Kompleksne DNA populatsioon, näiteks genoomne DNA, totaalne

cDNA teatud koest jne.

Kompleksne DNA populatsioon, näiteks genoomne DNA, totaalne

cDNA teatud koest jne.

Spetsiifiline amplifitseerimine

(DNA kloneerimine)

Spetsiifiline amplifitseerimine

(DNA kloneerimine)

Spetsiifiline

detektsioon

Spetsiifiline

detektsioon

Spetsiifiliste DNA järjestuseteüldised uurimismeetodid

Rakuline (in vivo) kloneerimine

Rakuline (in vivo) kloneerimine

DNA kloneerimine in virto PCR-i abil

DNA kloneerimine in virto PCR-i abil

1. Sobiv peremeesrakk

2. Replikon

3. Vahendid võõrDNA sisestamiseks replikoni ja selle ülekandeks peremeesrakku

1. Sobiv peremeesrakk

2. Replikon

3. Vahendid võõrDNA sisestamiseks replikoni ja selle ülekandeks peremeesrakku

1. Termostabiilne DNA polümeraas

2. Informatsioon järjestuse kohta, mille alusel saab sünteesida spetsiifilised praimerid

1. Termostabiilne DNA polümeraas

2. Informatsioon järjestuse kohta, mille alusel saab sünteesida spetsiifilised praimerid

Meetodid

Mida on selleks vaja

Molekulaarne hübridisatsioon

Molekulaarne hübridisatsioon

1. Märgitud DNA või RNA proov

2. Prooviga seondunud fragmentide detekteerimine

1. Märgitud DNA või RNA proov

2. Prooviga seondunud fragmentide detekteerimine

Hübridisatsiooni proovid

Hübridisatsiooni proovid

DNADNA RNARNA Oligonukleotiid

Oligonukleotiid

DNA rakuline

kloneerimine või PCR

DNA rakuline

kloneerimine või PCR

Transkriptsioon sobivasse vektorisse

kloneeritud DNA-lt

Transkriptsioon sobivasse vektorisse

kloneeritud DNA-lt

Keemiline süntees

Keemiline süntees

Tavaliselt kahe- ahelaline 0,1 kb kuni 100 kb DNA

kloonide puhul; 0,1 kb kuni 20 kb PCR-i produktide

puhul

Tavaliselt kahe- ahelaline 0,1 kb kuni 100 kb DNA

kloonide puhul; 0,1 kb kuni 20 kb PCR-i produktide

puhul

Üheahelaline, kuni mõni 1000

nukleotiidi

Üheahelaline, kuni mõni 1000

nukleotiidi

Üheahelaline tavaliselt 15-50

alust pikk

Üheahelaline tavaliselt 15-50

alust pikk

Tavaliselt DNA polümeraasiga

Tavaliselt DNA polümeraasiga RiboproovRiboproov OtsmärkimineOtsmärkimine

Tüüp

Päritolu

Prooviiseloomustus

Märkimine

DNA, RNA ja oligonukleotiidide perfektsete hübriidide Tm-e saab välja arvutada vastavate valemite alusel:

DNA-DNA hübriidi jaoks Tm=81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) – 0.61 (% form) – 500/L

RNA-DNA hübriidi jaoksTm= 79.8°C + 18.5 (logM) + 0.58 (%GC) – 11.8 (%GC)2 –

0.56(%form) – 820/L

M on monovalentsete katioonide molaarsus%GC on guanosiini ja tsütosiini protsent DNA-s%form on formamiidi protsent hübridisatsiooni lahusesL on dupleksi pikkus aluspaarides