6
66
Beim Vergleich der Länge des ersten RFIs von Patienten mit und ohne Anstieg der MDR1-
Genexpression im Tumorrezidiv zeigten sich deutliche Unterschiede. Die mittlere Dauer des
ersten RFI war bei den 8 Patienten, bei denen eine gesteigerte (≥ Faktor 1,8) MDR1-
Genexpression im Tumorrezidiv nachweisbar war, deutlich kürzer (Median 133 Tage,
95% Konfidenzintervall 90 bis 176 Tage) als bei den 4 Hunden ohne einem Anstieg der
MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv (Median 312 Tage, 95% Konfidenzintervall 216 bis
408 Tage). Im Log-Rang-Test erwies sich der Unterschied als signifikant (p=0,012).
RFI in Tagen
6004002000
Kum
. re
zidi
vfre
ies
Übe
rlebe
n
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
Abbildung 9: Kaplan-Meier Überlebenszeitkurve des rezidivfreien Intervalls (RFI), getrennt für Hunde mit einem Anstieg (≥ Faktor 1,8) der MDR1-Genexpression bei Rezidivierung (durchgezogene Linie) und für Hunde ohne einem deutlichen Anstieg (< Faktor 1,1) der MDR1-Genexpression bei Rezidivierung (gestrichelte Linie)
67
4.6.3 MRP1- und MRP2-Genexpression
4.6.3.1 Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere
Eine Expression des MRP1 Gens war sowohl in allen untersuchten Leber- (n=14) als auch
Lymphknotenproben (n=14) mittels der etablierten qPCR nachweisbar. Die Höhe der
Expression war im unveränderten Lebergewebe mit durchschnittlich 25 (SD 13) MRP1 cDNA
Kopien pro HPRT cDNA Kopie deutlich niedriger als im Lymphknotengewebe (130 (SD 57)
MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie; p<0,001) (Abbildung 10).
Zwischen den gesunden Beaglen (Leber: n=6; Lymphknoten: n=8) und den Hunden aus dem
Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere (Leber: n=8; Lymphknoten: n=6)
unterschied sich die Höhe der MRP1-Genexpression in beiden Geweben nur undeutlich
(Leber: p=0,435; Lymphknoten: p=0,387) (Abbildung 10).
Lymphknoten LeberGewebe
0
50
100
150
200
MR
P1 c
DN
A K
opie
n pr
o H
PRT
cDN
A K
opie
A
B
AB
Beagle
Beagle
" Sonstige"
" Sonstige"
Abbildung 10: MRP1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe von gesunden Beaglen (Leber: n=6; Lymphknoten: n=8) und Hunden aus dem Patientenkollektiv der Klinik für kleine Haustiere („Sonstige“) (Leber: n=8; Lymphknoten: n=6)
68
Die Höhe der MRP1-Geneexpression im unveränderten Lymphknotengewebe variierte
zwischen Biopsien von verschiedenen Beaglen (nur Popliteallymphknoten; n=9) stärker als
zwischen Biopsien von verschiedenen Lymphknoten (n=7) desselben Beagles (Spannweite 59
bis 247 bzw. 114 bis 221 MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie).
Es bestand keine deutliche Korrelation zwischen der Höhe der MRP1-Genexpression im
Lebergewebe und im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=10; R=-0,007; p=0,985)
(Abbildung 11).
MRP1 Kopien pro HPRT Kopie / Lymphknoten
3002001000
MR
P1 K
opie
n pr
o H
PRT
Kop
ie /
Lebe
r
100
75
50
25
0
Abbildung 11: Korrelation der Höhe der MRP1-Genexpression in Leber- und Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=10) (R=-0,007; p=0,985)
Eine deutliche Expression des MRP2-Gens (>10 Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA) war nur in
den Leberproben, nicht aber im unveränderten Lymphknotengewebe nachweisbar.
Durchschnittlich waren im Lebergewebe 21 (SD 13) MRP2 cDNA Kopien pro HPRT cDNA
Kopie enthalten. Ein signifikanter Unterschied in der Höhe der MRP2-Geneexpression
zwischen den Beaglen (n=6) und den Hunden aus dem Patientenkollektiv der Klinik (n=8)
bestand nicht (p=0,662).
69
4.6.3.2 Maligne Lymphome
Eine Expression des MRP1-Gens war bei allen 50 an malignem Lymphom erkrankten Hunden
bei Diagnosestellung im Tumorgewebe nachweisbar. Die Höhe der MRP1-Genexpression
variierte zwischen den Patienten und reichte von 11 bis 2499 (Median 268) MRP1 cDNA
Kopien pro HPRT cDNA Kopie.
Eine in Relation zu den im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen Werten
(Spannweite 55 bis 247 MRP1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie) erniedrigte MRP1-
Genexpression wiesen acht Lymphome auf (Abbildung 11). Bei 28 Lymphomen lag die Höhe
der MRP1-Genexpression über den im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen
Werten.
< Ln. = Ln. > Ln.MRP1-Genexpression bei Diagnose
5
10
15
20
25
Anz
ahl a
n Pa
tient
en
n=8 n=14 n=28
Abbildung 12: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung (n=50). Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere (n=15)
Im Gegensatz zu MRP1 war eine deutliche Expression des MRP2-Gens (>10 MRP2 cDNA
Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA) in keinem der untersuchten Lymphome bei Diagnosestellung
nachweisbar.
70
Vergleich von multizentrischen und gastrointestinalen Lymphomen
Durchschnittlich (Median) waren bei den Hunden mit multizentrischem Lymphom (n=44) im
Tumorgewebe 273 (Spannweite 11 bis 2499) und bei den an einem gastrointestinalen
Lymphom erkrankten Patienten (n=6) 192 (Spannweite 11 bis 542) MRP1 cDNA Kopien pro
HPRT cDNA Kopie bei Diagnosestellung nachweisbar (Abbildung 13). Der Unterschied
zwischen Lymphomen unterschiedlicher anatomischer Lokalisation erwies sich im U-Test
nach Mann und Whitney als nicht signifikant (p=0,179).
multizentrisch gastrointestinalanatomische Form
0
1000
2000
MR
P1 c
DN
A K
opie
n pr
o H
PRT
cDN
A K
opie
R R
R
R
R
RRRR
R
RR
RR
R
RR
R
R
R
R
RR
R R
R
RRR
R
R
RRRRRRRRR
R
RRRRR
R
R
R
R
Abbildung 13: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von Hunden mit einem multizentrischen (n=44) und Hunden mit einem gastrointestinalen Lymphom (n=6) (U-Test von Mann und Whitney: p=0,179)
71
Vergleich von B-Zell- und T-Zell-Lymphomen
Die Höhe der MRP1-Genexpression unterschied sich im U-Test nach Mann und Whitney
deutlich (p=0,001) zwischen Hunden mit multizentrischem T- Zell- und B-Zell-Lymphom.
Bei Hunden mit einem B-Zell-Lymphom (n=28) waren durchschnittlich 406 (Spannweite 142
bis 2499), bei den an einem T-Zell-Lymphom erkrankten Patienten (n=8) durchschnittlich 95
(Spannweite 11 bis 735) MRP1 cDNA Kopien pro HPRT Kopie nachweisbar.
B-Zell-Lymphom T-Zell-LymphomImmunphänotyp
0
1000
2000
MR
P1 c
DN
A K
opie
n pr
o H
PRT
cDN
A K
opie
RRR
R
RR
R
R
RR
RRR
R
R
RRR
R
R
RR
RRRR
R
RR RRR
R
R
R
R
Abbildung 14: Vergleich der MRP1-Genexpression in multizentrischen T-Zell-Lymphomen (n=8) und B-Zell-Lymphomen (n=18) bei Diagnosestellung (U-Test nach Mann und Whitney p=0,001)
72
Einfluss von Glukokortikoiden auf die MRP1-Genexpression
Aufgrund des Einflusses des Immunphänotyps auf die Höhe der MRP1-Genexpression
wurden nachfolgend nur Hunde mit einem B-Zell-Lymphom berücksichtigt.
Hunde, die bei Diagnosestellung mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren, wiesen im
Durchschnitt eine höhere MRP1-Genexpression im Tumorgewebe auf (Median 508,
Spannweite 407 bis 2499 MRP1 cDNA Kopien pro HPRT Kopie) als nicht mit
Glukokortikoiden vorbehandelte Hunde (Median 355, Spannweite 142 bis 1551 MRP1 cDNA
Kopien pro HPRT Kopie) (Abbildung 15). Im U-Test nach Mann und Whitney erwies sich
der Unterschied jedoch als nicht signifikant (p=0,055).
ja neinVorbehandlung mit Glukokortikoiden
500
1000
1500
2000
2500
MR
P1 c
DN
A K
opie
n pr
o H
PRT
cDN
A K
opie
RRR
R
RR
R
R RRRR
R
RRR
R
R
RRRRRRR
R
R
R
Abbildung 15: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe bei Diagnosestellung von an multizentrischem B-Zell-Lymphom erkrankten Hunden, die mit Glukokortikoiden vorbehandelt waren (n=7), und von Hunden, bei denen keine Vorbehandlung mit Glukokortikoiden durch den Haustierarzt erfolgt war (n=21) (U-Test nach Mann und Whitney p=0,055)
73
Einfluss der MRP1-Genexpression auf die Therapieantwort
Ingesamt reagierten 8 von 9 (89%) der Patienten, bei denen die Höhe der MRP1-
Genexpression im Tumorgewebe den im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere gemessenen
Werten entsprach (=Ln.), mit einer Vollremission auf die erste bzw. zweite Chemotherapie.
Bei den Patienten mit einer in Relation zu unverändertem Lymphknotengewebe erhöhten
MRP1-Genexpression (>Ln.) konnte in 19 von 23 (83%) der Fälle eine Vollremission erzielt
werden. Die Überprüfung auf statistische Signifikanz ergab keine deutliche Assoziation
zwischen der Therapieantwort (CR gegenüber PR oder NC) und der MRP1-Genexpression im
Tumorgewebe vor Therapiebeginn (>Ln. gegenüber =Ln.) (Fishers exakter Test: p= 0,65).
MRP1-Genexpression
>Ln.= Ln.
Anz
ahl a
n Pa
tient
en
30
20
10
0
Therapieantwort
NR
PR
CR
2
2
19
8
Abbildung 16: MRP1-Genexpression im Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden vor Beginn der ersten (n=25) bzw. zweiten Chemotherapie (n=7) und Therapieantwort der Patienten. Ln.: Lymphknotengewebe der Kontrolltiere; NR: kein deutlicher Tumorrückgang; PR: Teilremission; CR: Vollremission
74
Einfluss der Höhe der MRP1-Genexpression auf das rezidivfreie Intervall
Aufgrund des nachgewiesenen Zusammenhanges zwischen der Remissionsdauer und dem
Immunphänotyp, der anatomischen Form und der Anzahl vorangegangener Chemotherapien
wurden nur Hunde mit einem multizentrischem B-Zell-Lymphom und die Dauer des ersten
rezidivfreien Intervalls in der Analyse berücksichtigt.
Von den 19 an einem multizentrischen B-Zell-Lymphom erkrankten therapierten Hunden
wiesen 15 zum Zeitpunkt der Diagnosestellung eine in Relation zu unveränderten
Lymphknotengewebe erhöhte MRP1-Genexpression auf (Gruppe I). Bei den restlichen
4 Hunden entsprach die Höhe der MRP1-Genexpression den in den Lymphknoten der
Kontrolltieren gemessenen Werten (Gruppe IIa).
Das mittlere erste RFI (Median) war bei den Hunden der Gruppe IIa (MRP1-Genexpression =
Ln.) 224 Tage (95% Konfidenzintervall 67 bis 381 Tage) und bei Hunden der Gruppe I
(MRP1-Genexpression > Ln.) 281 Tage (95% Konfidenzintervall 166 bis 396 Tage). Der
Log-Rang-Test ergab einen p-Wert von 0,323.
75
MRP1-und MRP2-Genexpresssion bei Tumorrezidiven
Bei 12 Hunden konnten sowohl vor Therapiebeginn als auch bei Ausbildung des ersten
Tumorrezidivs Gewebeproben entnommen werden.
Im Wilcoxon-Test erwiesen sich die Unterschiede in der MRP1-Genexpression im
Tumorgewebe zwischen den beiden Untersuchungszeitpunkten (Diagnose und erstes Rezidiv)
als nicht signifikant (p=0,53).
Nur bei einem Hund war ein deutlicher (≥ Faktor 2) Anstieg der MRP1-Genexpression
zwischen Diagnose und erstem Rezidiv nachweisbar (Tabelle 23). Bei allen anderen
schwankte die Höhe der MRP1-Genexpression zwischen den Untersuchungszeitpunkten nur
unwesentlich (Faktor 0,5 bis 1,4).
Im Gegensatz zum MRP1-Gen war keine deutliche Expression des MRP2-Gens (>10 MRP2
cDNA Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA) in den untersuchten Tumorrezidiven nachweisbar.
Tabelle 23: MRP1 cDNA Kopienzahl pro HPRT cDNA Kopie im Tumorgewebe bei Diagnosestellung und Ausbildung des ersten Tumorrezidivs bei 12 an multizentrischem Lymphom erkrankten Hunden und errechneter Anstiegsfaktor
MRP1 Kopien pro HPRT Kopie Tier-Nr.
Diagnose 1. Rezidiv Faktor
P07 475 445 0,9 P09 355 344 1,0 P11 229 220 1,0 P12 380 424 1,1 P22 406 1095 2,7 P26 1057 913 0,9 P28 507 517 1,0 P30 870 545 0,6 P32 141 96 0,7 P39 142 132 0,9 P42 171 283 1,7 P46 475 461 1,0
76
4.7 RT-PCR zum Nachweis von Survivin mRNA
Mit allen drei PCR-Assays war eine Expression von Survivin mRNA in menschlichem
Kolonkarzinomgewebe nachweisbar (Tabelle 24). In Plazentagewebe vom Hund war dagegen
mit keinem der Primerpaare eine Expression von Survivin mRNA detektierbar.
Bei zwei Primerpaaren ließ sich das jeweilige PCR-Produkt aus genomischer DNA vom
Menschen, nicht aber aus genomischer DNA vom Hund amplifizieren (Tabelle 24).
Tabelle 24: Ergebnisse der zum Nachweis von Survivin durchgeführten PCR-Assays
Primerpaar Template Spezies
SURV1 SURV2 SURV3
cDNA Kolonkarzinom Mensch positiv positiv positiv
cDNA Plazenta Hund negativ negativ negativ
gDNA Hund negativ negativ negativ
gDNA Mensch negativ positiv positiv
77
4.8 Immunhistochemische Untersuchung der P-Glykoproteinexpression
Zum immunhistochemischen Nachweis von P-Glykoprotein wurde der Antikörperklon C219
verwendet. Die Färbung wurde an Lebergewebe etabliert. Das Färbemuster im Lebergewebe
(multifokale Färbung der kanikulären Oberfläche der Hepatozyten) entsprach den Angaben
zur P-Glykoproteinexpression im Lebergewebe aus der Literatur (GINN 1996).
Nach Etablierung des Antikörpers wurde bei 20 der an malignem Lymphom erkrankten
Hunden die Expression von P-Glykoprotein im Tumorgewebe bei Diagnosestellung
untersucht. Bei 19 von 20 Hunden reagierten nur einzelne Tumorzellen mit dem Antiköper
gegen P-Glykoprotein (< 1%) (Abbildung 17). Nur bei einem Patienten (Tier-Nr.P20) ließen
sich multifokal Tumorzellgruppen mit dem Antikörperklon C219 anfärben (Abbildung 17).
Bei dem Tumor dieses Patienten handelte es sich um ein gastrointestinales, nicht mit
Glukokortikoiden vorbehandeltes Lymphom, welches nicht auf eine Chemotherapie reagierte.
Die Höhe der MDR1-Genexpression betrug bei dem Lymphom mit der deutlichen
P-Glykoproteinexpression 50 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie. Bei den
restlichen 19 Hunden, bei denen nur sehr wenige Tumorzellen mit dem Antikörperklon C219
reagierten, war die mittels RT-qPCR gemessene Höhe der MDR1-Genexpression im
Tumorgewebe dagegen mit 0,4 bis 16 MDR1 cDNA Kopien pro HPRT cDNA Kopie deutlich
niedriger.
78
Abbildung 17: Immunhistochemischer Nachweis von P-Glykoprotein. Oberes Bild. Lymphom, bei dem nur einzelne Zellen mit dem Antikörperklon C219 reagierten. Umteres Bild. Lymphom mit deutlicher Immunreaktivität gegen den Antikörperklon C219 (Balken = 50 µm)
79
5 DISKUSSION
Voraussetzung für die Durchführung von klinischen Studien zur MDR beim Hund ist die
Möglichkeit, die Expression von Zellmembranproteinen, die eine Vielfachresistenz vermitteln
können, in Tumorbiopsien reproduzierbar quantifizieren zu können. Zur Untersuchung der P-
Glykoprotein-, MRP1- und MRP2-Expression stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung
(BECK et al. 1996; BROXTERMAN et al. 1996). Die Proteine können mittels monoklonaler
Antikörper nachgewiesen werden oder die Expression der für die Proteiene kodierenden Gene
kann untersucht werden (NOONAN et al. 1990; HERZOG et al. 1992; FLENS et al. 1994;
HIPFNER et al. 1994). Zwar können hohe Expressionsdichten mit allen Verfahren
zuverlässig bestimmt werden, die Messung geringer Expressionsdichten bereitet jedoch
häufig Schwierigkeiten (BECK et al. 1996, BROXTERMAN et al. 1996; MARIE et al. 1997).
Beim Hund werden zur Untersuchung der P-Glykoproteinexpression sowohl
immunhistochemische Techniken als auch Western Blots eingesetzt und zur Bestimmung der
MDR1-Genexpression konventionelle RT-qPCRs verwendet (MOORE et al. 1995; GINN
1996; STEINGOLD et al. 1998). Mit keiner dieser Techniken können jedoch präzise
quantitative Daten, die einen Vergleich der Expressionshöhe zwischen verschiedenen
Geweben, Tumorentitäten oder Krankheitsstadien ermöglichen, erhoben werden.
In der vorliegenden Studie wurde zur Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und MRP2-
Genexpression in kaninen Lymphomen eine RT-qPCR im real-time-Modus etabliert. Die
Untersuchungsmethode wurde erstmals 1996 von GIBSON und Mitarbeitern beschrieben
(GIBSON et al. 1996). Als allgemeine Vorzüge der RT-qPCR im real-time-Modus gelten u.a.
eine hohe Spezifität, Sensitivität und Reproduzierbarkeit der Daten, (BUSTIN 2002;
GINZINGER 2002). Als Housekeeping-Gen wurde Hypoxanthinphophoribosyltransferase
(HPRT) verwendet. HPRT wird im Vergleich zu anderen Housekeeping-Genen sehr niedrig
und konstant exprimiert (FOSS et al. 1998). Die in der eigenen Studie gemessenen HPRT
cDNA Kopienzahlen entsprachen in etwa den in den MDR1 niedrig exprimierenden
Lymphomen gemessenen MDR1 cDNA Kopienzahlen. HPRT ist somit als endogenes
Kontrollgen für die etablierten qPCR-Assays geeignet.
80
Zur Beurteilung der Sensitivität der etablierten RT-qPCR wurden Verdünnungen der MDR1-,
MRP1- und MRP2-Standards mit 106 bis 100 Kopien pro 25 µl PCR-Ansatz analysiert.
Sowohl bei MDR1 als auch bei MRP1 und MRP2 konnten 10 Kopien pro PCR-Ansatz sicher
nachgewiesen werden. Die Streuung der Ct-Werte innerhalb der als Triplikate gemessenen
Ansätze war relativ gering (SD < 1,25). Dies unterstreicht die Zuverlässigkeit der
Messergebnisse. Zur Bewertung der Reproduzierbarkeit der Messergebnisse wurde der
Variationskoeffizient der Ct-Werte herangezogen. Alle cDNA-Proben wurden in zwei
verschiedenen Messdurchgängen jeweils als Triplikat untersucht. Der Variationskoeffizient
der Ct-Werte innerhalb der Messdurchgänge und zwischen den Messdurchgängen reichte von
0,1% bis 5% und entsprach den von BUSTIN veröffentlichten Empfehlungen (BUSTIN
2000).
Aufgrund der in verschiedenen Studien nachgewiesenen Expression von P-Glykoprotein,
MRP1 und MRP2 in der Leber beim Hund (GINN 1996; CONRAD et al. 2001) wurde
unverändertes Lebergewebe als Positivkontrolle verwendet. Lymphknotengewebe diente als
Vergleichsgewebe. In allen untersuchten Lymphknoten- und Leberproben war eine
Expression von MDR1 mRNA und MRP1 mRNA mittels der etablierten RT-qPCR
nachweisbar. Eine Expression des MRP2-Gens war dagegen nur in unverändertem
Lebergewebe, nicht aber in Lymphknotengewebe sicher detektierbar. Die Höhe der
MRP2-Genexpression war jedoch auffallend niedrig. Beim Menschen wird MRP2 in der
Leber relativ hoch exprimiert. Unterschiede im MRP2-Expressionsmuster zwischen Hund und
Menschen werden vermutet (CONRAD et al. 2001).
Zur Verbesserung der Repräsentativität der Vergleichswerte wurden neben gesunden Beaglen
auch Patienten der Klinik für kleine Haustiere als Kontrolltiere verwendet. Die Höhe der
MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression im Leber- bzw. Lymphknotengewebe unterschied
sich zwischen den Klinikpatienten und den gesunden Beaglen nicht deutlich. Dies
unterstreicht die Repräsentativität des Kontrollkollektivs.
Die interindividuelle Variation der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression im Leber- und
Lymphknotengewebe der Kontrolltiere war verhältnismäßig hoch. Ähnliche Messwert-
schwankungen wurden auch in Lebergeweben von gesunden Menschen gefunden (SCHUETZ
et al. 1995). Ursache und Bedeutung der Schwankungen sind ungeklärt. Möglicherweise
spielen Alter, Abstammung oder Ernährung eine Rolle.
81
In früheren Studien zur P-Glykoproteinexpression beim Hund wurde unverändertes
Lymphknotengewebe als Negativkontrolle verwendet (MOORE et al. 1995; BERGMAN et
al. 1996; LEE et al. 1996). Bemerkenswerterweise war in der eigenen Studie in allen
untersuchten Lymphknotenproben eine Expression des MDR1-Gens mittels RT-qPCR
nachweisbar. Die Höhe der Expression war jedoch deutlich niedriger als in den untersuchten
Lebergeweben. Es ist anzunehmen, dass die in der vorliegenden Studie etablierte RT-qPCR
sensitiver ist als die in anderen Studien verwendeten immunhistochemischen
Nachweisverfahren. Studien, in denen eine Expression von P-Glykoprotein in Lymphozyten
des peripheren Blutes beim Menschen nachgewiesen wurde, unterstützen diese Annahme
(KLIMECKI et al. 1994; LOHRI et al. 1997).
Die Chemotherapie ist derzeit fast immer die Therapie der Wahl bei an malignem Lymphom
erkrankten Hunden (MADEWELL 1999). Zu Beginn der Behandlung kann bei bis zu 90%
der an einem multizentrischem Lymphom erkrankten Hunde ein Tumorrückgang erreicht
werden (ETTINGER 2003). Mittels der etablierten real-time RT-qPCR wurde die MDR1-,
MRP1- und MRP2-Genexpression in 50 Lymphomen bei Diagnosestellung und in
12 Tumorrezidiven quantifiziert. In allen Lymphomen war eine Expression des MDR1-Gens
nachweisbar. In der Mehrzahl der untersuchten Fälle war die Expression jedoch relativ
niedrig. Nur 3 von 50 Lymphomen wiesen bei Diagnosestellung eine in Relation zu gesundem
Lymphknotengewebe gesteigerte MDR1-Genexpression auf. Dieser niedrige Anteil steht im
Einklang mit der im Allgemeinen guten chemotherapeutischen Beeinflussbarkeit der
Lymphome des Hundes zu Behandlungsbeginn.
In früheren Studien konnte eine Expression von P-Glykoprotein mittels Western Blot oder
Immunhistochemie in 3 bis 33 % der Lymphome des Hundes bei Diagnosestellung
nachgewiesen werden (MOORE et al. 1995; GINN 1996; LEE et al. 1996). Ähnlich
variierende Angaben werden für das Non-Hodgkin-Lymphom des Menschen berichtet
(YUEN u. SIKIC 1994). Zumeist wurden zum Nachweis von P-Glykoprotein beim Hund die
Antikörperklone C219 und C494 verwendet (MOORE et al. 1995; BERGMAN et al. 1996;
GINN 1996; LEE et al. 1996) Es ist bekannt, dass die Verwendung unterschiedlicher
Antikörperklone gegen P-Glykoprotein beim Menschen zu abweichenden Färbeergebnissen
führen kann (PILERI et al. 1991; BECK et al. 1996). Ähnliches könnte unter Umständen auch
82
für den Hund gelten. In der eigenen Studie war nur bei einem der 20 immunhistochemisch
untersuchten Lymphome eine deutliche Immunreaktivität mit dem Antikörperklon C219
feststellbar. Im Vergleich zu früheren Studien erscheint dieser Anteil zunächst als
verhältnismäßig gering. In zwei von drei Studien, die ebenfalls den Antikörperklon C219
verwendeten, wurden jedoch ähnlich niedrige Anteile P-Glykoprotein-positiver Lymphome
gefunden (MOORE et al. 1995; GINN 1996).
Interessanterweise wies das stark P-Glykoprotein-positive Lymphom eine deutlich höhere
MDR1-Genexpression auf als die restlichen 19 immunhistochemisch untersuchten
Lymphome. Eine Korrelation zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression und der
Expression von P-Glykoprotein wurde beim Menschen u.a. bei Non-Hodgkin-Lymphomen
beschrieben (LIU et al. 2001). Im Allgemeinen war nur bei Non-Hodgkin-Lymphomen mit
einer relativ hohen MDR1-Expression auch eine Expression von P-Glykoprotein
immunhistochemisch nachweisbar (LIU et al. 2001). Nach den eigenen Untersuchungs-
ergebnissen kann eine Korrelation zwischen der Expressionsdichte von P-Glykoprotein und
der Höhe der MDR1-Genexpression ebenfalls vermutet werden.
Die etablierte RT-qPCR bietet zwar gegenüber dem immunhistochemischen Nachweis den
Vorteil der höheren Sensitivität, ermöglicht aber im Gegensatz zur Immunhistologie keine
morphologische Zuordnung der Expression. Somit ist eine Beeinflussung der
Untersuchungsergebnisse durch einen hohen Gehalt an nicht neoplastisch entarteten Zellen
denkbar. Bisher gelang es jedoch nicht, einen deutlichen Einfluss einer Kontamination mit
T-Lymphozyten auf die gemessene Höhe der MDR1-Genexpression in Lymphomen des
Menschen nachzuweisen (KANG et al. 1995). Dennoch erscheint eine gewisse Beeinflussung
möglich. Der Einsatz neuerer Techniken zur Gewebeisolierung könnte zur Klärung dieser
Problematik dienlich sein.
Maligne Lymphome können sich sowohl in ihrem pathologisch-anatomischen
Erscheinungsbild als auch in ihren tumorbiologischen Eigenschaften erheblich unterscheiden
(FAN 2003). Unter anderem gelten gastrointestinale Lymphome als im Allgemeinen
schlechter chemotherapeutisch beeinflussbar als multizentrische Verlaufsformen (COUTO et
al. 1989). Interessanterweise war in der vorliegenden Studie die mittlere Höhe der MDR1-
Genexpression im Tumorgewebe von Hunden mit gastrointestinalen Lymphomen bei
Diagnosestellung deutlich höher als bei Patienten mit multizentrischen Verlaufsformenn. Bei
83
gesunden Hunden unterschied sich die Höhe der MDR1-Genexpression zwischen
Darmlymphknoten und Lymphknoten anderer Körperregionen dagegen nicht. Eine
Chemotherapie wurde nur bei zwei der Hunde mit einem gastrointestinalen Lymphom
durchgeführt. Ein Patient reagierte mit einer Teilremission, der andere mit einem stationären
Tumorverhalten. Ein direkter Zusammenhang zwischen der höheren MDR1-Genexpression
und der schlechteren therapeutischen Beeinflussbarkeit gastrointestinaler Lymphome lässt
sich somit vermuten. Inwieweit sich dieser Zusammenhang in zukünftigen Studien bestätigt,
bleibt allerdings abzuwarten.
In zwei früheren Studien wurde bereits eine prognostische Relevanz der Expression von
P-Glykoprotein für die Überlebenszeit von Hunden mit malignem Lymphom beschrieben
(BERGMAN et al. 1996; Lee et al. 1996). Dagegen konnten Steingold und Koautoren keinen
Zusammenhang zwischen der Höhe der MDR1-Genexpression und dem Therapieerfolg
nachweisen (STEINGOLD et al. 1998).
In der eigenen Studie bestand eine deutliche Assoziation zwischen der Höhe der MDR1-
Genexpression und der Therapieantwort. So konnte bei keinem der Lymphome mit einer
gesteigerten MDR1-Genexpression durch die Chemotherapie eine vollständigen Rückbildung
des Tumors erreicht werden. Auch die Länge des ersten rezidivfreien Intervalls war bei den
Patienten mit einer erniedrigten MDR1-Genexpression vor Therapiebeginn deutlich länger als
bei Hunden, bei denen die gemessenen Werte den in gesundem Lymphknotengewebe
ermittelten normalisierten MDR1 cDNA Kopienzahlen entsprachen. Die Ergebnisse lassen
eine Relevanz der gesteigerten MDR1-Expression für den Behandlungserfolg bei einem Teil
der untersuchten Patienten vermuten.
Bei verschiedenen Tumoren des Menschen wurde eine Zunahme der P-Glykoprotein- bzw.
MDR1-Genexpression im Therapieverlauf nachgewiesen. 1979 wurde von GOLDIE und
COLDMAN ein Modell aufgestellt, nach dem - ausgehend von einer Mutationsrate von 10–5
bis 10–6 - die Wahrscheinlichkeit, bereits in einem Tumor mit 107 Zellen keine resistenten
Tumorzellen zu finden, äußerst gering ist (GOLDIE u. COLDMAN 1979). Etwaige resistente
Tumorzellen weisen unter dem Selektionsdruck der Chemotherapie einen Überlebensvorteil
auf. Letztendlich entsteht ein therapierefraktäres Tumorrezidiv (NÜSSLER u. GIESELER
2000). In der vorliegenden Studie konnte bei 7 von 12 Patienten ein deutlicher Anstieg der
MDR1-Genexpression zwischen Diagnosestellung und Rezidivausbildung nachgewiesen
84
werden. Interessanterweise war bei diesen Patienten auch die Länge des rezidivfreien
Intervalls gegenüber den Patienten ohne Anstieg der Höhe der MDR1-Genexpression im
Tumorrezidiv deutlich verkürzt.. Bei vier der Patienten mit einem Anstieg der MDR1-
Genexpression im Tumorrezidiv wurde die Chemotherapie wiederholt. Bei einem Patienten
erwies sich das Lymphom als therapierefraktär, bei den restlichen drei Patienten konnte eine
vollständige Remission erzielt werden. Bemerkenswerterweise war bei dem Patienten mit
dem therapierefraktären Lymphom die MDR1-Genexpression deutlich höher als bei den
restlichen Patienten. Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass bei einem Teil der Lymphome
des Hundes die MDR1-Genexpression im Therapieverlauf ansteigt. Ein Zusammenhang
zwischen einem Anstieg der MDR1-Genexpression im Tumorrezidiv und der Abnahme der
chemotherapeutischen Beeinflussbarkeit ist zu vermuten.
Im Gegensatz zur Expression von P-Glykoprotein ist über die klinische Relevanz der
Expression von MRP1 und MRP2 beim malignen Lymphom des Hundes, soweit aus der
Literatur ersichtlich, noch nichts bekannt. In der vorliegenden Studie konnte bei einem
Patienten mit einer geringen MDR1-Genexpression kein vollständiger Tumorrückgang
erreicht werden. Somit ist ein Vorkommen alternativer Resistenzmechanismen bei kaninen
Lymphomen zu vermuten.
Beim Menschen wurde bereits eine Expression des MRP1 in Non-Hodgkin-Lymphomen
nachgewiesen und eine Beteiligung bei der Ausprägung von Zytostatikaresistenzen bei einem
Teil der Patienten vermutet (FLENS 1996; ZHAN et al. 1997). In der vorliegenden Studie war
MRP1 mittels real-time RT-qPCR in allen untersuchten Lymphomen nachweisbar. Ein
Zusammenhang zwischen der Höhe der MRP1-Genexpression und der Therapieantwort oder
der Länge des rezidivfreien Intervalls war jedoch nicht feststellbar. Ein deutlicher Anstieg der
MRP1-Expression zum Zeitpunkt des ersten Rezidivs war ebenfalls nur bei einem von 12
Patienten nachweisbar. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass MRP1 bei der Mehrheit der
untersuchten Hunde als Resistenzmechanismus nicht von wesentlicher Bedeutung war.
Inwieweit die MRP1-Überexpression bei dem Patienten mit der gesteigerten MRP1-
Expression bei Rezidivausbildung von klinischer Relevanz war, ist ungewiss. Zwar kann in
vitro durch eine Steigerung der MRP1-Expresssion um 50% eine deutliche Herabsetzung der
Empfindlichkeit von Zellen gegen Doxorubicin (Senkung der IC50 um 50%) erzielt werden,
85
jedoch ist die Höhe der MRP1-Genexpression, die in vivo eine MDR vermitteln kann, bisher
nicht bekannt (GRANT et al. 1994; ZHAN et al. 1997).
In Transfektionsversuchen konnte gezeigt werden, dass neben P-Glykoprotein und MRP1
auch MRP2 eine Resistenz gegen verschiedene Zytostatika in vitro vermitteln kann (CUI et
al. 1999). In der vorliegenden Studie war weder in den unveränderten Lymphknotengeweben
noch in den Lymphomen zum Zeitpunkt der Diagnose oder Rezidivausbildung eine deutliche
Expression von MRP2 nachweisbar. Dieses weist darauf hin, dass MRP2 kein
Resistenzmechanismus bei den untersuchten Patienten war.
Schon seit einiger Zeit ist bekannt, dass die MDR1-Genexpression in Zellkulturen beim
Menschen durch Dexamethason zelltypspezifisch aktiviert werden kann (ZHAO et al. 1993).
Eine Behandlung mit Glukokortikoiden vor Chemotherapiebeginn gilt bei Hunden mit
Lymphomen als prognostisch ungünstig (PRICE et al. 1991). BERGMAN (2003) vermutet,
dass die schlechtere chemotherapeutische Beeinflussbarkeit von mit Glukokortikoiden
vorbehandelten Hunden möglicherweise mit einer Induktion der Expression von
P-Glykoprotein im Zusammenhang steht. Zur Prüfung dieser Hypothese wurde in der
vorliegenden Studie die Höhe der MDR1-Genexpression zwischen den mit Glukokortikoiden
vorbehandelten und den nicht mit Glukokortikoiden vorbehandelten Lymphomen verglichen.
Ein deutlicher Unterschied war jedoch nicht feststellbar. Auch bestand zwischen diesen
beiden Patientengruppen kein deutlicher Unterschied in der Länge des ersten rezidivfreien
Intervalls. An Zellkulturen gelang es ZHAO und Mitarbeitern zu zeigen, dass die Induktion
der MDR1-Genexpression durch Dexamethason sowohl zeit- als auch dosisabhängig ist
(ZHAO et al. 1993). Die Intensität und Dauer der Vorbehandlung variierten im eigenen
Patientenkollektiv stark. Es kann somit nicht ausgeschlossen werden, dass die Dosis und
Dauer der Glukokortikoidbehandlung bei einem Teil der untersuchten Patienten zu niedrig
waren, um eine Induktion der MDR1-Genexpression auszulösen.
Über den Effekt von Glukokortikoiden auf die MRP1-Expression ist bisher wenig bekannt.
ZHU und CENTER zeigten, dass der Promotor des humanen MRP1-Gens ein sogenanntes
glucocorticoid response element (GRE) enthält und vermuteten eine mögliche
Expressionssteigerung des MRP1-Gens durch Glukokortikoide (ZHU u. CENTER 1994). In
vitro konnte jedoch kein Einfluss von Dexamethason auf die Expression von MRP1 in
kaninen Osteosarkomzellinien oder humanen Kapillarendothelzellen nachgewiesen werden
86
(MEALEY et al. 2003, TOROK et al. 2003). Überraschenderweise wiesen in der
vorliegenden Studie die mit Glukokortikoiden vorbehandelten Lymphome eine höhere MRP1-
Genexpression auf als die nicht mit Glukokortikoiden vorbehandelten Tumoren. Eine
systematischere Prüfung des Zusammenhanges wäre wünschenswert.
Der Immunphänotyp gilt derzeit als einer der wichtigsten prognostischen Faktoren beim
malignen Lymphom des Hundes (MADEWELL 1999). In zahlreichen Studien ist ein
Zusammenhang zwischen dem Immunphänotyp und der Remissionsdauer oder der
Überlebenszeit aufgezeigt worden (GREENLEE et al. 1990; TESKE et al. 1994; DOBSON et
al. 2001). Es stellt sich somit die Frage, inwieweit sich T-Zell- und B-Zell-Lymphome
hinsichtlich der Höhe der MDR1-Genexpression unterscheiden. Beim Menschen ist eine
Korrelation zwischen der P-Glykoproteinexpression und dem Immunphänotyp von
Lymphomen bereits beschrieben worden (CHENG et al. 1993). Lee und Mitarbeiter konnten
dagegen beim Hund keinen Zusammenhang nachweisen (LEE et al. 1996). In der
vorliegenden Studie unterschied sich die Höhe der MDR1-Genexpression zwischen T-Zell-
und B-Zell-Lymphomen ebenfalls nicht deutlich. Überraschenderweise wiesen Hunde mit
einem T-Zell-Lymphom jedoch eine deutlich niedrigere MRP1-Genexpression im
Tumorgewebe auf als die Patienten mit einem B-Zell-Lymphom. Zukünftige Studien sind
erforderlich, um diese unerwarteten Studienergebnisse zu überprüfen.
Im Gegensatz zu MDR1, MRP1 und MRP2 gelang eine Etablierung einer RT-PCR zum
Nachweis einer Expression von Survivin auf Nukleinsäureebene beim Hund in dieser Studie
nicht. Alle zum Nachweis verwendeten Primer wurden so ausgewählt, dass eine 100%iger
Sequenzhomologie des Amplikons zwischen Mensch und Hund bestand. Zwar gelang der
Nachweis von Survivin in Kolonkarzinomgewebe und genomischer DNA vom Menschen,
jedoch nicht in genomischer DNA oder Plazentagewebe vom Hund. Die Integrität der
verwendeten cDNA und genomischen DNA wurde überprüft. Die Ergebnisse der
durchgeführten Vorversuche lassen weitere Untersuchungen, wie eine Überprüfung der aus
der Genbank entnommenen Survivinsequenz, als notwendig erscheinen.
In verschiedenen Studien wurde das maligne Lymphom des Hundes als mögliches Modell für
das Non-Hodgkin-Lymphom des Menschen vorgeschlagen. Als Voraussetzung für Studien
zur Modulation bestehender Vielfachresistenzen beim malignen Lymphom des Hundes wird
die Etablierung eines sensitiven und reproduktiven Untersuchungsverfahrens zum Nachweis
87
möglicher, mit der Ausprägung einer MDR in Zusammenhang stehender Mechanismen
angesehen. Mit den in der vorliegenden Studie etablierten RT-qPCR-Assays steht ein solches
Nachweisverfahren zur Verfügung.
Die Ergebnisse der Studie lassen vermuten, dass ein Teil der an malignem Lymphom
erkrankten Hunde von einer Modulation der P-Glykoprotein-Transporterfunktion profitieren
würde. Zukünftige Studien sind erforderlich, um diese Patienten prospektiv zu erfassen und
die Wirksamkeit und Sicherheit einer etwaigen Therapie zu prüfen.
88
6 ZUSAMMENFASSUNG
K. Culmsee
Klinische Relevanz der MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression beim malignen
Lymphom des Hundes
Eine systemische Chemotherapie ist derzeit die Therapie der Wahl bei Hunden mit
multizentrischen Lymphomen. Zwar spricht zu Behandlungsbeginn die überwiegende
Mehrheit der Tumoren sehr gut auf die Chemotherapie an, jedoch sind Rezidive aufgrund
erworbener Vielfachresistenzen (multidrug resistance, MDR) im Therapieverlauf relativ
häufig. Es wird angenommen, dass eine Steigerung der Expression verschiedener Gene, wie
z.B. des multidrug resistance 1–Gens (MDR1); der multidrug resistance associated-protein 1
(MRP1)- und 2 (MRP2)-Gene zur Ausprägung einer MDR führen können.
In der vorliegenden Studie wurde eine Reverse Transkription quantitative-Polymerase-
Kettenreaktion (RT-qPCR) im real time Modus zur Quantifizierung der MDR1-, MRP1- und
MRP2-Genexpression in gesunden und neoplastischen Geweben beim Hund etabliert.
Die MDR1-, MRP1- und MRP2-Genexpression wurde bei 50 an malignem Lymphom
erkrankten Hunden gemessen. Tumorgewebeproben wurden bei allen Patienten zum
Zeitpunkt der Diagnosestellung und bei 12 Hunden zusätzlich bei Ausbildung eines
Tumorrezidivs entnommen. 25 Hunde wurden mit einer Kombinationschemotherapie aus
L-Asparaginase, Vincristin, Cyclophosphamid, Doxorubicin und Prednisolon behandelt.
In allen untersuchten Tumorproben war eine Expression des MDR1- und MRP1-Gens
nachweisbar. Die Höhe der Expression variierte bei beiden Genen zwischen den untersuchten
Proben. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung wiesen 3 von 50 Lymphomen eine im Vergleich
zu unveränderten Lymphknotengewebe erhöhte MDR1- und 28 von 50 Lymphomen eine
erhöhte MRP1-Genexpression auf. Im Gegensatz zum MDR1- und MRP1-Gen war eine
Expression des MRP2-Gens in keinem der untersuchten Lymphome bei Diagnosestellung
oder zum Zeitpunkt des ersten Tumorrezidivs nachweisbar. Gastrointestinale Lymphome
wiesen eine höhere MDR1-Genexpression auf als multizentrische Lymphome (p=0,002).
Lymphompatienten, bei denen die MDR1-Genexpression im Vergleich zum
Lymphknotengewebe der Kontrolltiere nicht erhöht war, reagierten deutlich häufiger auf eine
89
Chemotherapie mit einer Vollremission als Hunde, bei den die MDR1-Genexpression
gesteigert war (p=0,002). So konnte bei keinem von drei Tumoren mit einer MDR1-
Genexpression höher als im Lymphknotengewebe der Kontrolltiere, aber bei 27 von 29
Tumoren ohne gesteigerter MDR1-Genexpression eine Vollremission erreicht werden. Ein
Zusammenhang zwischen der Therapieantwort und der Höhe der MRP1-Genexpression
bestand bei den untersuchten Patienten dagegen nicht (p=0,56).
Bei Patienten mit einem multizentrischen B-Zell-Lymphom unterschied sich die Länge des
ersten rezidivfreien Intervalls in Abhängigkeit zur Höhe der MDR1-Genexpression (p<0,001),
nicht aber in Abhängigkeit zur Höhe der MRP1-Genexpression.
Ein deutlicher Anstieg (≥ Faktor 2) der MDR1-Genexpression zwischen Diagnosestellung und
Rezidivausbildung war bei 7 von 12 Hunden nachweisbar. Dagegen war die Höhe der MRP1-
Genexpression zwischen Diagnosestellung und Rezidivausbildung mit Ausnahme eines
Hundes nicht wesentlich verändert. Bei den Hunden mit einem deutlichen Anstieg der MDR1-
Genexpression zwischen Diagnose und erstem Rezidiv war die mittlere Dauer des
rezidivfreien Intervalls signifikant kürzer (Median 133 Tage, 95% Konfidenzintervall 90 bis
176 Tage) als bei den Hunden ohne deutliche Änderung der MDR1-Genexpression
(n=4;Median 312 Tage, 95% Konfidenzintervall 216 bis 408 Tage; p=0,012).
Die Ergebnisse lassen vermuten, dass MDR1, aber nicht MRP1 oder MRP2 für die
Ausprägung einer Vielfachresistenz bei einem Teil der Patienten von Bedeutung war.
90
7 SUMMARY
K. Culmsee:
Clinical relevance of MRD1, MRP1 and MRP2 gene expression in canine lymphoma
In dogs, systemic chemotherapy for management of multicentric lymphoma is rewarding.
Although the majority of lymphomas initially respond well to chemotherapy, the development
of disease relapse due to multidrug resistance (MDR) is relatively common. Upregulation of
several genes thought to be involved in MDR including multidrug resistance 1 (MDR1),
multidrug resistance-associated protein 1 (MRP1) and 2 (MRP2).
In the present study, a real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction
assay (RT-qPCR) was established to accurately and reproducibly quantify the expression
levels of MDR1, MRP1 and MRP2 in canine normal and neoplastic tissues.
mRNA levels of MDR1, MRP1 and MRP2 were quantified in 50 dogs with lymphoma by RT-
qPCR. Tumor tissue samples were taken from all dogs at diagnosis and from 12 dogs at the
first relapse. All dogs underwent a combination chemotherapy (L-asparaginase, vincristine,
cyclophosphamide, doxorubicin, prednisolone).
MDR1 and MRP1 gene expression levels were detected in all samples analysed, with varying
copy numbers between the samples. At diagnosis in 3 of 50 lymphomas MDR1 expression
levels were higher than in normal lymph node tissue. Wheras, distinctly higher MRP1
expression levels were measuerd in 28 of 50 lymphomas. In contrast to MDR1 and MRP1, no
significant expression of MRP2 in any of the lymphomas at diagnosis or first relapse was
detectable. Interestingly, gastrointestinal lymphomas expressed higher MDR1-RNA levels
than multicentric lymphomas (p=0,002). When lymphomas were assigned based on their
MDR1 gene expression to groups there was a significant difference in ability to induce
complete (p=0,002) In none of three tumors with MDR1 expression levels higher than in
normal lymph node tissue, but in 27 of 29 tumors with no increase in MDR1 expression a
complete remission was achieved. In contrast there was no association between MRP1 mRNA
expression levels and achievement of complete remission detectable (p=0,56). Also, only high
MDR1 mRNA levels (p<0,001) but not high MRP1 levels, were associated with shorter
relapse-free intervals in dogs with multicentric B-cell lymphoma. There was a significant
91
increase (≥ factor 2) in MDR1 mRNA expression between diagnosis and first relapse in 7 of
12 dogs. Whereas MRP1 mRNA expression levels between diagnosis and first relapse were,
with the exception of one dog, unchanged. In dogs with an increase in MDR1 gene expression
between diagnosis and the first relapse (n=8) the median duration of relapse free interval was
significant shorter (median 133 days, 95% confidence interval 90 to 176 days) than in the
dogs with no clear change in MDR1 gene expression (n=4;median 312 days, 95% confidence
interval 216 to 408 days; p=0,012).
In conclusion the results of this study suggest that in contrast to MDR1, expression of MRP1
and MRP2 may not be a major mechanism of multidrug resistance for the majority of dogs
with lymphoma.
92
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9 ANHANG
9.1 Rasse und Alter der an Lymphom erkrankten Hunde
Tabelle 25: Rasse und Alter der an malignem Lymphom erkrankten Hunde
Tier-Nr. Rasse Alter (Jahre) P1 Dandie-Diamond-Terrier 11 P2 Dobermann 5 P3 Bouvier des Flandres 7 P4 Bouvier des Flandres 7 P5 Kleiner Münsterländer 7 P6 Weimaraner 5 P7 Deutsch-Drahthaar 6 P8 Dandie-Diamond-Terrier 1 P9 Bouvier des Flandres 5 P10 Berner Sennenhund 6 P11 Berner Sennenhund 7 P12 Boxer 6 P13 Neufundländer 4 P14 Riesen Schnauzer 5 P15 West Highland White Terrier 11 P16 Dobermann 7 P17 Rottweiler 4 P18 Schweißhund 7 P19 Schweißhund 5 P20 Dobermann 7 P21 Mischling 5 P22 Berner Sennenhund 5 P23 Mischling 7 P24 Mischling 6 P25 Mischling 7
127
Tabelle 25 Fortsetzung
Tier-Nr. Rasse Alter (Jahre) P26 Mischling 8 P27 Mischling 6 P28 West Highland White Terrier 11 P29 Golden Retriever 8 P30 Deutsche Schäferhund 8 P31 Yorkshire-Terrier 13 P32 Boxer 6 P33 Hovawart 7 P34 Bobtail 6 P35 Staffordshire-Terrier 5 P36 Yorkshire-Terrier 13 P37 Jack-Russel-Terrier 8 P38 West Highland White Terrier 8 P39 Collie 10 P40 West Highland White Terrier 8 P41 Boxer 11 P42 Foxterrier 8 P43 Mischling 11 P44 Golden Retriever 4 P45 Mischling 10 P46 Jack-Russel-Terrier 10 P47 Mischling 7 P48 Golden Retriever 8 P49 Berner Sennenhund 9 P50 Pon 0
128
9.2 Rezepturen der verwendeten Lösungen und Gele
10%iges, neutralgepuffertes Formalin nach LILLIE
100 ml Formalin (37%iges Formaldehyd) werden mit 4 g Natriumdihydrogenphosphat und
6,5 g Dinatriumhydrogenphosphat in 1 l dest. Wasser gelöst.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (0,05 molar, pH=7,25)
40g Natriumchlorid und 7,8 g Natriumdihydrogenphosphat werden in etwas weniger als
5 l dest. Wasser gelöst. Der PH-Wert wird mit Normalnatronlauge (ca. 40 ml) auf 7,25
eingestellt und die Lösung mit dest. Wasser auf 5 l aufgefüllt.
Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (Fa. Vector Laboratories)
Für 1 ml Reagenz werden 1ml PBS, 15 µl Avidin-Lösung (Reagenz A) und 15 µl biotinylierte
Peroxidase (Reagenz B) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert (nach Zugabe der
Reagenzien A und B Lösung jeweils kurz mischen).
Lösung für die enzymhistochemische Farbreaktion (3,3 Diaminobenzidin 0,05%)
Für 200 ml Lösung werden 100 mg 3,3’-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) in
50 ml PBS über mehrere Stunden gelöst (Stammlösung 0,2%ig, Lagerung bei –25 °C im
Dunkeln). Vor Gebrauch wird die Stammlösung 1:4 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung
verdünnt und filtriert (Faltenfilter, Fa. Schleicher & Schuell). Der filtrierten Lösung werden
2 ml Wasserstoffperoxid (3%ig) zugesetzt.
Färbelösung Hämalaun nach MAYER
Für 2 l Färbelösung werden 1g Hämatoxylin mit 1 l dest. Wasser gelöst. Anschließend werden
in der Hämatoxylinlösung 200 mg Natriumjodat (NaJO3) und 50 g Kalialaun unter Schütteln
gelöst (blauviolette Lösung). Die Lösung wird mit 50 g Chloralhydrat und 1 l Zitronensäure
versetzt (rotviolette Lösung).
129
DEPC-behandeltes destilliertes Wasser (0,01%)
100 mg Diethylpyrocarbonat (DEPC) mit 1 l dest. Wasser in Glasflasche vermischen. Über
Nacht stehen lassen und autoklavieren.
Tris-Borat-EDTA-(TBE)-Puffer (5 x)
Für 1 l einer 5-fach konzentrierten Stocklösung des TBE-Puffers werden 54 g TRIS,
27,5 g Borsäure (H3BO3) und 20 ml 0,5 M EDTA (pH=8) mit dest. Wasser auf 1 l aufgefüllt.
1% iges Agarosegel
Für ein 1%iges Agarosegel werden 1 g Agarose in 100 ml 0,5 x TBE-Puffer suspendiert, in
der Mikrowelle kurz aufgekocht und bei Raumtemperatur auf 50-60 °C abkühlen gelassen.
Nach Zugabe von Ethidiumbromid (10 µg) wird die Lösung in die abgedichtete Gelkammer
mit eingesetzter Taschenschablone gegossen und 30-60 min bei Raumtemperatur bis zur
Gelbildung stehen gelassen.
9.3 Verwendete Formeln und Gleichungen
Berechnung der Gesamt-RNA-Konzentration
c (µg/ml) = OD260 x VF x 40 mg/µl
(c: Gesamt-RNA-Konzentration der Ausgangslösung; VF: Verdünnungsfaktor)
Berechnung der DNA-Konzentration
c (µg/ml) = OD260 x VF x 50 µg/ml
(c: DNA-Konzentration der Ausgangslösung; VF: Verdünnungsfaktor)
Berechnung der PCR-Produktanzahl
1µg eines 4361 bp langen PCR-Produktes entsprechen 2,1 x1011 Moleküle
130
9.4 Ergebnisse der RT-qPCR-Messdurchgänge
Tabelle 26: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
Ct-Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - Lebergewebe - K1 25,22 0,01 31,41 0,21 30.053 172 201 27 K2 25,05 0,31 31,33 0,21 34.090 6.978 212 28 K3 24,37 0,02 31,60 0,62 23.597 235 239 87 K4 25,71 0,45 32,04 0,23 22.347 6.278 133 20 K5 24,86 0,44 32,24 0,50 14.847 805 156 54 K6 24,71 0,29 32,73 0,53 42.577 7.983 169 57 K10 26,09 0,15 33,07 0,30 5.506 562 46 8 K11 25,86 0,28 32,64 0,38 9.376 1.862 95 13 K12 25,01 0,11 33,06 0,19 11.310 774 74 10 K13 24,02 0,11 31,28 0,19 28.617 2.121 216 28 K16 23,90 0,11 31,91 0,39 24.207 1.791 135 34 K17 26,13 0,05 33,53 0,33 7.721 254 51 12 K18 25,35 0,20 32,91 0,10 26.234 3.450 154 10 K19 25,31 0,18 32,21 0,01 9.162 1.117 108 0
- Lymphknotengewebe - K1 27,44 0,10 29,72 0,17 4.573 361 571 61 K2 27,52 0,06 30,95 0,20 4.289 175 254 34 K3 27,00 0,18 30,18 0,10 6.075 729 419 27 K4 27,80 0,15 29,20 0,19 3.581 338 805 105 K5 27,73 0,07 30,26 0,33 3.735 156 405 90 K6 28,10 0,14 30,67 0,31 1.684 155 207 44 K7 27,60 0,04 30,07 0,20 4.083 93 452 60 K8 27,84 0,13 30,04 0,02 3.487 305 461 7 K9 / LMD 25,59 0,10 30,29 0,48 4.284 287 339 104 K9 / LMS 25,96 0,18 30,29 0,11 3.209 417 330 24 K9 / LCSD 26,13 0,05 31,09 0,23 3.024 99 196 28 K9 / LCSS 25,77 0,31 30,75 0,24 4.130 725 244 36 K9 / LPD 27,47 0,37 33,97 0,25 3.102 731 80 13 K9 / LPS 25,87 0,38 30,31 0,20 7.456 2.287 246 34 K9 / LJ1 25,02 0,08 30,22 0,34 6.409 339 350 79 K9 / LJ2 25,24 0,14 30,46 0,16 5.549 501 295 30 K10 27,56 0,11 30,33 0,12 4.185 309 381 30 K11 27,41 0,19 31,55 0,30 1.302 167 102 28 K12 29,72 0,16 34,07 0,08 550 58 44 10 K13 27,66 0,24 33,27 0,85 1.106 179 48 25 K14 26,71 0,14 30,88 0,16 5.251 488 314 33 K15 26,95 0,07 31,17 0,12 4.426 216 254 21
131
Tabelle 27: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - Lebergewebe - K1 25,42 0,11 32,79 0,22 11.970 856 106 15 K2 23,60 0,45 31,25 0,28 23.857 6.855 221 39 K3 24,16 0,53 31,87 0,15 16.683 6.114 146 15 K4 24,16 0,21 32,17 0,18 16.035 2.199 120 14 K5 24,99 0,33 32,81 0,35 9.333 2.178 79 18 K6 24,56 0,02 32,45 0,33 17.403 210 73 17 K10 26,10 0,34 35,04 0,67 6.988 1680 56 22 K11 26,09 0,14 34,24 0,52 3.464 324 46 14 K12 25,04 0,19 35,10 0,65 14.030 1798 52 22 K13 23,37 0,07 32,75 0,14 1.397 1.019 119 11 K16 24,25 0,19 31,91 0,33 2.537 2.807 122 27 K17 25,78 0,24 32,32 0,24 9.536 1.539 63 10 K18 25,41 0,15 32,41 0,36 24.286 2.482 120 28 K19 25,65 0,06 32,19 0,58 8.552 343 111 22
- Lymphknotengewebe - K1 26,70 0,22 29,78 0,56 3.654 505 384 26 K2 26,97 0,17 30,63 0,34 3.068 347 238 18 K3 26,43 0,15 30,25 0,17 4.370 418 349 42 K4 26,90 0,16 29,19 0,16 3.182 326 702 75 K5 26,03 0,13 29,58 0,14 5.669 461 543 52 K6 26,43 0,30 29,62 0,09 4.409 823 481 60 K7 25,92 0,09 29,19 0,14 6.077 354 703 63 K8 25,38 0,13 29,06 0,11 8.688 772 756 56 K9 / LMD 26,09 0,60 31,23 0,17 9.388 4.012 819 92 K9 / LMS 25,50 0,29 31,09 0,36 13.190 2.616 912 208 K9 / LCSD 25,64 0,43 30,84 0,10 4.839 1.312 320 21 K9 / LCSS 25,75 0,81 31,16 0,22 12.216 6.921 857 116 K9 / LPD 26,17 0,36 31,28 0,22 7.477 1.578 247 38 K9 / LPS 26,25 0,36 30,92 0,20 8.050 2.000 311 43 K9 / LJ1 24,08 0,38 30,80 0,65 33.620 8.579 1.142 467 K9 / LJ2 24,96 0,47 29,90 0,36 8.567 2.621 523 63 K10 27,19 0,10 30,51 0,10 3.738 242 461 30 K11 27,90 0,10 31,31 0,17 2.347 157 276 30 K12 29,26 0,41 34,37 0,13 323 83 19 2 K13 26,44 0,18 32,37 0,45 2.101 260 78 26 K14 26,38 0,12 30,05 0,23 6.998 1.440 295 45 K15 26,84 0,08 30,16 0,19 4.647 257 274 36
132
Tabelle 28: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung -
P01 29,71 0,33 31,37 0,38 661 136 1.191 305 P02 27,61 0,33 33,44 0,23 782 161 26 4 P03 25,46 0,50 29,23 0,12 3.512 1.104 461 36 P04 30,78 0,41 30,44 0,33 90 23 204 45 P05 28,15 0,13 28,23 0,11 613 54 1.004 76 P06 28,50 0,19 30,66 0,10 487 61 197 13 P07 32,45 0,41 32,08 0,22 74 20 144 21 P08 32,17 0,24 31,11 0,04 89 13 270 7 P09 29,50 0,12 30,57 0,44 508 41 395 106 P10 31,69 0,19 31,82 0,07 64 8 128 6 P11 28,55 0,10 30,60 0,38 530 35 305 73 P12 28,77 0,20 30,95 0,13 407 56 163 15 P13 29,77 0,15 33,06 0,46 233 24 56 18 P14 33,80 0,24 30,90 0,43 21 4 153 42 P15 30,83 0,22 30,58 0,21 152 23 188 27 P16 26,95 0,11 29,34 0,43 2.238 165 878 225 P17 32,84 0,07 30,28 0,58 220 10 347 65 P18 30,81 0,57 30,51 0,35 766 315 369 86 P19 28,90 0,53 30,08 0,35 2.689 969 488 109 P20 28,08 0,04 34,02 0,12 1.354 30 24 2 P21 21,98 0,03 31,32 0,16 71.475 1.633 209 22 P22 30,37 0,14 30,83 0,25 296 27 185 19 P23 31,04 0,06 31,10 0,11 189 8 168 12 P24 27,96 0,08 30,28 0,04 1.210 70 218 7 P25 24,99 0,18 29,62 0,12 10.176 1.155 632 48 P26 30,46 0,22 29,17 0,10 217 32 470 33 P27 27,36 0,02 31,01 0,32 1.832 29 134 29 P28 28,34 0,12 30,94 0,10 1.162 90 268 19 P29 31,87 0,50 29,72 0,04 88 28 624 15 P30 32,36 0,56 30,78 0,26 44 18 163 28 P31 30,23 0,10 29,74 0,33 177 11 329 67 P32 30,55 0,10 31,72 0,86 216 14 154 16
133
Tabelle 28 Fortsetzung
Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung -
P33 27,74 0,17 28,96 0,13 1.380 151 1.284 105 P34 29,91 0,20 29,81 0,25 310 38 622 111 P35 27,08 0,01 31,97 0,25 2.128 10 182 31 P36 29,70 0,19 31,79 0,85 378 47 223 109 P37 32,40 0,35 31,12 0,20 110 26 253 33 P38 27,58 0,12 29,51 0,19 1.434 117 758 105 P39 29,43 0,12 29,49 0,11 775 59 736 51 P40 29,24 0,17 29,93 0,11 480 52 585 41 P41 26,27 0,04 33,95 0,29 3.703 107 33 6 P42 30,18 0,08 28,52 0,06 309 16 1.346 56 P43 28,52 0,28 29,67 0,45 1.287 228 412 123 P44 24,32 0,03 29,04 0,18 12.297 215 1.023 119 P45 27,04 0,28 29,91 0,19 2.071 398 551 70 P46 28,42 0,08 30,29 0,84 1.606 88 274 142 P47 30,84 0,46 30,72 0,40 210 69 308 87 P48 29,63 0,03 32,13 0,44 488 11 156 49 P49 29,49 0,25 30,96 0,47 546 90 348 115 P50 32,99 0,67 30,31 0,02 79 30 463 6
- Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Rezidivausbildung - P07 31,24 0,13 30,42 0,18 68 6 367 45 P09 31,28 0,26 32,18 0,06 135 24 157 7 P11 26,94 0,08 31,40 0,39 4.030 200 1.172 281 P12 29,05 0,14 31,01 0,57 967 96 271 107 P22 31,03 0,11 32,07 0,25 178 13 120 22 P26 27,83 0,15 31,73 0,35 1.222 127 164 37 P28 27,79 0,33 31,48 0,28 1.680 359 180 34 P30 31,07 0,43 31,12 0,06 255 73 240 10 P32 27,21 0,08 31,34 0,21 1.955 97 273 39 P39 28,97 0,60 29,95 0,39 1.186 439 609 170 P42 29,91 0,21 29,13 0,06 636 87 1.126 44 P46 26,82 0,21 32,07 0,32 4.868 672 139 30
134
Tabelle 29: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MDR1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
C -Wert t Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung - P01 28,56 0,93 29,38 0,26 554 114 840 132 P02 27,37 0,10 32,99 0,26 1.035 71 42 7 P03 24,99 0,09 28,88 0,24 5.032 305 654 110 P04 30,65 0,50 30,84 0,22 95 6 177 26 P05 28,32 0,19 28,17 0,16 476 60 953 103 P06 28,62 0,15 30,66 0,23 389 39 174 27 P07 32,11 0,29 31,40 0,13 36 7 104 9 P08 31,74 0,06 30,50 0,37 225 10 980 230 P09 29,11 0,15 30,78 0,39 364 36 270 70 P10 31,29 0,11 31,35 0,34 157 11 235 50 P11 28,43 0,08 29,82 0,02 1.023 49 631 8 P12 29,19 0,12 31,41 0,20 621 47 223 28 P13 29,29 0,32 31,67 0,31 1.450 315 510 100 P14 33,37 0,54 30,24 0,17 350 110 4.140 440 P15 30,17 0,02 30,26 0,24 545 8 820 121 P16 27,54 0,12 29,76 0,51 3.022 241 1.164 367 P17 30,58 0,14 30,25 0,53 229 22 346 16 P18 29,25 0,09 30,65 0,72 1.102 64 700 306 P19 27,50 0,17 29,98 0,12 1.758 185 506 40 P20 27,58 0,07 33,24 0,30 1.320 59 31 6 P21 21,32 0,07 30,37 0,23 85.060 3.858 215 32 P22 29,77 0,73 31,80 0,62 263 22 137 16 P23 30,28 0,10 31,16 0,27 242 16 234 43 P24 28,33 0,09 31,52 0,34 2,770 308 498 48 P25 25,19 0,65 29,48 0,20 10.080 521 714 92 P26 31,57 0,41 30,74 0,19 136 34 215 28 P27 28,28 0,06 31,96 0,08 2.045 85 112 7 P28 27,88 0,14 30,30 0,03 1.079 97 225 4 P29 31,42 0,36 30,05 0,02 110 28 421 5 P30 33,13 0,49 32,31 0,16 64 23 107 11 P31 31,29 0,16 30,87 0,04 255 32 242 2 P32 31,98 0,19 31,99 0,05 167 20 109 4
135
Tabelle 29 Fortsetzung
Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MDR1 HPRT MDR1 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung - P33 29,18 0,08 29,42 0,22 1.110 55 659 104 P34 29,92 0,21 30,55 0,13 289 29 315 0 P35 27,98 0,18 31,57 0,25 2.027 244 189 32 P36 30,02 0,10 30,26 0,28 472 31 270 50 P37 31,65 0,36 31,68 0,09 138 31 165 10 P38 27,66 0,14 29,79 0,05 1.493 138 498 19 P39 29,41 0,16 29,74 0,04 579 57 583 12 P40 29,15 0,18 30,46 0,16 527 64 321 33 P41 27,06 0,19 34,44 0,10 5.358 672 36 2 P42 30,73 0,06 29,23 0,15 245 10 814 84 P43 28,17 0,04 30,17 0,12 1.154 26 452 35 P44 24,57 0,74 27,44 0,29 18.472 7.649 1.802 328 P45 28,56 0,12 30,98 0,63 1.534 119 360 158 P46 28,97 0,13 31,26 0,43 1.133 103 247 68 P47 30,34 0,11 30,05 0,29 333 24 252 192 P48 30,29 0,16 30,14 0,48 348 38 157 42 P49* 30,24 0,22 29,88 0,35 724 112 420 156 P50 32,82 0,32 29,38 0,06 86 17 462 19
- - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Rezidivausbildung - P07 31,45 0,32 29,79 0,27 111 26 309 56 P09 32,59 0,38 33,08 0,85 270 70 350 165 P11 26,85 0,21 30,29 0,41 1.298 185 408 118 P12 29,05 0,10 30,56 0,47 998 66 376 106 P22 30,80 0,09 31,90 0,18 244 15 121 15 P26 29,40 0,31 31,85 0,19 803 174 157 19 P28 27,71 0,17 30,78 0,18 2.676 301 390 46 P30 30,99 0,27 31,09 0,23 137 24 133 21 P32 28,07 0,10 31,15 0,18 1.865 122 236 30 P39 28,41 0,09 28,53 0,13 1.625 92 825 73 P42 30,61 0,27 29,12 0,18 571 98 843 100 P46 26,28 0,27 30,98 0,20 6.841 1.289 156 21
136
Tabelle 30: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
Ct-Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - Lebergewebe - K1 31,74 0,17 32,99 0,65 679 76 42 20 K2 30,41 0,26 32,34 0,25 1.692 317 62 10 K3 31,30 0,12 31,96 0,06 917 79 80 3 K4 29,69 0,08 31,62 0,30 2.750 133 103 22 K5 30,45 0,20 32,14 0,33 1.641 219 72 17 K6 29,38 0,15 32,64 0,35 5.024 487 117 28 K10 31,24 0,15 33,62 0,41 2.637 237 84 23 K11 30,32 0,13 31,30 0,21 3.911 332 249 34 K12 32,57 0,52 34,33 0,06 944 309 32 1 K13 28,60 0,46 30,64 0,07 6.049 1.922 359 16 K16 29,32 0,29 31,68 0,26 7.452 1.251 194 36 K17 32,02 0,17 32,52 0,53 2.282 239 161 60 K18 31,49 0,18 31,86 0,24 1.843 216 171 28 K19 31,45 0,52 31,61 0,37 1.953 611 205 47
- Lymphknotengewebe - K1 25,85 0,24 29,25 0,01 48.305 7,474 380 2 K2 27,67 0,61 31,24 0,06 11.455 4.130 241 9 K3 27,04 0,19 30,00 0,39 32.597 4.420 244 60 K4 25,72 0,70 29,74 0,05 43.973 17.694 268 12 K5 25,66 0,12 29,80 0,23 43.100 3.443 357 56 K6 26,09 0,15 31,14 0,28 78.087 7.432 293 52 K7 25,46 0,12 30,92 0,27 71.247 5.840 358 62 K8 25,93 0,10 30,06 0,17 25.680 1.880 337 38 K9 / LMD 26,13 0,08 30,56 0,31 51.530 8.150 326 123 K9 / LMS 26,17 0,29 31,27 0,17 30.147 5.846 238 26 K9 / LCSD 25,20 0,10 31,42 0,27 57.373 3.639 216 36 K9 / LCSS 24,95 0,16 21,24 0,03 67.933 7.337 241 4 K9 / LPD 0,11 27,76 0,34 31,22 20.337 4.458 103 8 K9 / LPS 24,98 0,07 31,24 0,03 66.040 2.786 241 4 K9 / LJ1 25,14 0,16 30,73 0,18 60.013 6.273 341 38 K9 / LJ2 25,98 0,11 31,38 0,30 34.003 2.539 222 44 K10 0,58 221 27,44 0,22 30,70 27.027 4.116 577 K11 26,19 0,24 31,38 0,35 67.707 9.812 350 80 K12 29,58 0,11 33,68 0,43 6.377 481 75 19 K13 26,12 0,16 30,32 0,13 65.130 6.746 709 62 K14 26,21 0,08 30,75 0,09 61.073 3.225 530 32 K15 26,90 0,21 31,32 0,16 38.840 5.333 361 39
137
Tabelle : Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in unverändertenmLeber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
31
Ct-Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - Lebergewebe - K1 30,48 0,21 32,05 0,17 3.306 450 159 18 K2 29,74 0,17 31,15 0,22 6.460 715 163 22 K3 31,73 0,17 31,32 0,21 1.850 198 146 21 K4 29,70 0,16 31,20 0,21 6.625 719 157 21 K5 31,77 0,12 34,20 0,23 3.065 250 152 22 K6 31,10 0,37 32,95 0,12 27.29 630 50 4 K10 30,55 0,06 32,22 0,15 5.894 237 190 18 K11 30,70 0,29 31,53 0,06 5.426 995 296 12 K12 31,05 0,22 33,70 0,59 4.305 611 76 31 K13 30,42 0,14 30,03 0,14 4.455 395 369 35 K16 30,26 0,13 32,89 0,21 4.055 366 125 17 K17 31,74 0,33 33,59 0,40 1.529 319 79 21 K18 31,65 0,17 32,69 0,33 1.605 189 144 32 K19 31,33 0,23 32,63 0,07 1.988 307 148 7
- Lymphknotengewebe - K1 26,69 0,25 29,36 0,03 45.562 7.346 528 8 K2 28,56 0,27 31,95 0,12 11.985 2.108 169 13 K3 26,11 0,12 31,04 0,04 31.480 2.672 151 4 K4 26,78 0,07 31,09 0,01 76.660 3.691 1.137 11 K5 25,26 0,05 29,86 0,04 113.100 8.890 674 19 K6 26,20 0,05 30,37 0,14 61.750 1.949 272 24 K7 25,65 0,28 30,52 0,16 83.453 15.313 437 46 K8 26,58 0,29 29,70 0,14 45.590 9.017 295 30 K9 / LMD 26,35 0,25 30,14 0,55 40.910 8.259 206 9 K9 / LMS 25,99 0,15 29,05 0,21 64.797 6.319 636 85 K9 / LCSD 25,37 0,11 31,34 0,26 38.007 2.867 141 25 K9 / LCSS 25,86 0,11 30,39 0,21 70.520 4.785 265 38 K9 / LPD 25,71 0,02 31,70 0,05 40.017 1.055 163 19 K9 / LPS 26,01 0,24 31,53 0,11 65.380 10.600 223 16 K9 / LJ1 25,55 0,19 30,90 0,46 33.710 4.270 196 64 K9 / LJ2 26,65 0,07 29,96 0,30 42.253 1.906 352 72 K10 28,62 0,57 31,85 0,63 19.487 7.576 307 119 K11 26,10 0,49 31,38 0,23 74.110 21.185 349 52 K12 30,55 0,36 33,30 0,33 6.042 1.306 94 19 K13 26,65 0,39 29,93 0,13 76.140 17.955 851 73 K14 26,41 0,14 30,77 0,40 87.403 7.974 501 132 K15 27,05 0,27 31,01 0,35 57.907 9.727 424 103
138
Tabelle 32: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang I. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung - P01 28,90 0,36 30,55 0,06 36.667 9.092 226 9 P02 31,10 0,10 34,33 0,60 8.257 540 28 12 P03 32,08 0,02 29,07 0,06 5.232 53 627 25 P04 27,93 0,15 29,86 0,20 81.733 8.250 369 53 P05 29,90 0,29 29,48 0,18 18.477 3.805 659 79 P06 27,72 0,27 30,38 0,19 134.533 24.075 338 17 P07 23,49 0,01 31,21 0,16 172.500 424 282 30 P08 28,61 0,36 31,39 0,03 207.225 48.620 925 15 P09 24,23 0,12 29,89 0,44 54.883 4.550 218 70 P10 25,19 0,01 33,23 0,13 135.600 1.153 69 6 P11 27,13 0,49 31,03 0,18 62.967 9.935 286 14 P12 25,47 0,13 31,53 0,29 23.350 2.153 69 13 P13 33,34 0,45 32,41 0,10 9.560 2.580 470 30 P14 28,84 0,26 32,21 0,21 61.985 10.035 1.020 135 P15 25,78 0,15 32,59 0,23 90.563 9.459 108 17 P16 27,14 0,13 30,75 0,07 118.533 10.904 198 9 P17 26,76 0,21 30,36 0,23 153.833 20.733 260 37 P18 28,18 0,64 31,66 0,16 120.394 51.472 310 85 P19 25,79 0,11 28,94 0,12 114.533 8.456 849 69 P20 30,30 0,21 33,55 0,41 14.083 1.918 31 8 P21 29,75 0,60 31,25 0,12 10.650 3.868 141 12 P22 26,19 0,15 31,92 0,28 116.067 11.545 242 43 P23 24,66 0,12 30,98 0,06 20.462 1.650 100 4 P24 33,82 0,31 31,03 0,36 3.340 674 342 42 P25 30,03 0,62 30,63 0,24 8.865 3.883 217 35 P26 24,89 0,33 32,11 0,30 137.767 33.201 152 33 P27 24,64 0,10 30,17 0,38 463.300 29.816 589 154 P28 27,04 0,13 32,10 0,08 49.783 4.274 104 6 P29 25,35 0,11 32,00 0,37 117.300 8.106 237 60 P30 26,27 0,05 32,40 0,14 82.723 2.565 86 8 P31 24,26 0,25 32,46 0,34 237.000 36.626 175 41 P32 28,23 0,13 32,46 0,41 30.907 2.759 194 25
139
Tabelle 32 Fortsetzung:
Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung -
P33 24,82 0,25 29,29 0,11 179.167 27.339 1.003 78 P34 28,93 0,21 30,66 0,34 7.905 1.103 421 99 P35 26,01 0,22 31,01 0,11 107.937 16.448 498 36
25,27 0,11 30,56 0,18 26.797 2.013 134 16 P37 24,30 0,03 31,95 0,45 54.093 915 200 67 P38 26,67 0,07 30,37 0,20 62.913 2.642 452 59 P39 23,63 0,21 30,63 0,22 80.900 10.310 458 40 P40 26,50 0,22 31,52 0,20 62.780 16.025 213 27 P41 26,12 0,15 33,35 0,25 30.006 2.990 38 6 P42 25,80 0,08 30,70 0,16 91.493 4.591 639 61 P43 25,96 0,37 31,19 0,36 113.347 29.387 449 107 P44 25,95 0,12 29,48 0,19 92.313 7.028 489 61 P45 29,02 0,37 30,93 0,19 61.670 2.426 312 38 P46 24,50 0,16 30,77 0,28 212.600 21.180 631 110 P47 24,46 0,21 31,69 0,43 355.967 48.850 284 84 P48 25,91 0,10 31,85 0,49 138.667 9.226 257 85 P49* 25,77 0,12 30,66 0,41 158.200 15.027 555 158 P50 28,65 0,11 29,50 0,18 35.433 2.610 804 108
- Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Rezidivausbildung - P07 24,38 0,06 30,14 0,17 132.500 5.200 364 49 P09 27,54 0,23 32,94 0,50 48.706 17.785 365 120 P11 24,06 0,73 30,79 0,30 187.100 14.234 448 33 P12 25,15 0,05 32,08 0,12 138.933 4.479 267 21 P22 27,85 0,25 33,73 1,26 138.567 25.576 543 62 P26 24,72 0,17 32,69 0,40 132.700 15.650 145 41 P28 25,52 0,22 31,65 0,57 87.490 14.059 217 76 P30 25,19 0,34 31,03 0,10 112.613 23.217 252 16 P32 28,08 0,03 31,12 0,07 17.013 290 237 11 P39 25,92 0,33 29,04 0,16 127.467 24.953 1.095 119 P42 23,91 0,50 30,00 0,23 321.200 111.061 1043 156 P46 24,99 0,15 31,76 0,22 154.00 15.012 330 46
P36
140
Tabelle 33: Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP1-Genexpression in Tumorgewebe von an malignem Lymphom erkrankten Hunden. Messdurchgang II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung -
P01 28,33 0,19 30,04 0,34 88.277 10.975 409 97 P02 32,40 0,06 33,85 0,31 5.536 214 31 7 P03 31,15 0,08 30,27 0,17 6.795 336 470 20 P04 28,01 0,87 31,44 0,22 60.590 27.997 204 31 P05 30,94 0,32 3.357 29,58 0,26 15.147 554 92 P06 28,00 0,02 32,12 0,10 19.217 309 146 9 P07 23,93 0,01 30,03 0,44 66.730 750 198 58 P08 29,84 0,74 32,47 0,07 121.550 35.205 390 15 P09 23,85 0,10 31,13 0,12 135.200 8.854 295 24 P10 25,66 0,20 31,27 0,36 542.450 73.893 178 43 P11 25,84 0,14 30,58 0,48 80.707 7.285 340 115 P12 24,96 0,21 32,13 0,11 63.307 8.903 150 11 P13 33,33 0,59 32,40 0,14 13.835 4745 455 40 P14 30,66 0,53 32,37 0,29 33.115 10.665 900 170 P15 25,15 0,17 31,08 0,30 174.567 18.733 208 43 P16 26,63 0,08 30,41 0,11 209.933 11.949 340 23 P17 26,77 0,12 30,58 0,20 191.667 14.840 306 41 P18 26,69 0,17 31,23 0,51 246.000 26.794 598 184 P19 27,61 0,07 29,31 0,18 110.533 5.254 711 85 P20 29,90 0,07 35,75 0,49 8.559 2.989 14 5 P21 29,84 0,16 31,61 0,20 16.343 1.736 182 23 P22 24,46 0,01 30,02 0,17 137.350 1.768 415 47 P23 26,21 0,13 32,39 0,31 49.227 4.201 175 36 P24 33,46 0,05 32,34 0,50 2.944 90 230 74 P25 29,34 0,50 29,05 0,26 33.167 9.901 640 115 P26 23,98 0,18 30,44 0,23 381.367 46.165 315 49 P27 25,25 0,07 32,05 0,13 35.153 1.500 152 5 P28 26,91 0,12 31,37 0,09 114.283 9.456 213 12 P29 25,28 0,30 30,39 0,07 118.410 23.201 371 17 P30 25,68 0,07 32,18 0,15 89.560 4.327 115 11 P31 24,99 0,15 31,61 0,06 194.533 19.176 145 4 P32 28,01 0,10 32,92 0,10 14.883 942 121 8
141
Tabelle 33 Fortsetzung:
Ct -Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP1 HPRT MRP1 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Diagnosestellung - P33 24,79 0,30 29,25 0,17 141.067 33.497 935 102 P34 29,02 0,39 30,83 0,36 12.021 3.196 363 81 P35 24,37 0,14 240 30,09 1,32 50.120 4.615 203 P36 26,48 0,27 32,63 0,33 41.380 7.667 149 35 P37 24,05 0,27 31,57 0,06 33.220 5.517 119 5 P38 26,44 0,23 30,59 0,25 81.747 12.390 660 110 P39 23,72 0,05 29,84 0,31 41.187 1.412 387 85 P40 24,61 0,01 30,62 0,92 164.600 849 482 275 P41 26,23 0,08 34,72 0,30 20.124 7.978 28 6 P42 25,32 0,16 29,32 0,41 141.636 14.512 716 306 P43 27,45 0,57 32,25 0,64 39.550 15.411 137 57 P44 26,89 0,32 30,18 0,03 94.990 21.859 571 12 P45 29,02 0,37 30,93 0,19 99.077 24.643 294 63 P46 24,35 0,15 31,10 0,03 196.100 2.687 303 7 P47 23,75 0,52 31,71 0,36 404.867 132.873 219 97 P48 24,78 0,06 31,67 0,19 176.167 6.615 349 41 P49 25,39 0,29 31,19 0,40 137.300 15.136 451 112 P50 30,68 0,30 29,86 0,21 12.820 2.503 495 67
- Tumorgewebe von an Lymphom erkrankten Hunden bei Rezidivausbildung - P07 23,07 0,06 30,58 0,32 230.100 8.883 437 99 P09 26,27 0,15 33,21 0,29 128.465 1.257 365 70 P11 25,15 0,18 29,76 0,35 79.673 9.167 484 106 P12 23,99 0,27 30,79 0,35 124.133 23.674 380 91 P22 25,83 0,28 32,75 0,32 146.767 25.891 141 31 P26 24,02 0,12 30,97 0,06 237.067 18.499 261 10 P28 25,07 0,09 32,14 0,14 149.967 10.563 238 21 P30 26,22 0,02 32,94 0,34 34.813 490 54 12 P32 28,81 0,21 32,42 0,47 21.207 2.762 177 50 P39 26,36 0,38 29,40 0,43 101.860 23.946 686 179 P42 24,66 0,13 29,46 0,15 312.567 26.931 1.209 106 P46 25,88 0,27 32,11 0,01 68.030 12.577 149 5
142
Tabelle : Ergebnisse der RT-qPCR zur Messung der MRP2-Genexpression in unverändertem Leber- und Lymphknotengewebe. Messdurchgang I und II. MW: arithmetischer Mittelwert, s: Standardabweichung
34
Ct-Wert Kopien pro 50 ng Gesamt-RNA MRP2 HPRT MRP2 HPRT Nr.
MW SD MW SD MW SD MW SD - Lebergewebe – Messung I K1 25,58 0,11 32,64 0,63 6.474 463 97 38 K2 25,02 0,06 28,59 0,28 9.350 351 1.305 240 K3 24,69 0,21 31,61 0,34 11.663 1.499 184 39 K4 25,08 0,21 27,70 0,22 8.981 1.196 2.310 340 K5 26,23 0,19 32,03 0,31 4.250 528 139 30 K6 25,25 0,11 32,04 0,32 8.029 592 138 28 K10 27,56 0,17 33,26 0,32 2.826 304 120 26 K11 27,86 0,22 32,21 0,15 2.052 291 160 15 K12 30,01 0,11 35,11 0,40 503 37 25 6 K13 28,59 0,03 31,33 0,25 1.439 23 414 66 K16 26,17 0,17 32,73 0,46 4.280 469 111 30 K17 28,07 0,02 32,19 0,22 927 12 87 13 K18 26,45 0,05 32,09 0,05 2.745 82 92 3 K19 27,52 0,14 32,37 0,19 1.793 160 137 16
- Lebergewebe – Messung II K1 26,32 0,18 32,71 0,13 4.397 493 114 10 K2 25,56 0,17 28,74 0,29 7.177 818 1.526 295 K3 25,29 0,05 31,79 0,33 8.500 242 210 42 K4 25,91 0,10 28,20 0,15 5.697 380 2.146 213 K5 27,06 0,06 32,13 0,13 2.705 90 167 14 K6 26,03 0,17 32,18 0,18 5.282 564 162 19 K10 26,83 0,21 32,34 0,29 2.810 369 140 28 K11 26,76 0,31 32,06 0,43 2.950 594 171 49 K12 27,75 0,15 33,79 0,18 2.492 240 84 9 K13 27,81 0,10 32,81 0,19 1.487 100 196 23 K16 26,38 0,10 31,26 0,10 4.700 289 178 11 K17 27,89 0,04 32,00 0,46 1.773 51 113 34 K18 27,14 0,08 31,73 0,55 2.884 151 136 44 K19 27,68 0,20 31,44 0,78 2.045 253 171 77
143
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. I. Nolte für die Überlassung des interessanten
Themas, für die jederzeit gewährte Hilfe und fachliche Unterstützung bei der Erstellung der
Arbeit.
Weiterhin bedanke ich mich bei den Mitgliedern meiner Betreuungsgruppe, Herrn Prof. Dr.
W. Löscher und Herrn Prof. Dr. J. Bullerdiek, für die konstruktiven Gespräche im Rahmen
des Ph.D.-Studiums.
Herrn Prof. Dr. A. Gruber aus dem Institut für Pathologie möchte ich für die Einweisung in
die molekularbiologischen Techniken, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes im Institut für
Pathologie und die jederzeit gewährte fachliche Unterstützung danken. Darüber hinaus ein
herzliches Dankeschön an die Mitarbeiter des Institutes für Pathologie für die freundliche
Atmosphäre im Labor.
Ein besonderes Dankeschön gebührt Frau N. Eberle und Frau I. Buitenduif aus der Klinik
für kleine Haustiere für die Hilfsbereitschaft bei der Probenentnahme.
Herrn Dr. G. v. Samson-Himmelstjerna aus dem Institut für Parasitologie danke ich für die
Erstellung der Primerseqenzen für die RT-qPCR und die Nutzung des Mx 4000.
Vielen Dank an Frau Prof. Dr. Günzel-Apel aus dem Institut für Reproduktionsmedizin und
Herrn Dr. C. Epe aus dem Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
sowie an Herrn Dr. M. Mengel aus dem Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule
Hannover für die Überlassung der Kontrollgewebe.
Frau PD Dr. M.-L. Enss und Frau S. Faber danke ich für die Betreuung während des
Ph.D.-Studiums.
Zuletzt ein ganz herzliches Dankeschön an meine Eltern für ihre uneingeschränkte
Unterstützung sowie ihr stets entgegengebrachtes Vertrauen.