kloning gen
DESCRIPTION
materi bioteknologiTRANSCRIPT
KLONING GEN(DNA RECOMBINAN)(DNA RECOMBINAN)--(REKAYASA GENETIK) (REKAYASA GENETIK)
Kloning - definisi
Dari Bahasa Yunani - klon, ranting Kumpulan turunan suatu individu yang dihasilkan
tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi)
Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya
Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya
Kloning DNA
Metoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan
memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon)
yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan
DNA yang kompleks.
Kloning Gen
Ketika keseluruhan DNA dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebut
Pada kloning gen, hanya gen (DNA) tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon)
Tujuan mengklon Gen Menentukan urutan basa nukleotida penyusun
gen tersebut Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa
nukleotida pengendali gen tersebut Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang
disandi gen tersebut Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada
kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan
Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.
Sumber DNA untuk diklon
DNA kromosom cDNA (complementary DNA) yang disintesis
menggunakan mRNA sebagai cetakan (template)
DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan PCR
Mensintesis cDNA
Perbanyakan DNA dengan PCR (Polymerase Chain Reaction)
Bahan / Alat untuk Mengklon
Enzim endonuklease restriksi Enzim ligase Vektors (Pembawa) Inang (Host) Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang
Memotong DNA Menggunakan enzim
endonuklease restriksi Ujung “lengket” (sticky ends) Ujung “tumpul” (blunt ends)
Penamaan enzim EcoRI E = genus (Escherichia) co = species (coli) R = strain I = # of enzyme
Ujung “lengket” dan “tumpul” (Blunt & Sticky ends)
Penyambungan (pasting) DNA
Pembentukan ikatan-H pada ujung-ujung yang komplemen (sticky ends)
Ligase membentuk ikatan fosfodiester untuk merekatkan benang-benang DNA
Vektor untuk Mengklon
Diperlukan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan suatu potongan DNA ke dalam sel agar DNA tersebut dapat disimpan dan diperbanyak di dalam sel tersebut
Plasmid
DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami dimiliki suatu jasad
Bentuknya benang ganda (double strands DNA, dsDNA) sirkular
Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain
Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu membawa potongan DNA lain ke dalam sel bila memiliki:
Replikator (origin of replication) Penanda (Marker) yang mudah diseleksi
(misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik) Situs untuk mengklon (potongan DNA yang
memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di dalam daerah replikator atau penanda
Vektor untuk Mengklon
Plasmid yang Dimiliki oleh Escherichia coli
Berasal dari plasmid alami E. coli
Potongan DNA tambahan
Potongan DNA tambahan
Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)
Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk binatang lain
Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan
Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA asing disambung, akan dihasilkan "plasmid rekombinan"
Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai
Kloning Terorientasi
Bila diinginkan untuk menginsersikan potongan DNA asing dengan orientasi tertentu
Dilakukan dengan memotong DNA vektor maupun DNA sumber gen yang dikehendaki menggunakan dua enzim restriksi yang berbeda
Vektor untuk Mengklon
1 Vektor berupa plasmid
2 Vektor berupa bakteriofaga
3 Cosmid
4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome)
& YAC (Yeast Artificial Chromosome)
1. Memiliki origin of replication dari inang yang
dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara
independen terhadap genom inang.
2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel
pembawa plasmid tersisipi DNA asing
ketahanan terhadap antibiotik ganda
penapisan biru-putih
3. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple
cloning sites, MCS)
4. Mudah diisolasi dari sel inang.
Vektor berupa Plasmid
Multiple Cloning Site (MCS)
Vektor berupa Plasmid
Vektor berupa Plasmid Keunggulan:
Kecil, mudah pengerjaannya Strategi seleksi mudah Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran
kecil (< 10kbp) Kelemahan:
Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)
Bakteriofaga (λ phage)
Vektor berupa bakteriofaga (λ vectors)
Lengan kiri: Protein penyusun kepala
& ekorLengan kanan:
Sintesis DNA Pengendalian Lisis inang
Daerah yang dihilangkan: integrasi & eksisi Pengendalian
Vektor berupa bakteriofaga (λ vectors)
Vektor berupa Bakteriofaga
Keunggulan: Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
ukuran besar (10 - 23 kbp) Seleksi berdasar ukuran
Kelemahan: Lebih sulit pengerjaannya
Vektor Cosmid
Keunggulan: Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
berukuran sangat besar (32 - 47 kbp) Seleksi berdasar ukuran Pengerjaan seperti plasmid
Kelemahan: Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan
plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)
Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna dari situs λ cos (dihilangkan pada vektor λ)
Vektor Cosmid
λ ZAP
Vektor BAC Replikasi dimediasi
oriS dan oriE parA and parB
mengendalikan agar hanya terdapat satu vektor dalam sel
Menggunakan penanda ketahanan terhadap KhloramfenikolR
Vecktor YAC
Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp dan dimasukkan ke dalam yeast
telomere telomerecentromere
URA3ARS HIS3
replicationorigin
markers
largeinserts
BACs dan YACs
Keunggulan: Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA
dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp) Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa
nukleotida total genom
Kelemahan: Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan
ukuran sangat besar
BACs : Bacterial Artificial Chromosomes
YACs : Yeast Artificial Chromosomes
Shuttle Vector Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam inang
(memiliki origin of replication dari masing-masing inang)
Memilih Vektor Ukuran DNA yang
disisipkan Ukuran vektor Situs enzim restriksi
yang tersedia Jumlah salinan (copy
number) Efisiensi kloning Kemampuan untuk
menapis DNA sisipan Rencana penelitian
selanjutnya
Cara Mengklon DNA (1) Isolasi vektor kloning (plasmid
bacterial) & DNA sumber gen Pemotongan DNA sumber gen
& vektor kloning menggunakan enzim restriksi yang sama
Penyisipan potongan DNA sumber gen ke dalam vektor kloning yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi yang sama; potongan disambung dengan bantuan enzim DNA ligase
Cara Mengklon DNA (2)
Vektor kloning yang telah tersisipi potongan DNA dimasukkan ke dalam sel inang (transformasi sel inang)
Penapisan sel pengklon (dan gen yang dimasukkan)
Identifikasi sel pengklon pembawa gen yang dikehendaki
Transformasi Sel Inang
Memasukkan plasmid (yang merupakan vektor yang telah disisipi gen) ke dalam sel inang
Transformasi (1)
PRA-INKUBASISel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2). Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel bakteri tersebut menjadi permeabel terhadap plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E. coli menjadi “kompeten" untuk menerima plasmid .
Transformasi (2)
INKUBASI Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E.
coli kompeten. Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang tidak
ditambah plasmid digunakan sebagai kontrol.
Transformasi (3)
KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol) dipaparkan sejenak (90 detik) kepada suhu 42 oC. Langkah ini memaksimumkan masuknya plasmid menembus membran dan dinding sel.
Transformasi (4)
PENYEMBUHAN (RECOVERY)Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol) ditumbuhkan dalam medium kaya nutrisi untuk memberi kesempatan penyembuhan setelah mengalami cekaman dan kejutan. Masa penyembuhan biasanya berlangsung satu waktu generasi (untuk E. coli berkisar antara 30 hingga 45 menit)
Transformasi (5)
PENAPISAN (SCREENING)Sel kompeten yang telah mengalami penyembuhan ditapis pada medium padat yang mengandung senyawa penapis berdasarkan penanda yang dibawa oleh plasmid.
Koloni E. coli yang membawa plasmid dengan penanda gen pendar fluor (pGLO)
E. coli yang Membawa Plasmid pGlo
Memudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi
DNA asing ketahanan terhadap antibiotik ganda penapisan biru-putih
Penanda selektif
Penapisan Klon Medium pertumbuhan
diberi antibiotik yang sesuai dengan sifat ketahanan yang digunakan sebagai penanda, misalnya Kanamisin
Bakteri di paruh cawan petri sebelah kanan memiliki plasmid dengan penanda ketahanan terhadap Kanamisin(Kanr), yang di sebelah kiri tidak memilikinya
Penapisan warna koloni Biru/Putih
lacZ insert
Enzim tidak berfungsi
X-gal produk
lacZ
Enzim berfungsi
X-gal produk
Penapisan Koloni Bakteri pembawa Plasmid Rekombinan
Hibridisasi Koloni
Dapat dilakukan jika memiliki DNA pelacak Bagian dari gen
yang dikehendaki Bagian dari gen
yang mirip dari jasad lain
Oligonukleotida sintetik
End
See ya ………
LAMPIRAN
Domba Dolly
Kloning dengan transfer inti,dengan memasukkan donor DNA dari hewan yang karakternya diinginkan ke dalam sel telur hewan yang inti DNA nya telah dihilangkan.setelah terbentuk embrioditanamkan ke rahim induk hewan yang akan membesarkannya.contoh domba Dolly(klon dari Skotlandia oleh IAN WILMOT)