konstruksi dan analisis kualitas pustaka genom … · dna. sekuensing dna merupakan teknik kunci...
TRANSCRIPT
KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA
GENOM KENTANG (Solanum tuberosum L.) UNTUK
SEKUENSING GENOM TOTAL
YULIANA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Konstruksi dan
Analisis Kualitas Pustaka Genom Kentang (Solanum tuberosum L.) untuk
Sekuensing Genom Total adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2014
Yuliana
NIM G84100042
ABSTRAK
YULIANA. Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kentang (Solanum
tuberosum L.) untuk Sekuensing Genom Total. Dibimbing oleh I MADE
ARTIKA dan I MADE TASMA.
Salah satu usaha untuk meningkatkan produktivitas kentang yaitu melalui
informasi genetik kentang. Tujuan penelitian yaitu mengkonstruksi pustaka
genom dari empat genotipe kentang di Indonesia (CIP 392781, PT 29, Amudera
dan Margahayu) dan menganalisis kualitas pustaka genom untuk sekuensing
genom total. Konstruksi pustaka genom dilakukan secara in vitro dengan
menempelkan adaptor pada ujung fragmen DNA. Pustaka genom selanjutnya
diklasterisasi dan disekuensing menggunakan cBOT cluster generation dan NGS
HiSeq 2000. Pustaka genom yang berhasil dikonstruksi berukuran 300-600 bp
dengan konsentrasi 13.08-60.14 nM. Pustaka genom yang dikonstruksi telah
memenuhi persyaratan untuk sekuensing genom total. Jumlah basa yang
dihasilkan dari proses sekuensing yaitu sebanyak 287.2 x 109bp. Klaster pustaka
genom dengan nilai Q scores di atas 30 yang dihasilkan lebih besar dari 88.6%.
Tingkat kesalahan pembacaan basa selama proses sekuensing sebesar 0.28-
1.01%%. Secara keseluruhan hasil sekuensing genom termasuk ke dalam kategori
ideal.
Kata kunci : Kentang, Next Generation Sequencing, Pustaka genom, Sekuensing
genom total.
ABSTRACT
YULIANA. Construction and Quality Analysis of Potato (Solanum tuberosum L.)
Genomic Library for Whole Genome Sequencing. Under the direction of I MADE
ARTIKA and I MADE TASMA.
One of the efforts to improve productivity of the potato with the genetic
information. The purpose of this study was to construct genomic libraries of four
potato genotypes of Indonesia (CIP 392781, PT 29, Amudera and Margahayu)
and analyze the quality of genomic library for total genomic sequencing. Genomic
library construction was performed in vitro by attaching the adapter to the ends of
DNA fragments. This was followed by, clustering and sequencing of genomic
library using the cBOT claster Generation and NGS HiSeq2000. Genomic
libraries were successfully constructed with a size of 300-600 bp and
concentration of 13.08 – 60.14 nM. The genomic libraries have met the
requirements for total genome sequencing. The amount of base generated from the
sequencing process was 287.2 x 109 bp. Cluster of genomic library produced with
the value of Q scores above 30 was more than 88.6%. Base reading error rate
during the sequencing process was 0.28-1.01%. Over all result from this genomic
sequencing was belong to the ideal category.
Key words: Potato, Next Generation Sequencing, Genomic library, Whole
genome sequencing.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
KONSTRUKSI DAN ANALISIS KUALITAS PUSTAKA
GENOM KENTANG (Solanum tuberosum L.) UNTUK
SEKUENSING GENOM TOTAL
YULIANA
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala yang
telah memberikan rahmat dan karunia-Nya. Shalawat dan salam semoga selalu
tercurah kepada Nabi Muhammad SAW beserta seluruh keluarga, sahabat dan
para pengikutnya sampai akhir zaman sehingga karya ilmiah ini sebagai salah satu
syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor berhasil
diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan
Desember 2013 hingga Juni 2014 ini ialah biologi molekuler, dengan judul
Konstruksi dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kentang (Solanum tuberosum
L.) untuk Sekuensing Genom Total.
Ucapan terimakasih penulis haturkan kepada kedua pembimbing penelitian
yaitu Dr I Made Artika MApp Sc dan Dr I Made Tasma MSc atas semua ilmu,
saran dan dukungan yang diberikan selama penyusunan karya ilmiah ini. Terima
kasih juga penulis ucapkan kepada Mbak Ida Rosdianti SSi, Bapak Dani
Satyawan MSi, Bapak Habib Rijzaani MSi dan Kak Ihsan yang telah banyak
membantu dalam teknis pelaksanaan penelitian, kepada kedua orang tua dan
seluruh keluarga yang selalu menginspirasi penulis untuk selalu berjuang keras
dan menjadi lebih baik.
Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Syahdan, Asep, Mbak
Titin, rekan-rekan Biokimia 47 dan penghuni 4S kostan atas dukungan, kritik,
bantuan dan sarannya selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Semoga
karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi penulis dan untuk perkembangan ilmu
pengetahuan umumnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Oktober 2014
Yuliana
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ............................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... x
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ x
PENDAHULUAN ............................................................................................... 1
METODE ............................................................................................................ 2
Bahan dan Alat ................................................................................................. 2
Prosedur Penelitian ........................................................................................... 3
HASIL ................................................................................................................. 8
PEMBAHASAN ................................................................................................ 15
SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................... 26
Simpulan ........................................................................................................ 26
Saran .............................................................................................................. 26
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 26
LAMPIRAN ...................................................................................................... 29
RIWAYAT HIDUP ........................................................................................... 33
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Kuantitas dan kemurnian DNA genom total kentang. 8
2 Konsentrasi double stranded DNA hasil isolasi 9
3 Kuantitas dan kemurnian DNA 10
4 Kuantitas dan kemurnian DNA setelah tahapan adenilasi ujung 3’ 10
5 Kuantitas dan kemurnian DNA 11
6 Kualitas dan kuantitas pustaka 12
7 Kuantitas pustaka genom kentang diukur menggunakan qPCR 13
8 Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom 13
9 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing 14
10Tingkat kesalahan (error rate) 15
DAFTAR GAMBAR
1 Elektroforegram DNA genom hasil isolasi 8
2 Elektroforegram DNA genom kentang hasil fragmentasi 9
3 Elektroforegram DNA hasil purifikasi 10
4 Elektroforegram DNA genom kentang hasil amplifikasi 11
5 Elektroforegram pustaka genom kentang dengan analisis bioanalyzer 12
6 Kualitas pustaka genom kentang menggunakan photocap_MW 12
7 Histogram jumlah klaster 14
DAFTAR LAMPIRAN
1 Strategi penelitian 29
2 Hasil pengukuran kuantitas pustaka genom 30
3 Grafik intensitas persentase hasil sekuensing pustaka genom 31
4 Proses klasterisasi di dalam cBOT 31
5 Proses sekuensing DNA menggunakan NGS Hiseq 2000 (Huson 2010) 32
1
PENDAHULUAN
Kentang (Solanum tuberosum L.) merupakan salah satu komoditas sayuran
penting yang termasuk dalam subsektor hortikultura di Indonesia. Kentang
termasuk sayuran semusim, berumur pendek, dan berbentuk perdu dan merupakan
tanaman semusim karena hanya satu kali berproduksi dan setelah itu mati (Samadi
2007). Kentang merupakan salah satu pangan utama dunia sesudah padi, gandum
dan jagung yang punya asam amino lengkap dibandingkan padi dan gandum yang
kekurangan asam amino lisin dan jagung yang kekurangan asam amino triptofan.
Kentang juga memiliki nutrisi yang tinggi diantaranya karbohidrat, protein,
mineral, asam nukleat, beberapa vitamin C, vitamin B kompleks serta vitamin A.
kJ (Wagih dan Wiersena 1994 ; Wattimena 1996).
Produktivitas kentang di Indonesia masih tergolong rendah karena area
pertanamannya hanya di daerah tertentu saja. Menurut data Badan Pusat Statistik
(2014), produktivitas kentang di Indonesia pada tahun 2012 adalah sebesar 16.58
ton/Ha dengan jumlah produksi sebesar 1.094.240 ton pada luas areal lahan
65.989 Ha dan data sementara BPS untuk tahun 2013 produktivitas kentang
mengalami penurunan menjadi sebesar 16.27 ton/Ha dengan produksi kentang
sebesar 1.023.381 ton pada luas lahan panen 62.900 Ha. Data ini menunjukkan
penurunan terhadap kentang baik dari segi lahan maupun hasil produksi panen
kentang ini sendiri.
Menurut Listanto (2010), rendahnya produktivitas kentang disebabkan oleh
beberapa faktor antara lain : tidak tersedianya varietas super, mutu benih yang
rendah, serangan hama dan penyakit serta teknik budidaya maupun penanganan
pasca panen yang kurang tepat. Usaha-usaha untuk meningkatkan produktivitas
kentang telah banyak dilakukan. Perbaikan tanaman dan peningkatan produksi
lebih lanjut menurut Puspita (2002), dapat dicapai dengan pemanfaatan sumber
plasma nutfah, baik melalui pemuliaan tanaman secara konvensional maupun
rekayasa genetika. Produksi pangan pada masa mendatang akan lebih banyak
bergantung pada penerapan teknologi daripada peningkatan luas lahan pertanian.
Teknik yang banyak berkembang sekarang diantaranya adalah teknik rekayasa
genetika.
Penciptaan bahan unggul pada kentang ini dihubungkan dengan studi
genetik yang melibatkan peranan gen didalamnya. Pemuliaan dengan marka
molekuler nantinya dapat mengetahui gen yang menyandi ketahanan kentang
terhadap penyakit dan hama. Teknik yang berkembang saat sekarang dan juga
sangat banyak membantu dalam penanda molekuler adalah teknik sekuensing
DNA. Sekuensing DNA merupakan teknik kunci untuk berbagai perkembangan
ilmu pengetahuan diantaranya arkeologi, antropologi, ilmu genetika, bioteknologi,
biologi molekular dan ilmu forensik (Franca et al. 2002). Sekuensing DNA terdiri
dari dua jenis yaitu sekuensing fragmen DNA dan sekuensing genom total.
Perbedaan kedua jenis sekuensing tersebut terletak pada metode dan jumlah basa
yang akan disekuens. Sekuens fragmen DNA menggunakan untai DNA pendek
sekitar 100-1000 bp. Metode yang digunakan untuk sekuens fragmen DNA adalah
metode chain termination. Sekuensing genom total (whole genome sequencing)
adalah proses penentuan sekuen genom suatu organisme yang dilakukan pada satu
waktu.
2
Tahapan sekuensing genom total kentang diawali dengan mengkonstruksi
pustaka genom kentang. Konstruksi pustaka genom menggunakan Low
Throughput Protocol dari illumina dan disekuensing menggunakan NGS Illumina
Hiseq 2000. Konstruksi pustaka ini relatif sangat mudah dan singkat karena tidak
membutuhkan vektor untuk menyisipkan fragmen DNA dan juga tidak
membutuhkan ruangan khusus untuk penyimpanan. Konstruksi ini juga tidak
membutuhkan DNA dalam jumlah banyak hanya membutuhkan double stranded
DNA (dsDNA) dengan konsentrasi rendah (20 ng/uL).
Penelitian ini bertujuan mengkonstruksi dan menganalisis kualitas pustaka
genom total untuk mengetahui karakteristik genom kentang empat genotipe
kentang yang diteliti. Hipotesis penelitian ini adalah dapat mengkonstruksi
pustaka genom kentang dan kemudian disekuensing menggunakan NGS Hiseq
2000. Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini yaitu diperoleh informasi dan
studi keseluruhan tentang genom kentang. Manfaat lain yaitu urutan DNA yang
dihasilkan diharapkan mampu untuk menunjang program perbaikan genetika
tanaman untuk menunjang program pemuliaan tanaman kentang.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah daun kentang yang
diambil dari Balai Penelitian Sayuran di Lembang dan yang ditanam di BB
Biogen dengan empat genotipe kentang (CIP 392781, PT 29, Amudra dan
Margahayu), es batu, etanol teknis, bufer ekstraksi CTAB (Cetil Trimetil
Amonium Bromida), NaOAc (natrium asetat), chisam (kloroform : isoamil
alkohol) dengan perbandingan 24 : 1, isopropanol, bufer TE, etanol absolut dan
etanol 70%, natrium bisulfit, dan 2% polivinilpirolidon. Bahan-bahan yang
digunakan untuk fragmentasi DNA adalah DNA hasil isolasi dan resuspension
buffer.
Bahan-bahan yang digunakan untuk modifikasi ujung fragmen DNA adalah
end repair control, end repair mix, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan
resuspension buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk adenilasi ujung 3’OH
DNA adalah A-tailing control dan A-tailing mix. Bahan-bahan yang digunakan
untuk ligasi adapter adalah ligase control, DNA ligase mix, DNA adapter index,
stop ligase buffer, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan resuspension buffer.
Bahan-bahan yang digunakan untuk pemurnian DNA hasil ligasi adalah serbuk
agarosa, buffer TAE 1X, SyBr Gold, loading dye, DNA ladder, dan nuclease free
water. Bahan-bahan yang digunakan untuk perbanyakan DNA adalah PCR Primer
Cocktail, PCR Master Mix, AMPure XP Beads, etanol 80%, dan Resuspension
Buffer. Bahan-bahan yang digunakan untuk klasterisasi dan sekuensing genom
kentang adalah 2 N NaOH, 1 N NaOH, 0.1 N NaOH, bufer hibridisasi (HT1),
Tris-Cl, 10 nM, PhiX library, akuades, EtOH 70 %, buffer library, TruSeq SR
Cluster Kit v3- HS (cBot), Truseq SBS Kit-HS (200 cycle).
Alat-alat yang digunakan meliputi tabung eppendorf 15 mL, tabung 2 mL,
tabung 1.5 mL, inkubator thermostat, sentrifus 5810R eppendorf, tissue lyser,
3
tungsten bead, batang magnet, vortex, mikropipet, nanodrop thermoscientific
2000 spectrophotometer, instrument Covaris M220, tabung AFA Covaris
snap_cap dan srew_cap, microwave, mikrosentrifus, kotak es, sarung tangan karet,
neraca analitik, sudip, tabung Durant, parafilm, Vortex Maxi Mix II, power supply,
perangkat elektroforesis, instrument Agilent 2100 bionalyzer, High sensitivity
DNA chip Agilent Technologies, Qubit 2.0 Fluorometer invitrogen, realtime PCR
2000 Sequence detection system ABI PRISM, thermocycler Biometra, IKA MS 3
Vortexer, UV transilluminator High Performance 2UV, mesin pendingin, alat
pengering Thermoscientific Savant DNA 120 spedvac evaporator, cBot Cluster
Generation, Illumina Hiseq 2000.
Prosedur Penelitian
Isolasi DNA Genom Kentang (Modifikasi Metode Doyle dan Doyle 1987)
Daun kentang yang masih muda dan segar ditimbang sebanyak 50 mg dan
kemudian ke dalam tabung berisi daun ditambahkan buffer ekstraksi (CTAB 2%,
Na-bisulfid dan PVP 2%) sebanyak 400 µL. Dua butir tungsten bead dimasukkan
ke dalam tabung berisi sampel dan kemudian digerus menggukan tissue lyser
dengan frekuensi 25/5 selama 30 detik dan kemudian diulangi lagi dengan posisi
sebaliknya. Inkubasi sampel pada 650C selama 30 menit dan dibolak-balik secara
berkala (10 menit). Kemudian, ke dalam sampel yang telah dipanaskan tersebut
ditambahkan CHISAM (24:1) sebanyak 750 µL dikocok bolak-balik selama 5
menit. Campuran larutan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm
selama 15 menit pada suhu 250C dan supernatan dipindahkan ke dalam tabung
baru (lebih kurang 600µL supernatan). Selanjutnya ke dalam supernatan tersebut
ditambahkan 60µL Na-asetat 3M dan dibolak balik kemudian tambahkan 600 µL
isopropanol dingin dan disimpan di dalam pendingin -20 0C selama 1 jam dan
setelahnya dibolak balik perlahan kemudian didinginkan lagi selama 15 menit.
Setelah dikeluarkan dari pendingin, larutan kemudian disentrifugasi 12000
rpm selama 15 menit pada suhu 40C. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang dan
pelet yang dihasilkan kemudian dicuci dengan menambahkan 200 µL etanol 70%
dingin dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit
pada suhu 40C. Cairan kemudian dibuang dan pelet dikeringkan menggunakan
vakum evaporator selama 15 menit. Endapan hasil pengeringan kemudian
dilarutkan dengan 50 µL buffer TE pH 8.0 hingga larut atau dengan dipanaskan
pada 650C selama 15 menit. Enzim RNAse kemudian ditambahkan 1/50 kali
volume DNA atau sebanyak 1µL untuk menghilangkan RNA dan kemudian
diinkubasi kembali selama 37oC selama 30 menit. Tahap selanjutnya adalah uji
kualitas dengan menggunakan gel agarose 1%,, uji kuantitas untuk konsentrasi
asam nukleat menggunakan nanodrop spektrofotometer DNA dan uji double
stranded DNA dengan menggunakan fluorometer Qubit ds DNA BR.
Uji Kualitatif DNA Genom Kentang
Uji kualitatif DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel
agarosa 1%. Gel agarosa dibuat dengan menambahkan agarosa sebanyak 1.1 g ke
4
dalam 110 mL larutan TAE 1X. Larutan kemudian dipanaskan hingga larut dan
didinginkan pada suhu kamar hingga hangat dan dituang ke dalam cetakan gel
elektroforesis yang telah dipasangi sisir (cetakan sumur) hingga gel memadat. Gel
yang sudah padat dipindahkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi TAE 1X.
Selanjutnya dibuat loading buffer dengan campuran blue juice 6x sebanyak 2 μL,
SyBr Gold 100x 0.5 µL, molecular water 7.5 µL. Sampel yang akan
dielektroforesis pada penelitian ini sebanyak 2 µL sampel DNA pada parafilm.
Setelah tercampur maka campuran sampel diinjeksi ke dalam sumur gel agarosa.
Marker yang digunakan adalah 100 bp plus DNA ladder sebanyak 5.5 μL
ditambah 0.5 µL SyBr Gold 100x. Setelah semua sampel selesai diinjeksi maka
alat elektroforesis dihubungkan pada power supply yang dialiri tegangan listrik
100 volt selama 30 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan bantuan lampu UV
dalam trasnsilluminator dan didokumentasikan.
Uji Kuantitatif DNA Genom Kentang (Invitrogen 2010)
Uji kuantitatif untuk konsentrasi dan kemurnian asam nukleat dilakukan
dengan menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific, USA dengan
blanko yang digunakan adalah larutan TE pH 8.0. Sebelum digunakan lubang
optik dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan nuclease free water.
Sebanyak 1 ul Larutan TE dimasukkan ke dalam lubang optik nanodrop
thermoscientific ditutup dan kemudian dipilih menu measure blank pada
komputer. Kemudian, lubang optik dibersihkan kembali dan sampel DNA
sebanyak 1 μL dimasukkan ke dalam lubang optik. Setelah itu, hasil pengukuran
akan muncul dalam konsentrasi ng/μL dan kemurnian DNA dapat dilihat langsung
dalam A280 dan A260. Uji kuantitas DNA dilakukan untuk mengetahui
konsentrasi dan kemurnian DNA dengan perbandingan A260/280 yang baik
sekitar 1.8 hingga 2.0.
Uji double stranded DNA (dsDNA) dilakukan dengan menggunakan
fluorometer Qubit ds DNA BR. Pengenceran larutan Qubit disiapkan dengan
perbandingan reagen 1: 200 dalam buffer Qubit. Beberapa tabung khusus
disiapkan dengan campuran larutan reagen dan buffer Qubit total 198 µL dan ke
dalamnya ditambahkan 2 µL DNA. Semua tabung yang sudah diisi dengan larutan
di vortex selama ± 3 detik dan kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 2
menit. Setelah diinkubasi, tabung kemudian dimasukkan pada alat Qubit 2.0
fluorometer dan konsentrasi dsDNA dapat dilihat pada layar dan dihitung
menggunakan rumus.
Konstruksi Pustaka Genom Kentang (TruSeq DNA low throughput protocol
(Illumina 2010a) )
Fragmentasi DNA. DNA diencerkan dalam resuspension buffer dengan
total keseluruhan volume yang telah dicampur 130 µL (berat DNA 2.6 ug).
Larutan dipipet dan dipindahkan ke dalam tabung Covaris sebanyak 130 µL dan
dimasukkan ke dalam alat instrument Covaris. Program dipilih secara manual
yaitu metode DNA 0300-130 µL_Snap_Cap tabung mikro yaitu program
pemotongan DNA dalam ukuran 300 bp. Tabung covaris dimasukkan ke dalam
alat dan running hingga 75 detik. Proses ini dilakukan dengan hati-hati karena
5
sensor alat ini sangat sensitif. Hasil dari fragmentasi Covaris dipindahkan ke
dalam tabung PCR sebanyak 50 µL (berat DNA 1 ug).
Modifikasi Ujung Fragmen DNA. Modifikasi diawali dengan pembuatan
Insert Modification Plate (IMP). Sebanyak 10 µL End repair control dan 40 µL
End Repair Mix ditambahkan ke dalam tabung yang mengandung 50 µL DNA
hasil fragmentasi. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara
dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan
diinkubasi dalam thermalcycler selama 30 menit pada suhu 300C.
Langkah selanjutnya yaitu pemurnian IMP yang diawali dengan
penambahan 160 µL AMPure XP Beads yang telah divorteks ke dalam sampel..
Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan
sebanyak 10 kali. Campuran sampel dan AMPure XP Beads diinkubasi selama 15
menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian dipindahkan keatas
batang magnet pada suhu ruang selama 15 menit. Sebanyak 127.5 µL supernatan
dibuang dengan hati-hati jangan sampai mengenai pelet yang terletak pada
dinding tabung. Tahapan sebelumnya diulangi kembali untuk menghilangkan
supernatan yang masih tersisa. Pada proses pencucian pelet, sebanyak 200 µL
etanol 80% ditambahkan dan diinkubasi selama 30 detik. Selanjutnya, etanol 80%
yang telah ditambahkan dibuang dan dilakukan sebanyak 2 kali ulangan. Pelet
kemudian dikeringkan selama 15 menit pada suhu ruang dan dipindahkan dari
batang magnet. Resuspension buffer sebanyak 17.5 µL ditambahkan ke dalam
tabung yang berisi pelet dan sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro
dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Selanjutnya, tabung berisi sampel
diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Tabung yang berisi sampel kemudian
dipindahkan ke atas batang magnet pada suhu ruang selama 5 menit untuk
memisahkan supernatan dengan pelet. Sebanyak 15 µL supernatan dipindahkan ke
dalam tabung yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin. Tahapan
selanjutnya yang bisa dilakukan adalah pengukuran kuantitas dan kualitas hasil
modifikasi ujung jika supernatant di dalam tabung masih tersisa. Tahapan
pemurnian menggunakan AMPure XP Beads juga dilakukan pada proses tahapan
penempelan adaptor dan proses perbanyakan fragmen DNA.
Adenilasi Ujung 3’ DNA. A-tailing control 2.5 µL dan A-tailing mix 12.5
µL ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Sampel dicampurkan
menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung
yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam thermalcycler selama 30 menit
pada suhu 370C dan setelahnya langsung dilanjutkan dengan tahapan penempelan
adaptor.
Penempelan Adaptor. Sebanyak 2.5 ul Ligase control, 2.5 µL DNA Ligase
Mix dan 2.5 µL dan DNA Adapter Index ditambahkan ke dalam tabung yang berisi
sampel. Sampel dicampurkan menggunakan pipet dengan cara dinaik turunkan
sebanyak 10 kali. Tabung yang berisi sampel ditutup dan diinkubasi dalam
thermalcycler selama 10 menit pada suhu 300C. Sebanyak 5 µL Stop Ligase Mix
ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel. Kemudian sampel dicampurkan
menggunakan pipet mikro dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali.
Langkah selanjutnya yaitu pemurnian sampel yang diawali dengan
penambahan 42.5 µL AMPure XP Beads dengan mengikuti prosedur yang sama
dengan sebelumnya. Selanjutnya resuspension buffer sebanyak 22.5 µL
ditambahkan ke dalam tabung yang berisi pelet. Sampel dicampurkan dan
6
diinkubasi pada suhu ruang. Sebanyak 20 µL supernatan dipindahkan ke dalam
tabung yang baru dan disimpan dalam mesin pendingin. Tahapan selanjutnya yang
dilakukan adalah pengukuran kuantitas dan kualitas hasil adenilasi dan
penempelan adaptor jika supernatan di dalam tabung masih tersisa.
Pemurnian DNA Hasil Ligasi. Pemurnian hasil ligasi terdiri dari dua tahap
yaitu pemisahan ukuran fragmen DNA melalui elektroforesis dan ekstraksi gel.
Pemisahan ukuran fragmen DNA diawali dengan pembuatan gel agarosa 2%.
Sebanyak 1.2 gram bubuk agarosa ditimbang dan ditambahkan larutan TAE 1x
sebanyak 60 mL. Larutan kemudian dipanaskan dalam microwave sampai semua
agarosa larut. Setelah suhu larutan hangat, kemudian tambahkan 6 uL pewarna
SyBr Gold dan kocok hingga homogen. Kemudian larutan dituang ke dalam
cetakan yang telah disiapkan.
Elektroforesis diawali dengan disiapkannya seperangkat bak elektroforesis,
kemudian larutan TAE 1x dituangkan ke dalam bak hingga gel terendam bagian
bawahnya. Selanjutnya, ditempat terpisah sebanyak 4 ul loading dye 6x
ditambahkan ke dalam tabung berisi 20 ul sampel hasil ligasi. Sebanyak 12 ul
penanda DNA ladder 100 bp diinjeksikan pada sumur gel yang tersedia. Sampel
kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel yang tersedia. Cetakan agarosa di buat
dengan 2 kolom dimana pada kolom ke dua berisi nuclease free water sebanyak
25 ul. Sampel kemudian di elektroforesis pada kuat arus 100 volt selama 60 menit.
Hasil elektroforesis dilihat di atas lampu UV transiluminator dan
didokumentasikan. Saat telah mendekati ukuran 400 bp, nuclease free water yang
berada pada kolom kedua dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung baru (20 ul).
Ukuran fragmen DNA 300 bp, 400 bp dan 500 bp diiris dari gel agarosa dan
disimpan dalam tabung untuk digunakan pada tahapan selanjutnya yaitu ekstraksi
gel jika hasil validasi pustaka tidak mencukupi untuk konsentrasi minimum yang
dibutuhkan untuk proses sekuensing.
Perbanyakan fragmen DNA. Perbanyakan DNA diawali dengan
penambahan 5 µL PCR Primer Cocktail dan 25 µL PCR Master Mix ke dalam
tabung yang berisi sampel. Sampel dicampurkan menggunakan pipet mikro
dengan cara dinaik turunkan sebanyak 10 kali. Tabung kemudian disimpan dalam
mesin PCR untuk proses perbanyakan yang terdiri dari 10 siklus selama 20 menit
dengan rincian reaksi predenaturasi pada suhu 98°C selama 30 detik, denaturasi
pada suhu 98°C selama 10 detik, annealing pada suhu 60°C selama 30 detik,
extension pada suhu 72°C selama 30 detik, dan pasca pemanjangan primer pada
suhu 72°C selama 5 menit.
Tahapan selanjutnya yaitu pemurnian hasil PCR yang diawali dengan
penambahan 50 µL AMPure XP Beads dengan mengikuti prosedur pemurnian
yang sama dengan sebelumnya sebanyak 32.5 µL resuspension buffer
ditambahkan ke dalam tabung yang berisi pelet dan dicampurkan menggunakan.
Sebanyak 30 µL supernatan dipindahkan ke dalam tabung yang baru dan disimpan
dalam mesin pendingin. Tahapan selanjutnya yang bisa dilakukan adalah validasi
terhadap kualitas dan kuantitas pustaka genom yang telah berhasil dikonstruksi.
Validasi kualitas pustaka genom. Uji ini digunakan untuk mengetahui
ukuran fragmen DNA hasil pemotongan yang dilakukan dengan mengikuti
protokol Agilent High Sensitivity DNA Assay. Cip HS DNA diletakkan di atas
priming station chip dan kemudian ke dalam lubang berlabel G ditambahkan 9 ul
dye mix kemudian ditekan menggunakan priming station selama 1 menit. Setelah
7
dibuka kemudian ke dalam lubang lain yang berlabel G ditambahkan 9 ul dye mix
dan marker pada masing-masing lubang kecuali lubang ladder, kemudian ke
dalam lubang ladder ditambahkan 1 ul HS DNA ladder. Sebanyak 1 ul sampel
juga kemudian dimasukkan ke dalam lubang sampel. Cip kemudian di vortex
selama 1 menit dan kemudian di running pada alat agilent 2100 bioanalyser yang
terhubung dengan computer. Kualitas ukuran pustaka juga di ukur dengan
menggunakan software bioinformatika photocap MW.
Validasi kuantitas pustaka genom. Sampel dibuat sebanyak 3 kali ulangan
dan setiap ulangan dibuat pengenceran 1:1000, 1:2000 dan 1:4000 menggunakan
buffer qPCR. Setiap sampel yang telah diencerkan ini kemudian diambil sebanyak
4 ul dan ditambahkan 16 ul reagen qPCR dan dimasukkan ke dalam tabung PCR.
Standar larutan juga dibuat sebanyak 3 ulangan dengan jumlah standar sebanyak 6.
Tabung PCR kemudian di masukkan ke dalam alat qPCR dan di running selama 2
jam. Hasil yang diperoleh akan digunakan untuk perhitungan klasterisasi pustaka
genom. Sebelum klasterisasi pustaka terlebih dahulu dihitung konsentrasi pustaka
genom yang dibutuhkan yaitu sebanyak 2 nM yang diencerkan ke dalam buffer
library (Tris-Cl 10 mM pH 8.5 dan 0.1 % tween 20).
Klasterisasi Pustaka Genom Kentang (cBot cluster generation protocol
(Illumina 2010b)
Klasterisasi DNA diawali dari preparasi sampel yang terdiri dari dua
tahapan, yaitu denaturasi dan pelarutan DNA. Denaturasi diawali dengan
penambahan 0.1 N NaOH ke dalam sampel DNA sehingga diperoleh konsentrasi
DNA pustaka akhir 13 pM. Campuran dinaik turunkan menggunakan pipet hingga
homogen. Sampel diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang untuk
mendenaturasi utas ganda DNA menjadi utas tunggal. DNA yang telah
didenaturasi disimpan dalam mesin pendingin sampai proses pelarutan DNA akan
dilakukan.
Tahapan preparasi sampel selanjutnya yaitu pelarutan DNA dalam buffer
hibridisasi. Sebanyak 987 uL buffer hibridisasi ditambahkan ke dalam template
DNA yang telah didenaturasi sebelumnya sehingga diperoleh konsentrasi akhir 13
pM. Sebanyak 120 µL DNA yang telah dilarutkan ditambahkan ke dalam 1%
PhiX control (1.2 ul) di dalam tabung PCR. Posisi sampel pada tabung dicatat dan
kemudian tabung dimasukkan ke dalam alat cBOT Cluster Generation untuk
dilakukan klasterisasi di dalam suatu flow cell.
Sekuensing Pustaka Genom Kentang (HiSeq 2000 protocol 2011)
Sekuensing pustaka genom menggunakan Illumina HiSeq 2000 terdiri dari
beberapa tahap yaitu persiapan reagen, pemilihan parameter untuk sekuensing,
pemasangan flow cell, sekuensing, dan post-run sequencing (maintenance wash).
Reagen yang digunakan selama sekuensing diantaranya SBS reagen (TruSeq SBS
kit), multiplexing reagen dan paired end reagen. Reagen-reagen tersebut
dimasukkan kedalam rak dan disimpan dalam ruang reagen compartment yang
terdapat dalam Illumina Hiseq 2000. Pemilihan parameter untuk sekuensing
dilakukan melalui Hiseq control software interface. Parameter yang tersedia
diantaranya flow cell ID, experiment, user name, flow cell type, control lane,
8
output folder,confirm first base, keep intensity files, existing recipe, save image
dan align lanes. Tahapan selanjutnya yaitu pemasangan flow cell yang telah
diklasterisasi melalui cBot cluster generation pada flow cell stage. Sekuensing
dilakukan selama sekitar 11 hari dengan panjang pembacaan DNA 2 x 101 siklus.
Tahapan terakhir setelah proses sekuensing selesai dilakukan yaitu dengan
dipindahkannya flow cell dari flow cell stage dan dilakukannya post-run
sequencing yaitu maintenance wash. Tahapan maintenance wash terdiri dari
pembilasan dengan menggunakan air dan NaOH.
HASIL
Hasil DNA Genom Kentang
Isolasi DNA genom kentang dari empat genotipe yaitu CIP 392781, PT 29,
Amudera dan Margahayu dilakukan dengan metode Doyle & Doyle (1987) yang
dimodifikasi. Analisis kualitas pustaka genom kentang dilakukan menggunakan
gel agarosa 1%. DNA genom kentang berhasil diisolasi dengan baik yang
ditunjukkan dengan ukuran pita-pita DNA yang semakin tinggi dari marker dan
semakin mendekati ke sumur gel. Marker DNA yang digunakan adalah 100 bp
(Gambar 1).
Analisis kuantitatif DNA genom kentang diukur menggunakan nanodrop
spektrofotometer. Pengukuran dilakukan untuk melihat kemurnian DNA genom
kentang dari kontaminasi polisakarida (A260/230) dan protein (A260/280). Tabel 1
menunjukkan masing-masing genotipe kentang menghasilkan DNA dengan
konsentrasi yang tinggi (1039 ng/uL – 3222.5 ng/uL) dan hanya genotipe
Amudera yang memiliki konsentrasi DNA yang rendah yaitu 197.8 ng/uL.
Kemurnian dari masing-masing genotipe kentang sangat murni yang dapat
diketahui dari nilai rasio yang masih berada pada rentang ukuran 1.8-2.0.
Gambar 1 Elektroforegram DNA genom hasil isolasi kentang genotipe 1.
CIP 392781, 2. PT 29, 3. Amudera dan 4. Margahayu
Tabel 1 Kuantitas dan kemurnian DNA genom total kentang.
Genotipe [Asam nukleat] (ng/uL) A260/280 A260/230
CIP 392781 2787.5 1.93 2.17
PT.29 3222.5 1.95 2.1
Amudra 197.8 1.86 2.44
Margahayu 1039 1.96 2.20
9
Analisis kuantitatif DNA genom kentang selanjutnya yaitu DNA double
stranded (dsDNA) ditunjukkan oleh Tabel 2. Pengukuran dsDNA dilakukan
menggunakan fluorometer. Hasil pengukuran dsDNA menunjukkan konsentrasi
dsDNA yang terdapat pada masing-masing genotipe memenuhi untuk tahapan
fragmentasi. Perhitungan bobot dsDNA untuk konstruksi pustaka genom ini
diperoleh dengan perhitungan :
Tabel 2 Konsentrasi double stranded DNA hasil isolasi
Genotipe [Qubit] (ug/mL)
Faktor
pengenceran [ds DNA] (ng/uL)
CIP 392781 2.31 100 231
PT.29 1.43 100 143
Amudra 0.482 200 96.4
Margahayu 0.353 200 70.6
Konstruksi Pustaka Genom DNA Kentang
Fragmentasi DNA Genom Kentang
Pita-pita DNA hasil dari fragmentasi DNA menggunakan prinsip sonikasi
dapat dilihat pada gambar 2. Pita-pita DNA yang smear menunjukkan bahwa
DNA tersebut telah berhasil difragmentasi pada ukuran yang diharapkan (300-400
bp) dengan intensitas yang lebih terang yang berarti bahwa konsentrasi DNA
tinggi terpotong pada ukuran 300-400 bp. Ukuran 300-400 bp dipilih karena
ukuran optimal yang disarankan Illumina untuk proses sekuensing yaitu <800 bp.
Modifikasi Ujung Fragmen DNA
Pengukuran terhadap konsentrasi DNA genom kentang hasil modifikasi
ujung fragmen DNA diukur menggunakan nanodrop spektrofotometer dapat
dilihat pada Tabel 3. Konsentrasi DNA yang diukur mengalami pengurangan pada
setiap tahapannya. Kemurnian DNA genom kentang 4 genotipe cukup murni dari
kontaminasi protein dan polisakarida yang ditunjukkan oleh nilai rasio A260/280 dan
A260/230 yang masih dalam rentang kualitas yang baik (1.8-2.0).
Gambar 2 Elektroforegram DNA genom kentang hasil fragmentasi
Genotipe 1. CIP 392781; 2. PT 29
10
Adenilasi Ujung 3’OH dan Ligasi Adaptor
Pengukuran terhadap kuantitas dan kemurnian DNA setelah adenilasi ujung
3’OH dan ligasi adaptor diukur menggunakan nanodrop spektrofotometer. Hasil
pengukuran pada Tabel 4 menunjukkan konsentrasi DNA yang semakin
berkurang dari tahapan sebelumnya. Kemurnian DNA yang diperoleh sudah
murni sementara untuk genotipe CIP 392781 tidak diukur karena DNA yang
tersisa telah terkontaminasi oleh manik-manik paramagnetik.
Pemurnian DNA Setelah Ligasi Adaptor
Elektroforegram dari 2 genotipe kentang hasil pemurnian produk ligasi yaitu
genotipe Amudera dan Margahayu dapat dilihat pada Gambar 3. Pemurnian DNA
dilakukan dengan menggunakan gel agarosa 2% dan berhasil memisahkan DNA
hasil ligasi adaptor yang berukuran 400-500 bp. Pemisahan dapat diketahui dari
pita-pita DNA yang smear dan pada ukuran yang diharapkan DNA ditampung di
dalam suatu lubang yang sejajar dengan marker DNA 400 bp. Marker DNA yang
digunakan adalah marker DNA 400 bp.
Tabel 3 Kuantitas dan kemurnian DNA setelah tahapan purifikasi modifikasi
ujung fragmen DNA
Genotipe [Asam nukleat] (ng/uL) A260/280 A260/230
CIP 392781 54.7 2.33 1.35
PT.29 107.1 1.99 2.29
Amudra 91.4 2.04 2.45
Margahayu 83.2 2.09 2.34
Tabel 4 Kuantitas dan kemurnian DNA setelah tahapan adenilasi ujung 3’ dan
ligasi adaptor
Genotipe [Asam nukleat] (ng/uL) A260/280 A260/230
CIP 392781 Td Td Td
PT.29 44.6 2.02 2.19
Amudra 47.5 1.97 2.01
Margahayu 40.9 2.0 2.03
Ket : Td = tidak diukur
Gambar 3 Elektroforegram DNA hasil purifikasi produk ligasi Genotipe 1.
Amudera dan 2. Margahayu
11
Perbanyakan DNA Setelah Pemurnian DNA Fragmen
Kuantitas dan kemurnian DNA setelah tahapan pemurnian produk ligasi dan
perbanyakan fragmen DNA menggunakan perbanyakan PCR menunjukkan
jumlah kuantitas asam nukleat yang diukur semakin berkurang dari tahapan
sebelumnya dan terdapat kontaminasi pada beberapa genotipe. Berkurangnya
konsentrasi pada setiap tahapannya dikarenakan seleksi-seleksi yang telah
dilakukan oleh pereaksi untuk menghasilkan pustaka yang ideal. Kontaminasi
yang terjadi juga diakibatkan oleh manik-manik paramagnetik yang masih
tertinggal di dalam larutan DNA hasil pemurnian. Kentang genotipe CIP 392781
dan Amudera mengalami kontaminasi oleh protein dengan nilai A260/280 sebesar
1.78 dan 1.53 (Tabel 5) dimana nilai tersebut berada di bawah rentang yang ideal
(1.8-2.0). Kentang genotipe CIP 392781 dan Margahayu juga mengalami
kontaminasi oleh polisakarida dengan nilai A260/230 masing-masing sebesar 1.62
dan 1.33 (Tabel 5).
Perbanyakan dilakukan pada pustaka DNA hasil pemurnian produk ligasi
yang telah berhasil menyeleksi pustaka berukuran 400-500 bp dan selanjutnya
dilakukan uji kualitas untuk mengetahui ukuran pustaka yang diseleksi. Uji
kualitas menggunakan gel agarosa 2% menunjukkan bahwa pustaka DNA pada
ukuran yang diharapkan (400-500 bp) telah berhasil diperbanyak (Gambar 4).
Pita-pita DNA pada ukuran tersebut disejajarkan dengan marker 100 bp dan hasil
yang terlihat yaitu pita-pita DNA yang berukuran 400-500 bp.
Validasi Kualitas dan Kuantitas Pustaka Genom Kentang
Kualitas dan kuantitas pustaka genom kentang divalidasi dengan
menggunakan bioanalyzer untuk uji kualitas dan qPCR untuk uji kuantitas.
Pengujian kualitas juga dilakukan dengan menggunakan software photocap_MW.
Ukuran fragmen pustaka yang diukur menggunakan bionalyzer yaitu kentang
genotipe CIP 392781 dan PT 29 dengan ukuran masing-masing 324 bp dan 360
Tabel 5 Kuantitas dan kemurnian DNA setelah tahapan pemurnian setelah
tahapan purifikasi produk ligasi dan perbanyakan fragmen DNA
Genotipe [Asam nukleat] (ng/uL) A260/280 A260/230
CIP 392781 17.7 1.78 1.62
PT.29 10.8 1.95 4.47
Amudra 3 1.53 2
Margahayu 3.8 2.67 1.33
Gambar 4 Elektroforegram DNA genom kentang hasil amplifikasi dari kiri
ke kanan : CIP 392781 dan PT 29
12
bp. Kentang genotipe Amudera dan Margahayu dianalisis ukuran fragmennya
menggunakan software dan hasil yang diperoleh kentang genotipe Amudera dan
Margahayu masing-masing berukuran 568 bp dan 471 bp terlihat pada Tabel 6.
Pita-pita pustaka genom yang telah dikonstruksi juga dapat terlihat dengan jelas
pada alat bioanalyzer (Gambar 4).
Sebelum dianalisis menggunakan software photocap_MW terlebih dahulu
pustaka genom kentang yang telah dikonstruksi dielektroforesis pada gel agarosa
2% dan gambar ditangkap menggunakan UV transilluminator dan selanjutnya
dianalisis dimana hasil analisis dapat dilihat pada Gambar 6.
Hasil analisis kuantitas dari pustaka genom kentang yang telah berhasil
dikonstruksi dilakukan dengan menggunakan quantitatif PCR dapat dilihat pada
Tabel 7. Hasil pengukuran selanjutnya akan digunakan untuk menghitung
Tabel 6 Kualitas dan kuantitas pustaka genom kentang menggunakan
bioanalyzer dan software photocap_MW
Genotipe Ukuran Fragmen [ Pustaka ] pg/ul
CIP 392781 324 5578
PT.29 360 4452
Amudra 568 -
Margahayu 471 -
Gambar 5 Elektroforegram pustaka genom kentang dengan analisis
bioanalyzer
Gambar 6 Kualitas pustaka genom kentang menggunakan photocap_MW
13
kebutuhan pustaka genom yang ideal untuk tahapan selanjutnya yaitu klasterisasi
dan sekuensing DNA. Minimal jumlah pustaka DNA genom kentang yang
diperlukan untuk sekuensing yaitu 2 nM. Hasil kuantitas pengukuran qPCR yang
diperoleh masing-masing genotipe kentang yaitu CIP 392781, PT 29, Amudera
dan Margahayu yaitu masing-masing sebesar 60.14 nM, 34.64 nM, 17.76 nM dan
13.08 Nm (Tabel 7). Hasil pengukuran rata-rata masing-masing kentang diperoleh
dari perhitungan:
Rerata kuantitas dapat dilihat pada lampiran 2.
Klasterisasi dan Sekuensing Pustaka Genom Kentang
Jumlah Basa dan Kualitas Klaster Pustaka Genom secara Umum
Hasil sekuensing pengukuran jumlah basa dan kualitas klaster pustaka
genom secara umum yang disekuensing menggunakan alat sekuensing Illumina
Hiseq 2000 yang menggunakan prinsip sekuensing oleh sintesis dilihat pada Tabel
8. Sebelum sekuensing terlebih dahulu pustaka genom dimasukkan ke dalam
suatu flow cell dan diklasterisasi dengan alat yang bernama cBOT cluster
generation. Tipe pembacaan sekuensing yang dipilih pada pustaka sekuensing
pustaka genom ini adalah tipe pembacaan paired end dengan 2 x 100 siklus.
Secara umum jumlah basa dan kualitas pustaka genom kentang menghasilkan
nilai yield total dan projected total yield yang sama yaitu 287.2 Gbp (Tabel 8).
Artinya, total jumlah basa yang dihasilkan sama dengan jumlah basa yang
diprediksi sebelumnya.
Densitas dan Kualitas Pustaka Genom Kentang pada Lajur dalam Flow Cell
Pengukuran kualitas klaster dari empat genotipe kentang dilakukan untuk
menghitung kerapatan klaster di dalam suatu lajur pada flow cell. Hasil
sekuensing menunjukkan bahwa densitas klaster pustaka genom yang dihasilkan
Tabel 7 Kuantitas pustaka genom kentang diukur menggunakan qPCR
Genotipe [Ukuran rata-rata] (nM)
CIP 392781 60.14
PT.29 34.64
Amudra 17.76
Margahayu 13.08
Tabel 8 Jumlah basa dan kualitas klaster pustaka genom hasil sekuensing
secara umum
Yield Total
(Gbp)
Projected Total
Yield (G)
Yield
Perfect
(G)
Yield <=
3 errors
(G)
%
Perfect
[Num
Cycles]
% <= 3
errors [Num
Cycles]
287.2 287.2 5.1 6.1 82[99] 97.55 [99]
14
tinggi (Tabel 9). Densitas klaster pustaka genom termasuk kategori ideal jika
klaster pustaka genom memilki densitas berkisar dari 400-600 K/mm2.
Salah satu contoh histogram jumlah klaster pada lajur dapat dilihat pada
Gambar 7. Contoh yang digunakan adalah kentang genotipe Amudera pada lajur 1.
Berdasarkan kualitas sekuen yang dihasilkan yaitu diperoleh nilai Q scores 92.5%
dengan jumlah basa yang dibaca sebanyak 31.7 Gbp (Gambar 7).
Tingkat Kesalahan (Error Rate), Nilai Penyejajaran (Aligned) dan Intensitas
Basa Hasil Sekuensing
Pengukuran yang dilakukan selanjutnya adalah analisis terhadap tingkat
kesalahan (error rate), nilai penyejajaran (aligned) dan intensitas basa hasil
sekuensing. Masing-masing pustaka genom mengalami dua kali pembacaan (Read
1 dan read 2). Setiap pembacaan mengukur hal yang sama dan menghasilkan hasil
yang berbeda untuk intensitas siklus I dan % intensitas siklus 20 (Tabel 10).
Rerata error pada siklus 100 yaitu sebesar 0.00 % yang menunjukkan sekuensing
berjalan dengan sangat baik dan tidak ada kesalahan. Intensitas siklus yang
dihasilkan juga tergolong ideal (nilai intensitas ideal 1000) dimana masing-
Tabel 9 Densitas dan kualitas pustaka genom hasil sekuensing
Lajur Densitas
(K/mm2)
Klaster
PF (%)
Phasing
(%)
Pre
phasing
(%)
Reads
(M)
Reads
PF
(M)
% >=
Q30
CIP 392781 779 93.1 0.173 0.287 215.4 199.8 94
PT 29 766 93.1 0.178 0.285 211.9 196.6 94.1
Amudra 633 95 0.182 0.302 174.87 165.8 92.75
Margahayu 881 89.3 0.174 0.277 243.68 216.9 88.4
Gambar 7 Histogram jumlah klaster berdasarkan kualitas sekuen yang
dihasilkan
15
masing nilai baik pada pembacaan 1 maupun 2 berada pada nilai 4736 hingga
5531.
PEMBAHASAN
Hasil Isolasi DNA Genom Kentang
DNA genom merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki oleh suatu
organisme termasuk didalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein dan RNA
(Weaver & Hedrick 1997). Isolasi DNA adalah pemisahan molekul DNA dari
molekul lain seperti dinding sel, membran sel, dan membran inti sehingga
strukturnya dapat terlihat dengan jelas. Tujuannya adalah mengidentifikasi dan
mengkarakterisasi DNA yang dibutuhkan untuk proses analisis molekuler lainnya.
Berbagai teknis analisis dalam pemuliaan tanaman dan biologi molekuler
berdasarkan pada hibridisasi molekuler dan polymerase chain reaction (PCR)
membutuhkan DNA dalam jumlah dan kualitas yang baik. Kandungan senyawa
sekunder dalam sel tanaman berbeda beda maka setiap tanaman membutuhkan
prosedur isolasi yang optimum agar diperoleh DNA genom yang dapat digunakan
untuk proses analisis biomolekuler lainnya (Prahaditya 2013).
Metode isolasi DNA genom pada penelitian ini menggunakan metode Doyle
& Doyle (1987) yang dimodifikasi. Ekstraksi DNA menggunakan prosedur ini
pada prinsipnya menggunakan cetil trimetil ammonium bromide (CTAB) yang
berfungsi untuk mendegradasi senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada
tanaman. Modifikasi yang dilakukan terdapat pada penambahan natrium disulfida
dan polivinilpirolidon 2% ke dalam buffer CTAB 2% yang berguna sebagai
antioksidan pencegah warna coklat polifenol saat penggerusan. Pengendapan
Tabel 10 Tingkat kesalahan (error rate), nilai penyejajaran (aligned) dan
intensitas basa hasil sekuensing
Read Lajur Aligned
(%)
Error
Rate
(%)
Error Rate
100 cycle
(%)
Intensity
cycle I
%
Intensity
Cycle 20
1 CIP 392781 1.3 0.3 0.00 5466 81.8
PT 21 1.2 0.28 0.00 5331 81.6
Amudera 3.0 0.36 0.00 5531 81.0
Margahayu 1.6 0.41 0.00 4954 80.9
2 CIP 392781 1.3 0.74 0.00 4845 81.9
PT 21 1.2 0.72 0.00 4736 81.5
Amudera 2.9 0.67 0.00 4764 84.4
Margahayu 1.5 1.01 0.00 4408 80.9
16
menggunakan isopropanol pada metode Doyle & Doyle dilakukan pada suhu
ruang selama satu malam, namun pada penelitian ini pengendapan isopropanol
dilakukan selama 1 jam pada suhu -20oC dan juga untuk pengeringan hanya
membutuhkan waktu 15 menit menggunakan vakum evaporator.
Uji terhadap kualitas DNA hasil isolasi dapat diketahui dengan teknik
elektroforesis. Elektroforesis merupakan suatu cara untuk memisahkan fraksi-
fraksi campuran berdasarkan pergerakan partikel-partikel koloid bermuatan yang
dipengaruhi medan listrik. Elektroforesis umumnya digunakan untuk menentukan
berat molekul, mendeteksi kemurnian, dan kerusakan protein atau asam nukleat,
menetapkan titik isolistrik serta memisahkan spesies-spesies yang berbeda secara
kualitatif dan kuantitatif. Oleh karena itu, metode elektroforesis banyak digunakan
untuk analisis asam nukleat, virus, enzim dan protein (Bintang 2010).
DNA genom kentang dari 4 genotipe telah berhasil diisolasi dengan baik
yang ditandai dengan terbentuknya pita-pita DNA pada elektroforegram.
Elektroforegram merupakan hasil uji kualitatif terhadap DNA yang telah diisolasi.
DNA hasil isolasi dielektroforesis pada gel agarosa 1% dan menggunakan marker
DNA 100 bp. Keberhasilan atau kualitas DNA yang telah diisolasi merupakan
DNA genom terlihat dari letak pita DNA yang mendekati sumur dan juga
intensitas pita DNA yang tinggi dengan tidak adanya smear yang membuktikan
DNA tidak terdegradasi dan DNA yang diperoleh tersebut merupakan DNA
genom kentang yang utuh (Gambar 2). Elektroforesis gel akan memisahkan
molekul DNA sesuai dengan ukurannya dan semakin besar molekul DNA maka
pita DNA yang dihasilkan akan semakin dekat dengan sumur gel (Brown 2007).
Kuantitas hasil isolasi DNA genom kentang dapat diukur dengan
menggunakan spektrofotometer nanodrop thermoscientific pada panjang
gelombang 230 nm, 260 nm dan 280 nm. Uji kuantitas bertujuan untuk
mengetahui konsentrasi dan kemurnian dari DNA genom hasil isolasi. Panjang
gelombang 230 nm merupakan serapan maksimum untuk polisakarida, panjang
gelombang 260 merupakan panjang serapan maksimum untuk asam nukleat dan
panjang gelombang 280 nm merupakan serapan maksimum untuk protein.
Kemurnian DNA ditentukan melalui rasio perbandingan nilai absorbansi asam
nukleat (260 nm) dengan nilai absorbansi polisakarida (230 nm) untuk
menunjukkan kemurnian terhadap polisakarida dan perbandingan dengan nilai
absorbansi protein (280 nm) untuk menunjukkan kemurnian terhadap protein.
Hasil uji kuantitas DNA genom kentang memiliki konsentrasi asam nukleat
sebesar 2224.8 ng/uL – 11672.7 ng/uL dengan rasio A260/280 sebesar 1.86 – 1.96
dan rasio A260/230 sebesar 2.1 – 2.44 (Tabel 1). Terdapat satu genotipe yang
memiliki konsentrasi yang rendah yaitu sebesar 197.8 ng/uL dikarenakan sampel
DNA adalah sampel yang telah diisolasi dan disimpan dalam waktu yang cukup
lama. Sampel DNA genom kentang yang diisolasi dapat dikatakan sangat murni
dari kontaminasi baik dari protein maupun polisakarida karena masih berada pada
rentang ukuran 1.8-2.0. Yuwono (2005), menyatakan bahwa nilai kemurnian yang
kurang dari 1.8 menunjukkan bahwa sampel mengandung kontaminasi protein dan
polisakarida.
Fluorometer Qubit digunakan jika bekerja dengan sampel yang berharga
atau sangat sulit untuk diaplikasikan. Uji kuantitas selanjutnya dan sangat
dibutuhkan adalah uji konsentrasi dsDNA hasil isolasi. Alat ini berbeda dengan
nanodrop ataupun spektrofotometer lainnya karena alat ini hanya akan
17
menghitung molekul target seperti double standed DNA saja. Keuntungan
penggunaan fluorometer ini adalah akurasinya baik dan sangat teliti sehingga
mampu mendeteksi konsentrasi yang terendah sekalipun. Double stranded DNA
atau dsDNA biasanya digunakan untuk sampel yang akan disekuensing, sampel
DNA genom dan percobaan penelitian lainnya (Invitrogen 2010). Alat ini juga
dapat diaplikasikan untuk mengukur konsentrasi single standed DNA dan protein
target.
Pengukuran konsentrasi dsDNA dilakukan dengan pengenceran 100 dan
200 kali. Hasil yang diperoleh yaitu dalam setiap 1 ul DNA hasil isolasi terdapat
dsDNA dengan konsentrasi 70.6 ng/uL hingga 231 ng/uL (Tabel 2). Konsentrasi
dsDNA yang telah diukur ini akan sangat memudahkan untuk tahapan konstruksi
pustaka selanjutnya. Berat dsDNA yang dibutuhkan untuk tahapan awal
konstruksi pustaka awal yaitu saat fragmentasi adalah 1 ug jika volume DNA
yang tersedia sedikit dan 2.6 ug jika volume DNA yang tersedia banyak atau
dapat dikatakan konsentrasi dsDNA yang dibutuhkan hanya 20 ng/uL yang
diencerkan ke dalam 130 uL atau 55 uL buffer resuspensi. Volume DNA yang
harus diencerkan diperoleh dengan perhitungan yaitu 20 ng/uL x 130 ul dan
kemudian dibagi dengan konsentrasi dsDNA yang telah diukur.
Konstruksi Pustaka Genom DNA Kentang
Pustaka genom adalah sekumpulan klon yang mengandung DNA genom
total dari suatu organisme. Pustaka genom seharusnya mengandung seluruh
sekuen DNA dari suatu organisme (Lodish et al. 2000). Selain sebagai bahan
genetik, pustaka genom juga sangat bermanfaat untuk mengisolasi gen utuh yang
mengandung promoter, terminator dan intron untuk mengetahui regulasi ekspresi
gen. Peta fisik suatu genom juga membutuhkan pustaka genom, sehingga pustaka
genom merupakan bagian yang sangat penting dalam perbaikan genetika tanaman,
baik melalui teknologi DNA rekombinan maupun melalui pemuliaan
konvensional (Suharsono 2002).
Konstruksi pustaka genom kentang pada penelitian ini mengikuti protokol
TruSeq DNA low troughput protocol dari Illumina yang dimodifikasi pada
beberapa tahapannya. Tujuan dari protokol ini yaitu menambahkan sekuen
adaptor ke dalam ujung fragmen DNA untuk menghasilkan pembacaan ganda atau
sekuen ujung pasangan pustaka. Tahapan awal konstruksi pustaka genom kentang
ini setalah isolasi DNA genom utuh dari kentang yaitu dilakukannya pemotongan
DNA kentang pada panjang tertentu yang diharapkan potongan tersebut telah
dapat mewakilkan gen-gen penyandi genom kentang, modifikasi ujung DNA,
adenilasi ujung 3’OH dan ligasi adaptor, pemurnian produk ligasi dan
perbanyakan fragmen DNA secara invitro atau menggunakan PCR. Hasil
konstruksi dari pustaka genom nantinya dapat divalidasi agar dapat dilanjutkan ke
tahap berikutnya.
Hasil Fragmentasi DNA Genom Kentang
Fragmentasi atau pemotongan DNA genom kentang dilakukan secara fisik
dengan alat Covaris yang menggunakan prinsip sonikasi untuk memotong DNA
genom secara acak pada kisaran pemotongan 300-400 bp. Pemilihan potongan
18
DNA pada 300-400 bp karena ukuran ideal pustaka genom yang disarankan oleh
illumina adalah < 800 bp karena pustaka yang berukuran sangat panjang ataupun
sangat pendek dapat mempengaruhi keakuratan data yang dihasilkan pada saat
proses sekuensing berlangsung. Alat Covaris ini dilengkapi dengan tabung
Covaris yang didesain secara khusus untuk pemotongan DNA. Alat ini tidak
membutuhkan DNA dalam jumlah besar untuk melakukan pemotongan. Covaris
akan memotong dan menghasilkan fragmen dsDNA dengan ujung 3’ atau 5’
overhang. Konsentrasi dsDNA yang dibutuhkan yaitu 20 ng/uL yang dilarutkan
ke dalam buffer resuspensi dengan berat akhir DNA 1 ug dan 2.6 ug. Buffer
resuspensi ini akan tetap menjaga DNA dalam kondisi yang baik dan stabil dan
juga dapat melarutkan kembali DNA setelah DNA berinteraksi dengan banyak
pereaksi yang digunakan. Kelebihan pemotongan dengan menggunakan covaris
ini adalah konsentrasi DNA yang dibutuhkan untuk pemotongan tidak banyak
namun harus benar-benar dsDNA dan juga dapat meminimalisir terbuangnya
DNA secara percuma. Sampel DNA dengan bobot DNA dari 50 ng- 2 ug
pertabungnya dapat dipotong dengan menggunakan M220 (Covaris 2012).
Fragmentasi DNA merupakan suatu proses yang mendeskripsikan cara
memperoleh fragmen DNA genom optimal yang mengandung pustaka akhir pada
rerata panjang ukuran 300-400 bp dan merupakan tahapan yang paling kritis.
Illumina menyarankan untuk hasil optimal potongan DNA pada 300-400 bp,
sedangkan untuk perbanyakan eksom bisa pada ukuran 200-300 bp (Illumina
2010a). Hasil fragmentasi DNA kemudian dapat diperiksa dengan dielektroforesis
pada gel agarosa 2% selama 40 menit. Gambar 3 merupakan elektroforegram
fragmen DNA genom yang sudah difragmentasi menggunakan Covaris.
Elektroforegram ini memperlihatkan pita hasil DNA genom yang smear pada
ukuran 200 hingga 1200 bp, ukuran yang nantinya akan dipilih adalah DNA yang
berukuran 300-400 bp. DNA yang berukuran lebih besar ataupun lebih kecil dari
ukuran yang diharapkan nantinya akan diseleksi pada tahapan-tahapan konstruksi
pustaka selanjutnya dengan menggunakan pereaksi-pereaksi yang spesifik.
Hasil Modifikasi Ujung Fragmen DNA
Modifikasi ujung fragmen DNA atau perform end repair merupakan suatu
tahapan setelah pemotongan DNA genom menggunakan covaris. Proses ini akan
mengubah ujung lengket hasil dari fragmentasi ke dalam ujung tumpul (blunt end)
menggunakan end repair mix. End repair mix mengandung enzim eksonuklease
dan polymerase. Aktivitas 3’-5’ eksonuklease akan menghilangkan atau
memotong pada ujung 3’ dan aktivitas polymerase akan memenuhi atau membuat
ujung 5’ (Illumina 2010a). Tahapan modifikasi ujung terdiri dari memasukkan end
repair mix untuk modifikasi, inkubasi untuk mengoptimalkan reaksi dan proses
pembuatan ujung dan selanjutnya adalah proses clean up atau pembersihan sisa-
sisa pereaksi yang tidak bereaksi dengan DNA dan juga dengan menambahkan
AMPure XP beads ke dalam tabung dimana AMPure XP beads ini akan mengikat
DNA dan menghilangkan kelebihan-kelebihan pereaksi yang digunakan. AMPure
XP beads mengandung silika dan manik-manik paramagnetik yang dengan
bantuan medan magnet akan mengikatkan fragmen DNA pada dinding tabung.
Sehingga, pada saat pencucian dengan etanol 80% fragmen DNA tidak ikut
terbuang bersama supernatan.
19
Pengukuran konsentrasi hasil modifikasi ujung DNA dapat diukur dengan
menggunakan nanodrop untuk mengetahui konsentrasi dan kemurniannya dan hal
ini bisa dilakukan jika supernatan yang digunakan masih tersisa di dalam tabung
dan tidak mengurangi jumlah larutan DNA untuk tahapan selanjutnya. Tabel 3
merupakan jumlah konsentrasi dan kemurnian DNA setelah tahapan pembersihan
ujung fragmen DNA. Konsentrasi asam nukleat yang dihasilkan sebesar 54.7
ng/uL hingga 107.1 ng/uL dengan tingkat kemurnian A260/280 sebesar 1.99-2.33
dan rasio A260/230 sebesar 1.35 – 2.45 (Tabel 3). Hal ini dapat menunjukkan DNA
yang telah dimodifikasi murni dari kontaminasi protein karena nilai yang
ditunjukkan tidak terlalu berbeda dengan rentang nilai yang seharusnya, dan
kemurnian dari polisakarida untuk sampel dengan genotipe CIP 392781 kurang
(<1.8) tapi tidak terlalu mempengaruhi terhadap kualitas pustaka modifikasi ujung
fragmen DNA karena DNA yang digunakan pada pengukuran ini adalah DNA
yang tersisa dan mungkin diakibatkan tidak teliti dalam penggunaan mikropipet.
Hasil dari modifikasi ujung fragmen DNA kemudian dapat dilanjutkan ke tahapan
adenilasi ujung 3’OH dan ligasi adaptor.
Hasil Adenilasi Ujung 3’OH dan Ligasi Adaptor
Adenilasi bertujuan mencegah ligasi antar fragmen DNA dan menyiapkan
DNA sebelum ligasi adaptor. Sebuah nukleotida adenin ditambahkan ke ujung 3’
dari fragmen tumpul untuk mencegah DNA saling berligasi satu sama lain selama
reaksi ligasi adaptor. Kecocokan nukleotida tunggal T pada ujung 3’ akan
menyediakan adaptor untuk melengkapi overhang untuk ligasi adaptor pada
fragmen. Strategi ini memastikan rendahnya kecepatan terbentuknya chimera
(jalinan-jalinan template) (Illumina 2010a). A tailing mix dalam adenilasi akan
membuat fragmen DNA menjadi kompatibel dengan adaptor dan mencegah ligasi
sendiri (self ligation) dengan penambahan adenin tersebut pada 3’overhang.
Ligasi adaptor merupakan proses yang akan melekatkan indeks atau adaptor
penunjuk pada ujung fragmen DNA dan menyiapkan pengikatan pustaka untuk
hibridisasi di atas suatu flow cell. Proses ligasi adaptor menggunakan adaptor
indeks nomor 2 (AD002) yang berisi sekuen nukleotida CGATGT (A) dan DNA
ligation mix yang menghubungkan adaptor untuk disisipkan (Illumina 2010a).
Stop ligation buffer ditambahkan secepatnya ke dalam tabung setelah proses
inkubasi untuk menghentikan proses ligasi. Karena proses ligasi yang terjadi terus
menerus tanpa dihentikan dengan cepat dapat mengakibatkan saling terjalinnya
nukleotida sehingga tidak menghasilkan pustaka yang sesuai ataupun dapat
mengakibatkan adaptor saling menempel satu sama lain.
Supernatan yang tersisa setelah proses tahapan pembersihan adenilasi ujung
3’OH dan ligasi adaptor kemudian diukur konsentrasi atau kuantitas dan
kemurnian DNA nya. Konsentrasi asam nukleat pada tahapan ini mengalami
penurunan jika dibandingkan dengan tahapan sebelumnya. Hal ini disebabkan
karena semakin banyak seleksi yang dilakukan sehingga nantinya didapatkan
pustaka DNA yang akurat. Konsentrasi asam nukleat yang diperoleh yaitu sebesar
40.9 ng/uL hingga 47.5 ng/uL dengan tingkat kemurnian A260/280 pada rentang
1.97 hingga 2.0 (Tabel 4). Terdapat satu genotipe (CIP 392781) yang tidak diukur
konsentrasi dan kemurniannya dikarenakan sisa supernatan setelah pembersihan
tidak mencukupi dan banyak terkontaminasi oleh manik-manik paramagnetik.
20
Kesalahan pengukuran atau penggunaan pipet dalam hal ini sangat diperhatikan
agar hasil yang diperoleh optimal. Supernatan yang tidak tersisa mungkin
disebabkan oleh kesalahan dalam proses penggunaan pipet.
Hasil Pemurnian DNA setelah Ligasi Adaptor
Pemurnian produk hasil ligasi adaptor dilakukan dengan menggunakan gel
agarosa 2%. Proses pemurnian reaksi produk ligasi dilakukan pada sebuah gel dan
akan mengangkat adaptor-adaptor yang tidak menempel, adaptor yang terligasi
baik satu sama lainnya, dan melakukan seleksi ukuran dari sekuensing pustaka
untuk menghasilkan kelompok (cluster) yang cocok (Illumina 2010a). Tahapan
pemurnian ini mengalami sedikit modifikasi dari protokolnya yaitu saat
dielektroforesis pada gel elektroforesis selama 60 menit dengan 100 volt
sementara aturan prosedur yaitu 120 volt dan 120 menit. Optimasi telah dilakukan
sebelumnya oleh Satyawan (2014), dimana ke dalam tabung yang berisi DNA
hasil ligasi langsung ditambahkan blue juice sebagai pemberat dan pemberi warna
DNA sedangkan pewarna SyBr Gold langsung dicampurkan ke dalam gel agarosa
2% untuk deteksi yang lebih akurat.
Gambar 4 merupakan perwakilan dari beberapa genotipe kentang hasil
pemurnian setelah ligasi adaptor. Genotipe yang mewakili yaitu Amudera dan
Margahayu. Pita-pita DNA yang smear ditunjukkan berada pada ukuran yang
diharapkan yaitu 300-400 bp dengan marker 100 bp. Pita DNA yang smear ini
menunjukkan ukuran-ukuran terpotongnya DNA dimana pada ukuran 300-400 bp
intensitas DNA sedikit tinggi sehingga DNA dapat dipotong pada ukuran tersebut.
Pemotongan tersebut dilakukan dengan cara mengiris gel pada ukuran DNA 300-
400 bp dan kemudian gel yang telah diiris dimasukkan ke dalam tabung untuk
kemudian disimpan dan digunakan pada tahapan selanjutnya. Ukuran-ukuran ini
diseleksi sesuai dengan ukuran pustaka yang dibutuhkan (<800 bp) untuk
sekuensing menggunakan NGS. Tahapan terakhir dari konstruksi pustaka genom
yang dilakukan adalah perbanyakan DNA hasil pemurnian ligasi adaptor yaitu
perbanyakan DNA yang berukuran 300-400 bp.
Hasil Perbanyakan DNA setelah Pemurnian DNA Fragmen
Perbanyakan DNA atau enrichment DNA fragment setelah tahapan
pemurnian produk ligasi dilakukan dengan menggunakan PCR untuk menyeleksi
perbanyakan fragmen DNA yang mempunyai adaptor pada kedua ujungnya dan
untuk diperbanyak menjadi banyak DNA pustaka. PCR primer cocktail akan
menempel ke ujung daripada adaptor. Jumlah siklus PCR juga harus
diminimalkan untuk mencegah penggambaran pustaka yang tidak simetris
(Illumina 2010a). Tahapan predenaturasi dilakukan selama 30 detik pada suhu
980C dan kemudian dilanjutkan dengan siklus PCR sebanyak 10 siklus dengan
rincian denaturasi pada 980C selama 10 detik, penempelan atau annealing pada
suhu 60oC selama 30 detik dan dilanjutkan dengan tahapan pemanjangan atau
extention pada suhu 720C selama 30 detik. Tahapan setelah pemanjangan
dilakukan selama 5 menit pada suhu 720C dan kemudian siklus ditahan pada suhu
40C. Pada perbanyakan DNA setelah pemurnian ini hanya DNA yang berukuran
300-400 bp yang telah ditempeli adaptor pada kedua ujungnya yang diperbanyak.
21
Konsentrasi dan kemurnian DNA setelah tahapan perbanyakan fragmen
DNA dapat diukur dengan menggunakan nanodrop sedangkan uji kualitas hasil
perbanyakan dapat diketahui dengan elektroforesis DNA pada gel agarosa 2%.
Supernatan yang tersisa pada tabung dapat digunakan untuk pengukuran setelah
proses pembersihan perbanyakan fragmen DNA. Kuantitas atau konsentrasi asam
nukleat yang diperoleh yaitu sebesar 3 ng/uL hingga 17.7 ng/uL dengan tingkat
kemurnian A260/280 yang diperoleh sebesar 1.53 hingga 2.67 dan kemurnian
terhadap polisakarida A260/230 yang diperoleh sebesar 1.62 hingga 4.47 (Tabel 5).
Kemurnian yang kecil yaitu <1.8 dan yang melebihi nilai 2 mungkin disebabkan
pada saat pengukuran masih terkontaminasi oleh manik-manik paramagnetik.
Kualitas pustaka hasil perbanyakan fragmen DNA ditunjukkan oleh
elektroforegram pada gambar 5 yang menunjukkan bahwa pita-pita DNA berada
pada ukuran yang diharapkan yaitu 400-500 bp dan ukuran ini masih berada pada
rentang ukuran ideal dari pustaka genom.
Hasil Validasi Kualitas Dan Kuantitas Pustaka Genom Kentang
Pustaka genom kentang yang telah berhasil dikonstruksi dapat diukur
kualitas dan kuantitasnya untuk memudahkan pada tahap klasterisasi dan
sekuensing DNA. Kualitas pustaka genom kentang yang telah berhasil
dikonstruksi dapat diukur ukuran fragmennya dengan menggunakan instrumen
bioanalyzer dan analisis menggunakan software photocap_MW. Analisis terhadap
kuantitas pustaka genom hasil konstruksi dapat dilakukan dengan menggunakan
quantitative PCR (qPCR). Analisis ini masing-masing hanya menggunakan DNA
hasil pustaka yang sedikit (±2 ul) sehingga jumlah pustaka DNA yang nantinya
akan digunakan untuk klasterisasi dan sekuensing masih terpenuhi. Terdapat
perbedaan antara bionalyzer dan qPCR selain masing-masingnya untuk analisis
kualitatif dan kuantitatif. Instrumen bioanalyzer selain digunakan untuk analisis
kualitas juga dapat mengukur kuantitas pustaka DNA namun instrumen ini akan
membaca semua pustaka berdasarkan potongannya. Sementara itu, qPCR hanya
akan mengukur pustaka yang memiliki fragmen yang ditempeli adaptor pada
kedua ujungnya dan juga menggunakan 2 primer sehingga data kuantitas lebih
akurat.
Kualitas pustaka genom hasil konstruksi dapat diketahui dengan
menggunakan alat bionalyzer dari agilent. Alat bionalyzer dapat mengetahui
secara spesifik atau secara tepat potongan ukuran dari fragmen DNA pustaka.
Pengukuran fragmen DNA pustaka menghasilkan ukuran pustaka yang baik yaitu
<800 bp, ukuran fragmen pustaka genotipe CIP 392781 dan PT.29 yaitu pada 324
bp dan 360 bp dengan konsentrasi pustaka sebesar 5578 Pg/ul dan 4452 Pg/ul.
Beberapa genotipe kentang diukur dengan menggunakan analisis software
photocap_MW. Sebelumnya, pustaka yang telah dianalisis kuantitasnya
menggunakan qPCR dielektroforesis pada gel agarosa 2% dan gambar yang
berhasil ditangkap didokumentasikan dan dianalisis menggunakan software
sehingga hanya menghasilkan ukuran saja tanpa bisa menghitung konsentrasi
pustaka akhir. Hasil yang didapatkan yaitu ukuran fragmen sebesar 568 bp untuk
genotipe Amudera dan 471 bp untuk genotipe Margahayu (Tabel 6). Ukuran ini
masih memenuhi ukuran ideal yang dibutuhkan untuk klasterisasi dan sekuensing
pustaka genom kentang.
22
Bionalyzer terdiri dari sebuah alat yang terhubung dengan sebuah komputer
dan software didalamnya dan chip atau lempeng yang kompatibel yang
menghasilkan pita-pita DNA saat pembacaannya. Chip agilent ini dapat
digunakan untuk mengukur DNA, RNA dan protein dengan prinsip pengujian
yang sama. Prinsip pengujian elektroforesis yang didasarkan pada prinsip gel
elektroforesis yang dipindahkan ke dalam bentuk lempengan. Bentuk lempengan
akan mengurangi penggunaan waktu dan penggunaan sampel. Pengujian kuantitas
DNA dan protein dapat diselesaikan dengan bantuan “upper marker”. Peak
sampel berada dibawah daerah upper marker dan karena konsentrasi upper marker
telah diketahui maka konsentrasi tiap sampel juga dapat dihitung (Agilent
Technologies 2003). Hasil pengukuran dengan bioanalyzer juga dapat
menghasilkan data berupa gambar elektroforegram dengan pita-pita yang tajam
dan ukuran yang sangat spesifik (Gambar 5).
Metode deteksi dengan qPCR merupakan sebuah proses dimana reaksi PCR
ini mengandung enzim dNTPs, buffer dan SyBr Green I, primer dan template.
SyBr Green I tidak memiliki fluororescen yang signifikan terhadap kehadiran
single stranded DNA (ssDNA). Proses selanjutnya yaitu produk dsDNA akan
berinteraksi dengan SyBr Green I dan menjadi sebuah produk yang bersinar.
Ketika produk sudah cukup terakumulasi maka fluororescen akan meningkat lebih
tinggi dibanding sebelumnya dan ini dinamakan dengan siklus ambang batas (Ct).
Nilai Ct kemudian digunakan untuk mengukur kuantitas jumlah template saat
dimulainya reaksi (Sigma 2008). Berdasarkan proses inilah maka konsentrasi
pustaka akhir yang dihasilkan dapat diketahui.
Nilai kuantitas pustaka genom kentang diukur menggunakan qPCR dengan
tiga kali pengenceran (1000, 2000 dan 4000) (Lampiran 2) pada genotipenya
menghasilkan kuantitas pustaka genom kentang dengan ukuran rata-rata sebesar
13.08 nM hingga 60.14 nM (Tabel 7) yang selanjutnya dapat digunakan untuk
perhitungan pustaka yang dibutuhkan untuk klasterisasi. Konsentrasi pustaka
genom kentang yang dibutuhkan untuk klasterisasi yaitu minimal 2 nM yang
diencerkan ke dalam Tris-Cl 10 mM pH 8.5 dan 0.1% Tween 20 untuk mencegah
absorbsi template ke tabung saat siklus karena dapat menurunkan jumlah
klasterisasi. Proses klasterisasi sendiri menggunakan pustaka DNA genom dengan
konsentrasi 13 pM, hasil ini diperoleh dari pengenceran stok pustaka DNA 2 nM.
Klasterisasi dan Sekuensing Pustaka Genom Kentang
Jumlah Basa dan Kualitas Klaster Pustaka Genom secara Umum
Sebelum dilaksanakan proses sekuensing, terlebih dahulu pustaka genom
diklasterisasi. Mardis (2008), mengatakan klasterisasi terlebih dahulu bertujuan
untuk menghasilkan klaster atau kelompok salinan dari pustaka genom yang akan
disekuen. Setelah proses klasterisasi, klaster pustaka genom tersebut kemudian
dimasukkan ke dalam alat NGS Hiseq 2000 untuk disekuensing. Basa penyusun
genom kentang berukuran 850 Mb satu salinannya menurut Potato Genome
Sequencing Consortium (2012) yang tersebar lebih dari 12 kromosom sementara
itu pengurutan basa penyusun genom kentang yang dilakukan pada penelitian ini
adalah pengurutan dari genotipe kentang yang autotetraploid.
23
Proses atau alur penghasilan klaster di dalam cBOT terdiri dari imobilisasi
dan ekstensi 3’, bridge amplification, linearisasi, dan hibridisasi (Lampiran 4).
Penambahan NaOH untuk denaturasi DNA ditambahkan diawal dan netralisasi
reaksi dilakukan dengan menambahkan HT1 buffer hibridisasi (Subtelny 2014).
Klaster yang telah dihasilkan diatas flow cell ini selanjutnya dapat digunakan
untuk proses sekuensing DNA genom kentang pada alat NGS Hiseq 2000.
Sekuensing ini juga dapat digunakan untuk menganalisis kualitas dari pustaka
genom yang telah dikonstruksi dan diklasterisasi sebelumnya. Proses analisis ini
dilakukan dengan melihat hasil pencitraan terhadap klaster pustaka genom saat
proses sekuensing berlangsung (Illumina 2011).
Secara total jumlah basa hasil sekuensing (yield total) diperoleh sebanyak
287.2 x 109 bp atau 287.2 Gbp dan hasil ini memiliki kesamaan dengan jumlah
basa yang diprediksi akan diperoleh selama proses sekuensing berlangsung
(projected total yield). Jumlah basa total dari hasil sekuensing ini sebenarnya
merupakan jumlah basa total dari beberapa sampel yaitu kentang, jagung dan
kakao yang saat proses sekuensing dilakukan pada saat bersamaan di dalam suatu
flow cell. Nilai projected total yield bergantung pada tipe pembacaan yang dipilih
selama proses sekuensing dimana NGS Hiseq 2000 memiliki empat tipe
pembacaan yaitu single read, paired end, multiplexed single read dan multiplexed
paired end. Penelitian ini menggunakan tipe pembacaan sekuensing adalah paired
end dengan jumlah siklus sebanyak 200 siklus.
Sekuenser sistem Hiseq ini mengadopsi teknologi sekuensing dengan
sintesis. Pustaka dengan adaptor yang sesuai didenaturasi menjadi untas tunggal
dan dicangkokan ke atas flow cell, diikuti dengan perbanyakan jembatan ke setiap
klaster yang mengandung klon fragmen DNA. Sebelum disekuensing, pustaka
disambung ke dalam utas tunggal dengan bantuan enzim linearisasi dan kemudian
empat jenis nukleotida (ddATP, ddGTP, ddCTP, dan ddTTP) yang mengandung
pewarna fluororescen berbeda dan menghilangkan kelompok penghambat yang
berkomplemen dengan template basa satu kali dan sinyal akan ditangkap oleh
CCD (alat pengisi sambungan) (Liu et al. 2012).
Yield perfect yang diperoleh selama proses sekuensing yaitu sebesar 5.1
Gbp (tabel 8). Menurut Kosasih (2012), nilai yang diperoleh tersebut merupakan
nilai yield pada lajur kontrol (lajur PhiX) sehingga nilainya hanya seperdelapan
dari nilai yield total. Nilai yield perfect menunjukkan jumlah basa yang akurat
melewati passing filter. Passing filter adalah sejenis algoritma yang dipakai oleh
komputer untuk menentukan keakuratan pembacaan basa saat sekuensing. Passing
filter yang digunakan berdasarkan data sekuen PhiX yang berperan sebagai
kontrol pada tahapan sekuensing menggunakan NGS Hiseq 2000.
Genom PhiX digunakan sebagai kontrol dalam proses sekuensing ini yang
memiliki beberapa keunggulan diantaranya mempunyai ukuran genom yang kecil,
mengandung komposisi basa penyusun genom yang beragam (45% GC dan 55%
AT) dan memiliki urutan genom yang telah diketahui secara lengkap (Illumina
2012; Kircher et al. 2011). Referensi ukuran genom dari PhiX sendiri yaitu 5384
bp yang tidak mengandung sekuen adaptor dan dengan kecocokan genom yang
unik (Minoche et al. 2011). Kontrol PhiX yang digunakan pada penelitian ini
sebanyak 1% yang artinya adalah di dalam sampel terdapat PhiX yang digunakan
sebagai kontrol sebanyak 1% saja.
24
Nilai yield <=3 errors, %perfect dan %<=3 errors menunjukkan tingkat
kesalahan selama proses sekuensing. Yield <=3 errors menunjukkan jumah basa
pada lajur kontrol yang memiliki tingkat kesalahan di bawah 3 basa. Nilai yield
<=3 errors dan yield perfect yang dihasilkan juga dapat menunjukkan bahwa
jumlah basa pada lajur kontrol memiliki tingkat kesalahan antara 1-3 basa.
Nilai %perfect yang dihasilkan selama proses sekuensing menunjukkan persentase
tingkat kesamaan antara basa yang dihasilkan dengan sekuen PhiX dalam 99
siklus. Nilai %<=3 errors menunjukkan persentase jumlah basa yang memiliki
tingkat kesalahan kurang dari 3 basa. Nilai yield <=3 errors, %perfect dan %<=3
errors dapat dilihat pada tabel 8 dengan nilai masing-masing 6.1 Gbp, 82 % dari
99 siklus dan 97.55 % untuk 99 siklus.
Densitas dan Kualitas Pustaka Genom Kentang pada Lajur dalam Flow Cell
Hasil konstruksi dari pustaka genom dialirkan pada setiap lajur dari flow cell
untuk menghasilkan klaster pustaka genom. Klaster di dalam flow cell yang telah
klasterisasi ini selanjutkan akan diukur kualitas dan kuantitasnya di dalam
sekuensing. Pengukuran kuantitas klaster dilakukan untuk menghitung densitas
(kerapatan klaster) di dalam suatu lajur pada flow cell. Hasil sekuensing
menunjukkan bahwa densitas klaster pustaka genom yang dihasilkan berkisar 633
K/mm2 -881 K/mm
2 (Tabel 9). Kualitas klaster pustaka genom dapat dilihat dari
gambar yang ditangkap kamera dengan sebaran yang tidak terlalu rapat ataupun
tidak terlalu jarang. Densitas klaster pustaka genom termasuk kategor ideal jika
klaster pustaka genom memiliki densitas berkisar dari 400-600 K/mm2.
Lajur flow cell dari masing-masing pustaka genom kentang yang dihasilkan
memiliki densitas yang tinggi dengan nilai densitas klaster >600 K/mm2. Densitas
klaster yang tinggi dapat disebabkan karena konsentrasi pustaka genom yang
digunakan dalam proses klasterisasi lebih tinggi dari seharusnya (>13 pM). Hal ini
juga mungkin terjadi karena kesalahan dalam pengukuran konsentrasi pustaka
genom sebelum klasterisasi (Quail et al. 2008). Kesalahan pengukuran konsentrasi
mungkin juga disebabkan oleh kesalahan perhitungan atau pengukuran saat
validasi pustaka genom kentang dan juga kesalahan dalam penggunaan mikropipet.
Persentase klaster pustaka genom kentang yang melewati passing filter juga
dihitung. Persentase klaster passing filter (PF) yang dihasilkan selama proses
sekuensing memiliki nilai lebih dari 80% (Tabel 9). Hasil tersebut menunjukkan
bahwa nilai klaster PF termasuk ke dalam kategori ideal. Illumina (2009)
menyatakan bahwa nilai persen klaster PF yang ideal memiliki nilai lebih dari
70%. Rendahnya nilai persen klaster PF dapat disebabkan oleh beberapa hal
diantaranya densitas klaster yang terlalu tinggi, ukuran pustaka genom yang
terlalu panjang dan tingginya persen dephasing (pashing dan prephasing) selama
proses sekuensing (Kosasih 2012).
Illumina (2009) menyatakan bahwa kualitas pustaka genom yang baik
memiliki nilai phasing kurang dari 0.4% dan nilai prephasing kurang dari 0.5%.
Nilai persen phasing dan prephasing merupakan salah satu indikator selama
proses sekuensing. Nilai persen dephasing yang dihasilkan sebesar 0.174 hingga
0.302 untuk phasing dan 0.277 hingga 0.302 untuk prephasing. Hasil tersebut
menunjukkan bahwa pustaka genom yang telah dikonstruksi dan diklasterisasi
memiliki kualitas yang baik.
25
Phasing dan prephasing dipengaruhi oleh efisiensi aliran fluida reagen
sekuensing dan reaksi kimia yang terjadi selama proses sekuensing (Illumina
2009). Phasing dan prephasing menggambarkan hilangnya sinkronisasi dalam
pembacaan basa dari urutan salinan klaster. Hal tersebut mengakibatkan dalam
pembacaan basa hasil sintesis selama proses sekuensing ada yang dibaca terlalu
cepat (prephasing) dan ada yang terlalu lambat (phasing). Kircher et al. (2011)
menyatakan bahwa phasing disebabkan tidak sempurnanya pemutusan ikatan
kimia penanda flourorescen pada proses terminasi gugus 3’OH dalam suatu
klaster. Efek phasing menyebabkan pada siklus selanjutnya tidak ada penempelan
basa pada klaster tersebut sehingga pendaran flourorescen yang terbaca bukan
berasal dari siklus sintesis basa yang baru melainkan berasal dari pendaran
flouroresen hasil sintesis basa sebelumnya. Berbeda dengan phasing, prephasing
disebabkan tidak efektifnya proses pemblokiran saat penempelan basa pada gugus
3’OH yang menyebabkan terjadinya penempelan dua basa sekaligus dalam waktu
yang bersamaan.
Nilai reads menunjukkan hasil pembacaan urutan basa dalam setiap klaster
pustaka genom. Sedangkan, nilai reads PF menunjukkan hasil pembacaan urutan
basa dalam klaster yang melewati passing filter (Kosasih 2012). Jumlah
keseluruhan nilai reads PF yang dihasilkan dari semua klaster pustaka genom dan
kontrol PhiX mempresentasikan nilai yield total. Nilai reads dan reads PF dapat
dilihat pada tabel 9 dimana nilainya sebesar 174.87 hingga 243.68 M untuk reads
dan 165.82 hingga 216.87 untuk nilai reads PF.
Nilai Q scores atau angka kualitas didefinisikan sebagai hubungan
logaritmik antara proses base calling selama sekuensing dengan kemungkinan
tingkat kesalahan yang dihasilkan dalam proses tersebut (Minoche et al. 2011).
Base calling diartikan sebagai proses konversi data hasil pencitraan pendaran
flourorescen selama proses sekuensing menjadi basa-basa yang berurutan. Nilai Q
scores pada penelitian ini diambil nilai Q score 30 yang artinya penghitungan 1
kesalahan pembacaan didalam 1000 basa atau dapat juga dikatakan P=0.001 %
kesalahan (Minoche et al. 2011). Secara keseluruhan nilai Q scores yang
dihasilkan selama proses sekuensing yaitu 88.4 hingga 92.75 % (Tabel 9) dan
gambar 7 merupakan salah satu contoh dari histogram jumlah klaster pada lajur 1
(Genotipe Amudera) berdasarkan kualitas sekuen yang dihasilkan yaitu nilai Q
scores 92.5% dengan jumlah basa yang dibaca sebanyak 31.7 Gb.
Tingkat Kesalahan (Error Rate), Nilai Penyejajaran (Aligned) dan Intensitas
Basa Hasil Sekuensing
Nilai % error rate menunjukkan persentase perbandingan kesalahan
pembacaan basa antara pustaka genom dengan kontrol yang dibaca pada beberapa
siklus sekuensing dan pada penelitian ini hanya ditampilkan pada siklus ke 100.
Secara keseluruhan, nilai error rate yang dihasilkan selama proses sekuensing
pada penelitian ini yaitu sebesar 0.28-1.01%. Sementara itu untuk kesalahan pada
siklus ke 100 yaitu 0.00 % yang menunjukkan bahwa sekuensing yang telah
dilakukan berlangsung dengan sangat baik dengan tidak adanya tingkat kesalahan.
Selama proses sekuensing, basa-basa yang dihasilkan yaitu adenin, timin,
guanin dan sitosin akan dihitung intensitas setiap siklusnya. Intensitas keempat
basa tersebut akan dideteksi melalui hasil pendaran flourescen yang dihasilkan
26
setiap lajur flow cell pada siklus pertama memiliki nilai lebih dari 4000 (Tabel 10).
Intensitas basa selanjutnya dihitung kembali pada siklus ke 20 dan menghasilkan
persen intensitas sekitar 80% dari intensitas basa pada siklus pertama. Persentase
basa hasil sekuensing pustaka genom juga dapat dilihat dalam bentuk grafik
sebaran yang seharusnya saling sejajar dan tidak terlalu berbeda atau tidak ada
jarak yang terlalu lebar diantara garis grafik (Lampiran 3). Secara umum
intensitas keempat basa yang dihasilkan selama proses sekuensing termasuk ke
dalam kategori ideal. Illumina (2009) menyatakan bahwa nilai intensitas ideal
yang dihasilkan selama proses sekuensing yaitu sebesar 1000.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Penelitian ini telah berhasil mengkonstruksi pustaka genom dan telah
memenuhi persyaratan untuk sekuensing genom total menggunakan Next
Generation Sequensing Hiseq 2000 dari empat genotipe kentang yaitu genotipe
CIP 392781, genotipe PT 29, genotipe Amudera dan genotipe Margahayu.
Pustaka genom yang telah berhasil dikonstruksi berukuran 300-600 bp dan
memiliki konsentrasi 13.08 – 60.14 nM. Jumlah basa total yang dihasilkan selama
proses sekuensing yaitu 287.2 Gbp dengan nilai Q scores besar dari 80% dan
tingkat kesalahan selama pembacaan 0.28-1.01 %. Nilai densitas klaster yang
dihasilkan menunjukkan bahwa kualitas klaster pustaka genom ke dalam kategori
ideal.
Saran
Pada penelitian selanjutnya, analisis bioinformatika perlu dilakukan untuk
menyusun basa-basa hasil sekuensing pustaka genom menjadi urutan basa genom
kentang yang utuh dan runut.
DAFTAR PUSTAKA
Agilent Technologies. 2003. Agilent 2100 Bioanalyzer 2100 expert user’s guide.
Deutchland (US): Agilent Technologies Inc.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2014. Luas Panen, Produksi dan Produktivitas
kentang 2009-2013. http//www.bps.go.id [Internet]. [4 Juni 2014] :
Jakarta.
Bintang M. 2010. Teknik Penelitian Biokimia. Jakarta (ID): Erlangga.
Brown TA. 2007. Gene Cloning and DNA Analysis : An Introduction. Sixth
Edition. New York (US): John Wiley and Sons.
27
Covaris. 2012. DNA-RNA shearing for Nex-Gen Sequencing.
http://covarisinc.com/applications/dnarna-shearing-for-NGS [Internet].
[10 Juni 2014].
Doyle JJ and Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure from small
quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19: 11–15.
Fisher R dan Eman N. 2000. Molecular farming of pharmateutical proteins
transgenic. Res 9: 279-299.
Franca LTC, Carrilho E, Kist Tarso BL. 2002. A review of DNA sequencing
techniques. Quaterly Reviews of Biophysics 35(2) : 169-200.
Huson D. 2010. Bioinformatics 1. Wiley-VCH Verlag.
Illumina. 2009. Sequencing Analysis Software : User Guide. San Diego (US) :
Illumina Inc.
Illumina. 2010a. TruSeq DNA-Sample Preparation Low Throughput (LT
Protocol). San Diego (US) : Illumina Inc.
Illumina. 2010b. cBot Quick Reference Guide. San Diego (US) : Illumina Inc.
Illumina. 2011. HiSeq 2000 Quick Reference Guide. San Diego (US) : Illumina
Inc.
Illumina. 2012. Using PhiX Control for HiSeq® Sequencing Runs. San Diego
(US) : Illumina Inc.
Illumina. 2013. Hiseq 2000 System User Guide. Sn Diego (US): Illumina Inc.
Invitrogen. 2010. Qubit 2.0 Fluorometer-Catalog no. Q32866. California (US):
Invitrogen Life Technologies.
Kircher M, Heyn P, Kelso J. 2011. Addressing challanges in the production and
analysis of illumina sequencing data. BMC Genomics 12: 382-396.
Kosasih A. 2012. Konstruksi Dan Analisis Kualitas Pustaka Genom Kedelai
(Glycine Max (L.) Merr.) untuk Sekuensing Genom Total [Skripsi].
Bogor (ID), Institut Pertanian Bogor.
Li ZT, Gray DJ. 2005. Genetic Engineering Technologies. di dalam: Trigiano RN,
Gray DJ, editor. Plant Development and Biotechnology: CRC Press.
Listanto E. 2010. Ekspresi gen RB pada Tanaman Kentang kultivr Granola untuk
Meningkatkan Ketahanan Terhadap Penyakit Hawar Daun (Phytaphthora
infestant (Mont.) de Bary).[Skripsi]. Bogor (ID). Institut Pertanian Bogor.
Liu L, Yinhu L, Siliang L, Ni H, Yimin H, Ray P, Danni L, Lihua L and Maggie
Ll. 2012. Comparison of Next Generation Sequencing Systems. Journal
of Biomedicine and Biotechnology . Vol 2012(1): 1-11.
Lodish et al. 2000. Molecular Cell Biology. Ed ke-4. New York (US): Madison
Avenue.
Mardis ER. 2008. Next generation DNA sequencing methods. The Annual Review
of Genomics and Human Genetics 9 :387- 402.
28
Minoche EA, Juliane CD, and Heinz Hl. 2011. Evaluation of genomic high-
througput sequencing data generated on illumina Hiseq and Genome
Analyzer systems. J Genome Biology 12:R112.
PGSC. 2012. Potato Genome Sequencing Consortium: Final Report for GB.
James Hutton Institute : Agriculture and Horticulture Development
Board
Prahaditya D. 2013. Analisis Keragaman Genetika Tanaman Kunyit dan
Temulawak secara Random Amplied Polymorphic DNA-Polymerase
Chain Reaction (RAPD-PCR) menggunakan Primer OPA-OPD 6-10.
[Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Quail MA, Kozarewa I, Smith F, Scally A, Stephens PJ, Durbin R, Swerdlow H,
Turner DJ. 2008. A large genome center’s improvements to the illumina
sequencing system. Nature Methods 5: 1005-1010.
Samadi B. 2007. Kentang dan analisis usaha tani. Yogyakarta (ID): Kanisius.
Sigma. 2008. qPCR Technical Guide. St. Louis (US): Sigma-aldrich, Inc.
Subtelny et al. 2014. PAL-seq protocol. Bartel Lab. J. Nature.
Suharsono. 2002. Konstruksi Pustaka Genom Kedelai Kultivar Slamet. Hayati 9
(2): 67-70.
Wagih ME and J.G Wiersena. 1994. Plants yielding non-seed carbohydrates. In
Siemons and K.Piluek (eds). Vegetables. Prosea Foundation. Bogor (ID).
Wattimena GA, Purwito A, Matjik NA. 2003. Research progress in potato
propaganon & breeding at Bogor Agricultural University.
http://www.eseap-cipotato.org/MF-ESEAP/puclications/PSP-2003/04-
Wattimena-IPB%20research.pdf [Internet]. [18 Mei 2014].
Wattimena. 1996. Penelitian Tanaman Kentang yang Dinamis dan Adaptiv dari
Laboratorium ke Pengguna. Makalah hasil penelitian bioteknologi PAU
biotek. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Weaver R and Hedrick PW. Genetics (Third Edition). Dubuque: W.C Brown.
Yuwono T. 2010. Biologi Molekular. Jakarta (ID): Erlangga.
29
Isolasi DNA Kentang
Konstruksi genom kentang
(fragmentasi DNA, modifikasi ujung fragmen DNA, adenilasi ujung 3’
DNA, penempelan adaptor, purifikasi DNA hasil ligasi, amplifikasi DNA, validasi
pustaka genom)
Sekuensing DNA
Analisis Sekuensing
LAMPIRAN
Lampiran 1 Strategi penelitian
Klasterisasi DNA
30
Lampiran 2 Hasil pengukuran kuantitas pustaka genom kentang menggunakan qPCR
Genotipe Ct StdDev
Ct Qty
Rerata
Qty
StdDev
Qty
Faktor
pengenceran
Ukuran
fragmen
[Ukuran
kecocokan]
(pM)
[Pustaka
tanpa
pengencara]
(nM)
[total]
(nM)
CIP
392781 9.61 0.123 44.19 43.11 3.389 1000 324 60.14 60.14 60.14
9.55 0.123 45.82 43.11 3.389
60.14 60.14
9.79 0.123 39.31 43.11 3.389
60.14 60.14
PT 29 10.44 0.186 25.61 27.59 3.464 1000 360 34.64 34.64 34.64
10.45 0.186 25.57 27.59 3.464
34.64 34.64
10.12 0.186 31.59 27.59 3.464
34.64 34.64
Amudra 11.21 0.069 23.27 22.36 1.084 1000 568 17.79 17.79 17.76
11.25 0.069 22.66 22.36 1.084
11.35 0.069 21.16 22.36 1.084
12.14 0.118 12.12 11.14 9.34E-001 2000 568 8.86 17.73
12.27 0.118 11.05 11.14 9.34E-001
12.37 0.118 10.26 11.14 9.34E-001
Margahayu 11.8 0.128 15.4 13.95 1.28 1000 471 13.39 13.39 13.08
12.04 0.128 12.98 13.95 1.28
11.99 0.128 13.47 13.95 1.28
12.93 0.048 6.91 6.65 2.26E-001 2000 471 6.38 12.76
13.01 0.048 6.54 6.65 2.26E-001
13.02 0.048 6.5 6.65 2.26E-001
31
Lampiran 3 Grafik intensitas persentase hasil sekuensing pustaka genom
Lampiran 4 Proses klasterisasi di dalam cBOT clustering (Klasterisasi oleh
Isothermal Bridge Amplification) (Illumina 2011).
33
RIWAYAT HIDUP
Penulis bernama lengkap Yuliana, dilahirkan di Pulau Kijang Kepri tanggal
27 Mei 1992. Penulis merupakan anak ke-4 dari 7 bersaudara dari ayah Limyardi
dan ibu Isna. Pada tahun 2010 penulis lulus dari SMAN 1 Salimpaung, Tanah
Datar dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur undangan
seleksi masuk IPB (USMI) dengan memperoleh beasiswa pendidikan Bidikmisi
selama 8 semester. Penulis diterima pada mayor Biokimia, Departemen Biokimia,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dengan mengambil Supporting
Course.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam beberapa kegiatan
kemahasiswaan di IPB dan organisasi mahasiswa daerah, di antaranya sebagai
anggota UKM Panahan IPB, staf Divisi Keilmuan Himpunan Profesi Community
of Research and Education in Biochemistry (Crebs) periode 2012/2013, divisi
Pengabdian Masyarakat (MIPA goes to field 2012). Penulis juga pernah aktif
dalam berbagai kegiatan kepanitiaan diantaranya staf pada seminar kajian ilmiah
dan kehalalan SKIK dan sekretaris II kepanitiaan lomba karya ilmiah popular.
Penulis pernah melakukan praktek lapangan (PL) di pusat penelitian dan
pengembangan kehutanan (Puslitbang) Rehabilitasi Kehutanan Jalan Gunung
Batu No.5 Bogor dengan judul “Isolasi dan Dekolorisasi Jamur Pelapuk Putih
pada Media RBBR” periode bulan juli hingga agustus 2013. Penulis juga pernah
mengikuti kompetisi menulis Essay dengan judul abstrak “The potential
production cellulose nanoparticle of lignocelluloses from cocoa’s pods as
ultralight composite materials biodegradable in Indonesia”.