kromozom bantlama ve fish
TRANSCRIPT
![Page 1: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/1.jpg)
KROMOZOM BANTLAMA
TEKNİKLERİ ve FISH
![Page 2: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/2.jpg)
İnsan kromozomlarındaki karyotipleme çalışmaları sırasında benzer
büyüklükteki ve benzer konumlu sentromere sahip kromozomların ayırt
edilebilmesini sağlamak amacı ile kromozomların uzun eksenleri boyunca farklı boyanmaları bantlama olarak isim
alır. Günümüzde farklı bantlama yöntemleri bulunmaktadır.
![Page 3: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/3.jpg)
![Page 4: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/4.jpg)
Q BANTLAMAFloresans boyalar
kullanılır ve böylece
kromozomlar üzerinde farklı bölgeler farklı
renkte boyanmış olur.
![Page 5: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/5.jpg)
C BANTLAMAKromozom
preparatları ısı ile denatüre edilip
sonra giemsa ile boyanır böylece heterokromatin
bölgeleri boyanırken diğer bölgeler
boyanmaz.
![Page 6: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/6.jpg)
NOR Bantlama (Nukleolar organizer bölgeler)
![Page 7: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/7.jpg)
En sık kullanılan bantlama yöntemidir. Preparatlar bir proteaz olan tripsin ile muamele edilir. Ardından giemsa ile boyama yapılır.böylece A-T açısından
zengin olan bölgeler daha koyu boyanır. Bu bantlar kromozomlara özgüdür ve
kromozomların kesin tanısında kullanılır. Ayrıca bu bantlar sayesinde
translokasyon, inversiyon, delesyon gibi kromozomal hasarlar belirlenebilir.
![Page 9: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/9.jpg)
![Page 10: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/10.jpg)
Giemsa boyamanın ardından preperatların sıcak tuz solüsyonu
ile muamele edilerek G bantlamadaki bant profilinin tam tersi elde edilir. Yani burada A-T açısından zengin bölgeler açık
renk boyanırlar.
![Page 11: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/11.jpg)
![Page 12: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/12.jpg)
G BANTLAMA R BANTLAMA
![Page 13: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/13.jpg)
![Page 14: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/14.jpg)
FLOURESCENCE IN SITU
HYBRIDIZATION (FISH)
YÖNTEMİ
![Page 15: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/15.jpg)
Çeşitli dokulardan alınan hücrelerin (kültüre almadan) DNA larını floresan işaretli problarla hibridize ederek,bu floresan işaretler sayesinde söz konusu DNA bölgesinin hücre içerisindeki durumunu görmemizi sağlayan bir yöntemdir.
![Page 16: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/16.jpg)
Moleküler sito-genetikteki hızlı ilerlemeler, bantlama ve boyama tekniklerinin hızlı gelişimiyle sağlanmıştır.
Standart bantlama teknikleri yalnızca bir denemede bir hücre için tüm genomu sorgulamada yetersiz kalmaktayken,
Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH), genleri ve kromozomları boyamada fluoresan moleküllerin kullanıldığı bir yöntem olarak bantlama teknikleriyle birlikte iyi bir değerlendirme aracıdır.
![Page 17: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/17.jpg)
Bu yöntem gen haritalanmasında ve kromozom aberasyonlarının tanımlanmasında kullanılır.
Kromozomların çalışılmasında kullanılan birçok teknik, aktif olarak bölünen hücreleri gerektirirken (metafaz kromozomları),
FISH aynı zamanda bölünmeyen hücrelere de uygulanabilir (interfaz nukleusu). Metafaz delesyonları belirlemede kullanılır Interfaz genelde kromozomların yeniden
düzenlenmesinin ve kromozom sayılarının belirlenmesinde kullanılır.
![Page 18: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/18.jpg)
Preperatların hazırlanması Materyalin preperat üzerine sabitlenmesi Ön yıkama Prob ve hedef DNA nın denaturasyonu Hibridizasyon Yıkama Görüntüleme Mikroskobi
![Page 19: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/19.jpg)
Fish yönteminde kullanılan probların işaretlenmesi önemli bir aşamadır. Bu işaretleme doğrudan floresan işaret taşıyan probun hedef DNA ile hibridizasyonu ile olabildiği gibi indirekt işaretleme ile yani floresan sinyal güçlendirilerekte yapılabilir. Genellikle indirekt yöntem tercih edilir.
![Page 20: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/20.jpg)
İndirekt işaretlemede Biotin gibi moleküller önce prob DNA içerisine yerleştirilir sonra biotinle çok sıkı bağ yapan avidin gibi moleküller ortama konur avidin molekülleri ayrıca floresan madde taşırlar(Florescein izotiyosiyanat FITC=yeşil renk). Daha sonra ortama anti avidin antikorları konur, bu antikor hem probdaki avidin hemde ortamdaki avidinlere bağlanır böylece sinyal güçlenir.
![Page 21: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/21.jpg)
![Page 22: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/22.jpg)
![Page 23: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/23.jpg)
Tekrarlayan bölge probları Lokusa özgü prob
Tüm kromozomu boyayan prob Banda özgü prob
![Page 24: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/24.jpg)
• Lokusa özgü olan problar bir kromozomun belirli bölgeleriyle hibridizasyona girer. Bu tip problar ilgilenilen belirli bir genin hangi kromozom üzerinde yerleşmiş olduğunu belirlemede kullanılır.
• Alfoid veya sentromerik tekrarlı problar, kromozomların sentromerlerinde bulunan
tekrarlayan dizilerden elde edilir. Kromozomlar farklı renklerde boyanabildiği için, bu prob herhangi
bir bireyin doğru sayıda kromozoma sahip olup olmadığının belirlenmesinde kullanılır.
![Page 25: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/25.jpg)
“Whole chromosome” probları, herbiri tüm bir kromozom boyunca farklı dizilerle hibridizasyona
girebilen küçük probların kolleksiyonudur. Bu şekildeki bir prob kitaplığı taranarak tüm bir kromozom spektral bir karyotip oluşturmak üzere boyanabilir. Bu
teknik kromozomal translokasyonların tanımlanmasında imakan sağlar.
FISH ile sitogenetik çalışmalara yardımcı olan ve iyi tanımlanmış uygulamalar geliştirilmiş olmasına rağmen, amaca uygun prob ve filtre seçimi doğru yapılmaz ise hatalı ve zaman alıcı denemeler ortaya çıkmaktadır.
![Page 26: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/26.jpg)
![Page 27: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/27.jpg)
Prosedür Metafaz kromozomları veya interfaz
nukleusu kullanılarak preparatların hazırlanması
Etanol içinde dehidrasyon DNA’yı 70oC’de denatüre etme Etiketli probun denatürasyonu
Hibridizasyon için 37oC’de, 4-16 saat inkübasyon
![Page 28: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/28.jpg)
![Page 29: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/29.jpg)
![Page 30: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/30.jpg)
![Page 31: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/31.jpg)
![Page 32: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/32.jpg)
![Page 33: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/33.jpg)
TANISAL AMAÇ:* Klinik sitogenetik
* Prenatal tanı (trizomi, monozomi, mozaizm, translokasyon, delesyon)
* İnterfaz sitogenetiği (mayoz, mitoz,.) * Mikrodelesyon sendromlarının tanısı * Dokuda enfeksyon ajanlarının tanısı
* Kanser genetiği * Dokuda mRNA düzeyinde onkogenlerin
değerlendirilmesi
![Page 34: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/34.jpg)
ARAŞTIRMA AMACI: * Gen haritalaması * Tümör biyolojisi
* Viroloji * Gen expresyon analizi * Mayoz/mitoz analizleri
* Hücre tanımlaması
![Page 35: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/35.jpg)
Di George Sendromu (22q11.2) Prader Willi Angelman (15q11-13) Williams Beuren Sendromu (7q11.23) Smith-Magenis Sendromu (7p11.2) Wolf Hirschhorn Sendromu (4p16.3) Miller-Dieker Sendromu (17p13.3) Cri-du-Chat Sendromu (5p15.2/5p15.3)
![Page 36: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/36.jpg)
Di George: metafaz görünümü Di George: İnterfaz hücresinde
![Page 37: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/37.jpg)
Prader Willi / D115Z1 / SNRP / PML loküs bölgeleri
![Page 38: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/38.jpg)
Sayısal kromozom anomalileri (-7,+8, +12)
Partial kromozom yada gen delesyonları
Gen amplifikasyonları Translokasyonlar
CGH ile tüm hücre genomunu tarama
![Page 39: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/39.jpg)
Trisomy 7
![Page 40: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/40.jpg)
11q23 MLL gen bölgesi
![Page 41: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/41.jpg)
Trizomi 11q23 (ALL)
![Page 42: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/42.jpg)
Trisomy 11(ALL)
![Page 43: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/43.jpg)
17p13.1 ( p53 )
17p11.1 - q11.1 (CEP 17)
p
q
![Page 44: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/44.jpg)
P53 delesyonu
![Page 45: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/45.jpg)
8p11.1 – q11.1 (CEP 8)
8q24.2 – q24.3 (c-myc)
p
q
![Page 46: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/46.jpg)
![Page 47: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/47.jpg)
![Page 48: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/48.jpg)
![Page 49: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/49.jpg)
t(9;22)(q34;q11.2) metafaz ve interfaz görüntüleri
![Page 50: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/50.jpg)
t(9;22) (bcr/abl)
![Page 51: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/51.jpg)
Monozomi 9, t(bcr;abl)
![Page 52: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/52.jpg)
Monozomi 22
![Page 53: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/53.jpg)
PML ve RARA lokusleri t(15q22;17q12-22.1)
![Page 54: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/54.jpg)
t(15q22;17q12-22.1) şematik
![Page 55: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/55.jpg)
t(15q22;17q11-12),(PML/RARA) metafaz ve interfaz görünümü
![Page 56: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/56.jpg)
t(2;5)(p23;q35) - Anaplastik büyük hücre lenfoması t(8;14) - Burkitt's lenfoma (c-myc) t(9;22)(q34;q11) - Philadelphia kromozom, Kronik miyoljenik lösemi (KML), Akut lenfoblastik lösemi (ALL) t(11;14) - Kabuklu hücre lenfoması (Bcl-1) t(11;22)(q24;q11.2-12) - Ewing's sarkoma t(14;18)(q32;q21) - Foliküler lenfoma (Bcl-2) t(17;22) - Dermatofibrosarkomik protuberans t(15;17) - Akut promyelötik lösemi t(1;12)(q21;p13) - Akut miyelötik lösemi t(9;12)(p24;p13) - Kronik miyelötil lösemi (CML), Akut lenfoblastik lösemi (ALL) (TEL-JAK2) t(X;18)(p11.2;q11.2) - Eklem sarkoması t(1;11)(q42.1;q14.3)- Şizofreni
![Page 57: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/57.jpg)
İnversyon 16 Şematik
![Page 58: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/58.jpg)
İnversyon 16 probu ile FISH
![Page 59: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/59.jpg)
Sitogenetik kültür sorunları İnterfaz nükleusunda çalışılabilir
Kantitatif ölçüm sağlar Tedavi sonrası izleme de ideal
Lösemilerde p190 ve 210 aynı anda bakılabilir, Kırılmanoktaları değişebilen translokasyonlarda
efektifdir Örn: t(9;22), t(15;17), 11q23, inv 16
Hızlı sonuç istendiğinde Klonal anomalilere sitogenetik yetersiz kalır Lökosit sayısı az olduğunda (<10.000) PCR
yapılamazsa Yapılan çalışmalar normal bireylerde de bu tip
translokasyonların olduğunu gösterdi.
![Page 60: Kromozom Bantlama Ve Fish](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081416/5571fa704979599169923893/html5/thumbnails/60.jpg)
Probun uygun olması ve doğru probun eldesi için nelere bakılması gerektiğinin
iyi bilinmesi
Hibridizasyon için birleşme sinyali
Nuklear organizasyonda beklenmedik varyasyonlar