kromatografi dan spektrofotometer
DESCRIPTION
Kromatografi adalah suatu metode analisa konsentrasi dengan menggunakan penyerapan cahaya terhadap warna komplementernya.TRANSCRIPT
A. Kromatografi
1. Prinsip Kerja Kromatografi
• Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, dimana komponen-komponen yang
dipisahkan didistribusikan diantara dua fasa, salah satu fasa fasa tersebut adalah suatu
lapisan stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir
lembut di sepanjang landasan stasioner.
• Fasa stasioner bisa berupa padatan maupum cairan, sedangkan fasa bergerak bisa berupa
cairan maupun gas.
Pemisahan campuran senyawa dalam suatu sampel berdasarkan perbedaan interaksi
sampel dengan fasa diam dan fasa gerak. Metode fisikokimia untuk memisahkan campuran zat
berdasarkan perbedaan waktu huni (residence time) masing-masing zat dalam fase gerak-fase
diam.
Senyawa A lebih dulu keluar karena waktu huni < senyawa B
Metode penting yang meliputi pemisahan, identifikasi dan penetapan kadar komponen-
komponen dari campuran yang komplek. Perbedaan gerak antara komponen yang satu dengan
yang lainnya disebabkan oleh perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan atau penguapan
diantara dua fase..
Komponen penting dalam teknik kromatografi:
• Fasa diam : support + stationary phase material
• Fas gerak : solvent (or carrier gas)
Teori Kromatografi
Pemisahan dalam kromatografi terjadi karena. Perbedaan kecepatan migrasi dari
berbagai komponen dalam campuran. Dengan kata lain, pemisahan terjadi karena perbedaan
waktu tambat masing-masing analit dalam fase diam. Penyebaran komponen campuran
sepanjang fase diam
Laju migrasi analit ditentukan oleh dua faktor yang didasarkan atas afinitasnya
terhadap fase gerak dan fase diam, yaitu :
1. Tertahannya analit pada fase diam. Makin kuat afinitasnya terhadap fase diam,
makin lama tertahannya pada fase diam dan makin lambat/pendek lajunya dibanding
laju fase gerak.
2. Terbawanya analit melaju bersama fase gerak. Makin kuat afinitasnya terhadap fase
gerak, makin cepat lajunya meninggalkan fase diam dan melaju makin mendekati
laju fase gerak.
Pada Kromatografi dibedakan istilah:
1.Pengembangan, digunakan untuk kromatografi datar yang fasa geraknya berjalan melalui fasa
diam tanpa terjadi pengeluaran senyawa dari fasa diamnya (digunakan pada KKt dan KLT)
2.Elusi, digunakan pada kromatografi yang fasa geraknya melalui fasa diam sambil membawa
senyawa keluar dari fasa diam (digunakan pada Kromatografi Kolom)
Dua jenis teknik kromatografi Cair:
1. Kromatografi fase normal
• Fase gerak bersifat non polar
• Fase diam bersifat polar
• Sampel yang kurang polar akan terelusi lebih awal
2. Kromatografi fase balik
Fase gerak bersifat non polar
Fase diam bersifat polar
Sampel yang kurang polar akan terelusi lebih awal
Kromatografi kertas, prosesnya dikenal sebagai analisis kapiler dimana lembaran kertas
berfungsi sebagai pengganti kolom. Kromatografi kertas adalah salah satu pengembangan dari
kromatografi partisi yang menggunakan kertas sebagai padatan pendukung fasa diam.
• Sebagai fasa diam adalah air yang teradsorpsi pada kertas dan
• sebagai larutan pengembang biasanya pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air.
• Kromatografi partisi adalah kromatografi yang didasari oleh hukum partisi.
Jika suatu zat terlarut dikocok dalam dua pelarut yang tidak bercampur maka zat terlarut
akan terdistribusi diantara dua fase dan apabila kesetimbangan tercapai diperoleh koefisien
partisi:
• Kd = konsentrasi zat terlarut pada pelarut A
konsentrasi zat pada pelarut B
2. Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang
ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan
kepolaran.
Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis
• Memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang
digunakan.
• Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya
disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan.
• Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran
antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen dalam campuran.
• Kromatografi Cair kinerja tinggi
• Kromatografi kertas
• Penentuan Konsentrasi
Untuk Kromatografi yg dilengkapi dg detektor :
1. Menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa yang dihasilkan
• Hasil akan direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak mewakili satu senyawa
dalam campuran yang melalui detektor
• Kemudian dg membandingkan senyawa murni
• Area dibawah puncak sebanding dengan jumlah setiap senyawa yang telah melewati
detektor
• area ini dapat dihitung secara otomatis melalui komputer
• Contoh hasil pembacaan detektor
2. Mendeteksi substansi yang telah melewati kolom dg penggunaan serapan ultra-violet.
• Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu
3. Menggunakan Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor
disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel
diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
• Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
• Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel)
• Komposisi yang tepat dari pelarut
• Temperatur pada kolom
Untuk meminimalkan adanya penyimpangan :
1. Dengan ulangan pada sampel yg sama (homogen)
2. Dengan membandingkan dengan senyawa standart
3. Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang
secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan.
Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang
menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x)
Hal-hal yang menyebabkan adanya penyimpangan :
1. Masih ada zat pengotor
2. Pada sampel terdapat juga zat-zat lain yang mempunyai waktu tambat yang berdekatan
4. Batas deteksi (limit of detection atau LOD)
Batas deteksi didefmisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih
dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang
secara spesi-fik menyatakan apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu.
NILAI RF
Rf = Jarak yang ditempuh substansi / Jarak yang ditempuh oleh pelarut
Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-
komponennya. Teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan
komponen dalam medium tertentu. Komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah
fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan
fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran.
B. Spektrofotometer
1. Prinsip Kerja Spektrofotometer
Spektrofotometer merupakan peralatan untuk mengukur besarnya absorbansi yang dilakukan
oleh bahan, zat, atau senyawa kimia. Dalam proses pengukuran bahan, zat atau senyawa kimia
harus dilarutkan terlebih dahulu dalam pelarut yang sesuai.
Pada metoda spektrofotometri, sampel menyerap radiasi (pemancaran) elektromagnetis,
Contoh larutan tembaga berwarna biru, karena larutan tersebut menyerap warna komplementer,
yaitu kuning. Semakin banyak molekul tembaga per volum, semakin banyak cahaya kuning yang
diserap dan semakin tua warna biru larutannya. Spektrometri memanfaatkan peristiwa ini.
Sebetulnya semua larutan, kecuali yang tidak berwarna, menyerap sinar cahaya dengan panjang
gelombang tertentu.
Untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan
menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang
digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analit yang akan dianalisa. Selain itu
juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil.
2. Bagian-Bagian Spektrofotometer
Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi:
1. Sumber tenaga radiasi yang stabil
2. Sistem yang terdiri dari lensa-lensa, cermin, celah-celah, dan lain-lain
3. Monokromator untuk mengubah radiasi menjadi komponen-komponen panjang
gelombang tunggal
4. Tempat cuplikan yang transparan
5. Detektor radiasi yang dihubungkan dengan system meter atau pencatat
Komponen utama yang berfungsi sebagai wadah dari sampel disebut cuvet. Cuvet
spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat contoh atau cuplikan yang akan
dianalisis. Cuvet harus memenuhi syarat- syarat sebagai berikut :
1. Tidak berwarna sehingga dapat mentransmisikan semua cahaya.
2. Permukaannya secara optis harus benar- benar sejajar.
3. Harus tahan (tidak bereaksi) terhadap bahan- bahan kimia.
4. Tidak boleh rapuh.
5. Mempunyai bentuk (design) yang sederhana.
Cuvet biasanya terbuat dari kwars, plexigalass, kaca, plastic dengan bentuk tabung empat
persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di daerah UV dipakai cuvet kwarsa
atau plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV.
Semua macam cuvet dapat dipakai untuk pengukuran di daerah sinar tampak (visible).
3. Hukum Lambert dan Hukum Beer
Hukum Lambert Beer : bahwa jumlah radiasi yang diserap atau ditransmisikan oleh larutab adlh
sebuah fungsi eksponensial dari konsentrasi dan panjang cuvet sampel
Hukum Lambert : bahwa fraksi penyerapan sinar tergantung dari intensitas sumber cahaya
Hukum Beer : bahwa penyerapan sebanding dengan jumlah molekul yang diserap
Secara matematis Hukum Lambert Beer kita tuliskan menjadi
−dPP
=kc∂ b
∫Po
P ∂ PP
=−k∫0
bc∂ b
ln(PPo )=−k (c . b−0 )=−k . b . c
−log(PP 0 )=k
2 ,303.b . c
−log T=∈ . b . c=A
Keterangan :
P0 = intensitas cahaya awal
P = intensitas radiasi pada absis l
L = panjangnya perjalanan (cm)
C = konsentrasi larutan
P1 = intensitas cahaya/tenaga radiasi dari peristiwa radiasi
P2 = intensitas cahaya/tenaga radiasi setelah melewati dinding cell yang terakhir
db
Dimana, jumlah yang paling penting adalah Transmittance, T :
T= I
Io=
P2
P1
4. Faktor dan Cara Menentukan Absorbasi – Konsentrasi
Faktor-faktor yang menyebabkan absorbansi vs konsentrasi tidak linear:
1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan
yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk warna.
2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun kuvet
dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.
3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau sangat
tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas
dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan).
Menentukan konsentrasi sampel dengan cara :
a. hukum lambert beer (A= a . b . c atau A = ε . b . c)
b. cara kurva kalibarasi
c. persamaan regresi linear:
Langkah-langkah membuat kurva kalibrasi absorbansi vs konsentrasi :
1. Maching kuvet : mencari dua buah kuvet yang memiliki absorbansi atau transmitansi sama atau hampir sama. Dua buah kuvet inilah yang akan digunakan untuk analisis, satu untuk blanko, satu untuk sampel. Dalam melakukan analisis Maching kuvet harus dilakukan agar kesalahannya makin kecil.
2. Membuat larutan standar pada berbagai konsentrasi
3. Pilih panjang gelombang maksimum (lmaks).
4. Ukurlah absorbansi semua larutan standar yang telah dibuat pada panjang gelombang maksimum.
5. Buat kurva kalibrasinya
Bibliography
Day dan Underwood. 1980. Analisa Kimia Kuantitatif. Edisi Keempat. Erlangga : Jakarta.
Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Penerbit Universitas Indonesia : Jakarta.