kronİk hepatİt ve sİrozlu vakalarda cox 2 gen … · 2019. 5. 10. · kronik hepatit ve sirozlu...
TRANSCRIPT
-
T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ GASTROENTEROLOJİ BİLİM DALI
KRONİK HEPATİT VE SİROZLU VAKALARDA COX-2 GEN
POLİMORFİZMİNİN FİBROZİS GELİŞİMİNDEKİ ÖNEMİ
Dr. BURHAN ÖZDİL
YAN DAL UZMANLIK TEZİ
TEZ DANIŞMANI
Prof.Dr.HİKMET AKKIZ
ADANA - 2008
-
Teşekkür Başarı parçaların gerektiği gibi birleştirilmesiyle oluşan bütünün adıdır. Bu bütüne ulaşmamda bana yol gösteren saygıdeğer hocam Prof. Dr. Hikmet Akkız, labratuar çalışmalarında her türlü
desteği ve fadakarlığı esirgemeyen çok değerli arkadaşlarım Süleyman Bayram, Aynur Bekar,
Ersin Akgöllü, mesai saatleri dışındaki çalışmalarımda değerli yardımcım ve destekçim sevgili
eşime en derin sevgi ve saygılarımı sunarım.
I
-
İÇİNDEKİLER
Sayfa No:
TEŞEKKÜR I İÇİNDEKİLER II TABLO DİZİNİ III ŞEKİL DİZİNİ IV KISALTMALAR V ÖZET-ANAHTAR KELİMELER VI ABSTRACT-KEYWORDS VII 1. GİRİŞ ve AMAÇ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Viral Hepatitler 3 2.2. Siroz 5 2.3. Hepatik aktivite indeksi 5 2.4. KC fibrozisinin patogenezi 7 2.5. COX Enzimleri, Fibrogenezisle ilişkisi ve Klinik Önemleri 10 2.6. Genetik polimorfizm 18 2.7. COX enzimindeki önemli genetik polimorfizm bölgeleri: 20 3. GEREÇ ve YÖNTEMLER 21 3.1. Vaka Seçimi 21 3.2. Çalışmada Kullanılan Araç ve Gereçler 21 3.3. Çalışmada Kullanılan Araç ve Gereçler 22 3.4. Çalışmada Kullanılan Stok Solüsyonların Hazırlanması 23 3.5. DNA İzolasyon Yöntemi 25 3.6. COX-2 Geninin PCR ile Çoğaltılması 26 3.6.1. -8473 T>C Polimorfizminin Genetik Analizi 26 3.6.2. -765 G>C Polimorfizminin Genetik Analizi 27 3.7. Çoğaltılmış DNA’ların Elektroforezde Değerlendirilmesi 28 3.8. PCR Ürünlerinin Restriksiyon Enzimleri ile Kesimi 29 3.8.1 COX-2 -8473 T>C Polimorfizminin Genotiplendirilmesi 29 3.8.2 COX-2 -765 G>C Polimorfizminin Genotiplendirilmesi 31
3.9. İstatistiksel Analizler 32 4. BULGULAR 33 5. TARTIŞMA 47 6. SONUÇ ve ÖNERİLER 51 KAYNAKLAR 52 ÖZGEÇMİŞ 72
II
-
TABLO DİZİNİ Sayfa
No:
Tablo 1. KC biyopsi örneğinin sayısal skorlamasının gösterildiği HAİ 6
Tablo 2. COX 1 ve COX 2 nin rol aldığı fizyolojik ve patolojik durumlar 11
Tablo 3. Viral etkenlere göre gruplar arasında fibrozis skoru ve HAİ’nin karşılaştırması 33
Tablo 4. COX 8473 bölgesi genotiplerinin fibrozis evresine göre karşılaştırılması.
34
Tablo 5. COX 8473 bölgesinde genotiplere göre fibrozis skoru.
34
Tablo 6. Fibrosis skoru ile COX 8473 genotipleri arasındaki Ki kare testi anlamlılık sonuçları
35
Tablo 7. Fibrozis 1 ve 4 olanlar arasında genotiplere göre fibrozis için risk artışının lojistik regresyon analizi
36
Tablo 8. Fibrozis 1 ve 3 olanlar arasında genotiplere göre fibrozis için risk artışının lojistik regresyon analizi.
36
Tablo 9. COX 8473 bölgesi genotiplere göre HAİ.
37
Tablo 10. COX 8473 bölgesi genotipleri arasında HAİ nin karşılaştırıldığı tek yönlü varyans analizi sonuçları
37
Tablo 11. COX-2 8473 bölgesi genotiplerinin birbiriyle farklı metodlarla karşılaştırılması.
38
Tablo 12. Genotiplerdeki HAİ ortalamalarına göre oluşturulan gruplar.
39
Tablo 13. COX 765 bölgesi genotiplerine göre fibrozis değerlerinin karşılaştırılması.
40
Tablo 14. COX 765 bölgesi genotiplerinin fibrozis evresine göre karşılaştırılması.
41
Tablo 15. Fibrosiz skoru ile COX 765G>C polimorfizmi arasındaki Ki kare test sonuçları ve P değeri
41
Tablo 16. COX 765 bölgesi genotiplerine göre fibrosiz 1- 3 arası gruplarda fibrosiz risk analizini gösteren Lojistiktik Regresyon Analizi
43
Tablo 17. COX 765 bölge genotipleri arasında HAİ değerlerinin karşılaştırılması.
43
Tablo 18. COX 765 bölgesi genotiplerine göre HAİ lerinin karşılaştırıldığı tek yönlü varyans analiz sonuçları ve p değeri .
43
Tablo 19. COX-2 765 bölgesi genotiplerinin birbiriyle farklı metodlarla karşılaştırılması.
44
Tablo 20. Genotiplerdeki HAİ ortalamalarına göre oluşturulan gruplar.
45
III
-
ŞEKİL DİZİNİ Sayfa
No:
Şekil 1. COX-2 ekspresyonun regülasyonuna aracılık eden sitokin ve yolaklar.
14
Şekil 2. COX-2 -8473 PCR ürünü.1-5. kuyular 45-49. hastaların PCR ürünü, 6. kuyu DNA marker’dir.
28
Şekil 3. COX-2 -765 PCRR ürünü.1-5. kuyular 63-67 hastaların PCR ürünü, 6. kuyu DNA marker’dir.
29
Şekil 4. COX-2 -8473 T>C tek nüleotid polimorfizminin RFLP metodu ile genotiplendirilmesi.
30
Şekil 5. COX-2 -765 G>C tek nüleotid polimorfizminin RFLP metodu ile genotiplendirilmesi.
32
Şekil 6. COX-2 -8473 PCR ürünü,28,29,30,31,43,44,47,48,49,50,51
33
Şekil 7. COX 8473 bölgesinde TT, TC ve CC genotipli olguların fibrozis skorlarının grafiksel karşılaştırması.
35
Şekil 8. COX-2 8473 bölgesi genotiplerin HAİ değişimlerinin grafiksel gösterimi.
39
Şekil 9. COX-2 -765 30,31,33,35,36,37,38,39,40,41,PCR ürünü
40
Şekil 10. COX 765 bölgesinde GG, GC ve CC genotipli hasta sayıları ile fibrozis skoru arasındaki dağılımın grafiksel gösterilmesi
42
Şekil 11. COX 765 bölgesi genotiplerin HAİ değişimlerinin grafiksel gösterimi.
46
IV
-
KISALTMALAR COX: Sikloeoksijenaz HAİ: Hepatik aktivite indeksi NS2-5A/B: Yapısal olmayan protein 2-5A/B TGF alfa/beta: Doku groft faktör PDGF: Platelet kökenli büyüme faktörü HSC: Hepatik stellat hücreler ECM: Ekstrasellüler matriks MMP: Matriks metalloproteinaz PG: Prostoglandin CYP2E1(P450 2E1): Sitokrom P450 PPAR: Peroksizom proliferasyon-aktivasyon reseptmrü STAT-3: Transkripsiyon ve sinyal ileten aktivatör 3 İBD: İnflamatuar barsak hastalığı HUVEC: Umblikal ven endotelyal hücreler HCC: Hepatosellüler karsinoma puFA: Poliamsature yag asiti
V
-
ÖZET
Kronik Hepatit ve Sirozlu Vakalarda COX-2 Gen Polimorfizminin Fibrozis Gelişimindeki Önemi
Amaç: Kronik hepatit ve sirozlu vakalarda COX-2 geninin -765 G>C ve -8473 T>C genetik polimorfizmlerinin nekroinflamatuar aktivite ve fibrozis üzerine olan etkilerini araştırmak. Gereç ve Yöntemler: Çalışmaya HBV ve HCV’ye sekonder kronik hepatit olduğu bilinen ve karaciğer (KC) biyopsileri yapılmış 104 (51/53, K/E) hasta alındı. Hastaların yaş ortalaması (45±15) idi. Vakalardan 54 tanesi HCV, 50 tanesi HBV etiyolojili idi. COX gen polimorfizmi çalışılmak üzere 5’er cc kan örnekleri alındı. KC biyopsi örnekleri Knodell Histolojik Aktivite Skoruna (HAİ) göre değerlendirildi. Biyopsi sonuçlarına göre vakalar fibrozis 1, 3 ve 4 olarak belirlendi. Fibrozis 4 olanlar siroz safhasında olan vakalardı. Buna göre vakaların 75 tanesi kronik hepatit ve 29 tanesi sirozdu. Yine Knodell skoruna göre HAİ’leri hesaplandı. Polimorfizm saptanan olgularla saptanmayanlar arasında HAİ ve fibrosiz skorları kıyaslandı. Sonuçların değerlendirilmesi için Student’ t- test (devamlı değişkenler için), X2 test (kategorik değişkenler için) ve lojistik regresyon analizi kullanıldı. Bulgular: HBV ve HCV’li gruplarda HAİ ve Fibrozis skorları arasında fark yoktu (Sırasıyla p
-
ABSTRACT
Importance of COX-2 Gene Polymorphism to Development of Fibrosis in Patients with Cirrhosis and Chronic Hepatitis
Aim: The aim of this study was to investigate impact of promoter polymorphisms of COX-2 -765 G>C and -8473 T>C on necroinflammatory activity and fibrosis. Materials and Methods: Promoter polymorphisms of COX-2 -765 G>C and -8473 T>C was studied in 104 patients (51 female, 53 male) who infected with hepatitis B or hepatitis C. Median age of patients were 45±15. 54 patients were infected with hepatitis C. 50 patients were infected with hepatitis B. Liver biopsy was evaluated according to Knodell histological activity score. According to the liver biopsy results the patients were categorized including fibrosis 1, 3 and 4. All of the patients in fibrosis 4 category was the in cirrhosis stage. In respect of this, 75 patients were in the chronic hepatitis stage and 29 patients were in the cirrhosis stage. In addition to this histological activity score was determined by Knodell score. A 5 mL sample of venous blood was collected from each subject into a test tube containing EDTA as anticoagulant. Differences in the distributions of demographic characteristics between patients were evaluated using the Student’s t-test (for continuous variables) and χ2 test (for categorical variables). The associations between COX-2 polymorphisms genotypes and the risk of fibrosis and HAI were estimated by logistic regression analyses. Results: There were not statistically significant difference in the fibrosis and histological activity scores of hepatitis B and C groups. The genotypic frequencies in the patients were TT 52.9%, TC 33.7% and CC 13.5% in -8473 COX-2 polymorphism. In -8473 TT, TC and CC genotypes group, fibrosis score were 2.9±0.9, 2.7±1.2 and 1.8±1.2 respectively. Difference of fibrosis scores of -8473 genotypes group were statistically significant (p=0.008). Histological activity scores were calculated 9,6±1,7, 8,4±2,7, 6,2±2,9 in -8473 TT, TC and CC genotypes respectively (p=0,0001). Compared with COX-2 -8473 the TC and CC genotypes, TT genotype was associated with an increased risk of fibrosis in the logistic regression analysis (p=0,003, OR=10.0, 95% CI =2,2-44,9) between fibrosis group 1 and 3. Between fibrosis group 1 and 4, COX-2 -8473 TT genotype was increased fibrosis risk 8-fold when compared with TC and CC genotypes (p=0,019, OR = 8.0, 95% CI =1,4-45,4). In the COX-2 -765 polymorphism genotypic frequencies in the patients were the following GG 66,3%, GC 26,0%, and CC 7,7%. In -8473 GG, GC and CC genotypes group fibrosis score were 2.9±0.9, 2,6±1,3 and 1,2±0,7 respectively (p=0,0001). Histological activity scores were calculated 9,3±2,0, 8,5±2,7, 5,2±2,5 in -8473 TT, TC and CC genotypes respectively (p=0,0001). We did not find CC genotype in COX-2 -765 G>C polymorphism. Compared with COX-2 -765 the C/C and GC genotypes, G/G genotype was associated with an increased risk of fibrosis in the logistic regression analysis (p=0,006, OR = 22,16 95% CI =2,4-198,7) between fibrosis group 1 and 3. Conclusion: Viral etiologic factors fibrosis score and histological activity score were not statistically different. Polymorphisms of COX-2 -8473 T and -765 G allels may increase risk of both the liver inflammation and the liver fibrosis development when compared to-8473 C and -765 C allels. In addition to this, 8473 C and -765 C allels may have protective effect on liver inflammation and the liver fibrosis development. Key Words: COX-2 8473 T>C, 765 G>C genetic polymorphism, Liver fibrosis, Hepatic activity index, chronic hepatitis
VII
-
1. GİRİŞ ve AMAÇ Karaciğerdeki (KC) kronik inflamatuar her olay fibrozisle sonuçlanır. Pek çok neden KC’ de
kronik inflamasyona neden olabilir. Ancak özellikle yaygınlığı ve bulaşıcılığı bakımından viral
hepatitler önemlidir. En sık kronik hepatit yapan etkenler HBV ve HCV viruslarıdır. Akut hepatit
tablosundan kronik hepatit ve siroza kadar değişen hastalık tablosuna neden olurlar.
KC de fibrozisin gelişimi bir yara iyileşmesidir. Ancak tüm yara iyileşmelerinde bir
remodeling süreci vardır ve tamir sonunda mümkün olduğunca az hasarla doku iyileştirilir. Bu
durum kronik hepatitlerde böyle değildir. Kronik inflamasyon ve takibinde gelişen fibrozis KC’ de
ciddi bozukluklara neden olur. KC fibrozisinin en ileri aşaması sirozdur ve sirozun da pek çok
komplikasyonunun nedeni KC’de gelişen fibrozistir. Portal HT, asit, KC atrofisi, splenomegali,
varis gelişimi, gastrointestinal sistem (GIS) kanaması gibi komplikasyonlar fibrosis sonucu portal
dolaşımın bozulması ve KC dokusunda gelişen kontraksiyonların sonucudur. Pek çok aynı
etiyolojiye sahip hasta olmasına karşın birbirinden oldukça farklı klinik tablolar görülebilir. Bunun
nedenleri arasında hastalığın etkeni, süresi, birlikte bulunan metabolik hastalıklar (diabetes mellitus
(DM), hepatosteatoz) yer aldığı gibi kişinin genetik farklılıklarıda rol oynar. Son dönemlerde
malignite dahil pek çok hastalığın gelişiminde kişisel farklılıların genetik polimorfizme bağlı
olduğu düşünülmektedir. Aynı türden ilaçların kişiler arası etkinlik farkı da yine genetik
polimorfizmle ilişkilidir.
Kronik hepatitler karaciğerin inflamasyonuna neden olan patolojilerdir. Burada en önemli
enzimlerden biriside siklooksijenaz (COX) enzimidir. COX enzimleri iflamasyonun başlaması ve
devamında anahtar enzimlerdendir. Bu nedenle KC’de gelişen fibrozisten sorumlu olduğu
düşünülmektedir. COX enziminin iki alt tipi COX-1 ve COX-2 enzimleridir. COX-1 fizyolojik
olayları düzenler. COX-2 ise patolojik süreçlerde rol alır. Yapılan az sayıdaki bazı çalışmalarda
COX-2’nin artan KC fibrozisiyle birlikte dokuda arttığı gösterilmiştir.1 COX enzmindeki
polimorfizmler pek çok hastalıkta gösterilmiştir. En fazla çalışılan ve patolojik süreçlerle ilişkili
olan COX-2 enzimi ve bu enzimi kodlayan gendeki polimorfizmdir. Ancak bu enzimdeki
polimorfizmin KC fibrozisinde bir farklılığa neden olup olmadığı bilinmemektedir.
Sirozun en ciddi komplikasyonlarından birisi de hepatosellüler karsinom (HCC) gelişimidir.
HCC’nin % 90’ı sirotik zeminde gelişir. COX-2’nin ise kanser prekürsörü lezyonlarda ve kanser
hücrelerinde arttığı gösterilmiştir. 2,3,4 HCC’nin büyük çoğunlukla sirotik zeminde gelişmesi ileri
evre fibrozisin bir kanser prekürsörü olduğunu düşündürmektedir. Dolayısıyla fibrozise katkısı olan
faktörlerin HCC’ye de katkısı olabilir. HCC gelişiminde rol oynayan COX-2 gen
polimorfizmlerinin fibrozisin ilerlemesine katkıda bulunabileceğini düşünmekteyiz. Bu bakımdan
1
-
COX-2 genetik polimorfizminin araştırılması ve fibrozisle ilişkisinin ortaya konulması önemli
olacaktır.
Yapılan çalışmalardan elde edilen sonuçlara göre 8473 T>C polimorfizmi pek çok kanserle
ilişkilendirilmiştir.5,6 Dolayısıyla bu bölge polimorfizmi yüksek COX-2 sentezine neden olabilir ve
böylece kronik hepatitlilerde yüksek fibrozise predispozisyon oluşturabilir. Buna karşın 765 G> C
poliorfizminin ise kolon adenom ve kanser gelişiminde önleyici etkisinin olduğu belirtilmiş olup
COX-2 sentezininde azaldığı gösterilmiştir.7,8 Bu bölge polimorfizmi düşük fibrozisle ve HAİ’ ile
ilişkili olabilir diye düşündük. Bu teorilerin geçerliliğini ortaya koymak için mevcut çalışma
tasarlanmıştır. Yaptığımız çalışmada özellikle kronik hepatit B ve C’li hastalarda gerek kronik
hepatit gerekse sirotik evrede KC fibrozisin evresi, HAİ ile COX gen polimorfizmi arasındaki ilişki
araştırılmıştır.
2
-
2. GENEL BİLGİLER 2.1. Viral Hepatitler KC’deki herhangi bir nedene bağlı inflamasyona hepatit denir. Akut veya kronik olabilir.
Hepatitlerin otoimmün, metabolik, konjenital, viral, toksik, ilaca bağlı pek çok nedeni vardır. Bu
etiyolojilerin en önemlilerinden birisi de viral hepatitlerdir. Halen klinik önemi olan 5 viral hepatit
etkeni bilinmektedir. Bunlar A,B,C,D,E hepatitleridir. Kronik hepatit tablosuna neden olan etkenler
B,C,ve D hepatitleridir.9
Bir viral hepatit tablosunun 6 aydan daha fazla sürmesi kronik hepatit olarak değerlendirilir.
Kronik hepatitler patolojik olarak hafif periportal lenfositik inflamasyondan pieace meal nekroz ve
KC mimarisinin bozulması demek olan siroza kadar bir tabloyu ifade eder. Hastalar tamamen
asemptomatik olabildiği gibi hafif laboratuar anormallikler de gösterebilirler. Bunun yanı sıra ileri
evre KC yetmezliği ve portal hipertansiyon gibi ciddi komplikasyonlar gelişebilir. Kronik viral
hepatitlerde KC dokusunda kronik inflamasyon vardır. Bunun sonucu olarak fibrozis gelişir ve
daha ileri aşama ise sirozdur. Siroz ile kronik hepatit arasındaki en önemli fark sirozda ileri
derecede fibroz doku artışı olması ve buna bağlı olarak KC mimarisi ve fonksiyonlarının
bozulmaya başlamasıdır.10
KC de kronik enfeksiyona ve onunla ilişkili komplikasyonlara neden olabilen en yaygın iki
virus vardır. HBV ve HCV virusları. HCV önemli bir morbidite ve mortalite nedenidir. Dünyada
170 milyondan fazla kişi HCV ile enfektedir. HCV’ nin neden olduğu kronik enfeksiyon aralarında
siroz ve HCC’nin de bulunduğu ciddi KC hastalıklarına yol açar.11 HCV flaviviridae familyasına
ait, zarflı tek zincirli RNA virusudur. Yaklaşık 3000 aminoasitlik poliproteini kodlayan 9,6 kb’lık
uzunluğa sahip bir virustur.12,13 Bu poliproteinler konak sinyal peptidazları ve virusta bulunan
proteinazlarca parçalanarak yapısal ( cor, E1 ve E2 ) ve yapısal olmayan (NS2 ve NS3 ten NS5A/B
ye kadar) viral proteinler ortaya çıkar.12 E1 ve E2 proteinleri zarf proteinleridir, hücre yüzeyine
viral bağlanmayı ve girişi sağlar. 14,15 HCV’ nin 6 farklı genotipi 52 suptipi tarif edilmiştir. RNA
bağımlı RNA polimerazın (NS5B) düzeltme fonksiyonu olmadığından yüksek mutasyon hızına
sahiptir ve aynı kişide genetik olarak heterojen quasispieslar mevcuttur.15-17 Farklı genotipler
birbirinden en az % 30, bir genotip içerisindeki farklı suptipler ise birbirinden en az % 20 genetik
farklılığa sahiptir. Bu genetik heterojenite farklı HCV genotipleri ile ortaya çıkarılan apopitotik
yolakların kıyaslanmasını güçleştirir. Genel olarak apopitozis viral klerenste santral role sahiptir.
HCV ile infekte KC’de artmış hepatosit apopitosizine karşın viral persistans görülür.18 Ülkemizde
3
-
en sık görülen genotip 1b’dir ve tedaviye yanıt genotip 2 ve 3’e göre daha kötüdür. HCV-RNA
yuvarlak endoplazmik retikulumda okunur ve endoplazmik retikulum membranındaki RNP
compleksleri içerisinde replike olur.13,19 HCV % 80 kronikleşerek siroz ve HCC’ye neden olur.20-23
HBV virusu hepadnaviridae familyasına ait olup genel olarak insanları az sayıda da hayvanı (
ağaçkakan, ördek, tarla sincabı) enfekte eder. HBV virusu 3,2 kb’lık bir genoma sahip, 42 nm
boyutlarda elektron mikroskopunda rahatlıkla görülebilen bir virustur. Zarflı bir DNA virusu olup 4
major proteini kodlar. Bu proteinler S, P, C ve X proteinleridir. S proteini veya HBsAg major zarf
proteinidir. L ve M proteinleride zarfta yer alan proteinlerdir. HBcAg veya Core proteini viral
genom çevresinde yer alır. HBx yani X proteininin fonksiyonu tam olarak aydınlatılmamıştır.
Ancak viral replikasyon için gerekli olduğu düşünülmektedir. HBV-DNA’nın transkripsiyonunu
etkileyen transkripsiyonel aktivatör olarak davranır. P proteini polimeraz proteinidir ve ilaçlara
karşı gelişen dirençten sorumludur.24 Dünyada 350 milyondan fazla kişinin HBV ile enfekte olduğu
hesaplanmıştır. HBV ile enfekte olanların % 90-95’i spontan olarak klerens sağlar. % 5-10’u ise
kronik HBV taşıyıcısı haline gelir ve bunların % 20-30’unda kronik hastalık gelişirken, % 5’inde
siroz ve HCC gelişir.25 HBV nin A dan H’a kadar 8 genotipi vardır. A ve C genotipleri en sık
görülür. Genotipler hastalığın progresyonunu ve tedaviye yanıtı belirlemede oldukça önemlidir.26-29
Ülkemizde ise en sık bulunan genotip D’dir. HBV enfeksiyonunun seyri konağın genetik
faktörlerine bağlıdır.
Viral hepatitlere karşı gelişen immün yanıtın önemli mediatörlerinden birisi de hücreler arası
iletişimi sağlayan sitokinlerdir. Sentezlerindeki veya etkilerindeki farklılık viral klerensi sağlar
yada kronisiteyi belirler.29 Kişiler arasında hastalığın bağışıklıkla sonuçlanması veya kronik
enfeksiyon gelişimiyle ilgili farklılıklar vardır. Bunlar immütenin etkinliğini belirleyen
farklıklardır. Özellikle sitokin denilen aracıların bu farklılığı belirlemede önemli olduğu
bilinmektedir. TNF alfa viral klerens ve konağın virusa immün yanıtında en önemli sitokinlerden
biridir.30 Kişiler arasında sitokin yapımındaki farklılık büyük oranda genetik polimorfizme
bağlanmıştır.31 Bu polimorfizmin viral klerensi sağlamada veya hastalığın kronikleşmesinde,
kronik hastalığın klinik seyrinin belirlenmesinde ve nihayetinde HCC ve son dönem komplikasyon
gelişiminde belirleyici etken olduğu düşünülmektedir.
4
-
2.2. Siroz Siroz KC’de kronik inflmasyona bağlı olarak sürekli yapım ve yıkımın olduğu bir yara
iyileşmesinin sonucur. KC’in normal yapısı bozulur, fibroz doku artar ve nodül formasyonu gelişir.
Siroz KC’de ileri evre fibrozis gelişimiyle temel yapının bozulduğu bir patolojidir. Viral ajanlar en
başta olmak üzere toksik, paraziter, metabolik, otoimmün, kolestatik pek çok etiyolojik nedeni
vardır. Gelişen fibrozisin kontraksiyonuna bağlı olarak KC volümü küçülmeye başlar; stromal yapı
bozulur; portal dolaşım zorlaşır. Portal hipertansiyon ve intrahepatik portosistemik şantlar gelişir.
Vakaların % 40’ı asemptomatiktir. Sirozlu hastalar klinik olarak Child-Pugh klasifikasyonuna göre
üç evrede değerlendirilirler. Child-Pugh A’da daha çok erken evre siroz mevcut olup toplam
hepatosit sayısı henüz KC fonksiyonlarının normal yerine getirilmesine yetecek kadardır. Bu
evredeki hastaların bir kısmı asemptomatiktir ve tesadüfen tanı konulabilir. Child-Pugh B ve C
hastalarda ise artık KC homesotasizi yerine getirecek kapasitede değildir. Organ küçülmeye başlar.
Bununla ilişkili olarak hepatik koma, portal hipertansiyon ve komplikasyonları, kollateral vasküler
yapılar ve varisler, asit, hipoalbüminemi, bilüribin artışı gibi komplikasyonlar gelişir. Bu
komplikasyonların en korkulanlarından birisi HCC’dir. HCC’lerin büyük çoğunluğu sirotik KC’de
gelişir. Bu nedenle sirotik hastalar HCC gelişimi yönünden risk altındadırlar. 32,33
2.3. Hepatik aktivite indeksi Hepatik aktivite indeksi ilk kez Knodell tarafından 1981’de yayınlanmıştır. KC biyopsisinde
daha objektif sonuçlar verilebilmesi amacıyla düzenlenmiş sayısal bir sistemdir. Buna göre
periportal köprüleşme nekrozu, intralobüler dejenerasyon ve fokal nekroz, portal inflamasyon ve
fibrozis değerlendirilir. İlk üçünün değerlendirilmesinden elde edilen sayısal değerlerin toplamı
histolojik aktivite indeksi (HAİ) olarak belirlenmiştir ve KC’deki inflamasyonun şiddetini gösterir.
Maksimum puan 18’dir. Fibrozis ise 0,1,3 ve 4 olarak değerledirilir. Fibrozisin 4 olması sirozu
gösterir. (Tablo 1) 34,35
5
-
Tablo 1. Knodell Histolojik Aktivite Skoru (HAİ) I. Periportal +/-
Köprüleşme Nekrozu
Skor II. Intralobüler
Degenerasyon ve
Fokal Necroz
Skor III. Portal
Inflamasyon
Skor IV. Fibrozis Skor
A. Yok 0
A. Yok 0 A. Yok 0 A. Yok 0
B. Hafif piecemeal
nekroz
1 B. Hafif (asidofilik
cicimler,
Lobül veya nodüllerin
1/3 inde balon
dejenerasyon ve/veya
dağınınk odaksal
hepatosellüler nekroz
odakları
1 B. Hafif (portal traktın
1/3 ünde dağınık
inflamatuar hücreler)
1 B. Fibrozis
Portal
genişleme
1
C. Orta şiddette
piecemeal nekroz
(Çoğu portal traktın
çevresinin %50 den
daha az tutulumu)
3 C. Orta şiddette (Lobül
veya nodüllerin 1/3-2/3
ünün tutulumu)
3 C. Orta şiddette (Portal
traktın 1/3-2/3 ünde
artmış inflamatuar
hücreler)
3 C.
Köprüleşme
fibrozisi
(Portal-portal
veya portal –
santral
bağlanma)
3
D. Belirgin piecemeal
nekroz
(Çoğu portal traktın
çevresinin %50 den
daha fazla tutulumu)
4 D. Belirgin (Nodül veya
nodülün 2/3 innde
tutulum)
4 D. Belirgin (Portal
traktın 2/3 ünde yoğun
inflamatuar hücre
birikimi
4 D. Siroz
4
E. Orta derecede
piecemeal nekroz ile
birlikte köprüleşme
nekrozu
5
F. Belirgin piecemeal
nekroz ile birlikte
köprüleşme nekrozu
6
G. Multilobuler nekroz
10
6
-
2.4. KC fibrozisinin patogenezi KC fibrozisi önemli bir morbidite ve mortalite nedenidir. KC fibrozisin nihai sonucu sirozdur.
Siroz asemptomatik durumdan KC yetmezliğine kadar değişen bir tablo sergiler. Sirotik vakaların
% 40’ı asemptomatiktir. Tanı tesadüfen veya postmortem konulur. 36 Fibrozis değişik situmuluslara
yanıt olarak gelişen bir yara iyileşmesinin sonucudur. Aralarında proteolikanlar, kollojen ve
glikoproteinlerin bulunduğu ekstrasellüler matriksin aşırı depolanmasıyla karakterizedir.37 Fibrotik
KC’de fibronektin, laminin, merosin, tenascin, nidojen ve hyalironik asitin de bulunduğu bazı farklı
glikoproteinlerin ekspresyonunda artış görülür. Aynı zamanda heparan dermatan, kondroidin sülfat,
perlekan, sindekan, biglikan ve dokorin gibi glikoproteinlerin de ekspresyonu ve depolanması
artmıştır.38 KC kuffer hücreleri vucudun en yayğın bulunan doku makrofaj hücreleridir.
İnflamasyonu başlatan her olaya pek çok sitokin, reaktif oksijen ürünleri ve araşidonik asit
metabolitleri (ekazanoitler) salgılayarak fibrozis gelişimi ve progresyonuna katılır. Hepatik stellat
hücreler (HSC)’in aktivasyonuna neden olur ve neticede kolojen sentezi, proteoglikanlar ve
hyalüronat sentezlenir. 39,40,41
Fibrozisin en önemli karakteristiği fibriler kollojenin artmasıdır. KC’de pek çok kollojen
tipinde bir miktar artış görülsede en sık artan ve büyük miktarda bulunan ve ekstrasellüler matriks
(ECM)’i oluşturan tip 1 ve 3 kollojenlerdir. ECM’in KC’de fazla miktarda depolanması
patofizyolojik değişikliklere ve organ hasarlanmasına neden olur. Hayvanlarda yapılan
çalışmalarda KC fibrogenezisi sırasında aşırı kollejen yapımından primer sorumlu hücrelerin
hepatik stellat hücreler olduğu görülmüştür. 42-44 Deneysel KC fibrozis modellerinden elde edilen
HSC’ler içerisinde kollejen proteinleri ve artmış mRNA seviyeleri gösterilmiştir.40,45,46 HSC’ler
aynı zamanda artmış hücre sayılarıyla birlikte sentrlobuler skar bölgelerinde idenditifiye edilir. 45,47
KC fibrosizi bulunan hayvan modellerinden izole edilen HSC’ler kontrol hayvanlardan elde
edilenlere göre daha fazla kollojen sentezler. 42,48 Bu bulgular HSC’lerin fibrozis gelişmindeki
önemini gösterir.
ECM’de aşırı depolanmadan primer olarak sorumlu olan hücre HSC’ler olsada diğer bazı
hücrelerinde buna katkıda bulunduğu ile ilgili deliller vardır. Bu fibrogenetik hücreler mezenkimal
orjinlidir ve aralarında myofibroblast, intestisyel fibroblast ve safra kanalı epitelyum hücreleri yer
alır.49-51 HSC’lerin isolasyonu sırasında myofibroblastlarında birlikte izole oldukları görülmüştür.
Bu nedenle iki hücrenin aynı hücre olabileceği düşünülür. Ancak pek çok bulgu farklı hücreler
olduğu yönündedir. HSC’ler kültürde aktivasyon sırasında apopitotik durumda iken
myofibroblastlar değildir.52 Bu iki hücre pek çok yerde birlikte görülmelerine rağmen farklı
genlerle ifade edilirler. Myofibroblastlar fibulin-2, IL-6 sentezlerken HSC’ler de bu sentez
7
-
görülmez. Diğer yandan HSC’ler CD 95L, sinaptofizin, alfa-2 makroglobulin, P100 ve reelin
sentezlerler.51 Bu iki ayrı myefibroblast benzeri hücrenin ayrı hücreler olduğuyla ilgili bir başka
gözlemde hepatik skar içerisinde farklı lokalizasyonlarda yer almalarıdır.53 Myofibroblastların
HSC’lerle birlikte KC fibrogenezisi sırasında fibrojenik yanıtta önemli katkı sağlayan hücrelerdir.
Primer bilier sirozda görülen bilier fibroziste portal fibroblastların hayati rolü olduğu
düşünülmektedir.51 Bu hücreler portal ven, arter komşuluğu ve portal doku civarında bulunurlar.
Sinüzoidal hepatik stellat hücrelere benzer şekilde portal fibroblastlar kronik kolestatik KC
hastalığında aktive ve prolifere olurlar. KC fibrozisini hızlandırırlar.54 Aktive portal
myofibroblastlar aynı zamanda aktive HSC’lerin markerlarını eksprese eder. Bunlar arasında düz
kas antikoru (SMA) aktin, tip1 kollojen ve platelet kökenli büyüme faktörü (PDGF) yer alır.
Bununla birlikte demsin ekspresyonu gösterilmemekle birlikte IL-6’da belirgin azalma görülür.
Halbuki hepatik sinuzoitlerde lokalize aktive HSC’lerde bunun tersi olur.54,55 Aktive portal
myofibroblastlar doku büyüme faktörü (TGF–beta) , PDGF, endotelin -1 gibi fibrojenik yanıta
katkıda bulunan mediatörler salgılarlar.56
KC’de inflmasyonu başlatan pek çok olay HSC’lerin aktivasyonuna neden olan TGF-beta,
PDGF sentezini uyarır. TGF-beta multifonksiyone groft faktör olup HSC’lerin en potent fibrogenik
sitokinidir.57 Tip 1 ,3 ve 4 kollojen, elastin, tenaskin, osteonektin, biglikan ve dekorin gibi ECM’ i
oluşturan maddelerin depolanmsını ve sentezini artırır.58 HSC’ler yanı sıra KC kuffer hücreleri,
hepatositler, plateletler bu sitokini sekrete edebilirler.59 HSC’leri aktive eden diğer bir groft faktör
bağ doku büyüme faktörü (CTGF)’dür ve aralarında deri, akciger (AC), böbrek ve KC’inde
bulunduğu farklı doku hücrelerinde fazla sentezi fibrozisle ilişkilidir ve TGF-beta uyarısı sonucu
sentezlenir. 42 PDGF HSC’ler için önemli bir mitojendir ve KC hasarlanmasını takiben miktarı
artar. HSC’lerin sayısını artırdığı gibi aynı zamanda bu hücreler üzerindeki PDGF reseptör
sayılarını da artırır. 36,60
Dünyada hepatik fibrozisini en yaygın nedeni hepatit B ve C viruslarıdır. KC’de diğer
fibrozisi indükleyen nedenler arasında otoimmun hepatit, ilaçların indüklediği fibrozis, helmintik
enfeksiyonlar, demir ve bakır yüklenmesi ve bilier obstriksiyonlar yer alır.61 Son dönemlerde non
alkolik steatohepatit (NASH)’in toplumda ciddi oranda KC fibrozisine neden olduğu
düşünülmektedir. Tedavi edilmeyen vakalar siroz ve KC yetmezliğine kadar ilerleyebilir.62 Viral
enfeksiyonlara yanıt olarak COX-2, nitrik oksit (NO) ve interferonlar gibi inflamasyonla ilişkili
enzim ve sitokinlerin gen expresyonunu regüle eden çok sayıda sinyal yolağı aktive edilir.63-67 Farklı pek çok nedene bağlı olarak aktive olan KC kuffer hücreleri tarafında üretilen TNF-alfa ve
reaktif oksijen ürünleri (ROS) gibi ajanlar COX-2 üretimini artırır.68 COX-2’ nin KC fibrozis evresi
8
-
ile korele olarak arttığı gösterilmiştir. Dolayısıyla KC fibrozisinin parofizyolojisinde rolü olduğu
düşünülmektedir.1,69,70 İnflamasyona neden olan her uyaran AP-1, NF kapa B , T hücrelerini aktive
eden nükleer faktör, IL-6 gibi pek çok transkripsiyon faktörü aracılığıyla COX-2 indüksiyonuna
neden olur. 71,72 COX-2’ nin aşırı yapımı prostoglandin (PGE2) gibi proinflamatuar mediatörlerin
yapımını artırır.73 PGE2 inflamatuar reaksiyonlar esnasında en fazla üretilen ve immün
fonksiyonların regülasyonunda rol alan bir moleküldür. 74
Matriks metalloproteinazları (MMP) doku tamiri ve remodelinginde önemli olduğu gibi
tümör büyümesi ve metastazlarında da önemli etkiye sahip bileşiklerdir. COX-2 PG’ ler aracılığıyla
MMP’ların ekspresyonunu regüle eder. Primer tümörün metastaz yapabilmesi için tümör hücresinin
çevresindeki ECM’i parçalaması gerekir. Bu esnada lenfatik ve kan damarları hasarlanır. ECM
remodelingine aracılık eden MMP’ler tümör metastazına yardım eder. Bazal laminanın ana
komponenti olan kollojen IV’ ün yıkılımı jelatinazlar (MMP2, MMP9) olarak bilinenen spesifik
MMP’ larca başarılır. MMP2 /jelatinaz A membran tip1 matriks metalloproteinazları (MT1-MMP)
tarafından hücre yüzeyinde aktive edilen bir pro enzim olarak sekrete edilir. MT1–MMP’nin
ekspresyonu ve MMP2’ nin aktivasyonu farklı situmuluslar tarafında indüklenen tümör invazyonu
ve metastazla birliktedir. MT1-MMP ekspresyonu ve MMP2 aktivasyonu COX-2 aktivitesi
tarafından regüle edilmektedir. 72,73,75,77,78 MMP-2 ler PDGF, TGF-h1 ve oksidatif stres aracılıklı
sinyal yolağı üzerinden HSC’leri aktive eder ve fibrotik procesi artırır.36,79,80 Aktive HSC’ler
dramatik olarak matriks metalloproteinaz doku inhibitörlerinin (TIMP-1 ve TIMP-2) ekspresyonu
ve sekresyonunu artırır.81,82,83 Bu artış HSC’lerde TIMP-1’in promoter bölgesinde yer alan AP-1
tarafından regüle edilir. TIMP-1’in fibrozis üzerine daha yaygın etkisi vardır. TIMP-1 ekspresyonu
invitro olarak diğer hücreler yanı sıra aktive HSC’lerin de apopitosizini inhibe eder. 84,85 Ayrıca
persistan TIMP-1 ekspresyonu aktive HCS’lerin varlığıyla birliktedir ve fibrozisin rezolüsyonu
döneminde TIMP-1 protein seviyesindeki azalmaya HSC’lerin azalan sayıları eşlik eder. 85
Viral hepatitlerin KC fibrozisi gelişim mekanizmaları tam olarak ortaya konulamamış
olmakla beraber özellikle HCV’de oksidatif stresin önemli olduğu düşünülmektedir. HCV’ye bağlı
kronik inflamasyon sırasında oksidatif stres artışına ikincil olarak lipit peroksidasyon ürünleri
serumda, periferik kan mononükleer hücreler ve KC dokusunda artar. 4-Hidroksinonenal (HNE)
and 8-hidroksiguanosin oksidatif DNA hasar markerlarıdır ve HCV’li hastalarda arttığı
gösterilmiştir. 86 Aynı zamanda hepatik, plazma ve lenfosit glutatyon (GSH) seviyeleri özellikle
HCV genotip 1b’ li hastalarda azalır. Glutatyon önemli bir endojen antioksidandır ve azlığında KC’
de hasarlanma görülür.86 Okside GSH miktarı artmış GSH törnoverini düşündürür. KC’de
polimorfonükleer hücreler ve Kuffer hücreleri tarafından NADPH oksidaz (NOX-2 proteini)’ ları
aracılığıyla reaktif oksijen ürünleri (ROS)/reaktif nitrojen ürünleri nin üretildiği görülür.87 HCV’nin
9
-
NS3 proteinleri fagositlerde NOX-2 proteinini aktive ederken, apopitozis, T hücreleri, naturel killer
(NK) hücreleri ve naturel killer T hücrelerinin aktivitesini tetikler.88 NOX-2 proteini fagozomal ve
plazma membranlarına lokalize olup ROS ve diğer reaktif oksijen ürünlerinin üretimini artırır. KC
önemli bir GSH kaynağıdır ve diğer dokuların GSH gereksinimini karşılar. HCV tarafından
KC’de gelişen hasar dolayısıyla GSH sistemi aksamaya başlar. Böylece KC başta olmak üzere pek
çok dokuda oksidatif strese bağlı hasarlanmalar görülür.89 HCV’nin hepatositlerde direkt olarakta
intrasellüler oksidatif stresi indüklediği gösterilmiştir. HCV cor gen ekspresyonu artışı ROS, okside
tioredoksin ve lipit peroksidasyon ürünlerinin seviyelerinde artışla birlikteyken, intrasellüler
ve/veya mitakondriyal GSH miktarında azalma görülmüştür. 90,91,92,93
2. 5. COX Enzimleri, Fibrogenezisle ilişkisi ve Klinik Önemleri Hücreler farklı stimuluslarla uyarıldıklarında yada hasar gördüklerinde hücre membran
lipitleri hızla biyolojik olarak aktif mediatörlere dönüşürler. Membran lipiti olan araşidonik aşitten
(AA) türeyen biyolojik mediatörler inflamasyon ve hemostazis gibi değişik foksiyonlarda görev
alırlar. Bu mediatörlere ototokoid’ ler veya lokal kısa etkili hormonlar denir. Bunlar hızla yapılırlar,
lokal etki ederler daha sonra ya spontan yada enzimatik yolla ortadan kaldırılırlar.94,95 Araşidonik
asitten türeyen mediatorler başlıca lökotirenler, prostoglandinler, lipoksinler ve trombaksanlardır.
Bunlara ekazanoitler denir. Prostoglandinlerin sentezini sağlayan enzim ise siklooksijenaz (COX)
dır. COX aynı zamanda prostoglandin endoperoksit sentetaz, yag asit siklooksijenaz, prostoglandin
sentetaz olarakta adlandırılır. Prostanoidlerin (PG) yapımının anahtar enzimidir. Ekazonitler
değişik doku ve organlarda multiple inflamatuar, mitojenik ve anjiojenik aktiviteye sahiptirler.
Aynı zamanda ağrı ve ateşe neden olurlar. COX enziminin COX-1 ve COX-2 olmak üzere iki
izoformu vardır. COX-1 Myomato tarafından 1976’da COX-2 ise Simmons tarafından 1989’da
tanımlanmıştır. Araşidonik asitten COX enzimleri aracılığıyla oluşturulan başlıca prostoglandinler
(PG) PGE2, PGD2, PGF2alfa, PGI2 (prostosiklin) ve TxA2 (Tromboksan) dır. Bunların her biri
spesifik enzimlerin etkisiyle oluşur ve bazıları doku ve hücreye özgüdür. TxA2 bunlara bir örnektir
ve plateletler içerisinde bulunur.95,96 Araşidonik asit salınımını stümüle eden sitokin ve groft
faktörler aynı zamanda COX-2’ nin transkripsiyonunu stimüle eder. Böylece PG’ lerin sentezi artar. 97
COX-1 endoplazimik retikulumda internal membran proteinine lokalizedir. COX-2 ise
hücrede perinükleer yerleşimli bir enzimdir. Sitosolik COX-1’in etkisiyle üretilen prostanoitler
otokrin ve parakrin etkiye sahiptir. Perinükleer COX-2 tarafından üretilen prostanoitler ise intrakrin
etkiye sahiptir. Hemen tüm memeli dokularında çoğu hücre türlerinde COX-1 enzimi devamlı
10
-
olarak sentezlenir. Hücreler arası iletişim, doku hemostazisi, hücre koruma ve hücre içi düzenleme
fonsksiyonlarına sahiptir. Pek çok fizyolojik duruma COX-1 enzimi hızlı yanıt verir. Bunun tersine
COX-2 proinflamatuar mediatörlerce indüklenebilir bir ezimdir ve sitokinler, tümör promoterlerı,
groft faktörler ve gonodotropinler tarafından indüklenebilir (Şekil 1). Uygun situmulasyon olmadan
COX-2 enzimi çoğu dokuda önemsiz derecede az bulunur. Ancak yeni yayınlarda COX-2
enziminin beyin, böbrek ve trakea gibi dokuların bazı hücrelerinde sürekli sentezlendiği
bildirilmektedir.98,99,100,101,102,103 (Tablo 2)
Tablo 2. COX 1 ve COX 2 nin rol aldığı fizyolojik ve patolojik durumlar 104
COX-1 yapıcı COX-2 düzenleyici
• Homeostatik • Patolojik Gastik mukozanın korunması İnflamasyon Platelet aktivasyonu Ağrı Renal fonksiyon Ateş
Patolojik proliferasyon Makrofaj diferasiasyonu • Doku tamiri • Fizyolojik Üreme Renal fonksiyonlar Diğerleri • Gelişimsel Böbrek
11
-
COX-1 ve COX-2 genleri ayrı ayrı genlerdir. Birbirine aminoasit seviyesinde % 60 benzerdir 105,106 COX-1 geni 22 kb’lık uzunluğa sahiptir ve 11 exon içerir.107 Hücre düzenleyici gendir. COX-
2 geni 8 kb uzunlukta 10 exon içerir.108 COX-2 expresyonu protein kinaz A ve C , tirozin kinaz,
lipopolisakkarit, v-Src, groft faktörler, tümör promoterları, onkogen, mitojen, hormonlar, bakteriyel
endotoksinler ve sitokinler gibi değişik uyaranlara yanıt olarak insan endotel, düz kas hücreleri,
monosit ve fibroblastlar gibi farklı hücrelerde hızla eksprese edilirler.73,109-115 Ayrıca COX-2
hücresel büyüme, diferasiasyon ve inflamasyon gibi sayısız durumda indüklenir.116,117 COX-2’nin
romotoit artrit, Crohn hastalığı, ülseratif kolit, H. Pylori tarafından oluşturulan gastrit, kronik venöz
bacak ülseri, lupus nefriti gibi pek çok kronik inflamatuar hastalıkta yapımı artar. Bu bulgular
COX-2’nin gerek akut gerekse kronik inflamatuar olaylarda önemli rollerinin olduğunu
göstermektedir.118-121 COX-2 araşidonik asitten PGH2 oluşumunda hız sınırlayıcı enzimdir. PGH2
nükleer eikazanoit sinyal sisteminde rol alan aralarında PGE2, PGI2, trombaksanlarında bulunduğu
pekçok inflamatuar bileşiğin prokürsörüdür.65,73,109,122-124 COX-2 ve beraberinde PGE2 yapımındaki
artışın CMV, herpes virus ve HBV’nin replikasyonuna eşlik ettiği görülmüştür.67,117,125 COX-2’nin
aşırı yapımı proinflamatuar molekül olan PGE2’nin seviyesini artırır.73 PGE2 inflamatuar
reaksiyonlar esnasında en bol bulunana lipit mediatörlerden birisidir ve immün fonksiyonu
düzenler.74 Değişik mekanizmalarla tümörün gelişimine aracılık eder. Tümör hücre apopitozisini
inhibe eder, tümör hücre proliferasyonunu indükler.126 Ayrıca PGE2 tümör hücresine direkt etkiyle
metastazı artıran matriks metalloproteinaz yapımını artırır ve anjiogenezisi stimüle eder.127
KC sistemik olarak ortaya çıkan araşidonik asit ürünlerinin parçalanması ve eliminasyonunda
major organlardan biridir.128 Bu parçalanmanın yada KC’deki primer hasarlanmanın sonucu olarak
ortaya çıkan PGE2 spesifik olarak portal kan basıncı, glukoz homeostazisi, KC parankim
hücrelerine besinlerin dağıtımı, KC fibrogenezisi gibi önemli fonksiyonları ve patolojileri regüle
eder.129 İnvitro çalışmalarda primer KC kuffer hücrelerinin yalnızca COX-1 eksprese ettikleri
bunun yanı sıra lipopolisakkaritlerle tedavi edilen Kuffer hücrelerinin hem COX-1 hemde COX-2
ürettikleri görülmüştür.130 Her iki COX izoformunun insan KC’indeki profili bilinmemektedir.
COX-1’in hem sirotik hemde normal KC dokusunda eksprese edildiği görülmüştür. Buna karşın
COX-2 normal KC’de eksprese olmazken sirozda sentezi artar. Bu durum aktif inflamasyonun
sonucu olabilir.1 Artmış COX-2 ekspresyonu fibrozisin gelişimi ve inflamasyonun derecesiyle
korele bulunmuştur.69,70 Bu durum COX-2’nin inflamasyonun bir mediatörü olduğunu
düşündürmektedir. KC sirozunda COX-2’ nin indüksiyonu olasılıkla multifaktöryeldir. Sirozda
doku perfüzyon bozukluğuna bağlı iskemik çevre COX-2’yi indükleyen nedenlerden birisi
olabilir.131 Çünkü iskemi ve hipoksinin COX-2’yi indüklediği bilinmektedir.132 Hatta KC’de groft
faktörler tarafından da indüklenebilir.133-136 KC diğer dokulardan daha fazla endotoksine maruz
12
-
kalan bir organdır ve endotoksinler COX-2’nin major indükleyicileridir.137 Dolaşımdaki
endotoksinler KC kuffer hücreleri tarafında alınırlar. Aktive olan kuffer hücreleri PG sentezini
artırır.138-140 Bu durum sirotik KC’de COX-2’nin indüksiyonunu açıklayabilir.
Etanol gibi KC’e toksik bir madde araşidonik asitin etkisiyle kollojen tip 1’in up regülasyonuna
neden olur. AA COX-2 aracılığıyla kollojen tip 1 yapımını indükler. Bu etki antioksidanlar veya
sitokrom P450 2E1 (CYP2El) inhibitörleri tarafından önlenebilir. Detoksifikasyon sırasında ortaya
çıkan hepatosit kökenli ROS’un stellat hücre aktivasyonunda rolü olduğu düşünülmektedir. 141,142
Romatoit artrit (RA)’lı hastalarda eklemlerde COX-2’nin sentezi inflamasyonun şiddetiyle
doğru orantılı olarak artar.144 Bu artış RA yanında diğer inflamatuar artritlerde daha çok vasküler
endotelyal hücreler ve mononükleer hücrelerle infiltre dokularda gösterilmiştir.104,143,144 Benzer
şekilde yoğun mononükler hücre artışının olduğu kronik hepatitlerde COX-2’nin artarak fibrozis
gelişiminde rol oynayabileceği düşünülmektedir. PGE2 COX-2’nin major ve en önemli ürünlerinde
biridir. PGE2’nin ratlarda intravenöz enjeksiyonu vasodilatasyon, plazma ekstravazasyonu ve ağrı
reseptörlerinin sensitizasyonu gibi önemli inflamatuar yanıtları uyarır.145 PGE2 RA’lı hastaların
eklemlerinde kartilaj ve kemik erezyonuna neden olur146, MMP’ların yapımını sitmüle eder,147
anjiogenezise katkıda bulunur,148 ve T lenfosit apopitosizini inhibe eder.149 PGE2’ye karşı
gelişitirilen nötralizan antikorlar ratlarda akut ve kronik inflamasyonu ortadan kaldırır. 150
PG’lerin reseptörleri aracılığıyla gösterdikleri pek çok biyolojik etkileri vardır. KC kuffer
hücreleri ve hepatositler arasında hücre sinyalinde anahtar mediatörlerdir.151,152 Hepatositler
üzerindeki reseptörlerine etki ederler. Trigliseritlerin KC’de sentez ve depolanmasını artırırlar.
COX inhibisyonunun KC’de lipit depolanmasını azaltıldığının bulunmasıyla bu fikir
doğrulanmıştır.153
Herhangi bir inflamatuar uyarana yanıt olarak inflamatuar pek çok hücre yanında KC kuffer
hücrelerinden de IL-1, IL-6, TNF-alfa, TNF-beta ve fibroblast groft faktör (FGF) gibi groft
faktörlerin ekspresyonu artar.154-156 COX-2 spesifik inhibitörlerinin bu groft faktörlerin salınımını
veya etkilerini engellediği düşünülmektedir.157,158 Çünkü COX-2 aralarında IL-1, TBF-alfa,
büyümeyi ve inflamasyonu sitmüle eden diğer pek çok sitokin tarafından sitümüle edilebilen bir
enzimdir. Tüm hücre ve dokularda glukokortikoitler tarafından inhibe edilir.159,160 Aralarında AP-1,
NF-kapaB, aktive T hücre nükleer faktörü, nükleer faktör IL-6 COX-2’ nin indüksiyonuna aracılık
eder. (Şekil 1) 71,72
HCV ilişkili kronik hepatit ve HCC’de COX-2 artışı olduğundan COX-2’nin indüklenmesi
multifaktöryal olabilir.69 Viral hepatitlerde önemli bir sitokin olan TNF-alfa, IL-1 ile kombine
halde COX-2 ekspresyonunu belirgin olarak artırmaktadır.161-164 IL-1 COX-2’nin transktipsiyonunu
artırmanın yanında COX-2 mRNA’nın yarı ömrünü de artırır. COX-2 TNF-alfa aracılı apopitosizi
13
-
antiapopitotik ürünler olan PGE2 ve PGI2 üreterek önler. PGE2 üretiminin kolon kanseri ve
kolanjikarsinomalarda apopitozisin inhibisyonuyla korele olduğu görülmüştür.164-167
Şekil 1. COX-2 ekspresyonun regülasyonuna aracılık eden sitokin ve yolaklar. COX-2 hücre tiplerine bağlı olarak farklı sitmuluslar tarafında stimüle edilir. HUVEC’ te COX-2’nin aşırı ekspresyonu IL-1, bFGF, TGF- beta ve hipoksi tarafından indüklenen traskripsiyon faktörü NFkapa B tarafından artırılabilir. Aynı zamanda COX-1 ve COX-2 peroksidaz aktivitesi, lipopolisakkarit ve TNF-alfa’ya yanıt olarak NFkapa B aktivasyonunun COX-2 mRNA ekspresyonunun aracılık ettiği görülmektedir. RAC311 ve C57MG hücre hatlarında, Wnt-1 ekspresyonu COX-2 geninin ekspresyonunu artırır. Bunu beta-catenin/Tcf kompleksi aracılığıyla COX-2 promotor aktivasyonu yapmak suretiyle gerçekleştirir. PGE2 COX-2 aktivitesinin major ürünüdür ve aynı zamanda COX-2 ekspresyonunu prostaglandin EP-1 reseptörüne bağlanarak stümüle edebilir. NSAİİ ilaçlar teröpatik olarak COX aktivitesini bloke etmekte kullanılır. Bununla birlikte, poliansature yağ asitlerine benzer şekilde (puFA), COX-2 ekspresyonunun indüksiyonu sonucunda bunlar PPAR’ı aktive edebilir.168
COX-2’lerin aşırı veya defektif üretimi kanser başta olmak üzere pek çok patolojiyle ilişkilidir.
Viral enfeksiyonlara yanıt olarak aralarında COX-2, indüklenebilen nitrik oksit sentetaz ve
interferonlarında bulunduğu inflamasyonla ilişkili gen ekspresyonu regülasyonuna katılan multiple
sinyal yolağı aktive edilir.63-67,169,170 Artmış COX-2 seviyesi artmış anjiogenesis, östrojen
sentezinde artış, apopitosizte azalma ile birliktedir ve bütün bunlar tümör gelişimini stimüle eder.
COX-2 ekspresyonunun aralarında meme, kolorektal, pankreatik, gastrik, AC ve baş boyun
kanserlerinin de bulunduğu değişik kanser türlerinde arttığı bulunmuştur.171-175 Son dönemlerde
gerek HCV’ye sekonder gerekse diğer nedenlere bağlı gelişen HCC’lerde artmış COX-2 düzeyi
bildirilmiştir.176,177 COX-2 inflamasyon, fibrogensiz ve karsinogensizten sorumlu tutulmaktadır.178-
180 Bu hususta farklı yazarlar artmış COX-2 ve PG yapımının farklı hayvan modellerinde KC hasarı
14
-
ve tümörogenezise, yanı sıra insanlarda fibrozis ve HCC gelişimine katkıda bulunabilecekleri
yorumunu yapmışlardır.70,181-184 COX-2’nin invitro farmokolojik inhibisyonunun hepatik stellat cell
aktivasyonunu module ettiği, insan hepatoma hücrelerinin proliferasyonunu inhibe ettiği görülmüş
ve bu ilaçların kronik KC hastalığında terapotik rolünün olabileceği düşünülmüştür.185,186
HCV infeksiyonu batıda kronik KC hastalığının en sık nedenidir.187 Bu hastaların % 20-30’
unda siroz zemininde HCC gelişimi için risk altındadırlar.188 HCC başlıca sirotik zeminde
görüldüğü için moleküler seviyede fibrogenesiz ve karsinogenezisin ortak patogenetik temeli
vardır.189 Potansiyel ilişki proteolitik enzimler olarak adlandırılan ve ekstrasellüler matriks
remodelinginde temel rol oynayan MMP’ların aktivasyonu olabilir ki bu enzimler fibrogenezis ve
karsinogenesizte önemli rol oynar.61 HCV infekte hastalarda MMP-2 ve 9 miktarının arttığı
görülmüştür. COX-2 ve PGE2’de olduğu gibi bu enzimlerinde KC fibrozisinin stage ile yakından
ilişkili olduğu bulunmuştur.190 Aynı zamanda bu ilişki HCC’li hastalarda tümör progresyonunda ve
rekürrensi ile de görülmüştür.191,192 Rat fetal hepatositlerinde COX 2 ekspresyonunu MMP 2 ve 9
salınımını artırdığı belirlenmiştir. Bu nedenle COX-2 nin MMP salınımda hayati rolü olduğu
düşünülmektedir. 190,193-196
Kronik HCV’li hastalarda COX-2 artışının moleküler temeli tam olarak ortaya
konulamamıştır, fakat artan deneysel verilere göre cor ve NS5A gibi bazı HCV proteinlerinin çok
sayıda hücresel gende transkripsiyonel trasnaktivator olarak rol oynadığı düşünülmektedir.197,198
Kültüre edilmiş hepatositler Core ve NS5A proteinleri yanı sıra fibrotik proseste önemli rolleri
bilinen TGF-alfa ve IL-1 beta ile muamele edildiklerinde sinerjistik olarak maksimal COX-2
ekspresyonu görülmüştür. Bu sonuca göre viral yükten bağımsız olarak COX-2 ekspresyonu HCV’
nin indüklediği KC hastalığının stage ile paralel artmaktadır.198,199 Core ve NS5A proteinleri NF
kB, AP-1, SRE ve STAT-3 gibi farklı transkripsiyon faktörlerini aktive edebilirler. Bunların
aktivasyonunun COX-2 gen ekspresyonunda artışına neden olduğu düşünülür.93,200,201 Her iki viral
protein intrasellüler kalsiyum (Ca) seviyesini değiştirir. Transkripsiyon faktörlerinden NF-AT’nin
Ca regülasyonu yaptığı bilinmektedir. Bu durum COX-2 gen ekspresyonu aktivasyonunda esastır.72
HCV proteinleri tarafından hepatositlerde COX-2 ekspresyonunu artıran alternatif bir yol da PPAR
ligandlarıdır.202 PPAR’lar tarafından transkripsiyonel regülasyon PPAR retinoit X reseptörleri
aracılığıyla sağlanır. PPAR retinoit X reseptörleri ile Core proteinlerinin etkileşimi transkripsiyonel
aktiviteyi regüle eder.203 Hepatositlerde COX-2 ekspresyonunun regülasyonunda bir transkripsiyon
faktörü olan C/EBP’nin de rolü tarif edilmiştir. Bu faktör HCV proteinleri ile etkileşmede başka bir
hedef olarak rol oynar.204
HBV siroz ve HCC’nin major viral etiyolojik ajanlarından ikincisidir. HCC gelişimini 200
kat artırır. HCC’li hastaların % 90’ından fazlasında siroz vardır.205,206 Son dönemlerde COX-2’nin
15
-
siroz ve iyi diferansiye HCC’de fazla üretildiği ortaya konulmuştur. Fakat kötü diferansiye HCC’de
nisbeten daha düşük bulunmuştur. Bu durum COX-2’nin hepatokarsinogeneziste erken aşamada rol
oynadığını düşündürmektedir.69,207 Kronik HBV’de de COX-2’nin arttığı gösterilmiştir. Bu artış
başarılı antiviral tedaviye ragmen devam etmiştir.208 Üstelik COX-2’nin artışı inflamatuar
aktiviteyle de ilişkili bulunmamıştır. Bu nedenle hepatositlerdeki HBV genomunun varlığıyla
ilişkili olabilir. HBV-DNA’sının hepatosit genomuyla birleşmesi HBx proteininin sürekli
ekspresyonuna neden olur. Daha önceki çalışmalarda da gösterilmiştir ki HBx proteini hepatosit
genomuna entegre olan HBV-DNA tarafından üretilir.209,210 Bu nedenle KC’de inflamasyon
gerilese bile COX-2’nin ekspresyonu konak DNA’sı ile entegre olan viral DNA tarafından sürekli
hale getirilir. 208
HBx, HBV ilişkili karsinogenezise katkıda bulunan ve viral enfeksiyon için gerekli olan bir
trasnaktivatördür.211 HBx proteininin invitro ve invivo olarak hepatosellüler transformasyonda ve
HCC gelişiminde önemli olduğu ortaya konulmuştur.212-214 HBx ve COX-2’nin karsinogenezisle
ilişkili olması nedeniyle hepatositlerdeki HBx geninin COX-2 artışına neden olduğu yorumu
yapılmıştır.215 HBV ilişkili kronik hepatitte HBx proteini COX-2 ile birlikte eksprese edilir ve her
birinin ekspresiyon hızları kronik hepatit, siroz ve HCC ile güçlü bir korelasyon gösterir.215 HBx
proteininin yokluğunda KC hücrelerinde COX-2 ekspresyonu saptanabildiğinden hepatosellüler
COX-2 yapımında başka situmulusların da rolünün olduğu düşünülmektedir.215 COX-2 hipoksi
tarafından da indüklenebilir.132
HBV virusu enfekte hepatositin konak immün hücrelerinden korunması için değişik stratejiler
geliştirmiştir. Bunlardan birisi HBx proteinidir. HBx’in enfekte hepatositi FAS aracılı apopitosizten
koruduğu görülmektedir.216,217 Diğer taraftan COX-2 hepatoma hücrelerinin proliferasyonunu
artırır ve apopitosizi inhibe ederek tümör büyümesini kolaylaştırır.218,219 Son çalışmalarda COX-2’
nin kolanjiokarsinoma hücrelerinde FAS aracılı apopitozisi inhibe ettiği görülmüştür. 220 COX-2
aynı zamanda Th1/Th2 dengesini Th2 yönünde değiştirerek HBV ile enfekte hepatositlerin
yaşamasına izin verir. 221 HBx ve COX-2’nin birlikteliği HCC gelişiminde de bu iki etkenin bir
arada rol oynadığını düşündürmektedir.215 Yüksek COX-2 ekspresyonu aralarında HCC’ninde
bulunduğu değişik kanserlerde artar.184,207 COX-2 ekspresyonu normal ve non sirotik hepatitle
kıyaslandığında sirotik KC’de fazla artış göstermiştir. Aynı zamanda sirotik KC’deki bu artış
displastik nodül ve HCC’den de fazla bulunmuştur.1,69 Morinaga ve arkadaşları HCC ile
kıyaslandığında tümörsüz KC’de daha fazla COX-2 ekspresyonu göstemişler, histolojik aktivite
indeksi, transaminaz değerleri ve proliferatif aktivite ile bu artışı ilişkili bulmuşlardır.222 Bu nedenle
COX-2’nin nekroinflamatuar ve rejeneratif aktivitede rolü olduğu yorumu yapılmıştır.
16
-
COX inhibitörlerinin (NSAİD) antitümör aktiviteleri vardır.223,224 Hayvan modellerinde COX-
2 inhibitörleri tümör hücrelerinde apopitozisi indüklemek suretiyle karsinogenezisi önlediği
gösterilmiştir.225,226 COX-2 vasodilator PG’ler yanısıra vasküler endotelyal groft faktör gibi
anjiogenik groft faktör salınımını artırarak anjiogenezisi kolaylaştırır.227,228 Bu artış özelikle
sirozlularda daha fazladır.229 Böylece KC sirozunda HCC gelişimine nekroinflmatuar aktiviteyi
artırmak, proliferasyonu hızlandırmak, anjiogenezisi artırmak ve apopitozisi inhibe etmek suretiyle
katkıda bulunur. 222,229-232
COX-2’nin inflamatuar olaylarda ortaya çıkması, aşırı yapımının patolojilere neden
olabilmesi yanında önemli fizyolojik rollerinin olduğunu düşünüdüren deliller mevcuttur. Özellikle
idiopatik pulmoner fibrozisli (IPF) hastalarda yapılan çalışmalara dayanılarak COX-2’nin normal
doku tamirinde kritik rolü olduğu düşünülmektedir. IPF’li hastalardan alınan AC fibroblast
kültürlerinde IL-1 stümülasyonuna COX-2 ekspresyonunun yetersiz olduğu görülmüştür.233
PG’lerin kollojen depolanması ve matriks metalloproteinaz yapımını etkilediği ile ilgili gözlemlerle
birlikte düşünüldüğünde COX-2 indüksiyonundaki yetersizliğin IPF gelişimine katkıda bulunduğu
düşünülebilir.234 COX-2 genel olarak proinflamatuar olmakla birlikte aynı zamanda inflamasyonun
gerilemesinde de rol oynar. COX-2 yokluğunda makrofaj kemotaksisi bozulur.235,236 Doku hasarına
yanıt olarak COX-2’nin artışı bu enzimin yara iyileşmesinde fizyolojik rolünün olduğunu
düşündürmektedir. GIS’de H. pylori ilişkili ülser gelişimide diğer dokulara benzer şekilde COX-2’
nin arttığı ve iyileşmeyle birlikte azaldığı görülür.104,237-239 COX-2’nin selektif inhibisyonuyla pek
çok dokuda yara iyileşmesi bozulur. 240-244
COX-2’nin üreme ile yakın ilişkisi vardır. COX-2’nin üretilemediği sıçanlarda fertilite
bozulur. 245 COX-2 hızlı ve geçici bir şekilde lüteinize hormona yanıt olarak preovulatuar
folüküllerde salgılanır ve ovulasyonun zamanlamasının belirlenmesine yardım eder.246,247
Erkeklerde vas deferenste androjenlere yanıt olarak sentezlenir.248 COX-1 ve 2 duktus dokusunda
birlikte PGE2 yapımını stümüle ederek patent duktusa neden olurlar. 249
PG’lerin kemik metabolizmasındaki önemleri bilinmektedir. Mekanik güç, hormon, sitokin,
groft faktörler iskelet dokusunda PG’lerin yapımını artırır. Bu artış COX-2’nin trasnkripsiyonel
regülasyonuyla ilişkilidir.250 Spesifik COX-2 inhibitörlerinin kemik oluşumunu inhibe ettiklerinin
gösterilmesi bu fikri desteklemektedir.251
Pankreatik adacık hücrelerinde COX-2 hem bazal durumda hemde IL-1’e yanıt olarak
salgılanan dominant izoformdur.252 PG’ler özellikle PGI2 AC’ de fizyolojik rollere sahiptir. Bunlar
arasında pulmoner vasküler tonusun sağlanması, kapiller endotelyal ve alveolar endotelyal
permeabilitenin regülasyonu, surfaktan hemostazisi, bronşial mukus sekresyonu ve transportunun
kontrolü yer alır.253 COX-1 ve 2 AC’de farklı hücre ve dokularda sentezlenir. COX-2 bazal
17
-
durumlarda makrofaj ve bronşial epitel bitişiğinde mast hücre benzeri hücrelerde sentezlenir. Aynı
zamanda musküler arterlerin düz kaslarında görülür. 253
COX-2 rat beyinlerinde sentezlenir. Normal nöral aktivite yanı sıra deneysel olarak
oluşturulan baş dönmesinde sentezinin arttığı görülmüştür.254-258
Renal fizylojide önemli rolü olduğu düşünülmektedir. Deneysel rat modellerinde sodyum
kısıtlanmasıyla glomerüler kan akımının ve renin salınımının regüle edildiği makula densada
eksprese edildiği görülür.259 İnsanlarda yapılan ön çalışmalarda COX-2’nin glomerüler podositlerde
ve renal vasküler yapılarda sentezlendiği belirlenmiştir. COX-2 spesifik inhibitörlerinin doz
bağımlı ödem yapması da bununla ilişkilendirilmiştir.260-262 Yaşlılarda COX-2 selektif inhibitörleri
PGI yapımını azaltarak üriner sodyum atılımını azaltır. 263,264 COX-2’nin rodent böbrek gelişiminde
rolü olduğu düşünülmektedir. COX-2 sentezleyemeyen farelerde renal anormallikler görülmüştür. 137,265
COX-2 inhibitörlerinin PGI2 yapımını azalttıklarının gösterilmesi ile COX-2’nin endotelyal
PGI 2 yapımında rolü olduğu düşünülmüştür.263,264 PGI2 pek çok fonksiyonu yanında vasküler
endotelyal homesotasiste önemli sitokindir.
Bütün bunların ışığında COX-2’nin hiç sentezlenmemesi kadar fazla sentezlenmesi de
patolojik süreçlerle birlikte görünmektedir.
2.6. Genetik polimorfizm Türler arasındaki çeşitlilik genetik farklılıklarla mümkün hale gelmiştir. Genetik çeşitlilik
aynı türün bireyleri arasında bireysel farklılıklara neden olur. Bu sayede kişilerin aynı hastalığa
farklı yanıtlar verdikleri görülür. Çoğu kişide kronikleşmeden iyileşen ve bağışıklık gelişen bir
hastalık bazılarında kronik enfeksiyonlara neden olur. Kronikleşen hastalığın seyride kişiler
arasında yine farklılık gösterir. Bazılarında ılımlı bir seyir varken diğerlerinde son derece hızlı
seyirli hastalık tablosu görülebilir. Bütün bu farklılıların genetik çeşitliliğe bağlı olduğu
düşünülmektedir.
Tek gen polimorfizmi (SNP= sinle nucleotid polimorfizm) insan genomunun genetik çeşitliği
içerisinde en sık rastlanan formdur.266 Bunların kimileri insan kanseri gelişiminde hassasiyete
neden olur.267-274 Bazı sitokinlerde gelişen polimorfizm sonucunda o sitokin fazla miktarda
yapılabileceği gibi275-277 eksik veya defektif te yapılabilir. Genetik polimorfizm pek çok enzim ve
sitokini kodlayan gende gösterilmiştir. Bu enzimlerden biriside COX enzimidir. COX-1 ile ilgili
bugüne kadar gösterilmiş 9 tek gen polimorfizm vardır. 278,279
18
-
COX-2 genindeki polimorfizmler klinik olarak daha fazla incelenmiştir. CRE ve yanı sıra
NfκB, NF-IL6, and myb gibi farklı nükleer regülatör faktörler COX-2 geninin dokuya spesifik
tarzda transkripsiyonunda önemli rol oynar. Polimorfizm COX-2’nin ekspresyonunu potansiyel
olarak değiştiren faktörler için bağlanma bölgelerinin oluşumunu veya ortadan kalkmasını
sağlayabilir. Böylece değişik hastalıklara karşı risk veya korunma sağlanmış olur.280-283 COX-2
geninde de pek çok polimorfizm saptanmıştır. Bunların çok azında fonksiyonel etki görülür. Papafi
ve arkadaşları tarafından tafif edilen -765 G>C polimorfizminde stimülatuar protein 1’in (Sp1)
bağlanma bölgesine bağlanması bozulur. Sp1 proteini transkripsiyon için pozitif bir aktivatör olarak
çalışır. Bu polimorfizm sayesinde in vitro olarak COX-2 promoter aktivitesinde % 30 azalma
görülür.7 COX-2’nin değişik allelleri veya haplotiplerindeki potansiyel genetik polimorfizm
inflamatuar yanıtı modüle eden proteinlerin aktivitesinde ve/veya ekspresyonunda değişikliğe
neden olur.284 COX-2’nin 3’ untranslated (UTR) ve promoter bölgesindeki tek gen polimorfizmi
(SNPs)’nin prostat, meme, kolorektal, özefageal, gastrik, mesane, bilier trakt ve non small cell AC
kanseri ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. 5,8,266,285-295
İnsan COX-2 geni 10 ekson ve 8,3 kilobazlık zincir içerir.296 COX-2 ve PG’ler inflamatuar
barsak hastalıklarında epitelyal hücreler ve mononükleer hücrelerde sentezlenir.297 Aralarında IL-1
betanın da bulunduğu proinflamatuar sitokinlere yanıt olarak sentezleri artar.298-300 PG’ler yara
iyileşmesinde esansiyeldir.301 NSAİİ’ ların kullanımıyla PG’ler inhibe edildiğinden ülseratif kolitte
semptomlar alevlenir ve İBS’yi aktive edebilir.302,303 Böylece PG’lerin ekspresyonu inflame
barsakta yara iyileşmesi sürecinde koruyucu etkisi gösterir.119 COX-2 gen polimorfizmlerinden
kaynaklanan sentezlenen miktarlarındaki farklılık İBS’ye hassasiyete neden olabilir.304
Daha önceki çalışmalarda viral enfeksiyonlara yanıt olarak artan COX-2’nin PGE2 yapımıyla
ilişkili olduğu gösterilmiştir. PG’ler hücre ve dokularda ikincil mesajcılar gibi davranırlar. HCV
eksprese eden hücrelerde PGE2’nin seviyesinin arttığı görülmüştür. HCV’nin supgenomik
replikonları NF kapa B aktivasyonu aracılığıyla COX-2 ekspresyonunu indükler.65,305-307
Sitokin gen polimorfizminin güncel olarak kullanımı mümkün hale gelmiştir. Özellikle organ
transplant alıcılarında genetik polimorfizme göre immün supresyon kişiselleştirilmeye başlanmıştır.
Genetik polimorfizmlerin bilinmesi organ rejeksiyonunun önceden bilinmesi anlamına gelmektedir
ve son derece önemlidir.308 İnflamasyonun ve immünitenin önemli sitokinlerinden biri olan TNF
alfa 308 polimorfizmi kalp, böbrek ve KC transplantasyonlularda şiddetli rejeksiyonla ilişkili
bulunmuştur.275,309-311 Aynı zamanda pirmer sklerozan kolanjit, otoimmün hepatit, serebral
malarya, mukokütanoz lasmanyazis, ve astımla da ilişkilidir.312-317 Bu ilişki tüm çalışmalarda
doğrulanmamakla birlikte gen polimorfizmi mevcut klinik durumların kişiler arası farklılığını izah
eden bir açıklamadır.276,318,319
19
-
2.7. COX enzimindeki önemli genetik polimorfizm bölgeleri
Literatürde elde edilen bilgilere göre yaklaşık COX-2’de 124 SNPs (tek nükleotid
polimorfizm) belirlenmiştir.284 Bunların çok azında fonksiyonel etki görülür. -765 G>C
polimorfizminde in vitro olarak COX-2 promoter aktivitesinde % 30 azalma görülür.7 COX-1 ile
ilgili bugün ekadar gösterilmiş 9 tek gen polimorfizm vardır.278,279 COX-1’ de görülen tek gen
polimorfim noktalarından ikisi L237M, V481I’ dır. 320
COX-2 5209 ve 8473 polimorfizmi İBD’da artışla ilişkili bulunmuştur.304 Birkaç raporda
COX-2 926 G-C polimorfizmi yüksek seviyede COX-2 artışına neden olmuştur ve in vitro olarak
%30 oranında promotor aktivitede azalma olmuştur.7,321 V511A (lokalizasyon Exon 10)
polimorfizmi Afrikalı Amerikalılar arasında % 5 oranında bulunur ve kolorektal adenom ve
karsinoma karşı koruyucu özelliği vardır.322 Diğer tek gen polimorzimleri ve lokalizayonları C-162G Promoter, C645T, T10G 5’-UTR, R228H Exon 6 polimorfizmleridir. 323
20
-
3. GEREÇ ve YÖNTEMLER
3.1. Vaka Seçimi
Çalışmada Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Anabilim Dalı Gastroenteroloji Bilim Dalı servisine başvuran ve kronik hepatit tanısı kesinleşmiş 104 (51 bayan,
53 erkek) kronik hepatit ve sirozlu vaka alındı. Vakaların tamamı viral etiyolojili idi. Vakalar KC
biyopsileri yapılmış veya yapılacak olan vakalar arasından rasgele seçildi. Biyopsi örnekleri
Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalında Knodell histolojik aktivite cetveline
göre değerlendirildi. Bu cetvelde 0 dan 18’e kadar sayısal skorlama mevcut olup 0 puan aktivitenin
olmadığını, 18 puan ise yüksek aktiviteyi ve KC inflamasyonunu göstermektedir. Knodell skoruna
göre fibrozis 0, 1, 3 ve 4 olarak skorlandı. 0’dan 3’e kadar olan skordaki olgular kronik hepatit,
fibrozis 4 olanlar ise siroz olarak değerlendirildi. Bu skorlamaya göre sirozlu olgularda HAİ
hesaplanmamaktadır ve yalnızca kronik hepatit olanlarda HAİ hesaplanmıştır. Fibrozis 0 olan vaka
yoktu. Fibrosiz 1 olan 29, fibrozis 3 olan 46, ve fibrozis 4 olan 29 vaka mevcuttu. Vakaların
tamamından EDTA içeren vakumlu tüplere 5 ml tam kan alındı. Kan örnekleri hastaların
kendilerinin ve birinci derece yakınlarının rızası ile alındı. Alınan kanlar +4 oC’de saklanarak en
geç 20 gün içerisinde DNA izolasyonu yapıldı. DNA izolasyonu standart yöntemle “fenol-
kloroform” yapıldı266,269,324-326 COX-2 geni tek nükleotid polimorfizmleri polimeraz zincir
reaksiyonu (PCR) temelli restriksiyon analizleri ile araştırılmıştır
Çalışma için Çukurova Üniversitesi Etik Kurul onayı alındı. Araştırılacak hastalar çalışma
konusunda bilgilendirilerek onayları ile birlikte rıza formları alındı.
3.2. Çalışmada Kullanılan Araç ve Gereçler
• Thermal Döngü Cihazı
• Soğutmalı Santrifüj
• Mikrosantrifüj
• Yatay elektroforez sistemi
• Elektroforez güç kaynağı
• Elektronik Hasas Terazi
• Hız ayarlı Vorteks
• Otomatik pipetler
21
-
• pH metre
• Enjektörler
• UV transillumunator
• UV görüntü analiz sistemi
• Steril 0.2 ml, 0.5 ml, 1.5 ml, 2 ml eppendorf santrifüj tüpleri
• Isıtıcı manyetik karıştırıcı
• İnkübasyon cihazı
3.3. Çalışmada Kullanılan Araç ve Gereçler
• Agaroz (Sigma)
• Tris-Base (Sigma)
• EDTA, sodyum tuzu (Sigma)
• SDS, Sodyumdodesildülfat (Sigma)
• Etil Alkol (Merck)
• Borik Asit (Sigma)
• Etidyum bromür (Sigma)
• Proteinaz K (Sigma)
• Taq DNA polimeraz enzimi (Promega)
• Restriksiyon enzimleri (Promega ve Fermentas)
• 10 X PCR buffer (Promega)
• Deoksiribonükleotid trifosfatlar (dNTPs, Promega)
• Brom fenol blue (Sigma B-6896)
• Mineral yağ (Sigma M-5904)
• Potasyum bikarbonat (Merck C754962)
• Sodyum klorür (Merck)
• Xylene cyanol (Sigma X-4126)
• Fenol (Sigma)
• Kloroform (Merck9
• DNA size marker (100 bp DNA ladder, Puc 19 DNA/Msp1 Marker) (Promega)
• MgCI2 (Promega)
22
-
3.4. Çalışmada Kullanılan Stok Solüsyonların Hazırlanması
• 0.5 M EDTA pH 8.0
- 18.61 g disodyum EDTA
- 80 ml bidistile H2O içinde çözülür
- Solüsyona 2 g NaOH tableti atılarak eritilir
- pH 8’e ulaştığında bidistile H2O ile 100 ml tamamlanır
- Otoklavda steril edilir
• 1 M Tris Tamponu (Stok)
- 121.1 g Tris base tartılarak bir behere alındı. Üzerine 42 mikrolitre HCI ile
yaklaşık 800 ml ddH2O eklenerek manyetik karıştırıcı yardımıyla iyice
çözündürüldü. Daha sonra balon jöjeye aktarıldı ve 1 litreye tamamlandı. 120 oC’de 15 dakika otoklavlanarak sterilize edildi.
• 10 X TBE (Stok Solüsyonu)
- 108 g Tris-base (0.9M)
- 55 g Borik asit (0.9M)
- 40 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 (20mM)
- Tris-base ve borik asit 700 ml bidistile H2O içinde çözülür
- EDTA eklenir
- Bidistile H2O ile 1000 ml’ye tamamlanır
- Oda sıcaklığında saklanır
• 1 X TBE (Çalışma Solüsyonu)
- 100 ml 10 X TBE stoktan
- 900 ml bidistile H2O eklenir
• Edityum bromür solüsyonu (10 mg/ml)
- 1 g Etidyum bromür
- 10 ml bidistile H2O içinde çözülür
- Işık almayan bir şişe içinde +4 oC’de saklanır
- Stok solüsyondan, çalışma solüsyonu 0.5 mg/ml olacak şekilde hazırlanır
23
-
• Proteinaz K (Sigma) Solüsyonu
- 10 ml 500 mM’lık Tris (pH 8) solüsyonu içine 100 mM'lık CaCI2’den 0.1 ml
ilave edilir ve 100 mg poteinaz K solüsyona eklenir. Bu şekilde 10 mg/ml
proteinaz K solüsyonları hazırlanır.
• % 10’luk SDS (Sodyum Dodesil Sülfat) (Merck)
- 10 g sodyum dodesi sülfat tartıldı. SDS tozlarını kaldırmamaya dikkate
ederek beher içine alındı ve üzerine 80 mililitre ddH2O eklendi. Manyetik
karıştırıcı yardımıyla çözündürüldü ve pH'sı 7.2’ye ayarlandı. 0.22
mikronluk filtreden geçirilerek sterilize edildi ve oda ısısında saklandı.
• 4 M Sodyum Klorür (NaCI)
- 233.6 gram Sodyum klorür tartılarak erlene alındı. Üzerine 800 ml ddH2O
ilave edildi ve manyetik karıştırıcı ile iyice çözündürüldü. Balon jöjeye
aktarılarak 1 litreye tamamlandı. 120 oC’de 15 dakika otoklavlanarak
sterilize edildi.
• Agaroz Jel Yükleme Tamponu (5X)
- 20 g Ficoll 400, 1 g SDS, 0.2 ml 0.5 M EDTA, 1 ml 1 M’lık Tris (pH 8), 200
mg Brom fenol blue, 200 mg Xylen cyanol tartılarak steril ddH2O ile 100
ml’ye tamamlandı. Oda sıcaklığında saklandı.
• Eritrosit Parçalama Tamponu (Lysis Buffer)
- 8.74 g Amonyum klorür, 1 g Potasyum bikarbonat, 200 µl 0.5 M’lık
EDTA’nın tartımları yapılarak erlen içine alındı. 900 ml ddH2O eklendi ve
çözeltinin pH'sı 1 N NaOH ile 7.4’e ayarlandı. Daha sonra balon jöje içine
alınarak 1 litreye tamamlandı. Çözelti ısıya dayanıklı şişelere aktarılarak 120 oC’de 15 dakika otoklavlandı ve +4 oC’de saklandı.
• Lökositleri Parçalama Tamponu (White Blood Cell Buffer-WBL)
- 25 ml 4 M NaCI ve 50 ml 0.5 M EDTA direk balon jöjeye aktarılarak 1
litreye tamamlandı. 120 oC’de 15 dakika otoklavlanarak sterilize edildi.
24
-
3.5. DNA İzolasyon Yöntemi - 5 ml EDTA’lı tüm kan 50 ml’lik polipropilen tüpe alınır
- Kan örneğinin üç katı hacminde (15 ml) eritrosit lizis tamponu konulup. Kapak
kapatılıp kısaca çalkalanır
- 2000 rpm’de +4 oC’de 15 dakika santrifüj yapılır. Üstteki süpernatant pastör
pipeti ile atılıt.
- Eritrosit lizis tamponu ile yıkama işlemi iki kez daha yapılıp üstteki süpernatant
atılarak aynı devir ve soğutmalı santrifüjde santrifüj edilir.Bu işlemelökosit
pelleti beyazlaşıncaya kadar devam edildi.
- Lökosit pelleti beyazlaşınca süpernatant dökülür. Lökosit pelleti üzerine 600 µl
lökosit parçalama solüsyonu (White Cell-Lysis Buffer) 0.5 ml %10 SDS ve 10
µl proteinaz K konulup köpürtmeden iyice pipetlenir. 55 oC’de 1 gece
inkübasyona bıraklır.
- 1 gece sonunda her tüpe hacminin 2 katı olacak şekilde fenol-kloroform (1:1)
çözeltisinden eklenir. +4 oC’de 30 dakika beklenir.
- 30 dakikanın sonunda +4 oC’de 15 dakika 15000 devirde santrifüj edildi.
Santrifüj sonunda süpernatant temiz tüpe alınarak süpernatantın hacminin 2 katı
kadar tekrar feno-kloroform çözeltisi eklendi ve +4 oC’de 30 dakika beklenir.
- 30 dakikanın sonunda +4 oC’de 15 dakika 15000 devirde santrifüj edildi.
Santrifüj sonunda süpernatant temiz tüpe alınarak süpernatantın hacmini kadar
kloroform ilave edildi. Ve +4 oC’de 15 dakika 15000 devirde santrifüj edildi.
- 15 dakikanın ardından süpernatant temiz bir tüpe alınarak üzerine -20 oC tutulan
%100’lük etil alkol eklendi. Bu aşamadan sonra örnekler -20 oC’de 1 gece
tutulur.
- 1 gecenin sonunda -20 oC’den çıkarılan örnekler +4 oC’de 15 dakika 15000
devirde santrifüj edildi.
- Santrifüj sonrasında süpernatant döküldü. Eppendorf tüpleri DNA konsantratörde
3 dakika vakum altında kurutuldu. Daha sonra DNA örnekleri steril ddH2O ile
çözündü. Bu aşamadan sonra çözünmüş DNA’lar -20 oC’de polimeraz zincir
reaksiyonu gerçekleştirilinceye kadar saklandı.
25
-
3.6. COX-2 Geninin PCR ile Çoğaltılması
3.6.1. -8473 T>C Polimorfizminin Genetik Analizi COX-2 geninin -8473 T>C (rs5275) polimorfizminin hedef bölgesini DNA dizisi ve
çoğaltılmasında kullanılan primer çifti aşağıdaki gibidir. 266,326
]
Sense: 5’ GTT TGA AAT TTT AAA GTA CTT TTG AT 3’
Antisense: 5’ TTT CAA ATT ATT GTT TCA TTG C 3’
COX-2 geninindeki -8473 T>C polimorfizmini içine alan DNA dizisi aşağıdaki gibidir altı
çizili nükleotid polimorfik olan nükleotidtir. 8401 tcgatgtttc caatgcatct tccatgatgc attagaagta actaatgttt gaaattttaa
8461 agtacttttg attatttttc tgtcatcaaa caaaaacagg tatcagtgca ttattaaatg
8521 aatatttaaa ttagacatta ccagtaattt catgtctact ttttaaaatc agcaatgaaa
8581 caataatttg aaatttctaa attcataggg tagaatcacc tgtaaaagct tgtttgattt
Belirlenmiş primer çifti için; PCR tüpünde son hacim 50 µL olup içeriği şu şekildedir. Her
iki primer çiftinden (50pmol) 0.5 µL, MgCI2 (25mM) 4 µL, dNTP (10mM) 2 µL, PCR tamponu 5
µL, Taq DNA polimeraz (5U/µL) 0.3 µL, DNA 5 µL (250ng) ve son hacim 50 µL olacak
şekilde ddH2O oluşur.
PCR işlemini gerçekleştirmek için, otomatik ısı döngü cihazını aşağıda belirtilen sıcaklık ve
sürelere göre ayarlandı.
• Başlangış Denatürasyonu 95 oC’de 10 dk (1 döngü)
• Denatürasyon aşaması 95 oC’de 1 dk
• Hibridizasyon aşaması 53 oC’de 1 dk (35 döngü)
• Sentez (Uzama) aşaması 72 oC’de 1 dk
• Son sentez aşaması 72 oC’de 10 dk (1 döngü)
PCR için kullanılan karışım 0.2 ml’lik tüplere dağıtıldı ve üzerine saflaştırılan genomik
DNA eklendi. Tüm işlemler tepkimenin doğru gerçekleşmesi için buz üstünde yapıldı. Bu şekilde
elde edilen tepkime karışımı otomatik ısı döngü cihazına yerleştirilerek tepkime gerçekleştirildi.
Tüm PCR’larda negatif kontrol olarak DNA içermeyen steril su kullanıldı.
26
-
3.6.2. -765 G>C Polimorfizminin Genetik Analizi COX-2 geninin -765 G>C polimorfizminin hedef bölgesinin DNA dizisi ve çoğaltılmasında
kullanılan primer çifti aşağıdaki gibidir. 326,327
Sense: 5'- ATT CTG GCC ATC GCC GCT TC -3'
Antisense: 5'- CTC CTT GTT TCT TGG AAA GAG ACG -3'
COX-2 geninindeki -765 G>C polimorfizmini içine alan DNA dizisi aşağıdaki gibidir altı
çizili nükleotid polimorfik olan nükleotidtir. 781 agcgtccctg caaattctgg ccatcgccgc ttcctttgtc catcagaagg caggaaactt
841 tatattggtg acccgtggag ctcacattaa ctatttacag ggtaactgct taggaccagt
901 attatgagga gaatttacct ttcccgcgtc tctttccaag aaacaaggag ggggtgaagg
Belirlenmiş primer çifti için; PCR tüpünde son hacim 50 µL olup içeriği şu şekildedir. Her
iki primer çiftinden (50pmol) 0.5 µL, MgCI2 (25mM) 2 µL, dNTP (10mM) 2 µL, PCR tamponu 5
µL, Taq DNA polimeraz (5U/µL) 0.3 µL, DNA 5 µL (250ng) ve son hacim 50 µL olacak
şekilde ddH2O oluşur.
PCR işlemini gerçekleştirmek için, otomatik ısı döngü cihazını aşağıda belirtilen sıcaklık ve
sürelere göre ayarlandı.
• Başlangış Denatürasyonu 95 oC’de 10 dk (1 döngü)
• Denatürasyon aşaması 94 oC’de 1 dk
• Hibridizasyon aşaması 59 oC’de 1 dk (35 döngü)
• Sentez (Uzama) aşaması 72 oC’de 1 dk
• Son sentez aşaması 72 oC’de 10 dk (1 döngü)
PCR için kullanılan karışım 0.2 ml’lik tüplere dağıtıldı ve üzerine saflaştırılan genomik
DNA eklendi. Tüm işlemler tepkimenin doğru gerçekleşmesi için buz üstünde yapıldı. Bu şekilde
elde edilen tepkime karışımı otomatik ısı döngü cihazına yerleştirilerek tepkime gerçekleştirildi.
Tüm PCR’larda negatif kontrol olarak DNA içermeyen steril su kullanıldı.
27
-
3.7. Çoğaltılmış DNA’ların Elektroforezde Değerlendirilmesi PCR sonucu oluşan DNA’ları yürütmek için %2’lik agaroz jel hazırlandı. 5 µl PCR ürünü 1 µl yükleme tamponuyla karıştırılarak kuyucuklara yüklendi. Jel 90 voltta 90 dakika elektroforeze
tabi tutuldu. Ultraviyole lamba altında PCR’da kullanılan primer çiftlerine göre oluşan DNA
bantları incelendi. COX-2 geni -8473 T>C polimorfizmi için 147 bç’lik 1 adet bant gözlendi (Şekil
2). COX-2 -765 G>C polimorfizmi için 157 bç’lik 1 adet band gözlendi (Şekil3).
Şekil 2. COX-2 -8473 PCR ürünü.1-5. kuyular 45-49. hastaların PCR ürünü, 6. kuyu DNA marker’dir.
28
-
Şekil 3. COX-2 -765 PCRR ürünü.1-5. kuyular 63-67 hastaların PCR ürünü, 6. kuyu DNA marker’dir.
3.8. PCR Ürünlerinin Restriksiyon Enzimleri ile Kesimi
3.8.1. COX-2 -8473 T>C Polimorfizminin Genotiplendirilmesi
COX-2 geni -8473 T>C polimorfizmini tanımlamak için özgül primerler kullanılarak
çoğaltılan 147 bç’lik hedef gen bölgesi BclI (Promega; R6651) restriksiyon enzimi ile kesildi. Bc1I
restriksiyon enziminin tanıma bölgesi şu şekildedir.
T▼GATC A
A CTAG▲T
29
-
Deneyin Yapılışı:
0.5 ml’lik ependorf tüpünün içine 16 µl ddH2O, 5 µl PCR ürünü, 2 µl Bc1I endonükleaz
tamponu, 5 ünite Bc1I restriksiyon enzimi, 0.2 µl bovin serum albumin eklendi. Karışım enzimin
optimum çalıştığı sıcaklık olan 50 oC’de ısıtıcı içinde 1 gece boyunca inkübe edildi. İnkübasyon
sonrası tüplerden alınan kesim ürünü 3 µl Bromfenol mavisi ile karıştırılarak % 3’lük agaroz jele
yüklendi. %3’lük agaroz jelde PBR322 moleküler ağırlık belirteci ve enzim kesimi yapılmamış
PCR ürünü eşliğinde 90 dakika 90 volt sabit akımda yürütülüp ultraviyole lamba altında incelenip
fotoğrafı çekildi.
Restriksiyon kesimi sonucunda eğer analiz edilen hastanın COX-2 geni -8473 pozisyonunda
C (Sitozin) nükleotidi bulunuyorsa 147 bç’lik PCR ürünü 124 bç’lik ve 23 bç’lik parçalara ayrıldı. -
8473 pozisyonu bir allelde C (Sitozin) diğer allelde T (Timin) nükleotidi bulunuyorsa 147 bç’lik
PCR ürünü agaroz jel elektroforezi sonucunda 147 bç’lik, 124 bç’lik ve 23 bç’lik üç bant görüldü.
Her iki allel T nükleotidini taşıdığı 147 bç’lik kesilmemiş PCR ürünün görülmesiyle kabul edildi.
(Şekil 4)
Şekil 4. COX-2 -8473 T>C tek nüleotid polimorfizminin RFLP metodu ile genotiplendirilmesi. 1. kuyu DNA marker, 2. kuyu homozigot TT genotipi, 3. kuyu heterozigot TC genotipi, 4. kuyu homozigot CC genotipi.
30
-
3.8.2. COX-2 -765 G>C Polimorfizminin Genotiplendirilmesi
COX-2 geni -765 G>C polimorfizmini tanımlamak için özgül primerler kullanılarak
çoğaltılan 157 bç’lik hedef gen bölgesi Bsh1236I (Fermentas) restriksiyon enzimi ile kesildi. Bsh1236I restriksiyon enziminin tanıma bölgesi şu şekildedir.
5'-C G^C G-3'
3'-G C^G C-5'
Deneyin Yapılışı:
0.5 ml’lik ependorf tüpünün içine 16 µl ddH2O, 5 µl PCR ürünü, 2 µl Bsh1236I
endonükleaz tamponu ve 5 ünite Bsh1236I restriksiyon enzimi eklendi. Karışım enzimin optimum
çalıştığı sıcaklık olan 37 oC’de ısıtıcı içinde 1 gece boyunca inkübe edildi. İnkübasyon sonrası
tüplerden alınan kesim ürünü 3 µl Bromfenol mavisi ile karıştırılarak %3’lük agaroz jele yüklendi.
%3’lük agaroz jelde PBR322 moleküler ağırlık belirteci ve enzim kesimi yapılmamış PCR ürünü
eşliğinde 90 dakika 90 volt sabit akımda yürütülüp ultraviyole lamba altında incelenip fotoğrafı
çekildi.
Restriksiyon kesimi sonucunda eğer analiz edilen hastanın Cox-2 geni -765 pozisyonunda G
(Guanin) nükleotidi bulunuyorsa 157 bç’lik PCR ürünü 134 bç’lik ve 23 bç’lik parçalara ayrıldı. -
765 pozisyonu bir allelde G (Guanin) diğer allelde C (Sitozin) nükleotidi bulunuyorsa 157 bç’lik
PCR ürünü agaroz jel elektroforezi sonucunda 157 bç’lik, 134 bç’lik ve 23 bç’lik üç bant görüldü.
Her iki allel C nükleotidini taşıdığı 157 bç’lik kesilmemiş PCR ürünün görülmesiyle kabul edildi.
(Şekil 5 )
31
-
Şekil 5. COX-2 -765 G>C tek nüleotid polimorfizminin RFLP metodu ile genotiplendirilmesi. 1. kuyu DNA
marker, 2. kuyu homozigot CC genotipi, 3. kuyu heterozigot GC genotipi, 4. kuyu homozigot GG genotipi.
3.9. İstatistiksel Analizler Sayısal değişkenlerin ortalamalarının karşılaştırılmasında Student-t testi kullanılmıştır. Fibrozis grupları arasındaki COX-2 genotip dağılımlarındaki farklılıklar Ki-Kare (X2) testi ile
yapıldı. COX-2 genotipi ile histolojik aktivite indeksi arasındaki ilişki tek yönlü varyans analiz
yöntemi ile saptanmıştır. Lojistik regresyon yöntemiyle de fibrozis riski ile COX-2 polimorfizmi
arasındaki ilişki araştırılmıştır. P değerinin 0.05 küçük olması istatistiksel olarak anlamlı kabul
edildi. Bütün istatistiksel yöntemler, “SPSS (Statistical Packages of Social Sciences, SPSS for
Windows, Version 11.5, Chicago, IC, USA )“ istatistiksel paket programı kullanılarak yapıldı.
32
-
4. BULGULAR
Çalışma sonuçlarında HBV ile HCV arasında fibrozis skoru ve HAI’leri arasında istatiksel bir
fark görülmedi.(Sırasıyla p
-
Tablo 4. COX 8473 bölgesi genotiplerinin fibrozis evresine göre karşılaştırılması. Her fibrozis skoruna göre
Tablo 5. COX 8473 bölgesinde genotiplere göre fibrozis skoru.
genotiplerin % dağılımları verilmektedir.
9 11 9 29 15,3 9,8 3,9 29,0
31
n
,0% 37,9% 31,0% 100, 0%16,4% 31,4% 64,3% 2 7,9%8,7% 10,6% 8,7% 27,9%
30 13 3 46 24,3 15,5 6,2 46,0
65,2% 28,3% 6,5% 100, 0%54,5% 37,1% 21,4% 4 4,2%28,8% 12,5% 2,9% 44,2%
16 11 2 29 15,3 9,8 3,9 29,0
55,2% 37,9% 6,9% 100, 0%29,1%