kukorica csíkos mozaik vírus (mdmv) populációk köpenyfehérje
TRANSCRIPT
TARTALOMJEGYZÉK
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ............................................................................................................ 3
1 BEVEZETÉS ............................................................................................................................... 7
2 IRODALMI ÁTTEKINTÉS ........................................................................................................ 9
2.1 A kukoricatermesztés hazai helyzete és jelentősége.............................................................. 9
2.2 A kukorica csíkos mozaik vírus általános jellemzése.......................................................... 13
2.3 Az MDMV genomszerveződése .......................................................................................... 16
2.4 A potyvírusok géntermékei és azok funkciói....................................................................... 17
2.5 Vírusizolátumok................................................................................................................... 20
2.6 Vírusok elleni rezisztencia ................................................................................................... 20
2.7 Vírusrezisztencia kiváltása molekuláris módszerekkel........................................................ 21
2.7.1 A vírusgének transzgénként való felhasználásának kockázati tényezői, valamint a
vírusok genetikai változékonyságának forrásai ....................................................................... 24
2.8 Fertőzőképes, teljes hosszúságú cDNS klónok használata .................................................. 25
3 ANYAG ÉS MÓDSZER ........................................................................................................... 27
3.1 Vírus izolátumok gyűjtése és felszaporítása ........................................................................ 27
3.2 Pollen-életképesség vizsgálat............................................................................................... 27
3.3 Vírus partikulum tisztítás elektronmikroszkópos vizsgálathoz ........................................... 27
3.4 Molekuláris vizsgálatok ....................................................................................................... 28
3.4.1 Mintafeldolgozás-RNS kivonás-Reverz transzkripció................................................... 28
3.4.2 Polimeráz láncreakciók.................................................................................................. 28
3.4.3 A köpenyfehérje gének klónozásának lépései ............................................................... 31
3.4.4 Transzformációs módszerek .......................................................................................... 31
3.5 A klónozások során használt vektorok, baktériumok és táptalajok ..................................... 32
3.5.1 A kukorica csíkos mozaik vírus klónozása során alkalmazott vektorok ....................... 32
4. Táblázat: A klónozások során használt vektorok összefoglaló táblázata. ........................... 32
3.5.2 A klónozások során használt baktériumtörzsek és táptalajok........................................ 33
3.5.3 A kompetens sejtek elkészítése...................................................................................... 34
3.6 Bioinformatikai vizsgálatok................................................................................................. 34
3.6.1 Nukleotid sorrend összehasonlítás és filogenetikai vizsgálatok .................................... 34
3.6.2 Rekombinációs vizsgálatok............................................................................................ 34
3.6.3 RNS másodlagos szerkezet vizsgálatok......................................................................... 35
1
4 EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK.................................................................................. 37
4.1 Kukorica csíkos mozaik vírus izolátumok gyűjtése és tüneteinek vizsgálata...................... 37
4.2 Pollenéletképesség vizsgálat ................................................................................................ 40
4.3 Elektronmikroszkópos vizsgálat .......................................................................................... 41
4.4 A kukorica csíkos mozaik vírus rokonsági viszonyainak feltárása...................................... 42
4.5 A vírus RNS másodlagos szerkezetének vizsgálata............................................................. 48
4.6 Rekombinációs vizsgálatok.................................................................................................. 53
4.7 A teljes genomot lefedő nukleotid sorrend meghatározása ................................................. 54
4.8 MDMV vírusrezisztencia kiváltására alkalmas konstrukció elkészítése ............................. 55
4.9 A kukorica csíkos mozaik vírus teljes hosszúságú cDNS klónjának elkészítése ................ 57
5 KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK ............................................................................ 61
6 ÖSSZEFOGLALÁS................................................................................................................... 62
7 SUMMARY............................................................................................................................... 63
8 MELLÉKLETEK....................................................................................................................... 65
1.sz. Melléklet. Irodalomjegyzék................................................................................................. 65
2. sz. Melléklet. A dolgozathoz kapcsolódó közlemények jegyzéke........................................... 80
3. sz. Melléklet. Magyarország helye a világ kukoricatermesztésében (2009)............................ 82
4. sz. Melléklet. Magyarország helye a világ kukoricatermesztésében (zölden learatott)........... 82
5. sz. Melléklet. Magyarország vezető mezőgazdasági terményei 2009-ben .............................. 82
6. sz. Melléklet. A vizsgátokba bevont vírusizolátumok összefoglaló táblázata ......................... 83
7. sz. Melléklet. A két teljes hosszúságú MDMV klón nukleotid sorrendje................................ 90
8. sz. Melléklet. Inszerciót tartalamzó MDMV köpenyfehérje gének MFE értékei (Vienna,
Nupack és UNAfold) ................................................................................................................... 96
9. sz. Melléklet. MDMV köpenyfehérje gének, Vienna, Nupack és UNAfold programokkal
számított MFE értékei. ................................................................................................................. 97
10. sz. Melléklet. Az SCMV alcsoport CP génjének RDP programmal végzett rekombinációs
vizsgálatainak eredményei ........................................................................................................... 98
11. sz. Melléklet. MDMV teljes hosszúságú elsődleges szerkezete alapján végzett
rekombinációs vizsgálatok eredményei (RDP).......................................................................... 105
9 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ................................................................................................. 107
2
Rövidítések jegyzéke
aa aminosav (amino acid)
bar foszfinotricin acetiltranszferáz gén
CaMV karfiol mozaik vírus (Cauliflower mosaic virus)
cDNS komplementer DNS
ClYVV here sárgaerűség vírus (Clover yellow vein virus)
CP köpenyfehérje (coat protein)
DMV (DsMV) tarógyökér mozaik vírus (Dasheen mosaic virus)
DNS dezoxiribonukleinsav
dNTP deoxyribonukleotid trifoszfát
dsRNS double stranded RNS (dupla szálú RNS)
ER endoplazmatikus retikulum
FDA fluoreszcein diacetát
For/fwd forward (szensz)
GORS genom szinten rendezett RNS szerkezet (genome scale ordered RNA structure)
HC-Pro segítő komponens (helper component proteinase)
HR hiperszenzitív reakció
IPTG izopropil-tio- β-D-galaktozidot
JGMV fenyércirok mozaik vírus (Johnsongrass mosaic virus)
kb kilobázis
kDa kilodalton
LMV saláta mozaik vírus, (Lettuce mosaic virus)
MCMV kukorica klorotikus foltosság vírus (Maize chlorotic mottle virus)
MDMV kukorica csíkos mozaik vírus (Maize dwarf mosaic virus)
MFE legkisebb szabadenergia (minimum free energy)
3
MP mozgási fehérje (movement protein)
NIa kis sejtmagi zárványfehérje (nuclear inclusion body, protease)
NIb nagy sejtmagi zárványfehérje (nuclear inclusion body, replicase)
NOS nopalin szintáz terminator (nopaline synthase terminator)
nt nukleotid
ORF open reading frame, nyitott leolvasási keret
PDR kórokozó közvetített rezisztencia (pathogen-derived resistance)
PCR polimeráz láncreakció (polimerase chain reaction)
PEG polietilén-glikol
PenMV köles mozaik vírus (Pennisetum mosaic virus)
PPV szilva himlő vírus (Plum pox virus)
PSbMV borsó maggal átvihető mozaik vírus (Pea seed-borne mosaic virus)
PTGS poszt ranszkripcionális géncsendesítés
PVA burgonya A virus (Potato virus A)
PVY burgonya Y vírus (Potato virus Y)
RdRp RNS függő RNS polimeráz (RNA dependent RNA polimerase, replicase)
Rev reverse (antiszensz)
RISC RNS-indukált silencing komplex (RNA-induced silencing complex)
RNS ribonukleinsav
RT-PCR reverz transzkripciós PCR (reverse transcription PCR)
SCMV cukornád mozaik vírus (Sugarcain mosaic virus)
SEL size exclusion limit- a plazmodezma áteresztő képessége
siRNS rövid interferáló RNS (short interfering RNA)
SrMV cirok mozaik vírus (Sorghum mosaic virus)
TaMV tamarillo mozaik vírus (Tamarillo mosaic virus)
TEV dohány karcolatos vírus (Tobacco etch virus)
TMV dohány mozaik vírus (Tobbaco mosaic virus)
4
TuMV répa mozaik vírus (Turnip mosaic virus)
TVMV dohány értarkulás vírus (Tobacco vein mottling virus)
UTR nem transzlálódó régió (untranslated region)
Vpg genomhoz kötött fehérje (viral protein-genome linked)
X-Gal 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktozidot
ZeMV kukorica mozaik vírus (Zea mosaic virus)
ZYMV cukkíni sárga mozaik vírus (Zucchini yellow mosaic virus)
5
6
1 BEVEZETÉS
Magyarország kukoricatermesztése nagy múltra tekint vissza, a spanyol kereskedők által
Európába szállított kukorica (tengeri) a törököktől (törökbúza) került magyar lakta területekre, és
azóta is meghatározó szerepe van mezőgazdaságunkban. Hazánk növénytermesztésére a
gabonatúlsúly jellemző (50-70%). A gabonát termelő területeken belül a kukorica (25-30%) és a
búza (18-30%) aránya a legjelentősebb. Magyarországon a kukorica a szántóföldi növények közül a
legnagyobb területet foglalja el, szerepe a mezőgazdaságban meghatározó. Termőterülete
elterjedésétől kezdve szinte állandóan nőtt és az 1930-as években már a szántóterület 20%-án
termesztettek kukoricát. Az intenzív állattenyésztéssel párhuzamosan folytatódott ez a növekedés,
valamint emelkedtek a termésátlagok. A második világháború után az országos termésátlag 2,2 t/ha
volt, majd az 1980-as évek elején már meghaladta a 6t/ha-os átlagot. A termésátlagokban az elmúlt
években nagyfokú ingadozás figyelhető meg, melynek okai a termesztéstechnológia nem megfelelő
alkalmazása és az időjárási szélsőségek (Nagy, 2007). A kukorica terméshozamait nagyban
befolyásolják a kártevők és kórokozók által okozott minőségi és mennyiségi veszteségek. Az egyik
ilyen kórokozó, és egyben a kukorica legjelentősebb vírus betegsége a kukorica csíkos mozaik vírus
(Maize dwarf mosaic virus, MDMV).
A potyvírusok családjába tartozó kukorica csíkos mozaik vírus (Maize dwarf mosaic virus,
MDMV) az egyszikű növények egyik legjelentősebb vírus kórokozója. A vírusfertőzésre a
különböző kukoricafajták eltérő érzékenységet mutatnak, általánosan megfigyelhető a mozaik
tünetek kialakulása, törpülés, gyengén fejlett címer és rosszul kötött termés (Revers et al., 1999). A
vírusfertőzés komoly mezőgazdasági károkat okoz (Oertel et al., 1997), a terméskiesés elérheti a
42%-ot is (Peti, 1983; Sum et al., 1979; Szirmai, 1968). Figyelembe véve, hogy a fertőzöttség
mértéke fajtánként akár 80% is lehet (Tóbiás et al., 2003), az MDMV kártétele gazdasági
szempontból igen jelentős. A gazdasági kártétel az abortált végű csövek nagy számából, a csövek
méretének csökkenéséből és az ezerszemtömeg csökkenéséből adódik össze (Toldiné Tóth É.,
2008).
Míg az SCMV (Sugarcane mosaic virus) alcsoport más tagjait, az MDMV-vel szerológiailag
rokon, egyszikűeket fertőző vírusokat kutatók részletes vizsgálatoknak vetették alá, addig az
MDMV jelentőségével kevesen foglalkoztak. Ezt támasztották alá a génbanki adatbázis adatai, ahol
korlátozott számú MDMV szekvencia volt megatlálható. Mivel az alcsoport tagjai közül hazánkban
az MDMV a domináns vírus, ezért indokolt a vírus szélesebb körű vizsgálata.
Az MDMV genetikai állományának változékonysága és ennek lehetséges patológiai
következményei figyelmünket a vírus tüneti determinánsainak és populációjának részletesebb
elemzésére irányította. A PDR (pathogen derived resistance) kísérletekeben a vírusok
7
köpenyfehérje génjét vagy annak egy darabját széleskörben alkalmazzák vírusrezisztencia
kiváltására. A köpenyfehérje multifunkcionális, fontos tüneti determináns és gazdaspecifitás
meghatározó, valamint nélkülözhetetlen a levéltetvekkel való terjedéshez, elengedhetetlen a vírus
sejtről-sejtre-valamint hosszútávú mozgásához. Mivel szerepe ilyen sokrétű, elsődleges
szerkezetének meghatározása jól alkalmazható a vírus genetikai vizsgálatára.
A köpenyfehérje fentebb említett tulajdonságai miatt, vizsgálataink a köpenyfehérjét (CP- coat
protein) kódoló régió összehasonlító analízisére terjednek ki.
Munkánk során a következő feladatokat tűztük ki doktori dolgozatom céljául:
1. A doktori képzés ideje alatt (2006-2009) meghatározni a kukorica csíkos mozaik vírus
(MDMV) rokonsági körét, két magyarországi kukorica termesztő – és nemesítő területről gyűjtött
izolátumok köpenyfehérje génjének elsődleges szerkezete alapján, ezzel feltérképezni a hazai
víruspopuláció összetételét, stabilitását.
2. MDMV köpenyfehérje génjét tartalmazó konstrukció készítése, mely a transzgénikus
növényekben alkalmas vírus ellenállóság kiváltására. A transzformációs módszerek alapjainak
kidolgozása.
3. Teljes hosszúságú, lehetőség szerint fertőzőképes MDMV klón előállítása.
8
2 IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2.1 A kukoricatermesztés hazai helyzete és jelentősége
2009-ben a világ kukoricatermeasztői között a Magyarország a tizenegyedik helyet foglalta el
(1. ábra), mely az ország méretéhez viszonyítva megelehetősen jó eredménynek számít.
A kedvező éghajlat és talajadottságok, a termesztési tapasztalatok, a szakmai ismeretek mind-
mind az európai és világpiacon betöltött szerepünket erősítik (Csíbor, 2004).
A kukorica fajlagos eszköz-és anyagigénye a kalászos gabonafélékhez viszonyítva nagy. Az
állandó költségek, melyek a termésátlagtól függetlenek, szintén magasak. A terméseredményeket
figyelembe véve a termelési költség és a felvásárlási ár közötti különbség határozza meg az elérhető
jövedelmet. A helyes fajtaválasztással és minőségi vetőmag használatával a termelési költségek
növelése nélkül biztosíthatják a termelők az eredményes termesztést. Az állandóan változó
közgazdasági és ökológiai feltételek arra ösztönzik a termelőket, hogy költségtakarékos
megoldásokat keressenek, amelyekkel megőrizhető a kukoricatermesztés jövedelmezősége. A
jövedelmezőség szempontjából fontos a termésstabilitás biztosítása; a fajta megválasztása,
betakarítási szemnedvesség csökkenése (ezáltal kevesebb szárítási költség). A fajták
megválasztásánál és a nemesítésnél fontos szempontok a szárszilárdság növelése, a
gyökérregenerálódó képesség növelése (pl. kukoricabogár lárva ellen), szárazságtűrés képesség
növelése, betegségekkel szembeni ellenálló képesség növelése. A mezőgazdasági technológiák
helyes alkalmazása, az agrotechnika; a vetésváltás következetes betartása, a jó minőségű vetőmag, a
trágyázás és a szárítás költségeinek mérséklése, talajtermékenységet fenntartó talajművelés, a
talajviszonyoknak megfelelő termelés mind hozzájárulnak a kukoricatermesztés sikeréhez (Nagy,
2007).
A kukorica keményítőtartalma 65%, ezért elsősorban energiahordozó. A nyersfehérje-tartalma,
ami főleg zeinből áll, alacsony: 7-9 %. A csíra olajtartalma 3-5%, ami az étolajok csoportjába
tartozik. A kukorica egyéb beltartalmi mutatói: a cukor 1,4%, pentozánok 6%, nyersrost 2%,
ásványi anyagok 1,2%. A termésmennyiség negatív korrelációban van a minőséggel.
A kukorica termésátlaga a gabonafélék között a legmagasabb (6,7 t/ha). Az elmúlt tíz év
kukoricatermesztési mutatóit az 1. táblázat foglalja össze. A kukorica kitűnő takarmány,
gazdaságosan előállítható energiaforrás és ipari alapanyag. Az iparilag fejlett országokban a
kukoricát takarmányozásra (80-90%), emberi fogyasztásra (5%) és különböző ipari termékek
előállítására használják. A kukoricából készült szilázs vagy szenázs, kérődző haszonállatainknak
egész télen át tartósított takarmányként szolgál (monodiéta). Humán táplálkozásban a
9
csemegekukorica, a pattogatni való kukorica, valamint a kukoricakása jelentős. A kukoricaszem
hasznosítása az élelmiszergyártásban a táplálkozási szokások változásával-fellendült, amit a
kukoricapehely iránti megnövekedett igény is alátámaszt. Ide sorolhatók a különböző puffasztott
termékek, a kukoricacsíra és a kukorica olaj. A kukoricát felhasználják a sörgyártásban, valamint a
whisky gyártás fontos alapanyaga. A kukoricaolaj összetevője a margarinnak, kukoricasziruppal
édesítik a dzsemeket, illetve sűrítőanygként szolgál a tejmentes, növényi alapú tejszínhez. Ipari
felhasználása egyre szélesedik. A keményítő, a szeszgyártás, a bioetanol, az étkezési (izo)
cukorgyártás alapanyaga, de manapság kukoricából már környezetbarát csomagolóanyagot is
előállítanak. A kukoricacsutka felhasználása is felértékelődött, ipari feldolgozása és hasznosítása
egyaránt megoldott, például alapanyagul szolgál a bioetanol gyártás eddigi leghatékonyabb
módjának. A kukoricacsutkából Bacillus stearothermophilus általi erjesztéssel 30%-al jobb
hatásfokot értek el, mint az élesztős fermentációval, ráadásul gazdaságosabb és olcsóbb is. A
baktériumos lebontás során hő termelődik, ami a fermentor hőmérsékletét 70°C-on tartja. Ez enyhe
vákumban lehetővé teszi az etanol desztillációját, amit azután csak kondenzálni kell. Az élesztő a
transzgénikus baktériummal szemben nem képes a hemicellulóz alkohollá alakítására. A bioetanol-
gyártás alapanyagai közül hazánkban jelenleg a kukorica és az őszi búza szolgálhat elsődlegesen a
termelés alapjául. A két kultúrát összehasonlítva megállapítható, hogy a kukorica esetében kétszer
nagyobb lehet a hektáronkénti nettó etanol-hozam a búzáénál. Ez egyrészt a magasabb
terméshozam, másrészt a kedvezőbb kinyerési hatékonyság (kukorica: 32%; búza: 24%)
eredménye. A takarmányozási és egyéb igényeket figyelembe véve átlagosan 2-3 millió tonna az
ipari feldolgozásra felhasználható kukorica mennyisége, ami 700-800 ezer tonna bioetanol
előállítást eredményez. Hazánkban is azok a kukoricahibridek lehetnek versenyképesek a bioetanol
gyártásban, melyek a szemben Magas Erjeszthető Tartalommal (MTA) rendelkeznek, emellett a
szemek törésállósága és betegségekkel szembeni ellenállósága a legfontosabb. A kukoricából
történő bioetanol előállítás egyik legnagyobb problémája a melléktermék felhasználása. A
melléktermék takarmánnyá alakítása (DDGS-Dried Distillery Grain with Solubles-a desztillálás
utáni cefremaradvány szárazanyag tartalma) nemcsak költséges, hanem a jelenlegi
állatállományokat figyelembe véve eladhatósága is nehéz. Erre a problémára megoldás lehet a
desztillációs maradék biogáz termelésre történő hasznosítása
(http://hu.wikipedia.org/wiki/Bioetanol). Mellékterméke, a szár, takarmányozásra, fűtésre
használható, vagy a talajba dolgozva a tápanyag-visszapótlásában van szerepe (Nagy, 2007).
Hazánkban a felhasznált szemeskukorica 90%-a abrak, a kérődző állatok fontos
tömegtakarmánya. Napjainkban kenyérsütésnél, sörgyártásnál egyre szélesebb körben használják.
Csemegeként elsősorban a főtt csemegekukorica és a pattogatott kukorica fogyasztása számottevő.
10
Az erdélyi magyarok-főleg a székelyek- a főtt puliszkát kenyérként, köretként fogyasztják. Az ipari
célú felhasználása az éves termelésünk 5-10%- át teszi ki.
1. Táblázat A kukoricatermesztés hazai mutatói 2000-2009-ig terjedő időszakban
(http://statinfo.ksh.hu/Statinfo; Magyar Statisztikai Zsebkönyv, 2010)
Időszak Kukorica (tonna/év) Kukorica (kg/ha) Kukorica (betakarított ha)
2000. év 4 984 332 4150 1 192 702 2001. év 7 857 713 6220 1 258 120 2002. év 6 120 937 5050 1 205 817 2003. év 4 532 147 3950 1 144 735 2004. év 8 332 448 7000 1 190 141 2005. év 9 050 004 7560 1 197 547 2006. év 8 281 666 6820 1 214 952 2007. év 4 026 734 3730 1 078 784 2008. év 8 897 138 7470 1 191 804
2009.év 7 542 000 6400 Nincs adat
Magyarország helye a világ kukoricatermesztésében 2009
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
USAKína
Brazília
Argentín
a
Indonéz
ia India
Dél-Afrik
a
Francia
ország
Mexikó
Nigéria
Magya
roros
zág
Terület
Term
elés
(100
0$)
0
50000000
100000000
150000000
200000000
250000000
300000000
350000000
Term
elés
(t/é
v)
Termelés (1000$)
Termelés (t/év)
1. ábra
Magyarország helye a világ kukoricatermesztésében 2009-ben
Az ábrán jól látható, hogy hazánk kukoricatermesztése 2009-ben, világviszonylatban a
tizenegyedik helyet foglalta el, mellyel az ország méreteit tekintve joggal büszkélkedhetünk
(Adatok forrása: http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx).
11
A magyar mezőgazdaság jövőjét a jó minőségű, egészséges, fertőzéstől mentes kukorica
termesztése jelentheti, mert ez szolgálhat alapjául egy magasabb minőségű állattenyésztésnek,
húsfeldolgozásnak és versenyképes piacnak. A hozamok mellett a megtermelt termékek minősége
és beltartalmi értéke még fontosabb, mert ez alapozza meg a magasabb feldolgozási fokban
előállítható termékek kiváló minőségét, és ezzel együtt annak piacát, jövedelmezőségét,
versenyképességét (Nagy, 2007).
Magyarország kukoricatermeszése (zölden learatott) 2009
0100000200000300000400000500000600000700000800000900000
USA
Mexikó
Nigéria
Francia
ország
Magya
rorsz
ágPeru
Indonézia
Dél-Afri
ka
Terület
Term
és (1
000$
)
050000010000001500000200000025000003000000350000040000004500000
Term
elés
(t/é
v)Termelés (1000$)Termelés (t/év)
2. ábra
Magyarország helye a világ kukoricatermesztésében (zölden learatott) 2009
2009-ben 421704 tonna zölden learatott kukoricaterméssel az ötödik helyen álltunk a világ
kukoricatermesztői rangsorában (Adatok forrása: http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx).
Az 1-3. ábrák jól szemléltetik Magyarország kiemelkedő szerepét a világ
kukoricatermesztésében. 2009.-ben a tizenegyedik helyen álltunk a világ kukoricatermesztő
országainak rangsorában, míg ugyan ebben az évben, a zölden learatott kukorica termésmennyisége
alapján az előkelő ötödik helyet foglaltuk el. Az ábrákhoz tartozó pontos adatokat a 3., 4., 5.-
mellékletek foglalják össze.
A 3. ábrán jól látható, hogy 2009-ben hazánkaban a kukorica volt a mezőgazdaság vezető
treménye, melyet a búza követett. Az ábrák alapján egyértelmű, hogy hazánkban a
kukoricatermesztésnek mekkora jelentősége van, mind humán, mind pedig takarmányozási
12
szempontból. A mezőgazdaság számára fontos a megbízható minőségű, fertőzéstől menetes
vetőmag, ezért nagy jelentősége van a vírusok elleni küzdelemnek és közvetve a vírusvektork
irtásának.
Magyarország vezető mezőgazdasági terményei 2009
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
Kukoric
aBúza
Serté
shús
Tehén
tej
Csirkeh
ús
Napra
forgóm
agSző
lőAlm
a
Repcem
ag
Termény
Term
elés
(100
0$)
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
Term
elés
(t/é
v)
Termelés(1000 $)
Termelés (t/év)
3. ábra
Magyarország vezető mezőgazdasági terményei 2009-ben
A kukorica által termelt összbevétel 2009-ben majdnem megegyezett a búzáéval, azonban a búza
ezt az éréket megközelítőleg fele annyi terméssel érte el (Adatok forrása:
http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx).
2.2 A kukorica csíkos mozaik vírus általános jellemzése
A Potyviridae családba tartozó kukorica csíkos mozaik vírus (Maize dwarf mosaic virus,
MDMV) előfordulását először a hatvanas években regisztrálták az Egyesült Államokban (Janson és
Ellett 1963, Williams és Alexander 1965), majd hamarosan hazánkban is leírták (Szirmai és
Paizsné, 1963). Gazdanövényei a kukorica, fenyércirok, cukornád, köles, cirok fajok, valamint
egyéb pázsitfű félék (Williams és Alexander 1965). Az MDMV maggal 0.007%- 0.4%-ban (Hill et
al., 1974; Mikel et al., 1984), mechanikai úton, valamint levéltetvekkel nem perzisztens módon
terjed (Toler, 1985).
13
Az MDMV fertőzés követkeményei a mozaikos tünetek kialakulása a levélen, majd később a
csuhéj leveleken, a törpülés, mely az internódiumok megrövidülésének eredménye, valamint a
gyengén fejlet címer és rosszul kötött termés. A kukorica csíkos mozaik vírus okozta törpülést a 4.
ábra szemlélteti.
A vírus elleni védekezés legegyszerűbb módjai a megfelelő termesztési technológia, az MDMV-
t terjesztő rovarvektorok (Rhopalosiphum maidis F. - 5. ábra, Rhopalosiphum padi L. - 5. ábra,
Schizaphis graminum R., Myzus persicae S.) populációjának gyérítése, illetve a vírusrezervoárként
szolgáló egyszikű gyomok (fenyércirok, Sorghum halepense L. Pers) irtása. Az MDMV elleni
védekezés másik lehetséges módja toleráns illetve rezisztens kukoricafajták kialakítása. Klasszikus
nemesítési folyamat esetében a rezisztencia leggyakoribb, de nem kizárólagos forrása a kukorica
genomjában természetesen is megtalálható Mdm1 gén, amely a hatodik kromoszóma rövid karján,
az endospermium színét meghatározó Y1 lokuszhoz kapcsoltan helyezkedik el (Scott és Louie,
1996; Simcox et al., 1995). Vírus elleni rezisztencia elérhető molekuláris nemesítési módszerekkel
is, ilyenkor a vírus köpenyfehérjéjét kódoló gént (coat protein, CP), vagy annak egy szakaszát
építik be a növény genomjába. Ez az úgynevezett kórokozó alapú rezisztencia (pathogen-derived
resistance, PDR) sikerrel alkalmazható az MDMV esetében is, sőt az MDMV-B, tehát SCMV
4. ábra
Kukorica csíkos mozaik vírussal fertőzött kukorica tipikus törpüléses tünete (Szeged-2006)
14
köpenyfehérjét termelő növény nem csak az MDMV, hanem az MDMV-MCMV (Maize chlorotic
mottle virus) kevert fertőzéssel szemben is ellenállóvá vált (Murry et al., 1993). Magyarország
Európa negyedik legnagyobb kukoricatermelője, hazánkban is komoly erőfeszítések folynak mind a
vírus kártételének és a védekezés lehetőségeinek kutatása, mind a rezisztens kukoricafajták
nemesítése terén (Gáborjányi et al., 1992; Hoang és Gáborjányi, 1991; Milinkó, 1977; Milinkó et
al., 1979; Kovács et al., 1998; Kovács et al., 1994; Tóbiás és Palkovics, 2004).
Az MDMV a trópusi fűféléket fertőző SCMV potyvírus alcsoportba tartozik (Shukla et al.,
1989). Ezen egymással szerológiailag rokon vírusok közé tartozik a cukornád mozaik vírus
(Sugarcane mosaic virus, SCMV), a köles mozaik vírus (Pennisetum mosaic virus, PenMV), a
fenyércirok mozaik vírus (Johnsongrass mosaic virus, JGMV), a cirok mozaik vírus (Sorghum
mosaic virus, SrMV), az MDMV, valamint a közelmúltban, Izraelben azonosított kukorica mozaik
vírus is (Zea mosaic virus, ZeMV), (Seifers et al., 2000).
5. ábra Kukorica levéltetű (Rhopalosiphum maidis) és zablevéltetű (Rhopalosiphum padi) károsítása
kukoricán
(Források:http://www.ctahr.hawaii.edu/nelsons/Misc/1_corn_leaf_aphid_maize_1.jpg-
Nelson;
http://www.scri.ac.uk/research/epi/agroecology/multitrophicinteractions/abovegroundbelowgr
oundtrophicinteractions-Johnson)
15
2.3 Az MDMV genomszerveződése
Az MDMV a Potyviridae család ezen belül a Potyvirus nemzetség tagja. A Potyviridae a
legnépesebb és gazdasági kártétel szempontjából a legjelentősebb víruscsalád. A növényi vírusok
30%-a sorolható ide, legalább 200 vírust tartalmaz (Ward és Shukla, 1991). A növényi vírusok
többségéhez hasonlóan az MDMV örökítő anyaga egyszálú, pozitív orientációjú RNS, amely tíz
fehérjét kódol (7. ábra). A mintegy 9500 nukleotid hosszúságú, egyetlen ribonukleinsavból álló
vírusgenom szerveződése követi a potyvírusok általános felépítését. A virion burok nélküli,
helikális szimmetriájú, alakja hajlékony fonál, mely 720 nm hosszúságú, 15 nm átmérőjű. Az
MDMV a potyvírusok III. szubdivízójához tartozik a fertőzött növényi szövetekben kialakuló
zárványfehérjék alapján. Ebben az esetben három különböző típusú zárványfehérje képződik, a
hengeres, a szélkerék és a lamelláris alakú. A 6. ábrán látható, hogy a vírus partikulum
összeépüléséhez megközelítőleg kétezer köpenyfehérje alegység szükséges (Martin és Gelie, 1997).
A virion megközelítőleg 5 % nukleinsavat és 95 % fehérjét tartalmaz (Jones és Tolin, 1972;
Dougherty és Carrington, 1988). A fehérjék termelése ekvimoláris. Ahhoz, hogy egy CP kialakuljon
az egész genomnak transzlálódnia kell, ezért van az, hogy kevés a szövetekből kimutatható virion, a
replikáció ‘felesleges’ termékei pedig a vírusra jellemző alakú zárványok formájában
felhalmozódnak.
6. ábra
Az MDMV virionjának felépítése
A burok nélküli helikális felépítésű, hajlékony fonál alakú virion hossza megközelítőleg 720 nm,
átmérője 15 nm. A vírus becsomagolásához 2000 CP alegység szükséges. (Forrás:
http://expasy.org/viralzone/all_by_species/48.html)
A vírus RNS 5’ végéhez kovalensen kapcsolódó fehérje (VPg) feltehetően az eukarióta mRNS-
eken meglévő diguanozin sapkát helyettesíti, ezáltal segít a vírus RNS transzlációjának
16
elindításában (Andino et al., 1999), az RNS 3’ végén poliadenilált régió található. Az első, mintegy
139 nukleotidot nem kódoló régiót egy hosszú leolvasási szakasz (ORF) követi, amiről egyetlen
338 kD hosszúságú poliprotein prekurzor íródik át, mely először autoproteolízissel, majd a
szabaddá váló, proteáz aktivitású P1, HC-Pro és NIa fehérjék által esik szét (ko-és poszt-
transzláció) funkcióképes fehérjékké (Kong és Steinbiss, 1998; Urcuqui-Inchima et al., 2001).
7. ábra
A potyvírusok genomszerveződése és géntermékei
Az egyszálú RNS tíz fehérjét kódol. VPg - genomhoz kötött fehérje, P1- első fehérje, HC-Pro-
segítő komponens-proteáz, P3 - harmadik fehérje, 6K1 - az első 6kDa-os fehérje, CI -
citoplazmatikus zárványfehérje, 6K2 - második 6kDa-os fehérje, NIa – kis sejtmai
zárványfehérje, Nib - nagy sejtmagi zárványfehérje, CP - köpenyfehérje, polyA - poliadenilált
régió (Fauquet et al., 2005).
2.4 A potyvírusok géntermékei és azok funkciói
A P1 fehérje proteináz aktivitású, a poliprotien érésekor önmagát képes lehasítani. A P3
fehérjével együtt a vírugenom legváltozékonyabb részét képezik, kivételt képez a C-terminális
részen elhelyezkedő konzervált aminosav szekvenciájú proteináz katalitikus domén, melynek
alapján a szerin típusú proteinázok közé tartozik (Verchot et al., 1992). Deléciós és mutációs
vizsgálatok alapján igazolták, hogy a P1 fehérje önmagában nem nélkülözhetetlen a
vírusfertőzéshez, azonban a P1 és HC-Pro határán elhelyezkedő egyedi hasítási hely
kulcsfontosságú szerepet tölt be (Verchot és Carrington, 1995). A P1 fehérje RNS kötő aktivitású,
de ez a kötődés nem specifikus, egyaránt köti az egyszálú – és duplaszálú RNS-eket, ebből arra
következtettek, hogy szerepe lehet a vírus sejtről-sejtre terjedésében (Arbatova et al., 1998).
A HC-Pro (helper komponens proteáz) egy multifunkcionális fehérje (Maia et al., 1996).
Cisztein típusú proteázként részt vesz a poliprotein prekurzor hasításában. Három fő régióra
osztható, az N-terminális részén egy KITC (Lys-Ile-Thr-Cys) nagyfokú konzerváltságot mutató
tetrapeptid található, melyről igazolták, hogy a levéltetű szájszervéhez való specifikus kötődésért
felelős (Blanc et al., 1998). A központi régiójában megtalálható PTK (Pro-Thr-Lys) motívum pedig
17
a virionhoz való kötődésben játszik szerepet (Peng et al., 1998). A mai napig elfogadott Pirone és
Blanc (1996) ’híd-elmélete’, miszerint a PTK hidat képez a levéltetű szájszerve és a vírus N-
terminális régiójában elhelyezkedő DAG motívum között. Nélkülözhetetlen a vírus szisztemikus és
sejtről-sejtre terjedésében, kísérletek igazolták, hogy a növény szállítórendszerében való mozgásnál
a ki-és belépéshez is szükséges (Kasschau et al., 1997). Bebizonyították, hogy C-terminális része
elengedhetetlen a vírus sejtről-sejtre terjedésében, mert ez képes megnövelni a plazmodezmák
áteresztőképességét (SEL-size exclusion limit), és elősegíti a vírus RNS átjutását egyik sejtből a
másikba. Alapvető feladata van a vírus amplifikációjában, valamint PTGS-t szupresszál (Pruss et
al., 1997).
A P3 fehérje a potyvírusok egyik legkevésbé ismert fehérjéje, ezt nagyfokú változékonyságával
magyarázzák, mely kevés esélyt ad az összehasonlításukra. Sejten belüli elhelyezkedése és a
replikációhoz szükséges fehérjékkel való kötődése alapján (NIb, CI, VPg) arra következtetnek,
hogy fontos szerepe van a vírus amplifikációjában, annak ellenére, hogy ennek a fehérjének (a 6K1
és 6K2 fehérjékkel egyetemben) nincs RNS kötő képessége (Merits et al., 1998).
A 6K1 és 6K2 fehérjék nélkülözhetetlenek a replikációhoz, nevüket méretükről kapták (6kDa).
A P3 és 6K1 fehérjék közti hasítási hely hiánya nem volt hatással a vírus életképességére, azonban
tünetmentes fertőzéshez vezetett, tehát a 6K1 fehérjének fontos szerepe van a vírus tüneti
determinációjában (Riechmann et al., 1995). A TEV 6K2 fehérjéről bebizonyították (Restrepo-
Hartwig és Carrington, 1994), hogy az endoplazmatikus retikulum membránjához kötött. A 6K2 a
replikáció során a CI-vel és VPg-vel komplexet alkotva, őket az ER típusú membránokhoz
horgonyozza (Schaad et al., 1997b).
A citoplazmatikus zárványfehérje (cylindrical inclusion - CI) szélkerék (pinwheel) alakú
zárványokat formál a citoplazmában, amelyet a Potyvirus genus egyik legjellegzetesebb bélyegének
tekintenek. Kutatók először igazolták PPV esetében, hogy egy pozitív orientációjú RNS vírus
helikáz aktivitású fehérjét kódol (Laín et al., 1990, 1991). Eagles et al. (1994) TaMV (Tamarillo
mosaic virus) esetében is azonos eredményre jutottak. Elektronmikroszkópos vizsgálatok szerint a
CI általában a plazmodezmák közelében található (Roberts et al., 1998). MDMV-vel fertőzött
kukorica növényekben a CI fehérje ATPáz aktivitását vizsgálva a kutatók (Chen et al., 1994) arra
jutattak, hogy a plazmodezmák közelében erős ATPáz aktivitás összefügg azzal, hogy a sejtről-
sejtre terjedéshez szükséges ATP hidrolízist a helikáz aktivitású CI fehérje végzi, mivel minden
RNS helikáz NTPáz természetű. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a CI szerepet játszik a
vírus transzportban, azonban nem jut át a szomszédos sejtbe, csak segíti a nukleoprotein komplex
átjutását a plazmodezmákon. Adams et al. (2005) szerint a CI fehérjét kódoló szakasz a
legalkalmasabb a potyvírusok taxonómiai besorolásához.
18
A vírus RNS 5’ végéhez kovalensen kapcsolódó VPg fehérje feltehetően az eukarióta mRNS-
eken meglévő diguanozin sapkát helyettesíti, ezáltal segít a vírus RNS transzlációjának
elindításában (Andino et al., 1999), valamint megvédi a mRNS-t az exonukleázoktól. Wittmann et
al. (1997) és Léonard et al. (2000) bizonyították, hogy a TuMV (Turnip mosaic virus) VPg fehérjéje
kötődik az eIF(iso)4E eukarióta transzláció iniciációs faktorhoz, mely úgynevezett ’cap-binding’
aktivitású. Schaad et al. (2000) TEV esetében bizonyították, hogy ez a kötődés vonal-specifikus.
Gazdafaktorokkal kapcsolatba lépve meghatározza a vírus gazdaspecifitását a hosszú távú
mozgásban (TEV-Tobacco etch virus Schaad et al., 1997a; TVMV-Tobacco vein mottling virus
Nicolas et al., 1997; PSbMV-Pea seed-borne mosaic virus Keller et al., 1998; PVA- Potato virus A
Andrejeva et al., 1999; Rajamäki és Valkonen, 1999). Továbbá bizonyították, hogy a fehérje
központi régiójában történő aminosav cserék hatására TVMV (Nicolas et al., 1997) és PVY
(Masuta et al., 1999) izolátumok képesek voltak a rezisztencia áttörésére.
Az NIa és NIb fehérjék alkotják a potyvírusok sejtmagi zárványtestecskéit (nuclear inclusion
bodies), melyek sejtmagi transzport szignálokat (NLS-nuclear localization signal) tartalmaznak
(Restrepo et al., 1990; Li et al., 1997). Az NIa fehérje (48kDa) két doménre osztható, az N-
terminális a fentebb említett VPg domén, a C-terminális pedig a proteináz domén (Kim et al., 1995;
Parks et al., 1995). Ez a potyvírusok legfőbb proteináza, mely a poliproteint (cisz és transz)
funkcióképes fehérjékké hasítja. A rokon poliproteineket specifikusan hasítja. Az NIb (58kDa) a
potyvírusok nagy sejtmagi zárványfehérjéje, ez a vírusgenom legkonzerváltabb régiója. Habár a
sejtmagban képez zárványtesteket, funkciója szerint a citoplazmában RNS függő RNS polimeráz
feladatot tölt be (Klein et al., 1994; Hong és Hunt, 1996), replikációs komplexet alkot a CI, VPg,
6K1 és 6K2 fehérjékkel. A sejtmagban betöltött szerepe mind máig ismeretlen.
A köpenyfehérje (CP-coat protein) a potyvírusok egyik legrészletesebben vizsgált régiója,
nukleinsav és aminosav összetétele alapján rokonsági viszonyok megállapítására használják. A több
funkciót is ellátó fehérjék közül a köpenyfehérje konzervált központi szakasza (core) főleg az
enkapszidációban vesz részt, a változékonyabb aminosav sorrendű N-és C-terminális doméneknek a
vírus rövid és hosszú távú mozgásában van szerepe (Dolja et al., 1994). Az N-terminális domén
fontos vírusspecifikus epitópokat tartalmaz (Shukla et al., 1988). Az N-terminális doménben
található a levéltetűvel való átvihetőségért felelős DAG aminosav-motívum (Harrison and
Robinson, 1988; Pirone és Blanc, 1996). A tripletben történő mutáció a vírusátvitel teljes
elvesztéséhez is vezethet (Atreya et al., 1991). Salomon és Bernardi (1995) MDMV fertőzés esetén
is igazolták az N-terminális régió levéltetű átvitelben betöltött szerepét. A köpenyfehérje számos
funkciói között szerepel még a vírusreplikáció szabályozása, a gazdafaktorokkal való kapcsolata
révén a vírus egyik fontos tüneti és gazdaspecifitás determinánsa (Riechmann et al., 1992; Hong et
al., 1995; Hajimorad et al., 2003).
19
Az adeninben gazdag (Gallie et al., 1987) 5’ nem kódoló régió (5’NTR) feltehetően transzlációs
enhanszerként működik (Carrington és Freed, 1990, Gallie and Walbot, 1992). Riechmann et al.
(1992) néhány potyvírus (PPV, PVY, TVMV, TEV) 5’NTR-jében a replikáció és transzláció
szempontjából fontos konzervált régiókat azonosítottak. Ezzel szemben Simon-Buela et al. (1997)
azt igazolták, hogy a PPV 5’NTR nem szükséges a fertőzőképességhez, de hozzájárul a vírus
versenyképességéhez és patogenitásához.
A potyvírusok 3’ nem kódoló régiójának (3’NTR) hossza és szekvenciája variábilis. A rokon
törzsek között hasonló, de a fajok között nincs magas fokú homológiája, ezért is használható a
potyvírusok klasszifikációjában, a genetikai távolságok megállapításában (Frenkel et al., 1989).
Rodriguez-Cerezo et al. (1991) megállapították, hogy a TVMV mutáns 3’ nem kódoló régiójában
jelenlévő inszerció közvetlenül hat a tünetek alakulására. Tacahashi és Uyeda (1999) a genom 3’
végén található poliadeniláció hatását ClYVV-nál vizsgálva azt tapasztalták, hogy legalább 5-10
adenozin jelenléte szükséges a fertőzőképesség magas szinten való fenntartásához. A 3’ NTR
meghatározza a mRNS stabilitását azáltal, hogy elősegíti a poliadenilációt, valamint erőteljes
másodlagos szerkezetével védi a mRNS-t az RNázok hasításától (Liu, 2009).
2.5 Vírusizolátumok
Az MDMV-t nem sokkal felefdezése után Louie és Knoke 1975-ben különböző vonalakba sorolták,
ezek az A, B, C, D, E, F, O vonalak. Ezen vírusvonalak különböztek egymástól az N20-as
beltenyésztett kukorica vonalon okozott tüneteik, valamint Acyrthosiphon pisum H., Myzus persicae
S. levéltetvekkel való átvitelük gyakoriságában. Azonban a víruspartikulumokat méretük és alakjuk
alapján nem lehetett megkülönböztetni. További kutatások során kiderült, hogy az addig MDMV-
nek vélt vonalak az SCMV alcsoport különböző tagjaji voltak. Így például az MDMV-B vonal a
cukornád mozaik vírushoz (SCMV), az O vonal pedig a fenyércirok mozaik vírushoz (JGMV)
tartozik (Shukla et al., 1989), a fennmaradó izolátumokat ma egységesen MDMV-nek nevezik.
Ezek a vírusok szerológiailag rokonságot mutatnak, azonban köpenyfehérje génjük aminoterminális
régiója alapján könnyedén megkülönböztethetők. Tosic et al. kísérletei alapján (1990) az SCMV
alcsoport tagjai különböző cirokfajtákon okozott tüneteik alapján szintén jól elkülöníthetők. A
kukorica csíkos mozaik vírusról tehát elmondható, hogy nincsenek elkülöníthető vonalai.
2.6 Vírusok elleni rezisztencia A kórokozók elleni rezisztencia több típusát különböztetjük meg. Extrém rezisztencia esetén a
vírusreplikáció a fertőzés korai stádiumában gátolt, nem jár együtt sejthalállal, míg az úgynevezett
hiperszenzitív reakció (HR) esetén valamely kórokozó eredetű elicitor hatására sejthalál következik
20
be, mely kis helyre lokalizálja a támadót, így állítva meg a fertőzés elterjedését. Vírusrezisztencia
alapulhat a replikáció gátlásán, vagy a vírus terjedési pontjainak blokkolásán. Előfordul olyan eset,
amikor nem alakulnak ki a fertőzésre jellemző tünetek, a vírus mégis kimutatható a növényből,
ekkor beszélünk toleranciáról. A kukorica genomjában természetesen is megtalálható az MDMV
rezisztenciáért felelős, Mdm1 gén, amely a hatodik kromoszóma rövid karján, az endospermium
színét meghatározó Y1 lokuszhoz kapcsoltan helyezkedik el (Scott és Louie, 1996; Simcox et al.,
1995). Az Mdm1 domináns gén a vírus hosszú távú mozgását (floém transzport) akadályozza meg.
Kutatók számos MDMV rezisztenciáért felelős gént leírtak (Simcox et al., 1995 (Mdm1);
Rosenkranz et al., 1984; Melchinger et al., 1998 (Scm1); Xu et al., 2000 (Scm2), 2000; Fuchs et al.,
1997 (Mdm2)). A legújabb kutatások eredményei - melyekkel a mikroarray technikának
köszönhetően bepillanthatunk a növényben expresszálódó gének aktivitásába - szintén
megegyeznek a tizenöt éve leírtakkal, azonban már részletesen nyomon tudjuk követni a
vírusfertőzés hatására expresszálódó géneket a növényben. Ezáltal világosabbá válhatnak az
egyszikű növények potyvírusok elleni védekezésének mechanizmusai (Użarowska et al., 2009)
A potyvírusok genetikai állománya – más RNS vírusokéhoz hasonlóan – rendkívül változékony,
a vírusgenom evolúciójában és az új gazdanövényekhez való adaptációjában központi szerepet
játszanak a mutációs, illetve az intra- és intermolekuláris átrendeződési (rekombinációs) folyamatok
(Tomimura et al., 2003). A genetikai állomány ezen plasztikussága lehetővé teszi az MDMV-vel
szemben ellenálló kukoricafajták rezisztenciájának áttörését. Tóbiás és Palkovics számolt be az
MDMV-toleráns ’Dallas’ fajtán megjelenő, az MDMV tüneteit mutató vírusbetegségről, melyről
szerológiai és molekuláris biológiai vizsgálatok során bebizonyosodott, hogy a kórokozó a kukorica
csíkos mozaik vírus volt (Tóbiás és Palkovics, 2004; Tóbiás et al., 2003). Az izolátum
köpenyfehérje régiójának nukleotid sorrendjét meghatározták, ebből következtettek a CP aminosav
sorrendjére. Arra a meglepő eredményre jutottak, hogy a ’Dallas’ fajtáról izolált vírus
köpenyfehérjéje az N-terminális szakaszon 13 aminosavból álló inszerciót hordoz, mely feltehetően
hozzájárult a toleráns fajta sikeres fertőzéséhez.
2.7 Vírusrezisztencia kiváltása molekuláris módszerekkel
A hagyományos nemesítési módszerekkel kiváltott rezisztencia nagy problémája, hogy a növényi
rezisztencia géneket nem képes célzottan bejuttatni az adott növénybe, és sok esetben nem
kívánatos tulajdonságok is átkerülnek a keresztezések során, melyeket évekig tartó szelekcióval
lehet csak kiküszöbölni. Hagyományos nemesítésen alapszik a kukorica keresztezése a kívánt
transzgént/ vagy géneket tartalmazó anyával, miután az F1 nemzedéket visszakeresztezik a szülői
vonallal (backcross), a kívánt fenotípusos tulajdonságokat mutató egyedeket ismét
21
visszakeresztezik, amíg a populáció stabilizálódik. Sajnos ezek a visszakeresztezések 6-8 évig is
eltarthatnak, ezért nem túl idő- és pénz takarékos megoldás. Ennél sokkal egyszerűbb módszer a
vírusgenom egy részének beépítése az adott növénybe, mellyel szintén kiváltható a rezisztenciát. A
növényi transzformációs rendszerek és vektorok alkalmazásával ez már számos növényfaj esetében
lehetővé vált.
A Patogéntől Származtatott Rezisztencia (PDR) fogalmának meghatározása 1985-ből,
Sanfordtól és Johnsontól ered. E megfogalmazás szerint a gazdanövényben expresszálódó vírus
génjének, génszakaszának RNS transzkriptuma, illetve génterméke a víruseredetű komponensek
természetes egyensúlyát megváltoztathatja. Így a vírus replikáció, valamint a vírus növényen belüli
terjedése megakadályozható, illetve megzavarható, ami a növény enyhített vagy elmaradó fertőzését
eredményezi.
A növénykórtanban jól ismert a keresztvédettségi reakció, amelyet a gyakorlati
mezőgazdaság számos esetben alkalmaz sikerrel (visszaszorítva a vad típusú vírus által okozott
betegségtüneteket illetve a vírus replikációját). A gyengített vírustörzzsel kialakított klasszikus
keresztvédettség jelenségét először McKinney írta le 1929-ben. TMV (Tobacco mosaic virus)
gyengített törzsével történő fertőzés esetén azt tapasztalta, hogy a későbbi vírustámadásnál a
növény a vírus más izolátumaival szemben is rezisztens volt. A molekuláris biológiai módszerek
fejlődésével lehetőség nyílt a növénykórtanban jól ismert keresztvédettségi reakció kialakítására,
hatékonyabb és biztonságosabb módon, a gyengített vírus által hordozott kockázati tényezők nélkül.
Az első vírusrezisztens transzgénikus növényekbe általában a köpenyfehéréjét kódoló
szakaszt használták a rezisztencia kiváltására, mert a köpenyfehérjének tulajdonították a
keresztvédettségben megfigyelt ellenállóság kialakulását.
Az első vírusellenállósági kísérletben a kutatók (Powell-Abel et al., 1986) karfiol mozaik
vírus (CaMV) 35S promóterrel és polyA régióval ellátott dohány mozaik vírus (TMV) CP génjét
építettek be dohányba és paradicsomba. A transzgénikus növényekből származó fehérjekivonat 0.1
%-ban tartalmazta a vírus köpenyfehérjét. TMV-vel történő mesterséges fertőzés során a CP-t
szintetizáló növényeken késéssel jelentkeztek a tünetek, illetve egy részük tünetmentes is maradt. A
rezisztenciát a hasadó utódpopulációkon is ki tudták mutatni. 1986 óta számos esetben hoztak létre
CP által kiváltott védettséget a világ laboratóriumaiban mintegy 16 vírusnemzetség különböző
tagjaival szemben, több gazdaságilag fontos növényfaj esetében (Józsa és Balázs, 2000). A
védettség mértéke függ az adott vírustól, az inokulum koncentrációjától és a transzformált növényi
vonaltól. A rezisztencia szintje azonban változó: a szimptómák kifejlődése időben késhet, a
megjelenő tünetek lehetnek enyhébbek, előfordulhat alacsonyabb vírusszám, létrejöhet felépülési
reakció („recovery”: amikor a növény elsődlegesen fertőződik, azonban a később megjelenő fiatal
levelek már tünet- és vírusmentesek).
22
A köpenyfehérje mellett gyakran használják rezisztencia kiváltására a vírusok mozgási
fehérje (MP) génjeit (Tacke et al., 1996), valamint a replikázkomplex komponenseinek génjeit.
A köpenyfehérje vagy más vírusfehérjék által kialakított rezisztencia vizsgálatok során
számos esetben tapasztalták azt a jelenséget, hogy a rezisztencia a fehérje jelenlétének hiányában is
kialakul (Mueller et al., 1995). Ez alapján arra következtettek, hogy a védettséget a transzgénről
átíródó RNS váltja ki.
Az RNS silencing egy szekvenciaspecifikus géninaktivációs rendszer, amelynek természetes
szerepe sokrétű: a genom védelme, a heterokromatin kialakulásának szabályozása, a génexpresszió
szabályozása, és antivirális védelem (Lesika et al., 2004).
A PTGS-ről azt feltételezik, hogy a növények vírusok és transzpozonok elleni védelmére
alakult ki (Voinnet et al., 1999). Állati szervezetekben is leírtak a PTGS-hez nagyon hasonló
folyamatot, amelyet RNS interferenciának (RNAi) neveztek (Dalmay et al., 2000). A központi
szerepet mindkettőben duplaszálú (ds) RNS-ek játsszák, amelyek általában nem fordulnak elő az
eukarióta sejtekben. Ezek a molekulák a folyamat elindítói, melynek következő lépésében a dsRNS-
eket egy dsRNS specifikus ribonukleáz (Dicer) hasítja rövid, 21-25 nt hosszúságú darabokra.
Mindazokban a növényekben, amelyekben a PTGS aktív, detektálhatóak ezek a kis RNS-ek,
amelyeket más néven rövid interferáló (short interfering, si-) RNS-eknek is neveznek (Lesika et al.,
2004). A siRNS-ek beépülnek az ún. RNS-indukált silencing komplexbe (RISC), amely azután
szekvencia-specifikus endoribonukleázként az egyszálú RNS célszekvenciát hasítani fogja. A
folyamat során egy mobilis silencing szignál képződik, amely a szomszédos sejtekben is aktiválja
az RNS géncsendesítést. Ez a szignál feltételezések szerint maga a siRNS szabad vagy
fehérjekomplex formában (Hamilton és Baulcombe, 1999).
Minden olyan vírus, amely kettősszálú RNS intermedieren keresztül replikálódik, aktiválja a
PTGS-t a növényekben. Evolúciójuk során ennek a mechanizmusnak a közömbösítésére a vírusok
silencing szupresszorokat fejlesztettek ki, amelyek a folyamatot annak különböző pontjain
gátolhatják. Ezt bizonyították a potyvírusok HC-Pro-ja, a tombusvírusok p19 fehérjéje (Silhavy et
al., 2002), és a closterovírusok p21-e esetében (Reed et al., 2003).
A transzgén eredetű vírusspecifikus dsRNS-k expresszálódása a valós vírustámadáshoz
hasonlóan aktiválja a növényi PTGS-t, azonban ilyenkor nincs jelen a vírus PTGS szupresszora,
ezért a folyamatot semmi nem gátolja. Fertőzéskor az aktiválódott védekezőrendszerrel bíró sejtben
a RISC azonnal képes a homológ szekvenciával rendelkező vírust specifikusan hasítani. Ez a
magyarázata annak, hogy a dsRNS-t expresszáló transzgén konstrukciók alakítanak ki a
leghatékonyabban vírusrezisztenciát, illetve inaktiválnak géneket, ezt több kísérletben is
bizonyítottak (Baulcombe, 1996; Ratcliff et al., 1997; Smith et al., 2000).
23
2.7.1 A vírusgének transzgénként való felhasználásának kockázati tényezői, valamint a
vírusok genetikai változékonyságának forrásai
A köpenyfehérje gént transzlálódó formában tartalmazó növényekben egy rokon vírustörzs
felülfertőzése során kialakulhat a heteroenkapszidáció, vagy komplementáció jelensége, amikor a
felülfertőző vírus RNS-ét a transzgénből származó CP csomagolja be részben vagy egészben (Fuchs
és Gonsalves, 2007). Kockázatot jelenthet, ha a transzgénről keletkező CP egy eredetileg vektorral
nem terjedő vírus RNS-ének becsomagolásával a vírus ilyen módon való terjedését lehetővé teszi. A
kockázat jelentősen csökkenthető csonkított köpenyfehérje gén beépítésével, amely nem
tartalmazza a köpenyfehérje DAG motívumának kódját.
A mutáció jelensége nagyon gyakori az RNS vírusok világában, mivel az RNS függő RNS
polimeráznak nincs nukleáz aktivitása, így nem rendelkezik hibajavító mechanizmussal. Az RdRp
átlagos tévedése 10-4, ez 10 kilobázisonként egy tévedést jelent. Ennek oka az, hogy az RNS-
polimeráz működéséhez nem igényli a bázispárosodást, tehát kevéssé függ a primer jelenlététől.
Tehát a mutáció nagyon fontos forrása az RNS vírusok genetikai változékonyságának. Suranto et al.
(1998-Krish izolátum) írtak le egy JGMV izolátumot, amely a köpenyfehérje gén N-terminálisán
található mutáció következtében áttörte az addig rezisztens cirok védelmi vonalát. Tóbiás és
Palkovics számolt be az MDMV-toleráns ’Dallas’ fajtán megjelenő, az MDMV tüneteit mutató
vírusbetegségről, melyről szerológiai és molekuláris biológiai vizsgálatok során bebizonyosodott,
hogy a kórokozó a kukorica csíkos mozaik vírus volt (Tóbiás és Palkovics, 2004; Tóbiás et al.,
2003).
A következő kockázati tényező, és egyben a vírusok genetikai változékonyságának egyik
legfőbb forrása a transzgén RNS és a felülfertőző vírus RNS közötti rekombináció lehetősége. A
vírusok közti természetes rekombináció ismert jelenség, hiszen egy fertőzött növényben gyakran
egyszerre több vírustörzs van jelen. Revers et al. (1996) a CP+3’UTR-t vizsgálva azt találták, hogy
a természetes rekombináció az általuk vizsgált 8 faj közül a PVY-ra a legjellemzőbb. SCMV
esetében több alkalommal találtak rekombinációs helyeket a genomban, különböző inter-és
intramolekuláris átrendeződéseket (Zhong et al., 2005; Achon et al., 2007). Achon et al. (2007)
MDMV köpenyfehérje génjét vizsgálva nem találtak rekombinációs helyeket.
A transzgénikus növények és vírusok közti rekombináció kockázata két tényezőből, a
rekombinációs gyakoriságból és a rekombináció által okozott veszélyből (pl. súlyosabb betegség
kialakításának képessége) tevődik össze. A rekombinációs gyakoriság becslésére Dietrich et al.
(2007) transzgénikus és nem transzgénikus növényeket fertőztek egy-, illetve kétféle vírussal.
Összesen 560 növényt megvizsgálva 4 héttel az inokulálás után egyetlen rekombináns potyvírus
szekvenciát sem találtak, így arra a következtetésre jutottak, hogy a rekombináció gyakorisága
24
nagyon alacsony. A kétféle típusú fertőzés azonban nem egyenrangú, mert míg a transzgénikus
növényben a vírus eredetű szekvencia minden sejtben jelen van, a természetes kettős fertőzés esetén
a két vírus majdnem teljesen szeparáltan is jelen lehet (Dietrich és Maiss, 2003).
Szabadföldön évek óta termesztett, köpenyfehérjét expresszáló különböző növényfajok (tök,
papaya, szőlő) vizsgálatai alapján azt a következtetést vonták le, hogy a beépített, vírusrezisztenciát
kialakító konstrukciók nem jelentenek nagyobb környezeti kockázatot, mint egy természetes kevert
vírusfertőzés (Fuchs és Gonsalves 2007). A biológiai biztonság szempontjából azonban
legalkalmasabbnak a PTGS-en alapuló vírusrezisztencia létrehozása tűnik, mivel ennek során nem
képződik fehérje, és RNS sem halmozódik fel, így a felülfertőző vírussal történő esetleges
rekombináció valószínűsége igen csekély (Aziz és Tepfer, 1999).
2.8 Fertőzőképes, teljes hosszúságú cDNS klónok használata
A fertőzőképes cDNS klónok lehetővé teszik az RNS vírusok, így a Potyvírusok genetikájának
vizsgálatát inszerciós, deléciós mutánsok, mutagenezis és komplementációs kísérletek segítségével.
A potyvírusok genomszerkezetének pontos feltárása a vírusok nukleotid szekvenciájának
ismeretével és a vírus RNS komplementer DNS-éről (cDNS) szintetizálódó fertőzőképes
transzkriptumok létrehozásával vált lehetővé. Míg egy-egy kevert fertőzésből eredő adatok is fontos
segítséget nyújthatnak a vírusok patológiájának molekuláris szintű tanulmányozására, addig a
fertőzőképes cDNS klónokkal irányítható, célzott folyamatokba nyerhetünk betekintést. Bár a
vírusok patológiájáról az elsődleges szerkezet, valamint a másodlagos RNS szerkezet is szolgáltat
információt, alaposabb vizsgálathoz kiméra vírusokra van szükség, amelyeket fertőzőképes cDNS
klónok segítségével állíthatunk elő.
Fertőzőképes cDNS klónokat kutatók már sok esetben sikeresen előállítottak (PPV Maiss et
al., 1992; LMV Yang et al., 1998; TuMV Sánchez et al., 1998; ZYMV Gal-on et al., 1991; PsbMV
Johansen, 1996), azonban a mai napig vannak bizonyos potyvírusok, melyek cDNS klónjaival
hosszú évekig tartó kísérletezés után sem tudtak fertőzést előidézni. Ennek okai a lehetnek a
következők: A poliadenilációs szignál megléte, vagy rövidsége, egy-két bázis hibás a vírus 5’
végén, az inszerciók a vírusgenom instabilitását okozhatják, DNS minősége és mennyisége, a
gazdanövény, az inokulálás típusa (manuális, Agrobaktérium közvetített, belövéses).
A fertőzőképes cDNS klónokkal létrehozott mesterséges vírus kimérákkal az is vizsgálható, hogy a
vírusszekvenciát hordozó transzgénikus növény rezisztenciája áttörhető-e rekombináns genommal
rendelkező vírus által.
25
26
3 ANYAG ÉS MÓDSZER 3.1 Vírus izolátumok gyűjtése és felszaporítása
Mintáinkat négy egymást követő évben (2006-2009), két földrajzilag jól elkülönülő területről, a
szegedi Gabonatermesztési Kht. tenyészkertjéből kukoricáról (Zea mays L. convar. dentiformis, Zea
mays L. convar. saccharata), fenyércirokról (Sorghum halepense (L.) Pers) és szemes cirokról
(Sorghum bicolor (L.) Moench), valamint martonvásári tenyészparcellákról kukoricáról (Zea mays
L. convar. dentiformis, Zea mays L. convar. saccharata), fenyércirokról (Sorghum halepense (L.)
Pers) gyűjtöttük.
A tüneteket mutató levélmintákat 0,02 M nátrium-foszfát-pufferben (pH 8) homogenizáltuk,
celittel elkevertük és a kapott présnedvvel a növényeket bedörzsöltük. Korábbi irodalmi adatok
alapján (Kovács et al., 1997) 2-3 leveles fejlettségi stádiumban lévő csemegekukoricát (Zea mays L.
convar. saccharata ’Honey’) használtunk inokuláláshoz. A levélmintákat további feldolgozásig -70
°C-on RNAlater oldatban (Ambion) tároltuk.
3.2 Pollen-életképesség vizsgálat
A fitotron kamrában nevelt MDMV fertőzött és kontroll kukorica növények pollen-
életképességét FDA festéssel vizsgáltuk. A fluoreszcein diacetát képes átjutni a sejtmembránokon,
miközben intracelluláris észterázok lehasítják róla a diacetát csoportot. Az ép membránnal
rendelkező sejtekben felhalmozódik a fluoreszcein, így jelzi a sejtek életképességét. A növények
címeréből anthérákat szedtünk, melyekből kipreparáltuk a pollent. A mikrospórákat 0,04 µg ml-1
FDA koncentrációjú 0,3M mannitol oldatban vizsgáltuk (Widholm, 1972; Bakos et al., 2008).
3.3 Vírus partikulum tisztítás elektronmikroszkópos vizsgálathoz
A növényanyagot a fertőzéstől számított 14. napon vizsgáltuk, ilyenkor nagyon erőteljes a vírus
replikáció, ezáltal sok partikulum található a szövetekben (Jones és Tolin, 1972).
1. 500 mg fertőzött kukoricalevél eldörzsölve 2 ml 0,2 M pH5,2 nátriumacetát pufferben, 0,1%
merkaptoetanol hozzáadásával.
2. 30 perc inkubáció jégen.
3. Centrifugálás (10 perc, 14000 rpm ).
4. Felülúszóhoz 300 µl 40%-os polietilén-glikol (PEG), valamint 1M nátrium-klorid
hozzáadása, vortex.
27
5. 30 perc inkubáció jégen.
6. Centrifugálás (10 perc, 14000 rpm ).
7. Üledék beszárítása, feloldása 50 µl 0,01 M, pH 5,5 nátriumacetát pufferben.
8. A grid 10 µl feloldott üledékbe helyezése, 2 perc inkubáció, majd leitatás szűrőpapírral.
9. Háromszori desztillált vizes mosás, leitatás szűrőpapírral.
10. Kontrasztfestés (10 másodperc) 1%-os uranilacetáttal, szárítás (1 óra).
3.4 Molekuláris vizsgálatok 3.4.1 Mintafeldolgozás-RNS kivonás-Reverz transzkripció
A levelekből Qiagen RNeasy Plant Mini Kittel RNS-t vontunk ki, a kiindulási mennyiség 100
mg volt. A kinyert RNS minőségét gél-elektroforézissel ellenőriztük, mennyiségét pedig
spektrofotometrikus úton határoztuk meg, majd a Fermentas cég RevertAid First Strand cDNA
Synthesis kitjével (M-MuLV-reverz transzkriptáz), oligo dT18 nukleotid primerrel reverz
transzkripciót végeztünk. A reakcióelegyet a gyártó ajánlása szerint állítottuk össze.
A teljes hosszúságú klón esetében az átírandó szekvenciák hosszúsága miatt a cDNS
RibonukleázH (Ambion) kezelése után, a reverz transzkripciót az Invitrogen cég Superscript III RT
enzimével a gyártó ajánlása szerint végeztük.
3.4.2 Polimeráz láncreakciók
Az egyszálú cDNS-ből a PCR primer pár (MDMV 8198 fwd 5’ AAA CCG GTG GYT RCT
YGA ART GC 3’; MDMV3'- 5’ ATC CTA GGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT
GTC 3’ ) a 3’ nem kódoló régiót, a köpenyfehérjét kódoló régiót és az NIb mintegy 323 bp
hosszúságú szakaszát szaporította fel (~1317 bp).
A polimeráz láncreakcióhoz egységesen 40:1 arányú Taq:Pfu polimeráz enzimkeveréket
használtunk. A PCR profil 35 cilklusú, egyfázisú (30 másodperc denaturálás 94°C, 30 másodperc
primerek kötődése 56°C, 1 perc 45 másodperc szintézis 72°C).
A teljes genomot lefedő PCR-hez használt primereket a 2. számú táblázat foglalja össze. A
klónozott vírus fragmentumok szekvenálását a Biomi Kft. végezte, M13 forward, M13 reverse és az
amplifikáló primerekkel.
28
2. Táblázat Az MDMV teljes hosszúságú nukleotid sorrendjének meghatározására, a CP cDNS-
klónokhoz, valamint a teljes hosszúságú klón elkészítéséhez használt primerek összefoglaló
táblázata.
Primer neve Primer szekvencia MDMV-Mv0801-4105-for ACCAGGAAGGGAGTGTGAGTTC
MDMV-Mv0801-4446-rev TTATCAACATCCAATTCAGCCG
MDMV-Mv0801-3375-for CAATTCTGAGCACAGTCGAACA
MDMV-Mv0801-3541-rev CACATCATTGCTGAAGGTGTCC
MDMV-Mv0801-6644-for CCAGAAGACTTCAACGCATACC
MDMV-Mv0801-6800-rev TGCTCTGTGACGTCGAATGATA
MDMV-33for ACACGACCAAACACAACCAA
MDMV-324for CGGTTCAACCAAAGAAGTG
MDMV-1147for CATCAAGGCTAGATGCACACC
MDMV-1986for GACTTGGTAAGTGGCCCAAA
MDMV-2751for GGCGTGTGTACAAGGACAAG
MDMV-3704for GCACATTCGCAAATTGAGA
MDMV-4595for GAGATACCAGCTATGATAG
MDMV-5487for CAGGCGGTCTACTGATGCT
MDMV-6220for CTTAATCACTCCTGCACACC
MDMV-7318for GCTTGGAATTTGGAATGGGTC
MDMV-8198for AAACCGGTGGYTRCTYGAARTGC
MDMV5’ ATACCGGTAAAACAACAAGACTCAACACAAC
MDMV-324rev CACTTCTTTGGTTGAACCG
MDMV-1147rev GGTGTGCATCTAGCCTTGATG
MDMV-1986rev TTTGGGCCACTTACCAAGTC
MDMV-2751rev CTTGTCCTTGTACACACGCC
MDMV-3704rev TCTCAATTTGCGAATGTGC
MDMV-4595rev CTATCATAGCTGGTATCTC
MDMV-5487rev AGCATCAGTAGACCGCCTG
MDMV-6220rev GGTGTGCAGGAGTGATTAAG
MDMV-7318rev GACCCATTCCAAATTCCAAGC
MDMV-8205rev AGCAGCCACGCAATAGAACTT
MDMV3’ ATCCTAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCA
MDMV-Szgd5-988for CATGGCCTTGTTAGAGATTCTTTT
MDMV-Szgd5-1514for TTGTCTGGGGAAAGAGAGAGTATC
MDMV-Szgd5-1937for GTGAACGAAGATTCAGCCAAAG
MDMV-Szgd5-2161for TTAATTCAACAGATGACAATTCTAGAGAAAG
MDMV-Szgd5-3155for ATACACGCAAAGTTGCTCAAGA
MDMV-Szgd5-3433for ACCTTTTCCACGTATTGATTTCAC
MDMV-Szgd5-4154for TTCTCTACGCAACATCCAGTTG
MDMV-Szgd5-4266for CAACATTCTGGTTTATGTGGCTAG
MDMV-Szgd5-5952for TGACTCCACACGAACCATTAAG
MDMV-Szgd5-6798for GCGCTTTTAAAACAGCAAAACT
MDMV-Szgd5-8049for AACTTTGGTTCATGTCAACACG
MDMV-Szgd5-8412for ATCAAGCCGGCGAGAATGTTG
MDMV-Szgd5-5952for TGACTCCACACGAACCATTAAG
MDMV-Szgd5-4154for TTCTCTACGCAACATCCAGTTG
29
MDMV-Szgd5-8049for AACTTTGGTTCATGTCAACACG
MDMV-Szgd5-3098rev GCACTTCATTTATCTCCTTTTCGTA
MDMV-Szgd5-4538rev CACCATAAGATATGCTCACTTTGC
MDMV-Szgd5-6380rev ATGGAGGAAAGTCTTTGGGG
MDMV-Szgd5-6998rev CTTCCTCGTGCGTTGATAGGTA
MDMV-Szgd5-7042rev ACTCTTGTCGTATTTGCCCATAA
MDMV-Szgd5-7167rev ACATTGCGTAGGAGTTGGATG
MDMV-Szgd5-7533rev ATCTGTTCCAACCACCATAAAACT
MDMV-Szgd5-8141rev AAACTTTAGCACCAGTGTATAGGTTTCTAAG
MDMV-Szgd5-2519for CAGATGACAATTCTAGAGAAAGCTTC
MDMV-Szgd5-9157rev TGCTGCAGCCTTCATCTGCATG
MDMV-Szgd5-SalI-4759for GTCGACTTTCACCATTTATCATGTCTGA
MDMV-Szgd5-SalI-4759rev CAGCTGCTCAAACTGCATCATAGTTCTC
MDMV-Szgd5-8358rev GTCGTGCATAAACATTCAATTCAT
MDMV-Szgd5-8145rev GATATTGAGGGATTAGTGATCGATC
MDMV-Szgd5-9264rev AGTGTATGTTGCGACTAACGTCAC
MDMV-Szgd5-2465for GCACAACTAGAAGCTCTAGCAAAA
MDMV-Szgd5-2553rev TCAAGCCCATTACAGCTAATTTCA
Uni-dN6 GCCGGAGCTCTGCAGAATTCNNNNNN
MDMV-8457Sz1rev CCATGGTTCTTGAAATGCAACCCTTCG
MDMV-CP-8385for ATATAARGATTTGCTCCATGA
MDMV-CP-9357rev ATACCGGTAAAACAACAAGACTCAACACAAC
MDMV6716fwd AATCCAAATTTRATATCYTGG
PolyT2 CGGGGATCCTCGAGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT
MDMV8158for ATATAARGATTTGCTCCATGA
Adapter_AgeI-XmaJIFor
(EcoRI,AgeI,StuI,DraI,NheI,ApaI,KpnI,XmaJI,BamHI)
TTG AAT TCT TTT TTT ACC GGT TTT TTT TAG
GCC TTT TTT TTT AAA TTT TTT TGC TAG CTT
TTT TGG GCC CTT TTG GTA CCT TTT TTT CCT
AGG TTT TTT GGA TCC TTT TT
Adapter_AgeI-XmajIrev
AAA AAG GAT CCA AAA AAC CTA GGA AAA AAA
GGT ACC AAA AGG GCC CAA AAA AGC TAG CAA
AAA AAT TTA AAA AAA AAG GCC TAA AAA AAA
CCG GTA AAA AAA GAA TTC AA
35S_5'_AgeI ACC GGT AGA TTA GCC TTT TCA ATT TCA GAA
AGA AT
35S_3'_StuI ATA GGC CTC TCC AAA TGA AAT GAA CTT CCT
TAT ATA GA
MDMV5'_DraI TTT AAA AAC AAC AAG ACT CAA CAC AAC ACA
ACC AAA
NOS5'_KpnI TCG AGG TAC CGA TCG TTC AAA CAT TTG G
NOS3'_XmaJI ATC CTA GGG ATC TAG TAA CAT AGA TGA CAC
CG
polyA50_ApaI-KpnIfor
TTG GGC CCA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA
AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AGG
TAC CTT T
PolyA50_ApaI-KpnIrev
AAA GGT ACC TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT
TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTG
GGC CCA A
30
A teljes hosszúságú klón esetében a szekvenciák hosszúsága miatt a ROCHE cég Expand Long
Template enzim keverékét használtuk. A teljes vírusgenomot két részletben szaporítottuk fel. Az
első szakasz az 5’-4446-ig (4446bp), a második szakasz 4105-poly adenilációs szignálig tart
(5400bp). A reakció mindkét esetben kétfázisú, az első 10 ciklus (15 másodperc denaturálás 94 ºC-
on, 30 másodperc primer kötés 55 ºC-on, 3 perc 45 másodperc szintézis 68 ºC-on) után a maradék
20 ciklusra a polimerizációs időt minden ciklusban 10 másodperccel növeltük.
A csonkított MDMV köpenyfehérjegént tartalmazó konstrukció előállításához használt
primereket a 3. táblázat foglalja össze.
3. Táblázat Az MDMV rezisztencia kiváltására alkalmas konstrukció előállításához használt
primerek szekvenciáinak összefoglaló táblázata.
Primer neve Primer szekvencia Act1ifwd_PstI CTGCAGGTAACCACCCCGCG
Act1irev_EcoRI GAATTCCTACAAAAAAGCTCCG
ModpolyT2_SmaI_HindIII CGGCCCGGGTCGAGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT
dMDMV-CPfwd_XbaI_KpnI_EcoRI TTTCTAGAGGTACCCGAGCAACCAGGGCTGAATTCG
MDMVCP_fwd_XbaI_EcoRI TTTCTAGACGAGCAACCAGGGCTGAATTCG
Ubi_SpeI_fwd ATACTAGTGTGCAGCGTGACCC-
Ubi_AgeI_rev ACCGGTTGAAGCGGAGGT
A rezisztencia kiváltására alkalmas konstrukció elkészítésének részletes leírása az Eredmények és
megvitatásuk részben található.
3.4.3 A köpenyfehérje gének klónozásának lépései
A PCR-rel felszaporított és gélből visszaizolált DNS fragmentumokat pLitmus28i (2823 bp,
New England BioLabs) vektor AgeI-XmaJI klónozó helyére illesztettük be, a vektort minden
esetben foszfatázzal kezeltük (fermentas-SAP-Shrimp Alkaline Phosphatase). A klónozások során a
Fermentas cég restrikciós endonukleázait használtuk. A ligátumokat Escherichia coli TOP10
(Invitrogen) kompetens sejtekbe transzformáltuk, majd kék-fehér szelekcióval választottuk ki az
inszertet tartalmazó klónokat. A valóban pozitívnak bizonyult minták bázissorrendjét M13for és
M13 rev primerekkel meghatároztuk.
3.4.4 Transzformációs módszerek
31
Az E. coli sejtek transzformálását Inoue módszere szerint végeztük (1990). A kompetens sejt
szuszpenzió 50µl-enkét folyékony nitrogénben fagyasztottuk, majd -70 ºC-on fagyasztva tároltuk.
Transzformáció után a sejteket folyékony SOC táptalajban egy órán keresztül 37 ºC-on 200 rpm-en
rázattuk, majd a szelekciós markernek megfelelő antibiotikummal kiegészített szilárd LB táptalajra
szélesztettük. Amennyiben a vektor konstrukció a kék-fehér szelekciót lehetővé tette, a szilárd
táptalajra 10µl 1 M izopropil-tio- β-D-galaktozidot (IPTG) és 40µl 20mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-
indolil-β-D-galaktozidot (X-gal) szélesztettünk. Ezt követte egy egész éjszakás, 37 ºC-on végzett
inkubácó. A TOPO-XL, illetve TOPO-TA vektorral való transzformálások esetében nem volt
szükség kék-fehér szelekcióra, mert ezek a vektorok tartalmazzák a ccdB gént a LacZ fragment C-
terminális részén. Ha a kívánt szekvencia beépül, elrontja az amúgy letális ccdB gént, ennél fogva
csak a sikeresen ligálódott vektorokat tartalmazó baktériumok képesek életben maradni.
A pAHC20-UbiCPiPC növényi transzformációs vektort Höfgen és Willmitzer (1988) módszere
alapján juttatuk be Agrobacterium tumefaciens sejtekbe, annyi módosítással, hogy csak egy napot
növesztettük szilárd táptalajon, valamint az antibiotikum koncentrációt többszörösére emeltük, a
baktérium (Agl1) alacsony antibiotikum érzékenysége miatt.
3.5 A klónozások során használt vektorok, baktériumok és táptalajok 3.5.1 A kukorica csíkos mozaik vírus klónozása során alkalmazott vektorok
A filogenetikai vizsgálatok során az MDMV köpenyfehérje génjét pLitmus28i (New England
BioLabs) vektorba klónoztuk. A klónozásokhoz használt vektorokat a 4. táblázat foglalja össze.
Az MDMV csonkított köpenyfehérje génjét tartalmazó konstrukció elkészítéséhez pLitmus28i
(New England BioLabs), pBluescriptKSII+ (Fermentas), pAct1F (McElroy et al., 1991) valamint
pAHC20 (Christensen et al., 1996) vektorkat használtunk.
A teljes hosszúságú MDMV klón előállításához a PUC19 (Fermentas), TopoXL
(Invitrogen), TopoTA (Invitrogen) plazmidokat alkalmaztunk.
A klónozásokhoz szükséges NOS terminátort (nopaline synthase terminator) és a CaMV
(Cauliflower mosac virus) 35S promoterét a pGWB402 (Nakagawa et al., 2007) vektorból PCR
segítségével szaporítottuk fel.
4. Táblázat: A klónozások során használt vektorok összefoglaló táblázata.
Vektor neve Eredet
pGWB402 (11685bp) Nakagawa et al., 2007
PUC19 (2686bp) Fermentas
32
pLitmus28i (2823 bp) New England BioLabs
pBluescriptKSII+ (3kb) Fermentas
pAHC20 (6kb) Christensen et al., 1996
pAct1F McElroy et al., 1991
TopoXL (3500bp) Invitrogen
TopoTA (3900bp) Invitrogen
3.5.2 A klónozások során használt baktériumtörzsek és táptalajok
A klónozások során E.coli Top10 hőkompetens (Invitrogen), E.coli JM109 hőkompetens, valamint
A. tumefaciens Agl1 törzseit használtuk. Az Escherichia coli transzformációkhoz LB (Lauria-
Bertani) és SOC táptalajokat, az Agrobacterium tumefaciens-el végzett munkákhoz YEB (Yeast
Extract Broth, Sambrook et al., 1989) táptalajt használtunk.
YEB-táptalaj (1000ml):
Bacto-yeast extract 1 g
Marhahús kivonat 5 g
Kazein hidrolizátum 5 g
Szacharóz 5 g
Agar (Bakterológiai) 15 g
pH 7,2
(Vervliet et al., 1975)
LB táptalaj:
Bacto-tryptone 10 g
Bacto-yeast extract 5 g
NaCl 10 g
pH 7,2
SOC táptalaj:
Bacto-tryptone 20 g
Bacto-yeast extract 5 g
1M NaCl 10 ml
1M KCl 2,5 ml
1M MgCl2 10 ml
33
1M MgSO4 10 ml
2M glükóz 10 ml
pH 7
A táptalajonkban használt antibiotikumok végkoncentrációi:
Ampicillin (E.coli) 150 mg/l
Kanamicin (E. coli) 50 mg/l
Ampicillin (A. tumefaciens) 400 mg/l
Rifampicin (A. tumefaciens) 150 mg/l
3.5.3 A kompetens sejtek elkészítése
A hőkompetens E.coli sejteket Inoue (1990), az A. tumefaciens sejteket pedig Höfgen és Willmitzer
(1988) módszere alapján készítettük el.
3.6 Bioinformatikai vizsgálatok 3.6.1 Nukleotid sorrend összehasonlítás és filogenetikai vizsgálatok
A CP gének elsődleges szerkezetének adataiz BioEdit Sequence Alignment Editor programmal
értékeltük ki, majd illesztettük a következő vizsgálatokhoz. A nukleinsav, illetve az in silico
következtetett CP aminosav szekvencia adatokból ClustalX2.0.9 programmal elkészítettük a
rokonságot jellemző törzsfát. A három különböző számítási módszerrel (neighbour-joining-NJ;
Maximum parsimony-MP; maximum likelihood-ML) azonos eredményeket kaptunk, ezért a
rokonsági viszonyokat jellemző törzsfát az NJ módszer eredményei alapján állítottuk össze. A
filogenetikai vizsgálatok során a statisztikai megbízhatóságot a Clustal X program 1000 ismétlést
alkalmazó bootstrap analízise biztosította. A törzsfát NJplot (Perriére és Gouy, 1996) programmal
jelenítettük meg.
Az MDMV rokonsági körének átlagos diverzitását és genetikai távolságát (p-distance)
MEGA 4.0.2 programmal számítottuk ki (Kumar et al., 2008). A törzsfán szereplő szekvenciák
hivatkozási számai megtalálhatóak a 6. számú mellékletben.
3.6.2 Rekombinációs vizsgálatok
Az általunk izolált és a nemzetközi adatbankokban megtalálható MDMV szekvenciákra
épülő rekombinációs vizsgálatokhoz a TOPALi v2 (Milne et al., 2004) programcsomag PDM
34
(Probabilistic Divergence Measures) analízisét, valamint a RDP3 v.3.44 (Recombination detection
program, Martin et al., 2005; Heath et al., 2006) alkalmaztuk (ablak méret =500 nt, ablak
elmozdulásának mérete =50 nt) 95%-os szignifikancia szinten.
3.6.3 RNS másodlagos szerkezet vizsgálatok
Az RNS másodlagos szerkezet, és RNS stabilitás vizsgálatokhoz ViennaRNA (Hofacker et al.,
1994), NUPACK (Dirks és Pierce, 2004) és UNAFold (Markham, és Zuker, 2008) programokat
használtunk.
35
36
4 EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 4.1 Kukorica csíkos mozaik vírus izolátumok gyűjtése és tüneteinek vizsgálata
Mintáinkat Martonvásáron és Szegeden, kukoricáról (Zea mays L. convar. dentiformis, Zea
mays L. convar. saccharata), fenyércirokról (Sorghum halepense (L.) Pers) és szemes cirokról
(Sorghum bicolor (L.) Moench) gyűjtöttük.
A szántóföldről gyűjtött, különböző tüneteket mutató kukorica levélminták nedvével inokulált
csemegekukoricán (Zea mays L. convar. saccharata, „Honey”) nem mutatkoztak eltérő tünetek,
ebből arra következtethetünk, hogy MDMV esetében inkább a gazdanövény valamint a környezeti
tényezők felelősek a különböző tünetek kialakításáért, mint a vírus köpenyfehérje génjének apróbb
eltérései vagy a földrajzi elhelyezkedés (8-9. ábra). A 8-9. ábrán látható kukoricákat fertőző
izolátumok: Mv0804, Mv0813, Sz0815, Mv0816.
A négy év során gyűjtött mintáinkból összesen nyolcvanhat esetben (5. táblázat) sikerült az
MDMV jelenlétét kimutatni PCR módszer segítségével.
5. Táblázat: 2006-2009 időszakban gyűjtött MDMV izolátumok. A +jelölés az MDMV pozitív
mintákat jelöli.
Gyűjtött minták száma Martonvásár
MDMV +
Gyűjtött minták száma Szeged
MDMV +
2006 21 4 12 12
2007 12 7 10 10
2008 17 17 15 15
2009 12 12 10 9
Összesen 62 40 47 46
SCMV és SrMV specifikus primerekkel azonban egyik évben sem sikerült vírust kimutatni, ez az
eredmény teljesen megegyezik Achon et al. (2007) és Oertel et al. (1997) megállapításaival,
miszerint Németországban az SCMV a dominánsan elterjedt egyszikűeket fertőző vírus, míg a többi
európai országban az MDMV az uralkodó.
37
8. ábra
A négy év alatt gyűjtött MDMV fertőzések tüneti különbségei szántóföldi körülmények között,
kukoricán (Zea mays L. convar.dentiformis)
38
9. ábra
A négy év során gyűjtött, szántóföldön eltérő tüneteket mutató MDMV izolátumok szimptómái
fitotroni kamrában nevelt csemegekukoricán (Zea mays L. convar. saccharata)
39
4.2 Pollenéletképesség vizsgálat
A fitotron kamrában nevelt, MDMV fertőzött és kontroll kukorica növények pollen-
életképességét FDA festéssel vizsgáltuk. A pollenéletképességet százalékosan nem lehetett
kiértékelni, mert az MDMV fertőzött növény mikrospóráinak csak a sejtfala volt látható, életképes
pollent egyáltalán nem lehetett detektálni. A mikroszkópos felvételt a 10. ábra mutatja be.
A vírusfertőzött kukoricák az internóduszok megrövidülése miatt fele olyan magasak voltak,
mint a kontroll növények, címerük két héttel később fejlődött ki, és negyed akkora méretű volt. Az
MDMV fertőzött kukoricák címereiből csak preparálással tudtuk kinyerni a mikrospórákat.
Irodalmi adatok alapján elmondható, hogy eddig nem vizsgálták az MDMV, vagy bármely más,
egyszikűeket fertőző potyvírus ferőzésének hatását a gazdanövény pollentermelő - illetve pollen -
életképességére.
10. ábra
Fluoreszcein diacetáttal (FDA) festett kukorica pollenek
A: Kontroll. B: MDMV fertőzött.
Az FDA festés után jól látható, hogy az antherákból kipreparált kontroll pollenek,- melyek
mindkét esetben fitotroni kamrában nevelt kukoricákból származnak - életképesek, míg az
MDMV-vel háromleveles stádiumban megfertőzött növények mikrospóráinak csak sejtfala
képződött.
40
4.3 Elektronmikroszkópos vizsgálat
A víruspartikulumokat az inokulálástól számított 14. napon tisztítottuk Sz0904-es MDMV
izolátummal fertőzött kukoricalevélből.
11. ábra
MDMV elektronmikroszkópos képe
Negatívan festett MDMV virionok elektronmikroszkópos preparátumon (Fotó: Fábián Attila).
A képen a kukorica csíkos mozaik vírusra jellemző formájú és méretű víruspartikulumok
láthatóak, bar=500nm.
Az elektronmikroszkópos felvételeken, az uranil acetátos festés után a potyvírusokra
jellemző formájú és méretű víruspartikulumok voltak láthatóak (11. ábra). A minták tisztasága
természetesen nem egyezik meg a többszöri ultracentrifugálással végzett elválasztás utáni
preparátumokéval (Langenberg et al., 1973), azonban sokkal gyorsabb és vegyszer-takarékosabb
megoldásnak bizonyult, ráadásul nincs szükség nagy mennyiségű fertőzött növényre.
41
Igaz, hogy a tisztítási módszer nem a potyvírusokhoz, hanem a tombusvírusokhoz optimalizált,
azonban a szedimentációs együtthatók és a hasonló kémiai tulajdonságuk miatt nagyon jól
alkalmazható potyvírusok tisztítására.
4.4 A kukorica csíkos mozaik vírus rokonsági viszonyainak feltárása
A nukleinsav, illetve az in silico következtetett CP aminosav szekvencia adatokból
elkészítettük a rokonsági viszonyokat ábrázoló törzsfát (Gell et al., 2008; Gell et al, 2010), amely
összesen kilencvennégy MDMV izolátum szekvenciáját tartalmazza (12.ábra), ebből nyolc az NCBI
génbank adatbázisból származott (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ezen szekvenciák és regisztrációs
számaik a következők: MDMV-Hungary-ScH/SYN (AJ542536), MDMV-Spain-M (AM110758),
MDMV-Spain-Sp (AJ416645), MDMV-A (U07216) MDMV-Argentina-Arg (DQ973169),
MDMV-Bulgarian-Bul (NC003377), MDMV-Royalty (AJ563726), MDMV-Bulgaria-Burgas
(AM490848).
A vizsgált izolátumok közti átlagos genetikai távolság 7,4% (p-distance-0,074). Ha a
köpenyfehérje gén különböző régióit vizsgáljuk, akkor elmondható, hogy az N-terminális régió (1-
204 nt) a legváltozékonyabb, átlagosan 12,2% a nukleotid sorrendben található eltérés. Az N-
terminális régió nagyfokú változékonysága jól ismert tulajdonság a potyvírusok között (Bousalem
et al., 2000; Moury et al., 2002). A C-terminális régióban (717-915 nt) 7,2%, míg a konzervált
központi régióban (205-716 nt) összesen 5,2% az átlagos szekvencia eltérés. A 3’ UTR (252 nt)
genetikai távolsága 0-11,4%-ig változott, átlagosan 3,7%.
Különböző potyvírusok szerológiai és molekuláris vizsgálata alapján a kutatók két fő tényezőt
határoztak meg, melyek nagy hatással lehetnek a köpenyfehérjére: az egyik a földrajzi eredet, a
másik pedig a gazdanövény (Pfosser et al., 2002; Alegria et al., 2003; Ohshima et al., 2002;
Sánchez et al., 2003; Xu et al., 2008). A kukorica csíkos mozaik virus izolátumok rokonsági
viszonyai és a genetikai távolságok alapján elmondható, hogy az SCMV alcsoport többi tagjával
ellentétben, az MDMV izolátumai között sem földrajzi elhelyezkedés sem pedig gazdanövény
alapján nem találhatók szekvencia variánsok, a víruspopulációk stabilnak tekinthetők. Hazai
viszonyok között nem tudtunk különbséget tenni a vírusizolátumok között földrajzi eredet alapján,
azonban ezt eredményezheti a Szeged és Martonvásár közti távolság rövidsége is. Valószínűleg a
kukorica csíkos mozaik vírusra nem hat erőteljes szelekciós nyomás, mind a gazdanövényeihez,
mind pedig a vektoraihoz nagymértékben alkalmazkodott, és semmilyen drasztikus környezeti vagy
biológiai hatás nem készteti a genetikai állományának nagymértékű megváltoztatására.
42
100
96
97 100
100
98
98
100 100
99
100
98
100
97
99 100
86
86 100
100
12. ábra
MDMV köpenyfehérje génjének elsődleges szerkezete alapján készült rokonsági törzsfa, a 2006-
2009-es időszakban izolált, valamint a génbanki adatbázisban megtalálható mintákból. Az
inszerciót tartalamzó izolátumok, az Argentin és Spanyol izolátumokkal teljesen külön csoportot
alkotnak.
43
Kivételt képez néhány martonvásári izolátum (Mv0702, Mv0801, Mv0811, Mv0814,
Mv0905), melyek köpenyfehérjéjük N-terminális részén hordoznak 13 aminosav hosszúságú
inszerciót. Az egyik martonvásári izolátumnál, melyet 2008-ban fenyércirokról gyűjtöttünk, az
inszerció előtt 9 aminosav hosszúságú delécióval is rendelkezik (12. ábra). Ugyan ezt az inszerciót
nukleinsav szinten (39nt) a 13. ábra mutatja be. Az MDMV köpenyfehérje aminoterminális részén
elhelyezkedő inszerciót már korábban leírták (Tóbiás et al., 2004), de ez az első eset, hogy az
inszerció egy delécióval párosul. Inszerciók és deléciók más potyvírusok esetében is előfordulnak a
köpenyfehérjének ebben a változékony régiójában, ilyen például TuMV/deléció (Lehmann et al.,
1997), SCMV/inszerció (Oertel et al., 1997; Frenkel et al., 1991), DMV/inszerció (Pappu et al.,
1994), SCMV (SCE alcsoport)/deléció (Alegria et al., 2003), SrMV/inszerció (Mirkov et al., 1997).
A köpenyfehérje aminoterminális régiójában jelen levő inszerciók és deléciók alátámasztják
a potyvírusok genomjának rugalmasságát és alkalmazkodó képességét, valamint előfordulásuk
gyakorisága miatt arra lehet következtetni, hogy talán valamilyen funkcionális tulajdonsággal
bírnak. Előfordulhat, hogy például erősebb kapcsolatot tudnak kialakítani a vektorukkal, vagy
gyorsabb a sejtről-sejtre terjedésük, de a mai napig nem áll rendelkezésünkre információ ezekről a
lehetőségekről. Az összehasonlító számítógépes vizsgálatok alapján az izolátumok egy részében
talált inszert nagyfokú konzerváltságot mutat mind a nukleinsav bázissorrendjét mind
elhelyezkedését tekintve. További számítógépes analízis alapján arra a következtetésre jutottunk,
hogy az inszerció szerepet játszik a vírus RNS stabilitásában (Petrik et al., 2010).
Az inszerciót tartalmazó izolátumok az adatbázisban megtalálható Argentin izolátummal
külön csoportot alkotnak a rokonsági törzsfán. További érdekesség, hogy az összes inszerciót
hordozó izolátumban a DAG aminosav motívum - mely a levéltetűvel való átvihetőségi factor -
DVG-re változott (14. ábra). Kutatók igazolták, hogy a TVMV (Tobacco vein mottling virus) DAG
motívumában történt mutáció a levéltetűvel való átvitel gátlásához vezetett (Pirone és Blanc, 1996;
Wang et al., 1996). A rendelkezésünkre álló szekvenciák alapján úgy tűnik, hogy az inszerció és a
DAG mutációja között összefüggés van, habár előfordul olyan izolátumban is, amely nem tartalmaz
inszerciót (MDMV-AJ542536-HUN-Sc-Sc/H).
Kutatók több esetben bizonyították a potyvírusok DAG motívumában történő mutációk
hatását a levéltetűvel való terjedésre (PRSV Quemada et al., 1990; Shukla et al., 1991; Ullah et al.,
2003; Farreyrol et al., 2006). Atreya et al. (1991) TVMV (Tobacco vein mottling virus)
izolátumokon vizsgálták a DAG motívum mutációit. Kísérleteik alapján arra az eredményre
jutottak, hogy a DAG motívum második és harmadik aminosavában történő változás általában
teljesen lehetetlenné teszi a vírus levéltetvekkel való terjedését, míg Atreya et al. (1995) TVMV-vel
végzett vizsgálatai során arra az eredményre jutott, hogy a megváltozott DVG motívum miatt csak
csökkent a levéltetvekkel való terjedés mértéke, de nem szűnt meg. A kérdés az, hogy az Asp-Ala-
44
Gly módosulása Asp-Val-Gly-re hatással van e az MDMV levéltetvekkel való terjedésére.
13. ábra Inszerciót tartalmazó MDMV izolátumok köpenyfehérje gének 5’ régiójának összehasonlítása
Az ábrán jól látható, hogy általunk vizsgált izolátumok közül hat esetben (egy génbanki
adatbázisból származik) található egy 39 nukleotid hosszúságú inszerció a köpenyfehérjegén N
terminális részén. A fenyércirokról izolált Mv0811-es minta esetében az inszerció előtt egy 27
nukleotid hosszúságú deléció is található.
14. ábra
Inszerciót tartalmazó MDMV izolátumok köpenyfehérje amino terminális régiójának
összehasonlítása
A szürkével kiemelt részek 13 aminosav hosszúságú inszerciót mutatnak az MDMV
köpenyfehérje aminoterminális régiójában. A Mv0811 minta esetében az inszerció mellett egy 9
aminosav hosszúságú deléció is megtalálható. Továbbá a levéltetűvel való terjedésért felelős
DAG motívum az összes inszerciót tartalmazó izolátumban DVG-re módosult.
Az RNS vírusok körében jól ismert jelenség, hogy egy adott növényen belül a
víruspopulációk variábilisak az állandó replikációs hibákból adódó változásoknak, mutációknak,
rekombinációknak köszönhetően (quasis species Vignuzzi et al., 2006). Azért, hogy megvizsgáljuk
az általunk leírt vírusizolátumok populációinak intraspecifikus struktúráját, két izolátum (Mv0702,
Sz0612) esetében 8-8 klón szekvenciáját is meghatároztuk. Az Mv0702-es izolátum esetében 99-
100% szekvencia homológiát találtunk, a Sz0612-es minta esetében 0,1-7,6% szekvencia eltérést
tapasztaltunk (az adatok nincsenek bemutatva). Ez a különbség azonban aminosav szinten nem
mutatkozott meg, csak 0-3,1%-os volt. Tehát elmondható, hogy a vizsgált izolátumok populációi a
növényen belül homogének voltak.
45
15. ábra
Az SCMV alcsoport rokonsági köre
46
Elkészítettük az SCMV alcsoport rokonsági viszonyait bemutató törzsfát is (15. ábra),
melyen jól látszik, hogy az MDMV közeli rokonságban áll az SrMV, PenMV és ZeMV csoportok
tagjaival, míg az SCMV-vel és a JGMV-vel jóval távolabbi rokonság figyelhető meg. A törzsfán az
is megfigyelhető, hogy az SCMV alcsoport tagjai közül a JGMV kettő, az SrMV kettő (HS, NS),
míg az SCMV hét (SCE, NSCE, MZ, Thailand, MBD, Brazil, Vietnam), egymástól jól elkülönülő
csoportra oszlik. Az SCMV első csoportjába (SCE csoport) tartozó izolátumok származási helyei:
Ausztrália, USA, Kína, Dél-Afrika, Irán, Kongó, Kamerun, Egyiptom, és Argentína. Ezeknek, a
különböző helyről származó izolátumoknak az a közös jellemzője, hogy mind cukornádról lettek
azonosítva. Az SCMV második csoportjába-NSCE csoport-tartozó izolátumok mindegyike Kínából
származik, és nemes cukornádról izolálták őket (Saccharum officinarum L. cv). A harmadik csoport
- MZ csoport - tagjai Kínából, Spanyolországból, Németországból, Vietnámból és Mexikóból
származik, és egy kivételével (SCMV-Vietnam-DQ925432- Maranta arundinacea - nyílgyökér),
mindet kukoricáról izolálták. A negyedik csoport (Thailand csoport) tagjai Thaiföldről és
Vietnámból származnak. Az ötödik csoportba egyetlen izolátum, az MBD (D00949) tartozik,
melyet Ausztráliában izoláltak kukoricáról. A hatodik csoport összes tagját Brazíliában izolálták. A
hetedik csoportot összesen két izolátum alkotja, VN/SC3 (DQ925430) és VN/SC4 (DQ925428).
Az SrMV HS csoportjába tartozó vírusizolátumok cukornádról, az NS csoport izolátumai
pedig egy cukornádhibridrőlről származnak. Tehát elmondható, hogy az SCMV alcsoport
izolátumai földrajzi eredet és gazdanövény szerint is különböző csoportokat alkotnak. A PenMV és
ZeMV esetében a kevés rendelkezésre álló szekvencia adat miatt nem támasztható alá az
előbbiekben bemutatott csoportosítás. A kukorica csíkos mozaik vírus esetében viszont
elmondhatjuk, hogy nem követi az SCMV alcsoportra jellemző gazdanövény és földrajzi eredet
szerinti megkülönböztethetőséget.
Az SCMV alcsoportra jellemző rokonsági viszonyokat ábrázoló filogenetikai elemzést
bővítettük azzal, hogy az N, core és C-terminális régiókat külön-külön is bevontuk a
vizsgálatainkba (16. ábra). Ez alapján elmondható, hogy az N-terminális-t, és a konzervált központi
kódoló régió alapján az MDMV szoros rokonságban van az SrMV-vel és a ZeMV-vel, azonban a C-
terminálist kódoló szakasz alapján inkább az SCMV-vel mutat szoros rokonságot. Az is jól látszik,
hogy legtávolabbi rokona az alcsoporton belül a JGMV. Ezt a számított genetikai távolságok,
valamint a részben eltérő gazdanövénykör is alátámasztja (Tosic et al., 1990), mert sem az MDMV,
sem pedig az alcsoport többi tagja nem okoz tünetet zabon (Avena spp. L.).
A filogenetikai elemzésekbe bevont izolátumok hivatkozási számát és nevét a 6. melléklet
tartalmazza.
47
16. ábra
Az SCMV alcsoportot képviselő izolátumok rokonsági viszonyait feltáró törzsfák
Balról jobbra látható az N-terminális, a központi valamint a C-terminális régió alapján készített
rokonsági törzsfa. Színek szerint: Szürke-JGMV, homokszín-SCMV, sárga-MDMV, narancs-
PenMV, zöld-SrMV, kék-ZeMV. A pirossal bekeretezett rész szemlélteti, hogy az N-terminális és a
központi régió elsődleges szerkezetének alapján az MDMV az SrMV-vel és a PenMV-vel mutat
közeli rokonságot, míg a C-terminális nukleotid sorrendje alapján inkább az SCMV-hez áll közel. A
JGMV minden esetben teljesen külön ágon található.
4.5 A vírus RNS másodlagos szerkezetének vizsgálata
A köpenyfehérje aminoterminális szakaszában talált inszerció és a DAG aminosav motívum
mutációját más potyvírusok esetén is megfigyelték (ZeMV Seifers et al., 2000, MDMV Tóbiás és
Palkovics, 2004). Az általuk vizsgált izolátumokban is úgy tűnt, hogy ez az inszerció egy
duplikáció eredménye (13. ábra), azonban funkciójáról nem tudni sokat. Továbbá elég sok vírus
RNS 5’ és 3’ másodlagos szerkezeten alapuló funkcionális vizsgálatot végeztek (Thivierge et al.,
2005; McCormack et al., 2008), melyek genom szinten rendezett RNS struktúrák (GORS- genome
scale ordered RNA structures) alapján mutatták meg a különböző vírusnemzetségek közti
48
szignifikáns eltéréseket (Simmonds et al., 2004; Davis et al., 2008). Vizsgálataik azt
eredményezték, hogy a potyvírusok genomjából hiányoznak ezek az RNS struktúrák, valószínűleg
az RNS nukleokapszid fehérjékkel való kapcsolata limitálja, vagy korlátozza ezeknek a
szerkezeteknek a szükségét. Munkánk során az MDMV N-terminálisában megtalálható inszert RNS
stabilitásra és másodlagos szerkezetre kifejtett hatását vizsgáltuk. Az általunk gyűjtött és az
adatbázisban megtalálható MDMV köpenyfehérje gének becsült másodlagos RNS szerkezetét
elkészítettük három különböző programmal, Vienna RNA csomag (Hofacker et al., 1994), UNAfold
(Markham et al., 2008) és NUPACK (Dirks et al., 2004). A génbanki adatbázisból származó
szekvenciák hivatkozási számai a következők: A34974, AF395135, AJ001691, AJ416633-
AJ416645, AJ437348, AJ542536, AJ563724, AM110758, AM490848, AM490849, AM491607
DQ973169, AJ563725, AJ563726, MDU07216, NC003377, FM883164-FM883228. A Vienna és
az UNAFold programok egyaránt a Zuker-algoritmussal számolnak (Zuker és Stiegler, 1981), míg a
NUPACK lehetőséget ad az úgynevezett pseudknot (álcsomó) RNS szerkezet vizsgálatokra is. A
programok részletes összehasonlítását és az algoritmusok közti különbségeket Susan Schroeder
nagyon áttekinthetően összefoglalta (Schroeder, 2009).
A három program számításaiból azonos eredmények születtek, így végül a Vienna RNA
csomag RNAfold programjának végeredményeit foglaltuk össze a 17. ábrán látható diagrammon. A
különböző programok eredményeit a 8. és 9. mellékletek foglalják össze.
49
A diagrammon jól látható, hogy az inszerciót tartalmazó izolátumok legkisebb
szabadenergiája ( MFE, minimum free energy) alacsonyabb, mint azok melyek nem tartalmazzák
ezeket a szekvenciákat. A random szekvenciák utáni értékek (867, 876, 915) a vizsgált
17. ábra
A négy év során gyűjtött inszerciót tartalmazó MDMV izolátumok MFE értékeinek
összehasonlító diagrammja, az inszerció nélküli hazai és Spanyol izolátumokkal.
Az ábra a Magyar, Spanyol inszerciót tartalmazó, inszerció nélküli szekvenciák MFE (minimum
free energy-legkisebb szabadenergia) értékeit szemlélteti különböző randomizált és kevert
szekvenciákkal. A random szekvenciák utáni értékek (867, 876, 915) a vizsgált köpenyfehérje
gének hosszúságát jelölik. Az Mv0702-es izolátum kivételével jól látható, hogy az inszerció
lecsökkenti az RNS molekula MFE értékét, mind az eredeti, mind pedig a randomizált
mintákban.
50
köpenyfehérje gének hosszúságát jelölik. A hazai izolátumok hosszúsága 876bp, a Spanyol
izolátumoké 867bp, míg az inszerciót tartalmazóké 915bp volt. Az inszerciót tartalmazó izolátumok
átlagosan 7,7 %-al alacsonyabb MFE értékkel rendelkeznek, mint a 915bp hosszúságú random
inszerciót tartalmazó szekvenciák, míg az inszerciót tartalmazó szekvenciák legkisebb
szabadenergiája 7,2 %-al alacsonyabb, mint az inszerciót nem tartalamzóak. A statisztikailag
szignifikáns különbségek számításához ANOVA tesztet készítettünk.
Az RNS másodlagos szerkezet vírus replikációban betöltött szerepe jól ismert (Simmonds et
al., 2004), így előfordulhat, hogy az inszerciónak hatása van a vírus replikációjára azáltal, hogy
stabilabb másodlagos szerkezetet alakít ki.
A 18. ábrán látható RNS másodlagos szerkezet alapján elmondható, hogy az MDMV
köpenyfehérje génjének N-terminális szakaszában megtalálható inszerció stabilizálja a
molekulaszerkezetet, az alacsonyabb MFE (minimum free energy) értékekhez, kevesebb
elágazással rendelkező molekulaszerkezet kapcsolódik. Azonban felvetődik a kérdés, hogy ha ez az
inszerció pozitív hatást gyakorol az MDMV RNS másodlagos szerkezetére és stabilizálja a
molekulát, akkor miért csak ilyen alacsony számban fordul elő a víruspopulációban.
Vizsgálatainkból kiderül, hogy az inszerció és a DAG motívumban történő változások között szoros
összefüggés van, elképzelhető, hogy alakultak ki más inszerciót hordozó izolátumok is csak
azokban a DAG motívum olyan aminosav kombinációt eredményezett, amely lehetetlenné tette a
levéltetvekkel való terjedést, és mivel ez a vírus maggal igen gyengén (0,007-0,4%) terjed, ezek a
variánsok kiszelektálódtak a víruspopulációból.
.
51
18. ábra
Inszerció nélküli és inszerciót tartalmazó MDMV izolátumok becsült másodlagos szerkezetének
összehasonlítása
Az ábrán jól látható, hogy az inszerciót tartalamzó izolátumok másodlagos szerkezete kevesebb
elágazást tartalmaz, ami hatással lehet a vírus replikációjára azáltal, hogy az RNS függő RNS
polimeráz könnyeben tud haladni a molekulán. Az inszerciót tratalmazó izolátumok legkisebb
szabadenergia értéke (MFE) alacsonyabb, ezért több energiát kellene befeketni ahhoz, hogy
megszűntessük ezt a stabil molekulaszerkezetet.
52
4.6 Rekombinációs vizsgálatok
Az kukorica csíkos mozaik vírus köpenyfehérje génjében, TOPALi V2 programjával végzett
vizsgálata alapján nem találtunk rekombinációs helyet sem az izolátumok között, sem pedig a rokon
vírusok izolátumaival. Azonban Chare és Holmes (2006) a Bolgár és a Sc/H izolátumok között
találtak egy rekombinációs helyet a köpenyfehérjegén 586–810nt terjedő szakaszán (225nt). Achon
et al. (2007) megismételték a vizsgálatot, és az általuk végzett kísérletben nem tudták alátámasztani
Chare és Holmes (2006) felfedezését. Az általunk meghatározott két teljes hosszúságú
vírusizolátum (MV0801-M, Sz-0605-M) és az adatbázisban megtalálható három teljes hosszúságú
MDMV szekvencia (NC_003377.1; AM110758, AJ001691) vizsgálata során a P3-as fehérjét
kódoló régióban találtunk egy rekombinációs töréspontot 2951nt-nél (19. ábra). Az első szakasz
alapján (1-2951nt) az izolátumokat földrajzi eredet szerint csoportosulnak, míg a második szakasz
(2951-9563nt) az Mv0801-M izolátum az Sp izolátummal mutat közeli rokonságot. Tehát érdemes
megemlíteni, hogy bár a köpenyfehérjét kódoló régió meglehetősen homológ, földrajzi eredettől és
gazdanövénytől függetlenül, addig a potyvírusok legváltozékonyabb, P3 fehérjét kódoló régiójában
található rekombinációs pont az MDMV-re jellemző.
19. ábra
MDMV teljes hosszúságú izolátumaiból TOPALi programmal készített rekombinációs
vizsgálat
A bal oldalon 1-2950nt, a jobb oldalon 2951-9563nt genomi szakaszt ábrázoló törzsfa látható,
valószínűleg a P3 fehérjét kódoló régióban van egy rekombinációs hely az MDMV
genomjában. Az ablak méret=200, lépték=50, szignifikancia szint=95%.
Rekombinációs vizsgálatainkat ezután elvégeztük az RDP3 (Recombination Detection
Program) programmal, mellyel a teljes hosszúságú MDMV izolátumokat valamint az SCMV
alcsoport köpenyfehérjét kódoló szakaszait vizsgáltuk. Az RDP egyszerre kilenc különböző
algoritmust futtat (RDP, GENECONV, Boot Scan, MaxChi, Chimaera, SiScan, Phylpro, LARD,
53
3Seq), melyek közül mind mást hanyagol el és másra fekteti a hangsúlyt. A programot napjainkban
leginkább HIV (Human immunodeficiency virus) rekombinációs változatok kutatására használják,
azonban tapasztalataink szerint a potyvírusok ilyen típusú vizsgálatához is kiválóan alkalmazható.
A program az öt teljes hosszúságú MDMV szekvenciában (AM110758-Spain, NC_003377-
Bulgaria, AJ001691-Bulgaria, Mv0801-M, Sz0605-M) négy rekombinációs eseményt talált,
melyeket eddig nem írtak le (11. melléklet). Az SCMV alcsoport tagjai közül SCMV-SCMV,
SrMV-SrMV, JGMV-MDMV (70-210), MDMV-MDMV, SrMV-MDMV (329-397) izolátumok
között találtunk rekombinációs eseményeket a köpenyfehérje kódoló régiójában. Az RDP vizsgálati
eredményeit és a szórás értékeket a 10. és 11. melléklet foglalja össze. Az RDP programmal számos
rekombinációs eseményt sikerült detektálni, míg a TOPALi csak egyetlen töréspontot talált a teljes
hosszúságú MDMV genomban.
4.7 A teljes genomot lefedő nukleotid sorrend meghatározása
A teljes MDMV genomot lefedő szekvenciák meghatározásához egymással átfedő vírus szakaszokat
klónoztunk, majd BioEdit programmal összeillesztettük a szekvenciákat (7. melléklet). A Sz0605
izolátum Szegedről származik és kukoricáról gyűjtöttük, az Mv0801 izolátum Martonvásárról
származik, szintén kukoricáról. CloneManager program segítségével megvizsgáltuk a teljes genom
restrikciós mintázatát, majd ennek alapján terveztük meg a teljes hosszúságú klón elkészítését. A
genomot lefedő szekvencia darabok a 20. ábrán láthatóak.
20. ábra A kukorica csíkos mozaik vírus (MDMV) teljes genomját lefedő szekvenciák meghatározásának
sematikus ábrája
Az ábrán látható hosszúságú szekvencia szakaszokat klónoztuk, és M13for, M13rev illetve
bizonyos esetekben az amplifikációs primerekkel meghatároztuk bázissorrendjüket. A kapott
elektroferogrammokat a BioEdit Sequence Alignment Editor programmal jelenítettük meg, majd
a génbanki adatbázisban megtalálható szekvenciákkal illesztettük. Az így kapott szekvencia
illesztésből összeállítottuk a teljes hosszúságú szekvenciákat a Sz0605, és a Mv0801-es
izolátumok esetében.
54
4.8 MDMV vírusrezisztencia kiváltására alkalmas konstrukció elkészítése
Első lépésként a klónozás megtervezésénél figyelembe vettük, a környezeti kockázati
tényezőket, melynek fontos kritériuma a transzgén megfelelő kiválasztásával kezdődik. A kockázati
tényezők csökkentése az általunk tervezett konstrukcióban a következők voltak: a vírusszekvencia
nem íródik át fehérjévé a transzlációs start kodon hiánya miatt; nem tartalmazza a köpenyfehérje N-
terminális régiójában a DAG motívumot kódoló régiót; mely a levéltetvekkel való vírusátvitelhez
nélkülözhetetlen, ezért egy esetleges levéltetűvel nem terjedő vírus felülfertőzése esetén, annak
vektorkörét nem bővíti; a rezisztencia PTGS alapú, így nem halmozódik fel a transzgénről származó
RNS (Tepfer és Balázs, 1997; Aziz és Tepfer, 1999; Tepfer et al., 2002); a növényi transzformációs
vektor az ampicillin rezisztencia gént a határszekvenciákon kívül tartalmazza, így lehetőséget ad a
baktériumok pozitív szelekciójára, azonban a növényeknek nem adja át azt. A vírusrezisztencia
kiváltására alkalmas konstrukció a géncsendesítés elvén működik, a hajtű (hairpin) konstrukcióban
a vírus csonkított köpenyfehérje gén szakasza fordított ismétlődés formájában van jelen, melyeket
egy rizs intron választ el egymástól. A vírusszekvenciák egymással komplementerek, így az intron
kivágódása (splicing) után kettősszálú RNS molekulák képződnek, melyekből az MDMV specifikus
siRNS-ek a PTGS elicitorai lesznek. A klónozás lépéseit a 21. ábra szemlélteti.
21. ábra
Az MDMV rezisztencia kiváltására alkalmas konstrukció elkészítének sematikus ábrája.
55
1. A klónozás első lépéseként megterveztük a beépíteni kívánt génszakaszt. A szekvenciát a
már fentebb említett szempontok szerint, az általunk addigra meghatározott, összesen 65
MDMV köpenyfehérje gén szekvenciája alapján választottuk ki.
2. A rizs aktin intront pAct1F nevű vektorból PCR segítségével szaporítottuk fel. A reakció 35
ciklusú, egyfázisú volt (94 ºC-on 20 másodperc denaturáció, 50 ºC-on 30 másodperc primer
kötés, és 72 ºC-on 30 másodperc polimerizáció). A PCR terméket a primerekkel bevitt
(Act1ifwd_PstI, Act1irev_EcoRI) restrikciós helyeken emésztettük, majd pBluescriptIIKS+
vektor megfelelő helyére klónoztuk.
3. Az Mv0808-as izolátum cDNS-éből két egymással komplementer szekvenciát PCR-el
felszaporítottunk. A primerpárok: MDMV XbaIfor-ModpolyT3rev; dMDMVCP-polyT2rev.
A reakció 35 ciklusú, egyfázisú volt (94 ºC-on 20 másodperc denaturáció, 60 ºC-on 30
másodperc primer kötés, és 72 ºC-on 50 másodperc polimerizáció).
4. Az egyik vírusszekvenciát az aktin intront tartalmazó vektor HindIII-KpnI helyére
illesztettük, majd ezt emésztettük XbaI-SmaI restrikciós enzimekkel, ahova a másik irányú
vírusszekvenciát klónoztuk.
5. Az ubiquitin promótert pAHC20 vektorból PCR segítségével felszaporítottuk. A reakció 35
ciklusból állt (94 ºC-on 30 másodperc denaturáció, 55 ºC-on 30 másodperc primer kötés, 72
ºC-on egy perc polimerizáció). A PCR terméket pLitmus28 vektor SpeI-AgeI helyére
klónoztuk.
6. A pBKS+ vektorból XbaI-KpnI emésztéssel kiemeltük a hajtű konstrukciót tartalmazó
szakaszt, majd az Ubi promótert tartalmazó pLitmus28 vektor megfelelő klónozó helyére
illesztettük.
7. Az így kapott pozitív klónok egyikéből SpeI-KpnI restrikciós emésztéssel kiemeltük a hajtű
konstrukciót a promóterrel együtt, majd T4 polimerázzal kezeltük.
8. A pAHC20 egyszikű transzformációs vektor BamHI-es klónozóhelyére ligáltuk az
előzetesen T4 polimerázzal kezelt génkazettát. A beépülés irányát PCR-el ellenőriztük.
A pAHC20 egyszikű növényekhez használt transzformációs vektor a génkazetta előtt tartalmaz
egy ubiquitin promótert, mely egyszikűekben bizonyítottan fokozottabb expressziót eredményez
(Liu, 2009; Christensen és Quail, 1996). A promótert egy ubiquitin intron követi, melynek szintén
az expressziós szint megnövelésében van fontos szerepe. A génkazetta után a pAHC20 vektor
tartalmazza a bar gént, mely egy igen széles körben alkalmazott szelekciós markergén. A bar gén
egy PAT (foszfinotricin acetil transzferáz) nevű enzimet kódol, melyet egy talajlakó baktérium, a
Streptomyces hygroscopicus termel abból a célból, hogy megvédje magát másodlagos anyagcsere
termékei autotoxikus hatásától. A transzgénikus növényekben expresszálódó bar gén herbicid
56
rezisztenciát vált ki, így a táptalajokat foszfinotricinnel kiegészítve tudjuk szelektálni a pozitív
növényeket.
A növényi transzformálások és a potenciálisan transzformáns kukorica növények felnevelése
folyamatban van, sajnos a különböző kukorica fajták és vonalak nagyon nagy különbségeket
mutatnak regenerációs készségében, így a továbbiakban a megfelelő transzformációs-és
regenerációs módszerek kidolgozására kell törekednünk
4.9 A kukorica csíkos mozaik vírus teljes hosszúságú cDNS klónjának
elkészítése
A kukorica csíkos mozaik vírus teljes hosszúságú klónját az Mv0801-M izolátumból
készítettük el. Az SCMV alcsoport tagjai közül a mai napig csak a JGMV (Johnsongrass mosaic
virus) esetében készült el teljes hosszúságú, fertőzőképes cDNS klón (Kim et al., 2003).
Fertőzőképes cDNS klónokat kutatók már sok esetben sikeresen előállítottak (PPV-Maiss et al.,
1992; LMV Yang et al., 1998; TuMV Sánchez et al., 1997; ZYMV Gal-on et al., 1991; PSbMV
Johansen, 1996), azonban a mai napig vannak bizonyos potyvírusok, melyek cDNS klónjaival
hosszú évekig tartó kísérletezés után sem tudtak fertőzést előidézni. Ennek okai a lehetnek a
következők: A poliadenilációs szignál hiánya, vagy rövidsége; egy-két bázis hibás a vírus 5’ végén,
mely a fertőzőképesség teljes elvesztéséhez vezethet; az inszerciók a vírusgenom instabilitását
okozhatják, DNS minősége és mennyisége, a gazdanövény, az inokulálás típusa (manuális,
Agrobaktérium közvetített, belövéses). A teljes hosszúságú cDNS klón elkészítésének sématikus
lépéseit 22. ábra mutatja be.
57
22. ábra
MDMV teljes hosszúságú klón előállításának lépései.
1. A klón elkészítésének első lépése az izolátum teljes szekvenciájának meghatározása volt.
Ezután a szekvenciában található egyedi hasítási helyek megkeresése CloneManager
programmal.
2. Második lépésben a PUC19 vektort emésztettük EcoRI-BamHI enzimekkel, így
elimináltunk olyan hasítási helyeket, melyek később zavarhatták volna a klónozást.
3. A megemésztett vektorba egy adaptert ligáltunk (2. táblázat), mely tartalmazza a megfelelő
restrikciós helyeket. A megemésztett vektorokat minden klónozási lépés előtt foszfatázzal
kezeltük.
4. A CaMV 35S promóterét PCR technika segítségével szaporítottuk fel, pGWB402 vektorból.
A primerpárok: 35S AgeI_for, 35S StuI_rev. A reakció 35 ciklusú, egyfázisú volt (94 ºC-on
20 másodperc denaturáció, 60 ºC-on 30 másodperc primer kötés, és 72 ºC-on 50 másodperc
polimerizáció).
5. A 35S promótert tartalmazó vektorok ApaI-KpnI helyére illesztettük a NOS terminátort,
amit szintén a pGWB402 vektorból PCR segítségével szaporítottunk fel. A primerpárok:
NOS_ApaI_for, NOS_KpnI_rev. A reakció 35 ciklusú, egyfázisú volt (94 ºC-on 20
másodperc denaturáció, 60 ºC-on 30 másodperc primer kötés, és 72 ºC-on 20 másodperc
polimerizáció).
58
6. A Mv0801-es izolátum leveleiből RNS-t vontunk ki, melynek mennyiségét és minőségét
Agilent RNA Nano Chippel ellenőriztük, majd DNázos kezelés után elvégeztük a reverz
transzkripciót (Superscript).
7. Az elkészült cDNS-eket RNázH-val kezeltük, hogy az esetleg kialakult duplexek ne
zavarják a PCR reakciót.
8. A teljes hosszúságú klón esetében a szekvenciák hosszúsága miatt a ROCHE cég Expand
Long Template enzim keverékét használtuk. A teljes vírusgenomot két részletben
szaporítottuk fel. Az első szakasz az 5’-4446-ig (4446bp), a második szakasz 4105-poly
adenilációs szignálig tart (5400bp). A reakció mindkét esetben kétfázisú, az első 10 ciklus
(15 másodperc denaturálás 94 ºC-on, 30 másodperc primer kötés 55 ºC-on, 3perc 45
másodperc szintézis 68 ºC-on) után a maradék 20 ciklusra a polimerizációs időt minden
ciklusban 10 másodperccel növeltük.
9. Először az F2-es fragmentumot klónoztuk PUC19_35S_polyA_NOS NheI-ApaI helyére,
majd a pozitív szelekció után az F1-es szekvencia darabot illesztettük a DraI-NheI helyre.
10. Az elkészült klónokkal 10-10 növényt fertőztünk, levelenként 1µg DNS-el. A növényeket
fitotroni kamrákban neveltük.
Sajnos tizenkét különböző tisztításból származó teljes hosszúságú cDNS klón egyikével sem
sikerült fertőzést kiváltanunk, a kukoricák teljesen tünetmentesek voltak. A fitotron kamra
hőmérséklet és fény intenzitás beállításai optimálisak voltak a kukorica neveléséhet valamint
a vírus tünetek kifejlődéséhez, amint ez a pozitív kontroll növényeken látható volt. A
kukoricákból ezután RNS-t vontunk ki és a PCR analízis alapján sem találtunk kukorica
csíkos mozaik vírust az inokulált növényekben.
59
ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK
1. Munkánk során, négy egymást követő évben (2006-2009) meghatároztuk 86 MDMV
izolátum részleges NIb és teljes köpenyfehérje génjének elsődleges szerkezetét, ezzel nagy
mérékben bővítettük a génbanki adatbázis MDMV szekvencia gyűjteményét.
2. Az izolátumokat azonos gazdanövényen, azonos környezeti körülmények között tesztelve
megállapítottuk, hogy a szántóföldi körülmények között eltérő tüneteket mutató MDMV
izolátumok között valójában nincsenek tüneti különbségek. Ez visszavezethető, a
gazdanövényre, a hőmérsékleti különségekre, melyek nagyban befolyásolják a vírustünetek
kialakulását, valamint arra, hogy milyen fenofázisban fertőződött meg a növény.
3. A meghatározott szekvenciákból elkészítettük az MDMV rokonsági viszonyait jellemző
törzsfát, kiegészítve az adatbázisban megtalálható szekvenciákkal. Ez az első, ekkora
mintaszámot feldolgozó, köpenyfehérje gén elsődleges szerkezetén alapuló MDMV
rokonsági viszonyait feltáró vizsgálat.
4. Először írtunk le egy olyan MDMV köpenyfehérje gent (Mv0811, FM883174), mely az N-
terminális részén található inszerció mellett tartalmaz egy deléciót is.
5. Az inszerciót tartalmazó izolátumok elsődleges szerkezetéből, három különböző
számítógépes program számításai alapján RNS stabilitás és RNS másodlagos szerkezet
vizsgálatokat végeztünk, melynek eredményei rávilágítottak arra, hogy a köpenyfehérje gén
változékony N-terminális régiójában előforduló inszerciók hatással lehetnek az RNS
másodlagos szerkezetének stabilizálásában.
6. Meghatároztuk két, földrajzilag elkülönülő helyről izolált kukorica csíkos mozaik vírus
teljes szekvenciáját (Mv0801-es és a Sz0605-ös izolátumok).
7. Elkészítettünk egy géncsendesítésen alapuló, MDMV rezisztencia kiváltására alkalmas
konstrukciót, mely a kukorica csíkos mozaik vírus csonkított köpenyfehérjegénjét
tartalmazza.
8. Bebizonyítottuk, hogy a háromleveles fejlődési stádiumban, MDMV-vel megfertőzött
csemegekukoricának nemcsak pollentermelése hanem pollen-életképessége is
nagymértékben lecsökken. Ez az első ilyen jellegű adat egyszikű növényt fertőző potyvírus
fertőzések estében.
9. Rekombinációs vizsgálataink alapján elmondható, hogy az MDMV genomjára jellemzőek
az intermolekuláris átrendeződések. Valamint a köpenyfehérjét kódoló régiójban az SCMV
alcsoportba tartozó vírusokkal is előfordulnak rekombinációs események.
60
5 KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK
A kukoricatermesztés jelentősége hazánkban igen nagy, fontos a humán táplálkozásban
betöltött szerepe, haszonállataink takarmányozásához pedig nélkülözhetetlen. Az nagymértékben
terjedő bioetanol gyártás következtében ipari felhasználása is egyre jelentősebb. A kukorica vírusos
megbetegedései közül az MDMV az egyik legjelentősebb kórokozó, mely nagy
termésveszteségeket okozhat. Ezért nagyon fontos a vírus rezervoár gyomok irtása, valamint a
levéltetű vektorok elleni védekezés.
2006-2009-ig terjedő időszakban, szántóföldi kukorica, cirok és fenyércirok levélmintákból
származó RNS-ek PCR vizsgálatai alapján elmondható, hogy hazánkban az adott termőhelyeken az
SCMV alcsoport tagjai közül az MDMV a dominánsan előforduló vírus.
A négy év során vizsgálatainkba bevont kukorica csíkos mozaik vírus izolátumok
köpenyfehérje génjének elsődleges szerkezete alapján elmondhatjuk, hogy az MDMV genetikai
állománya nem mutat jelentékeny változékonyságot. A víruspopuláció hazánkban, és a világ más
részein is stabilnak mondható.
Vizsgálataink során bebizonyosodott, hogy az MDMV fertőzés nem csak a kukoricacső
méretének, szemtermésének, valamint címer méretének csökkenését okozza, hanem a minimális
megtermelt pollen életképességét is nagyban befolyásolja.
Az általunk meghatározott 86 MDMV köpenyfehérje gén, valamint az adatbázisban
megtalálható MDMV szekvenciák vizsgálata alapján elmondható, hogy a csonkított köpenyfehérje
géntől származtatott vírusrezisztencia áttörésének lehetősége MDMV esetében alacsony, mivel a
populáció homogénnek bizonyult, és a nukleotid sorrendben előforduló különbségek általában nem
jelentettek aminosav szintű változásokat.
61
6 ÖSSZEFOGLALÁS
A Potyvirus nemzetségbe tartozó kukorica csíkos mozaik vírus (MDMV) komoly károkat
okozhat a hazai kukoricatermesztésben, mert évjárattól és földrajzi elhelyezkedéstől függetlenül
minden évben előfordul szántóterületeinken. A különböző fajták és hibridek eltérő érzékenységet
mutatnak a vírusfertőzéssel szemben, azonban minden esetben kielégítő védekezést jelenthet a
vírusrezervoár gyomok irtása, és a levéltetvek elleni védekezés.
A 2006-2009-ig terjedő négy éves időszakban vizsgált nyolcvanhat MDMV köpenyfehérje gén
elsődleges szerkezete alapján elmondható, hogy a vírus populáció homogén. Az SCMV alcsoport
többi képviselőjével ellentétben, az MDMV izolátumokat sem földrajzi elhelyezkedés sem pedig
gazdanövény alapján nem lehet csoportosítani. A vizsgált izolátumok CP gén elsődleges szerkezet
alapján számított genetikai távolsága 7,4%, mely nagyrészt az izolátumokban található inszerció
következménye. Aminosav szinten 95%-os az izolátumok köpenyfehérjéi közti azonosság.
A Martonvásárról származó inszerciót tartalmazó izolátumok (Mv0702, Mv0801, Mv0811,
Mv0814, Mv0905) az Argentin és Spanyol izolátumokkal külön csoportot alkotnak a rokonsági
viszonyokat jellemző fán, azonban az inszerciót leszámítva lényegében nem térnek el a többi
izolátumtól. A tünetek kialakítása mind időben, mind pedig intenzitásukban nagyjából megegyezik.
További számítógépes vizsgálatok során arra következtetésre jutottunk, hogy az inszerciók szerepet
játszhatnak a vírus RNS másodlagos szerkezetének stabilizálásában, ezáltal közvetve hathatnak a
vírus replikációjára.
Rekombinációs vizsgálatainkat két különböző programmal végeztük, míg a TOPALi egyetlen
rekombinációs töréspontot detektált, addig az RDP több intermolekuláris átrendeződést állapított
meg. Vizsgálataink alapján elmondható, hogy az MDMV-re jellemző a rokon vírusaival való
rekombináció, és ennek kimutatására alkalmasabbnak találjuk az RDP-programcsomagot az
általánosan használt TOPALi PDM analízisénél.
A genetikai távolságok valamint a köpenyfehérje gének elsődleges szerkezetének megállapítása
segítséget nyújt a kukorica csíkos mozaik vírus, és az SCMV alcsoport vírusainak rokonsági
viszonyainak feltárásában.
Fontos megemlíteni, hogy az eddig leírt, MDMV fertőzés következtében fellépő
termésveszteséget okozó tünetek (levélfelület index csökkenés, törpülés, a címer és a cső kései
kifejlődése, rossz magkötés és csökkent címerméret, alacsony ezerszemtömeg, abortált végű
csövek) mellett nagy szerepe lehet a pollen életképességének, mivel kisérleteinkben a fertőzött
kukoricából származó pollen életképtelennek bizonyult.
62
7 SUMMARY
Maize dwarf mosaic virus (MDMV) is a member of the Potyvirus genus, which causes severe
agronomical losses in Hungarian maize cultivation, because it occures in all years in the Hungarian
maize fields independently from geographical location and season. Maize cultivars have different
levels of susceptibility to MDMV, but in all cases protection against the virus infection could be
achieved satisfactory by clearing of the virus reservoir weeds and by protection against aphids.
From 2006 to 2009 eighty-five new MDMV isolates were investigated, and based on the
primary structure of the coat protein genes it can be concluded that the virus population is homogen.
In contrast to the other members of the SCMV subgroup MDMV CP gene sequences can not be
grouped according to either host or geographic origin. The genetic distance between the
investigated isolates based on the primary structure of the CP gene is 7,4%, which is largely due to
the insertion containing isolates. The in silico deduced amino-acid sequence comparisons of the
isolates showed, that they share 95% identity in their coat protein region.
The insertion containing isolates from Martonvásár (Mv0702, Mv0801, Mv0811, Mv0814,and
Mv0905) form a separate group together with the Argentinian and Spanish isolates in the
phylogenetic tree. If the insertion is not considered the isolates are quite similar to each other. The
symptom development of the insertion containing sequences and the other sequences is almost the
same both in time and in intensity. Based on further computer analyses it can be concluded, that the
insertions could have a role in the stabilization of the RNA molecule, thereby indirectly have an
effect to the virus replication.
The recombination analysis was made with two different programs. While the TOPALi has
detected only one recombination breakpoint in the MDMV genome, several intermolecular
reassortments has been found using the Recombination Detection Program (RDP v. 3.44).
Based on our investigations it can be concluded, that the recombination event with relative
virus groups is a typical feature of MDMV, and for the detection of these events, the RDP program
was more suitable than the generally used TOPALi PDM analysis.
The establishment of the genetic distances and the primary sequences of the CP genes are very
helpful to explore the relationship between the MDMV and the viruses of the SCMV subgroup.
It is important to mention, that beside the until described MDMV caused symptoms (like
decreasing the Leaf Area Index-LAI; stunting; late development of the corn cob, and the tassel;
decreased size of the tassel; reduction in seed set; low thousand kernel weight; aborted-end corn
cobs), the viability of the pollen could have a great importance. Based on our results the pollen
originated from MDMV infected maize has completely lost its viability.
63
64
8 MELLÉKLETEK 1.sz. Melléklet. Irodalomjegyzék
ACHON, M.A., SERRANO, L., ALONSO-DUEÑAS, N., PORTA, C. (2007): Complete
genome sequences of Maize dwarf mosaic and Sugarcane mosaic virus isolates coinfecting
maize in Spain. Arch. Virol.,152 (11): 2073-2078.
ACHON, M.A., SOBREPERE, M., MINGUELL, R. (2004): Molecular and Biological
properties of a Sugarcane Mosaic Potyvirusisolate from Spain. Z. Pflanzenkr. Pflanzenschutz,
110: 324-331.
ACHON, M.A., MEDINA, V., SHANKS, M., LOMONOSSOFF, G.P. (1994): Characterisation
of a maize-infecting potyvirus from Spain. Eur. J. Plant Pathol., 100: 157-165.
ADAMS, M.J., ANTONIW, J.F., FAUQUET, C.M. (2005): Molecular criteria for genus and
species discrimination within the family Potyviridae. Arch. Virol., 150: 459-479.
ALEGRIA, O.M., ROYER, M., BOUSALEM, M., CHATENET, M., PETERSCHMITT, M.,
GIRARD, J.C., ROTT, P. (2003): Genetic diversity in the coat protein coding region of
eighty-six sugarcane mosaic virus isolates from eight countries, particularly from Cameroon
and Congo. Arch. Virol.,148(2): 357-72.
ANDINO, R., BODDEKER, N., GAMARNIK, A. V. (1999): Intracellular determinants of
picornavirus replication. Trends Microbiol., 7: 76-82.
ANDREJEVA, J., PUURAND, Ü., MERIT,S A., RABENSTEIN, A., JÄRVEKÜLG, L.,
VALKONEN, J.P.T. (1999): Potyvirus HC-Pro and CP proteins have coordinated functions in
virus-host interactions and the same CP motif affects virus transmission and accumulation. J.
Gen. Virol. 80: 1133-1139.
ARBATOVA, J., LEHTO, K., PEHU, E., PEHU, T. (1998): Localization of the P1 protein of
potato Y potyvirus in association with cytoplasmic inclusion bodies and in the cytoplam of
infected cells. J. Gen. Virol., 79: 2319-2323.
ATREYA, P.L., ATREYA, C.D., PIRONE, T.P. (1991): Amino acid substitutions in the coat
protein result in loss of insect transmissibility of a plant virus. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 88:
7887-7891.
ATREYA, P.L., LOPEZ-MOYA, J.J., CHU, M., ATREYA, C.D., PIRONE, T.P. (1995):
Mutational analysis of the coat protein N-terminal amino acids involvement in potyvirus
transmission by aphids. J. Gen. Virol., 76: 265-270.
65
AZIZ, R., TEPFER, M. (1999): Recombination in RNA viruses and in virus-resistant transgenic
plants. J. Gen. Virol., 80: 1339-1346.
BAKOS, F., DARKÓ, É., ASCOUGH, G., GÁSPÁR, L., AMBRUS, H., BARNABÁS, B.
(2008): A cytological study of aluminium-treated wheat anther cultures resulting in plants
with increased Al tolerance. Plant Breeding, 127: 235-240.
BAULCOMBE, D.C. (1996): Mechanisms of Pathogen-Derived Resistance to Viruses
inTransgenic Plants. Plant Cell, 8: 1833-1844.
BLANC, S., AMMAR, E.D., GARCIA-LAMPASONA, S., DOLJA, V.V., LLAVE, C.,
BAKER, J., PIRONE, T.P. (1998): Mutations in the potyvirus helper component protein:
effects on interaction with virions and aphid stylets. J. Gen. Virol., 79: 3119-3122.
BOUSALEM, M., DOUZERY, E.J.P., FARGETTE D. (2000): High genetic diversity, distant
phylogenetic relationships and intraspecies recombination events among natural populations
of Yam mosaic virus: a contribution to understanding potyvirus evolution. J. Gen. Virol., 81:
243-255.
CARRINGTON, J.C., FREED, D.D. (1990): Cap-independent enhancement of translation by a
plant potyvirus 5' nontranslated region. J. Virol., 64: 1590-1597.
CHARE, E.R., HOLMES, E.C. (2006): A phylogenetic survey of recombination frequency in
plant RNA viruses. Arch. Virol. 151: 933-946.
CHEN, S., DAS, P., HARI, V., (1994): In situ localization of ATPase activity in cells of plants
infected by maize dwarf mosaic potyvirus. Arch. Virol., 134, 433-439.
CHEN, J., CHEN, J., ADAMS, M.J. (2001): A universal PCR primer to detect members of the
Potyviridae and its use to examine the taxonomic status of several members of the family.
Arch. Virol., 146 (4):757-766.
CHEN, J., CHEN, J., ADAMS, M.J. (2002): Characterisation of potyviruses from sugarcane and
maize in China. Arch. Virol., 147 (6): 1237-1246.
CHRISTENSEN, A.H., QUAIL, P.H. (1996): Ubiquitin promoter-based vectors for high level
expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants.
Transgenic Res., 5:213-218.
CSÍBOR, I. (2004): A kukorica az Uniós csatlakozás küszöbén. Agrofórum.15.5: 2.
DALMAY, T., HAMILTON, A., RUDD, S., ANGELL, S., BAULCOMBE, D. C. (2000): An
RNA-Dependent RNA Polymerase gene in Arabidopsis is required for post-transcriptional
gene silencing mediated by a transgene but not by a virus. Cell, 101: 543-553.
DAVIS, M., SAGAN, S.M., PEZACKI, J.P., EVANS, D.J., SIMMONDS, P. (2008):
Bioinformatic and Physical Characterizations of Genome-Scale Ordered RNA Structure in
Mammalian RNA Viruses. J. Virol., 82: 11824-11836.
66
DENG, C.L., WANG, W.J., WANG, Z.Y., JIANG, X., CAO, Y.Y., ZHOU, T., WANG, F.R.,
LI, H.F., FAN, Z.F. (2008): The genomic sequence and biological properties of Pennisetum
mosaic virus, a novel monocot-infecting potyvirus. Arch. Virol., 153 (5): 921-927.
DIETRICH, C., MAISS, E. (2003): Fluorescent labelling reveals spatial separation of potyvirus
populations in mixed infected Nicotiana benthamiana plants. J. Gen. Virol. 84: 2871-2876.
DIETRICH, C., MILLER, J., MCKENZIE, G., PALKOVICS, L., BALÁZS, E., PALUKAITIS,
P., MAISS, E. (2007): No recombination detected in artificial potyvirus mixed infections and
between potyvirus derived transgenes and heterologous challenging potyviruses. Environ.
Biosafety Res., 6: 207-218.
DIRKS, R.M., PIERCE, N.A. (2004): An algorithm for computing nucleic acid base-pairing
probabilities including pseudoknots. J. Comput. Chem., 25: 1295-1304.
DOLJA, V.V., HALDEMAN, R., ROBERTSON, N.L., DOUGHERTY, W.G., CARRINGTON,
J.C. (1994): Distinct functions of capsid protein in assembly and movement of tobacco etch
potyvirus in plants. EMBO J., 13: 1482-1491.
DOUGHERTY, W.G., CARRINGTON, J.C. (1988): Expression and function of potyviral gene
products. Annu. Rev. Phytopathol., 26: 123-143.
EAGLES, R.M., BALMORI-MELIÁN, E., BECK, D.L., GARDNER, R.C., FORSTER, R.L.S.
(1994): Characterization of NTPase, RNA binding and RNA-helicase activities of the
cytoplasmic inclusion protein of tamarillo mosaic potyvirus. Eur. J. Biochem. 224: 677–684.
ESPEJEL, F., JEFFERS, D., NOA-CARRAZANA, J.C., RUIZ-CASTRO, S., SILVA-
ROSALES, L. (2006): Coat protein gene sequence of a Mexican isolate of Sugarcane mosaic
virus and its infectivity in maize and sugarcane plants. Arch. Virol., 151 (2): 409-412.
FAN, Z., CHEN, H., CAI, S., DENG, C., WANG, W., LIANG, X., LI, H. (2003): Molecular
characterization of a distinct potyvirus from whitegrass in China. Arch. Virol., 148 (6):1219-
1224.
FAN, Z.F., WANG, W.J., JIANG, X., LIANG, X.M., WANG, F.R., LI, H.F. (2004): Natural
infection of maize by Pennisetum mosaic virus in China. Plant Pathol., 53 (6): 796-796.
FARREYROL, K., PEARSON, M.N., GRISONI, M., COHEN, D., BECK, D. (2006): Mosaic
virus isolates from French Polynesia and the Cook Islands are Dasheen mosaic virus strains
that exclusively infect vanilla. Arch. Virol.,151 (5): 905-919.
FAUQUET, C.M., MAYO, M.A., MANILOFF, J., DESSELBERGER, U., BALL, L.A. (2005):
Virus Taxonomy. Classification and nomenclature of viruses. Eight Report of the
International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier Academic Press.: 821.
Food and Agricultural commodities production. http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx.
67
FRENKEL, M.J., WARD, C.W., SHUKLA, D.D. (1989): The use of noncoding nucleotide
sequences is the taxonomy of potyviruses: application to watermelon mosaic virus 2 and
soybean mosaic virus-N. J. Gen. Virol., 70: 2775-2783.
FRENKEL, M.J., JILKA J.M., MCKERN, N.M., STRIKE, P.M., CLARK, .JM. JR., SHUKLA,
D.D., WARD, C.W. (1991): Unexpected sequence diversity in the amino-terminal ends of the
coat proteins of strains of sugarcane mosaic virus. J. Gen. Virol., 72 ( 2): 237-42.
FUCHS, E., GRUNTZIG, M., HOHMANN, F., KUNTZE, L., OEKTET, U. (1997): 15 Jahre
Forschungsarbeiten über Viruskrankungen an Mais in Mitteldeutschland. Kuhn-Arch., 91, No
(1): 3-34.
FUCHS, M., GONSALVES, D. (2007): Safety of virus-resistant transgenic plants two decades
after their introduction: lessons from realistic field risk assessment studies. Annu. Rev.
Phytopathol., 45: 173-202.
GALLIE, D.R., SLEAT, D.E., WATTS, J.W., TURNER, P.C., WILSON, T.M.A. (1987): A
comparison of eukaryotic viral 5’-leader sequences as enhancers of mRNA expression in vivo.
Nucl. Acids Res., 15: 8693-8711.
GALLIE, D.R, WALBOT, V. (1992): Identification of the motifs within the tobacco mosaic
virus 5’-leader responsible for enhancing translation. Nucl. Acids Res., 11: 4631-4638.
GAL-ON, A., ANTIGNUS, Y., ROSNER, A., RACCAH, B. (1991): Infectious in vitro RNA
transcripts derived from cloned cDNA of the cucurbit potyvirus, zucchini yellow mosaicvirus.
J. Gen. Virol., 72: 2639-2643.
GÁBORJÁNYI, R., HOANG, N.D., KOVÁCS G. (1992) Resistance of maize inbred lines and
sorghum species to potyviruses found in Hungary. Cereal Res. Commun., 20: 131-137.
GELL, G., BALÁZS, E., PETRIK, K. (2010): Genetic diversity of Hungarian Maize dwarf
mosaic virus isolates. Virus Genes, 40: 277-281.
GELL, G., PETRIK, K., BALÁZS, E., DIVÉKI Z. (2008): Kukorica csíkos mozaik vírus
(MDMV) populációk molekuláris analízise. Növényvédelem, 44 (11): 567-571.
GEMECHU, A.L., CHIEMSOMBAT, P., ATTATHOM, S., REANWARAKORN, K.,
LERSRUTAIYOTIN, R. (2006): Cloning and sequence analysis of coat protein gene for
characterization of sugarcane mosaic virus isolated from sugarcane and maize in Thailand.
Arch. Virol., 151: 167-172.
GOUGH, K.H., SHUKLA, D.D. (1993): Nucleotide sequence of Johnsongrass mosaic potyvirus
genomic RNA. Intervirology, 36 (3): 181-192.
HA, C., REVILL, P., HARDING, R.M., VU, M., DALE, J.L. (2008): Identification and
sequence analysis of potyviruses infecting crops in Vietnam. Arch. Virol., 153: 45-60.
68
HAJIMORAD, M.R., EGGENBERGER, A.L., HILL, J.H. (2003): Evolution of Soybean mosaic
virus-G7 molecularly cloned genome in Rsv1-genotype soybean results in emergence of a
mutant capable of evading Rsv-1 mediated recognation. Virology, 314: 497-509.
HAMILTON, A.J., BAULCOMBE, D.C. (1999): A Species of Small Antisense RNA in
Posttranscriptional Gene Silencing in Plants. Science, 286 (29): 950-952.
HARRISON, B.D., ROBINSON, D.J. (1988): Molecular variation in vector-borne plant viruses:
epidemiological significance. Philos. Trans.R. Soc. London. B Biol.Sci., 321: 447-462.
HEATH, L., VAN DER WALT, E., VARSANI, A., MARTIN D.P. (2006): Recombination
patterns in aphthoviruses mirror those found in other picornaviruses. J. Virol., 80: 11827-
11832.
HILL, J.H., MARTINSON, C.A., RUSSEL, W.A. (1974): Seed Transmission of Maize Dwarf
Mosaic and Wheat Streak Mosaic Viruses in Maize and Response of Inbred Lines1. Crop Sci.,
14: 232-235.
HOANG, N.D., GÁBORJÁNYI, R. (1991): A kukoricapatogén potyvírusok (kukorica csíkos
mozaik vírus és cukornád mozaik vírus) és törzseik meghatározása cirokfajtákon és
nemesítési vonalakon. Növénytermelés, 40: 493-498.
HOFACKER, I.L., FONTANA, W., STADLER, P.F., BONHOFFER, S., TACKER, M.,
SCHUSTER, P. (1994): Fast folding and comparison of RNA secondary structures (the
Vienna RNA Package). Monaths. Chem., 125: 167-188.
HONG, Y.L., LEVAY, K., MURPHY, J.F., KLEIN, P.G., SHAW, J.G., HUNT, A.G.: (1995): A
potyvirus polymerase interacts with the viral coat protein and VP gin yeast-cells. Virology,
214: 159-166.
HONG, Y., HUNT, A.G., (1996): RNA polymerase activity catalyzed by a potyvirus-encoded
RNA-dependent RNA polymerase. Virology 226: 146–151.
HÖFGEN, R., WILLMITZER, L. (1988): Storage of competent cells for Agrobacterium
transformation. Nucl. Acids Res., 20: 9877.
INOUE, H., NOJIMA, H., OKAYAMA, H. (1990): High efficiency transformation of
Escherichia coli with plasmids. Gene, 96 (1): 23-28.
JANSON, B.F., ELLETT, C.W. (1963): A new corn disease in Ohio. Plant Dis. Rep., 47: 1107-
1108.
JOHANSEN, I. E. (1996): Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in
Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 93: 12400-12405.
69
JOHNSON, S.N.: Environment Plant Interactions. Above Ground-below Ground Trophic
Interactions.http://www.scri.ac.uk/research/epi/agroecology/multitrophicinteractions/abovegr
oundbelowgroundtrophicinteractions.
JONES, R.K. & TOLIN, S.A. (1972): Factors Affecting Purification of Maize Dwarf Mosaic
Virus from Corn. Phytopathology, 62: 812-816.
JÓZSA, R., BALÁZS, E. (2000): Víruseredetű köpenyfehérje gének által közvetített rezisztencia
transzgénikus növényekben I. Növénytermelés, 49: 165-184.
KASSCHAU, K.D., CRONIN, S., CARRINGTON, J.C., (1997): Genome amplification and
long-distance movement functions associated with the central domain of tobacco etch
potyvirus helper component-proteinase. Virology, 228: 251-262.
KELLER, K.E., JOHANSEN, I.E., MARTIN, R.R., HAMPTON, R.O. (1998): Potyvirus
genome-linked protein (VPg) determines pea seed-borne mosaic virus pathotype-specific
virulence in Pisum sativum. Mol. Plant-Microbe Interact, 11: 124-130.
KIM, D.G., PARK, Y.S., KIM, S.S., LEW, J., NAM, H.G., GOI, K.Y. (1995): Expression,
purification and identification of a novel self-cleavage site of the NIa C-terminal 27-kDa
protease of turnip mosaic potyvirus C5. Virology, 213: 517-525.
KIM, K.S., OH, H.Y., SURANTO, S., NURHAYATI, E., GOUGH, K.H., SHUKLA, D.D.,
PALLAGHY, C.K. (2003): Infectivity of in vitro transcripts of Johnsongrass mosaic
potyvirus full-length cDNA clones in maize and sorghum. Arch. Virol., 148: 563-574.
KLEIN, P.G., KLEIN, R.R., RODRÍGUEZ-CEREZO, E., HUNT, A.G., SHAW, J.G. (1994):
Mutational analysis of the tobacco vein mottling virus genome. Virology, 204: 759-769.
KONG, P., STEINBISS, H.H. (1998): Complete nucleotide sequence and analysis of the putative
polyprotein of maize dwarf mosaic virus genomic RNA. Arch. Virol., 143: 1791-1799.
KOVÁCS, G., GÁBORJÁNYI, R., TOLDI, É. (1994): Inheritance of resistance to maize-dwarf
mosaic-virus and sugarcane mosaic-virus in maize. Cereal Res. Commum., 22: 361-368 .
KOVÁCS, G., TOLDI, É., GÁBORJÁNYI, R., VASDINYEI, R. (1997): Effect of plant age on
susceptibility of corn hybrids to maize dwaf mozaik potyvirus. Cereal Res. Commun., 25 (4):
969-975.
KOVÁCS, G., GÁBORJÁNYI, R., VASDINYEI, R., TOLDI, É. (1998): Resistance of maize
inbred lines to maize dwarf mosaic virus and sugarcane mosaic potyviruses. Cereal Res.
Commun., 26: 195-201.
KUMAR, S., NEI, M., DUDLEY, J., TAMURA, K. (2008): MEGA: A biologist-centric
software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Brief. Bioinform., 9 (4):
299-306.
70
LAIDLAW, H. K. C., PERSLEY, D.M., PALLAGHY, C.K., GODWIN, I.D. (2004): Sequence
diversity in the coat protein coding region of the genome RNA of Johnsongrass mosaic virus
in Australia. Arch. Virol., 149: 1633-1641.
LAÍN, S., RIECHMANN, J.L., GARCIA, J.A., (1990): RNA helicase: a novel activity
associated with a protein encoded by a positive strand RNA virus. Nucl. Acids Res., 18: 7003-
7006.
LAÍN, S., MARTÍN, M.T., RIECHMANN, J.L., GARCIA, J.A. (1991): Novel catalytic activity
associated with positive-strand RNA virus infection: nucleic acid-stimulated ATPase activity
of the plum pox potyvirus helicaselike protein. J. Virol. 65: 1-6.
LANGENBERG, W.G. (1973): Serology, physical properties, and purification of unaggregated
infectious maize dwarf mosaic virus. Phytopathology, 63: 149-154.
LEHMANN, P., PETRZIK, K., JENNER, C., GREENLAND, A., SPAK, J., KOZUBEK, E.,
WALSH, J.A. (1997): Nucleotide and amino acid variation in the coat protein coding region
of turnip mosaic virus isolates and possible involvement in the interaction with the brassica
resistance gene TuRB01. Physiol. Mol. Plant. Path., (51): 195-208.
LÉONARD, S., PLANTE, D., WITTMANN, S., DAIGNEAULT, N., FORTIN, M.G.,
LALIBERTÉ, J.F. (2000): Complex formation between potyvirus VPg and translation
eukaryotic initiation factor 4E correlates with virus infectivity. J. Virol., 74: 7730-7737.
LESIKA, J, PIONTEK, P., KULINSKA, Z.S., JARMOLOWSKI, A. (2004): siRNAs and
miRNAs: small RNA molecules for big tasks. Acta Physiol. Plant., 26 (3): 363-368.
LI, X.H., VALDEZ, P., OLVERA, R.E., CARRINGTON, J.C. (1997): Functions of the tobacco
etch virus RNA polymerase (NIb): subcellular transport and protein–protein interaction with
VPg: proteinase (NIa). J. Virol., 71: 1598-1607.
LIU, D. (2009): Design of Gene Constructs for Transgenic Maize. Scott, M.P. Methods in
Molecular Biology: Transgenic Maize. Humana Press, New York, USA 3-20.
LOUIE, R., KNOKE, J. K. (1975): Strains of maize dwarf mosaic virus. Plant Dis. Rep., 59:
518-522.
Központi Statisztikai Hivatal (2010): Magyar Statisztikai Zsebkönyv 2009, 111-112.
MAIA, I.G., HAENNI, A.L., BERNARDI, F. (1996): Potyviral HCPro: a multifunctional
protein. J. Gen. Virol., 77: 1335-1341.
MAISS, E., TIMPE, U., BRISSKE-RODE, A., LESEMANN, D.-E., CASPER, R. (1992):
Infectious in vivo transcripts of a plum pox potyvirus full-length cDNA clone containing the
cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter. J. Gen. Virol., 73: 709-713.
MARKHAM, N.R., ZUKER, M. (2008): UNAFold: software for nucleic acid folding and
hybridization. Methods Mol. Biol., 453: 3-31.
71
MARTIN, M.T., GELIE, B. (1997): Non-structural potyvirus proteins detected by immunogold
labelling. Eur. J. Plant Pathol., 103: 427-431.
MARTIN, D.P., WILLIAMSON, C., POSADA, D. (2005): RDP2: recombination detection and
analysis from sequence alignments. Bioinformatics, 21: 260-262.
MASUTA, C., NISHIMURA, M., MORISHITA, H., HATAYA, T. (1999): A single amino acid
change in viral genome-associated protein of Potato virus Y correlates with resistance
breaking in ‘Virgin A mutant’ tobacco. Phytopathology, 89: 118-123.
McCORMACK, J.C., YUAN, X., YINGLING, Y.G. ZAMORA, R.E., SHAPIRO, B.A.,
SIMON, A.E. (2008): Structural Domains within the 3’ Untranslated Region of Turnip
Crinkle Virus. J. Virol., 82: 8706-8720.
McELROY, D., BLOWERS, A.D., JENES, B., WU, R. (1996): Construction of expression
vectors based on the rice actin 1 (Act1) 5’ region for use in monocot transformation. Mol.
Gen. Genet., 231: 150-160.
McKINNEY, H.H. (1929): Mosaic disease in the Canary Islands, West Africa and Gibraltar. J
Agric. Res., 39: 557-558.
MELCHINGER, A.E., L. KUNTZE, R.K. GUMBER, T. LÜBBERSTEDT, E. FUCHS (1998):
Genetic basis of resistance to sugarcane mosaic virus in European maize germplasm. Theor.
Appl. Genet., 96: 1151-1161.
MERITS, A., GUO, D., SAARMA, M. (1998): VPg, coat protein and five non-structural
proteins of potato A potyvirus bind RNA in a sequence-unspecific manner. J. Gen. Virol., 79:
3123-3127.
MIKEL, M.A., D'ARCY, C.J., FORD, R.E. (1984): Seed transmission of maize dwarf mosaic
virus in sweet corn. J. Phytopathol., 110: 185-191.
MILINKÓ, I. (1977): Some new results on maize dwarf mosaic virus in Hungary. Acta
Phytopathol. Entomol. Hung., 9: 329-331.
MILINKÓ, I., PETI, J., PAPP, I. (1979): Problems and possibilities for control of maize dwarf
mosaic virus in Hungary. Acta Phytopathol. Entomol. Hung., 14: 127-131.
MILNE, I., WRIGHT, F., ROWE, G., MARSHALL, D.F., HUSHMEIER, D., MCGUIRE, G.
(2004): TOPALi: software for automatic identification of recombinant sequences within DNA
multiple alignments. Bioinformatics, 20: 1806-1807.
MIRKOV, T.E., YANG, Z.N. (1997): Sequence and relationships of Sugarcane Mosaic and
Sorghum Mosaic Virus strains, and development of RT-PCR based RFLPs for strain
discrimination. Phytopathology, 87: 932-939.
72
MOURY, B., MOREL, C., JOHANSEN, E., JACQUEMOND, M. (2002): Evidence for
diversifying selection in Potato virus Y and in the coat protein of other potyviruses. J. Gen.
Virol., 83 (10): 2563-2573.
MUELLER, E., GILBERT, J., DAVENPORT, G., BRIGNETI, G., BAULCOMBE, D.C. (1995):
Homology-dependent resistance, transgenic virus resistance in plants related to homology-
dependent gene silencing. Plant J., 7: 1001-1013.
MURRY, L.E., ELLIOTT, L.G., CAPITANT, S.A., WEST, J.A., HANSON, K.K., SCARAFIA,
L., JOHNSTON, S., DELUCAFLAHERTY, C., NICHOLS, S., CUNANAN, D., DIETRICH,
P.S., METTLER, I.J., DEWALD, S., WARNICK, D.A., RHODES, C., SINIBALDI, R.M.,
BRUNKE, K.J. (1993): Transgenic corn plants expressing MDMV strain-b coat protein are
resistant to mixed infections of maize-dwarf mosaic-virus and maize chlorotic mottle virus.
Nature Biotechnology, 11: 1559-1564.
NAGY, J. (2007): Kukoricatermesztés. Akadémiai Kiadó. Budapest, 19-23.
NAKAGAWA, T., SUZUKI, T., MURATA, S., NAKAMURA, S., HINO, T., MAEO,
K.,TABATA, R., KAWAI, T., TANAKA, K., NIWA, Y., WATANABE,Y., NAKAMURA,
K., KIMURA, T., ISHIGURO, S. (2007): Improved Gateway Binary Vectors: High-
Performance Vectors for Creation of Fusion Constructs in Transgenic Analysis of Plants.
Biosci. Biotechnol. Biochem. 71 (8): 2095-2100.
National Center for Biotechnology Information. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
NELSON, S.C.: Hawaii Pest and Disease Image Gallery (Miscellaneous Plants and Crops). Corn
leaf aphid. http://www.ctahr.hawaii.edu/nelsons/Misc/1_corn_leaf_aphid_maize_1.jpg.
NICOLAS, O., DUNNINGTON, S.W., GOTOW, L.F., PIRONE, T.P., HELLMANN, G.M.,
(1997): Variations in the VPg protein allow a potyvirus to overcome 6a gene resistance in
tobacco. Virology, 237: 452-459.
OERTEL, U., SCHUBERT, J., FUCHS, E. (1997): Sequence comparison of the 3'-terminal parts
of the RNA of four German isolates of sugarcane mosaic potyvirus (SCMV). Arch. Virol.
142: 675-687.
OHSHIMA, K., YAMAGUCHI, Y., HIROTA, R., HAMAMOTO, T., TOMIMURA, K., TAN,
Z., SANO, T., AZUHATA, F., WALSH, J.A., FLETCHER, J., CHEN, J., GERA, A.,
GIBBS, A. (2002): Molecular evolution of Turnip mosaic virus: evidence of host adaptation,
genetic recombination and geographical spread. J. Gen. Virol. 83: 1511-1521.
PAPPU, S.S., PAPPU, H.R., RYBICKI, E.P., NIBLETT, C.L. (1994): Unusual amino-terminal
sequence repeat characterizes the capsid protein of dasheen mosaic potyvirus. J. Gen. Virol.,
75: 239-242.
73
PARKS, T.D., HOWARD, E.D., WOLPERT, T.J., ARP, D.J., DOUGHERTY, W.G., (1995):
Expression and purification of a recombinant tobacco etch virus NIa proteinase: biochemical
analyses of the full-length and a naturally occurring truncated proteinase form. Virology, 210:
194-201.
PENG, Y.H., KADOURY, D., GAL-ON, A., HUET, H., WANG, Y., RACCAH, B. (1998):
Mutations in the HC-Pro gene of zucchini yellow mosaic potyvirus: effects on aphid
transmission and binding to purified virions. J. Gen. Virol. 79: 897-904.
PERRIÈRE, G., GOUY, M. (1996): WWW-Query: An on-line retrieval system for biological
sequence banks. Biochimie, 78: 364-369.
PETI, J. (1983): A kukorica csíkos mozaik vírus kártételének vizsgálata 24 kukoricahibriden.
Növényvédelem, 19: 18-25.
PETRIK, K., SEBESTYÉN, E., GELL, G., BALÁZS, E. (2010): Natural insertions within the N-
terminal region of the coat protein of Maize dwarf mosaic potyvirus (MDMV) have an effect
on the RNA stability. Virus Genes, 40: 135-139.
PFOSSER, M.F., BAUMANN, H. (2002): Phylogeny and geographical differentiation of
zucchini yellow mosaic virus isolates (Potyviridae) based on molecular analysis of the coat
protein and part of the cytoplasmic inclusion protein genes. Arch. Virol., 147: 1599-1609.
PIRONE, T.P., BLANC, S. (1996): Helper-dependent vector transmission of plant viruses. Annu.
Rev. Phytopathol., 34: 227-247.
POWELL-ABEL, P., NELSON, R.S., DE, B., HOFFMANN, N., ROGERS, S.G., FRALEY,
R.T., BEACHY, R.N. (1986): Delay of disease development in transgenic plants that express
the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science, 232: 738-743.
PRUSS, G., GE, X., SHI, X.M., CARRINGTON, J.C., VANCE, V.B. (1997): Plant viral
synergism: the potyviral genome encodes a broad-range pathogenicity enhancer that
transactivates replication of heterologous viruses. Plant Cell, 9: 859-868.
QUEMADA, H., L'HOSTIS, B., GONSALVES, D., REARDON, I. M., HINRICKSON, R.,
HIEBERT, E., SIEW, L. C. & SLIGHTOM, J. L. (1990): The Nucleotide Sequences of the 3'-
terminal Regions of Papaya Ringspot Virus Strains W and P. J. Gen. Virol., 71: 203-210.
RAJAMÄKI, M.L., VALKONEN, J.P. (1999): The 6K2 protein and the VPg of potato virus A
are determinants of systemic infection in Nicandra physaloides. Mol. Plant–Microbe
Interact., 12: 1074-1081.
RATCLIFF, F., HARRISON, B.D., BAULCOMBE, D.C. (1997): A Similarity Between Viral
Defense and Gene Silencing in Plants. Scince, 276 (6): 1558-1560.
74
REED, J.C., KASSCHAU, K.D., PROKHNEVSKY, A.I., GOPINATH, K., POGUE, G.P.,
CARRINGTON, J.C., DOLJA, V.V. (2003): Suppressor of RNA silencing encoded by Beet
yellows virus. Virology, 306 (2): 203-209.
RESTREPO, M.A., FREED, D.D., CARRINGTON, J.C. (1990): Nuclear transport of plant
potyviral proteins. Plant Cell, 2: 987-998.
RESTREPO-HARTWIG, M.A., CARRINGTON, J.C. (1994): The tobacco etch potyvirus 6-
kilodalton protein is membrane associated and involved in viral replication. J. Virol., 68:
2388-2397 .
REVERS, F., LE GALL, O., CANDRESSE, T., LE ROMANCER, M., DUNEZ, J. (1996):
Frequent occurence of recombinant potyvirus isolates. J. Gen. Virol., 77: 1953-1965.
REVERS, F., LE GALL, O., CANDRESSE, T., MAULE, A.J. (1999): New Advances in
Understanding the Molecular Biology of Plant/Potyvirus Interaction. Mol. Plant-Microbe
Interact., 12 (5): 367-376.
RIECHMANN, J.L., LAÍIN, S., GARCÍA, A. (1992): Highlights and prospects of potyvirus
molecular biology .J. Gen. Virol., 73: 1-16.
RIECHMANN, J.L., CERVERA, M.T., GARCIA, J.A. (1995): Processing of the plum pox virus
polyprotein at the P3-6K1 junction is not required for virus viability. J. Gen. Virol., 76: 951-
956.
ROBERTS, I.M., WANG, D., FINDLAY, K., MAULE, A.J. (1998): Ultrastructural and
temporal observations of the potyvirus cylindrical inclusions (CIs) show that the CI protein
acts transiently in aiding virus movement. Virology, 245: 173-181.
RODRIGUEZ-CEREZO, E., KLEIN, P.G., SHAW, J.G. (1991): A determinant of disease
symptom severity is located in the 3'-terminal noncoding region of the RNA of a plant virus.
Pro.c Nati. Acad. Sci. USA, 88: 9863-9867.
ROSENKRANZ, E., SCOTT, G.E. (1984): Determination of the number of genes for resistance
to maize dwarf mosaic virus strain A in five corn inbred lines. Phytopathology, 74(1): 71-76.
SALOMON, R., BERNARDI, F. (1995): Inhibition of viral aphid transmission by the N-
terminus of the maize dwarf mosaic virus coat protein. Virology, 213: 676-679.
SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F., MANIATIS, T. (1989): Molecular cloning: A Laboratory
Manual, Ed 2. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
SANFORD, J.C., JOHNSON, S.A.T. (1985): The concept of parasite-derived resistance-deriving
resistance genes from the parasite’s own genome. J. Theor. Biol., 113: 395-405.
SÁNCHEZ, F., MARTÍNEZ-HERERRA, D., AGUILAR, I., PONZ, F. (1998): Infectivity of
turnip mosaic potyvirus cDNA clones and transcripts on the systemic host Arabidopsis
thaliana and local lesion hosts. Virus Res., 55: 207-219.
75
SÁNCHEZ, F., WANG, X., JENNER, C.E., WALSH, J., PONZ, F. (2003): Strains of Turnip
mosaic virus as defined by the molecular analysis of the coat protein gene of the virus. Virus
Res., 94: 33-43.
SCHAAD, M.C., LELLIS, A.D., CARRINGTON, J.C. (1997a): VPg of tobacco etch potyvirus
is a host genotype-specific determinant for long-distance movement. J. Virol., 71: 8624-8631.
SCHAAD, M.C., JENSEN, P.E., CARRINGTON, J.C. (1997b): Formation of plant RNA virus
replication complexes on membranes: role of an endoplasmic reticulum-targeted viral protein.
EMBO J., 16: 4049-4059.
SCHAAD, M.C., ANDERBERG, R.J., CARRINGTON, J.C., (2000): Strainspecific interaction
of the tobacco etch virus NIa protein with the translation initiation factor eIF4E in the yeast
two-hybrid system. Virology, 273: 300-306.
SCHROEDER, S. (2009): Advances in RNA Structure Prediction from Sequence: New Tools for
Generating Hypotheses about viral RNA Structure-Function Relationships. J. Virol., 83:
6326-6334.
SCOTT, G.E., LOUIE R. (1996): Improved resistance to maize dwarf mosaic virus by selection
under greenhouse conditions. Crop Sci., 36: 1503-1506.
SEIFERS, D.L., SALOMON, R., MARIE-JEANNE, V., ALLIOT, B., SIGNORET, P., HABER,
S., LOBODA, A., ENS, W., SHE, Y.M., STANDING, K.G. (2000): Characterization of a
novel potyvirus isolated from maize in Israel. Phytopathology, 90: 505-513.
SHUKLA, D.D., STRIKE, P.M., TRACY, S.L., GOUGH, K.H., WARD, C.W. (1988): The N
and C Termini of the Coat Proteins of Potyviruses Are Surface-located and the N Terminus
Contains the Major Virus-specific Epitopes. J. Gen. Virol., 69: 1497-1508.
SHUKLA, D.D., TOSIC, M., JILKA, J., FORD, R.E., TOLER, R.W., LANGHAM, M.A.C.
(1989): Taxonomy of potyviruses infecting maize, sorghum, and sugarcane in Australia and
the United-States as determined by reactivities of polyclonal antibodies directed towards
virus-specific N-termini of coat proteins. Phytopathology, 79: 223-229.
SHUKLA, D.D., FRENKEL, M.J. , WARD, C.W. (1991): Structure and function of the
potyvirus genome with special reference to the coat protein coding region. Can. J. Plant
Pathol., 13: 178-191.
SILHAVY, D., MOLNÁR, A., LUCIOLI, A., SZITTYA, GY., HORNYIK, CS., TAVAZZA,
M., BURGYÁN, J. (2002): A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-
generated, 21- to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO J., 21 (12): 3070-3080.
SIMCOX, K.D., MCMULLEN, M.D., LOUIE R. (1995): Co-segregation of the maize-dwarf
mosaic-virus resistance gene, mdm1, with the nucleolus organizer region in maize. Theor.
Appl. Genet., 90: 341-346.
76
SIMMONDS, P., TUPLIN, A., EVANS, D.J. (2004): Detection of genome-scale ordered RNA
structure (GORS) in genomes of positive-stranded RNA viruses: Implications for virus
evolution and host persistence. RNA, 10: 1337-1351.
SIMON-BUELA, L., GUO, H.S., GARCIA, J.A. (1997): Long sequences in the 5' noncoding
region of plum pox virus are not necessary for viral infectivity but contribute to viral
competitiveness and pathogenesis. Virology, 233: 157-162.
SMITH, N.A., SINGH, S.P., WANG, M.B., STOUTJESDIJK, P.A., GREEN, A.G.,
WATERHOUSE, P.M. (2000): Gene expression: total silencing by intron-spliced hairpin
RNAs. Nature, 407: 319-320.
SUM, I., SEBESTYÉN, E., PAPP, I., LISZT, A. (1979): A kukorica törpe mozaik vírus hatása
15 kukoricahibridre. Növénytermelés, 28: 309-315.
SURANTO, S., GOUGH, K. H., SHUKLA, D. D., PALLAGHY C. K. (1998): Coat protein
sequence of Krish-infecting strain of Johnsongrass mosaic potyvirus. Arch. Virol., 143: 1015-
1020.
SZIRMAI, J., PAIZS, L.-NÉ (1963): A kukorica csíkos mozaik betegsége. Növénytermelés, 12:
43-50.
SZIRMAI, J.(1968): The occurrence of stripe mosaic disease of maize in Hungary and
possibilities of breeding for virus resistance. Acta Phytopathol. Entomol. Hung., 3: 189-198.
TACKE, E., SALAMINI, F., ROHDE, W. (1996): Genetic engineering of potato for broad-
spectrum protection against virus infection. Nature Biotechnology, 14: 1579-1601.
TACAHASHI, Y., UYEDA, I. (1999): Restoration of the 39 end of potyvirus RNA derived from
poly(A)-deficient infectious cDNA clones. Virology, 265: 147-152.
TEPFER, M., BALAZS, E. (editors) (1997): Virus-Resistant Transgenic Plants: Potential
Ecological Impact. Versailles & Heidelberg: INRA &Springer-Verlag.
TEPFER, M. (2002): Risk assessment of virus-resistant transgenic plants. Annu. Rev.
Phytopathol., 40: 467-491.
THIVIERGE, K., NICAISE, V., DUFRESNE, P.J., COTTON, S., LALIBERTÉ, J.F., GALL, O.,
FORTIN, M.G. (2005): Plant Virus RNAs. Coordinated Recruitment of Conserved Host
Functions by (+) ssRNA Viruses during Early Infection Events. Plant Physiol., 138: 1822-
1827.
TÓBIÁS, I., PALKOVICS, L., PERECZES J. (2003): A kukorica törpe mozaik vírus
előfordulása csemegekukoricán. Növényvédelem, 39 (6): 247-250.
TÓBIÁS, I., PALKOVICS, L. (2004): An unusual feature at the N-terminal end of the coat
protein of Maize dwarf mosaic virus isolated in Hungary. J. Phytopathol., 152: 445-447.
77
TOLDINÉ TÓTH, É. (2008): A vírusfertőzöttség hatása egy kukoricahibrid termésére.
Növényvédelmi Tudományos Napok, Absztrakt. 18.
TOLER, R.W. (1985): Maize Dwarf Mosaic, the Most Important Virus Disease of Sorghum.
Plant Dis., 69: 1011-1015.
TOMIMURA, K., GIBBS, A.J., JENNER, C.E., WALSH, J.A., OHSHIMA, K. (2003): The
phylogeny of Turnip mosaic virus; comparisons of 38 genomic sequences reveal a Eurasian
origin and a recent ’emergence’ in east Asia. Mol. Ecol., 13: 2099-2111.
TOSIC, M., FORD, R.E., SHUKLA, D.D., JILKA, J. (1990): Differentiation of sugarcane,
maize dwarf, johnsongrass, and sorghum mosaic viruses based on reactions of oat and some
sorghum cultivars. Plant. Dis., 74: 549-552.
ULLAH, Z., CHAI, B., HAMMAR, S., RACCAH, B., GAL-ON, A., GRUMAT, R. (2003):
Effect of substitution of the amino termini of the coat proteins of distinct potyvirus species on
viral infectivity and host specificity. Physiol. Mol. Plant Pathol., 63: 129-139.
URCUQUI-INCHIMA, S., HAENNI, A.L., BERNARDI, F. (2001) Potyvirus proteins: A wealth
of functions. Virus Res., 74: 157-175.
UŻAROWSKA, A., DIONIZIO, G., SARHOLZ, B., PIEPHO, H.P., XU, M., INGVARDSEN,
C.R., WENZEL, G., LÜBBERSTEDT, T. (2009): Validation of candidate genes putatively
associated with resistance to SCMV and MDMV in maize (Zea mays L.) by expression
profiling. BMC Plant Biol., Doi: 10.1186/1471-2229-9-15.
VERCHOT, J., HERNDON, K.L., CARRINGTON, J.C. (1992): Mutational analysis of the
tobacco etch potyviral 35-kDa proteinase: identification of essential residues and
requirements for autoproteolysis. Virology, 190: 298-306.
VERCHOT, J., CARRINGTON, J.C. (1995): Debilitation of plant potyvirus infectivity by P1
proteinase-inactivating mutations and restoration by second-site modifications. J. Virol., 69:
1582-1590.
VERVLIET, G., HOLSTERS, M., TEUCHY, H., VAN MONTAGUE, M., SCHELL, J. (1975):
Characterization of different plaque-forming and defective temperate phages in
Agrobacterium strains. J. Gen. Virol., 26: 33-38.
VIGNUZZI, M., STONE, J.K., ARNOLD, J.J., CAMERON, C.E., ANDINO, R. (2006):
Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions is a viral
population. Nature, 439: 344-348.
VIRAL ZONE/Potyviridae: http://expasy.org/viralzone/all_by_species/48.html.
VOINNET, O., PINTO, Y.M., BAULCOMBE, D.C. (1999): Suppression of gene silencing: A
general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants. PNAS, 96 (24): 14147-
14152.
78
WANG, R. Y., AMMAR, E. D., THORNBURY, D. W., LÓPEZ-MOYA, J. J., PIRONE, T. P.
(1996): Loss of potyvirus transmissibility and helpercomponent activity correlate with non-
retention of virions in aphidstylets. J. Gen. Virol., 77: 861-867.
WARD, C.W., SHUKLA, D.D. (1991): Taxonomy of potyviruses: Current problems and some
solutions. Intervirology, 32: 269-296.
WIDHOLM, J. M. (1972): The use of fluoresceine diacetate and phenosaphranin for determining
viability of cultured plant cells. Stain Technol., 47: 189-194.
WIKIPÉDIA: Bioetanol. http://hu.wikipedia.org/wiki/Bioetanol.
WILLIAMS, L.E., ALEXANDER, L.J. (1965): Maize dwarf mosaic virus, a new corn disease.
Phytopathology, 58: 802-804.
WITTMANN, S., CHATEL, H., FORTIN, M.G., LALIBERTÉ, J.F. (1997): Interaction of the
viral protein genome linked of turnip mosaic potyvirus with the translational eukaryotic
initiation factor (iso) 4E of Arabidopsis thaliana using the twohybrid system. Virology, 234:
84-92.
XU, M.L., MELCHINGER, A.E., LÜBBERSTEDT, T. (2000): Origin of Scm1 and Scm2 – two
loci conferring resistance to sugarcane mosaic virus (SCMV) in maize. Theor. Appl. Genet.,
100: 934-941.
XU, D.L., PARK, J.W., MIRKOV, T.E., ZHOU, G.H. (2008): Viruses causing mosaic disease in
sugarcane and their genetic diversity in southern China. Arch. Virol., 153(6): 1031-1039.
YANG, S.J., REVERS, F., SOUCHE, S., LOT, H., LE GALL, O., CANDRESSE, T., DUNEZ,
J. (1998): Construction of full-length cDNA clones of lettuce mosaic virus (LMV) and the
effects of intron-insertion on their viability in Escherichia coli and on their infectivity to
plants Arch. Virol., 143: 2443-2451.
ZHONG, Y., GUO, A., LI, C., ZHUANG, B., LAI, M., WEI, C., LUO, J., LI, Y. (2005):
Identification of a naturally occurring recombinant isolate of Sugarcane mosaic virus causing
maize dwarf mosaic disease. Virus Genes, 30 (1): 75-83.
ZUKER, M., STIEGLER, P. (1981): Optimal computer folding of larger RNA sequences using
thermodynamics and auxiliary information. Nucl. Acids Res., 9: 133-148.
79
2. sz. Melléklet. A dolgozathoz kapcsolódó közlemények jegyzéke Folyóiratban megjelent közlemények:
Gell, G., Balázs, E. and Petrik, K. (2010): Genetic diversity of Hungarian Maize dwarf mosaic virus
isolates. Virus Genes. 40: 277-281. IF: 1,706.
Petrik, K., Sebestyén, E., Gell, G. and Balázs, E. (2010): Natural insertions within the N-terminal
region of the coat protein of Maize dwarf mosaic potyvirus (MDMV) have an effect on the
RNA stability. Virus Genes. 40: 135-139. IF: 1,706.
Gell Gy., Petrik K. , Balázs E. és Divéki Z. (2008): Kukorica csíkos mozaik vírus (MDMV)
populációk molekuláris analízise. Növényvédelem, 44. (11). 567-571.
Gell, Gy., Petrik, K., Sebestyén, E. és Balázs, E. (2010). Kukorica csíkos mozaik vírus (MDMV)
populáció jellemzése két kukoricatermesztő területen. Növénytermelés. 59 (4): 19-29.
Gell, G., Petrik, K., Balázs, E. (2011). Unique sequence variant in the CP region of a MDMV isolate. Acta Phytopathologica. 46 (1): 11-15.
Tudományos előadások, poszterek:
Gell, G., Petrik, K. and Balázs, E. (2008): Genetic diversity of Maize dwarf mosaic potyvirus
(MDMV) in Hungary. MMT 2008. évi Nagygyűlése, 2008 október 14-17, Keszthely.
(poszter)
Petrik, K., Gell, G., Divéki, Z. and Balázs, E. (2008): Genetic variability and recombination events
of Maize dwarf mosaic potyvirus (MDMV). IUMS 2008 Istanbul, XIV. International Congress
of Virology, 10-15 August 2008, Istanbul. (poszter)
Balázs, E., Petrik, K., Gell, G., Divéki, Z. (2008): Recombination studies of Maize dwarf mosaic
potyvirus (MDMV) as an important factor for risk assessment in maize plants. 10th
International Symposium on the Biosafety of Genetically Modified Organisms, 16-21
November 2008, Wellington, New Zealand. (poszter)
80
Gell Gy., Petrik K., Balázs E. és Divéki Z. (2008): Kukorica csíkos mozaik vírus (MDMV)
populációk molekuláris analízise. 54. NÖVÉNYVÉDELMI TUDOMÁNYOS NAPOK.
(előadás)
Az értekezéshez szorosan nem tartozó közlemények és előadások jegyzéke:
Gell, G., Bakó, A., Spitkó, T., Pintér, J. and Balázs, E.: Monitoring of transgene expression in
maize during the vegetation period. In: 8th International Symposium in the Series RECENT
ADVANCES IN PLANT BIOTECHNOLOGY: NEW DEVELOPMENTS IN GREEN GENE
TECHNOLOGY Szeptember 1-4, 2009 - Szeged p. 53. (poszter)
Pánczél, S., Gell, Gy., Mészáros, A., Balázs, E. 2009. Regenerációs és transzformációs kísérletek
különböző olajtök (Cucurbita pepo L. var. styriaca) genotípusokkal. Lippai János – Ormos
Imre –Vas Károly Tudományos Ülésszak, Corvinus Egyetem, Budapest, október 28-30.
Abstracts pp. 48-49.
Gell, G., Bakó, A., Spitkó, T., Pintér, J. and Balázs, E.: Monitoring of transgene expression in
maize during the vegetation period. PPBA, Experiences with GMP field trials and combating
climate change challenges with green biotechnology. July 4-7, 2010-Kolozsvár, Romania.
Bakó, A., Gell, Gy., Balázs, E. (2010) Quantification of transgene expression in maize
(Zea mays L.) throughout the vegetation period. Plant Breeding. 130: 41-45. IF:
1,026.
81
82
3. sz. Melléklet. Magyarország helye a világ kukoricatermesztésében (2009) Rangsor Ország Termelés (1000$) Termelés (t/év)
1 USA 23281637 333010910 2 Kína 6621618 163118097 3 Brazília 1835853 51232447 4 Argentína 1510179 13121380 5 Indonézia 1390883 17629740 6 India 1123654 17300000 7 Dél-Afrika 960723 12050000 8 Franciaország 877298 15299900 9 Mexikó 814086 20202600 10 Nigéria 688353 Nincs adat 11 Magyaroroszág 557571 7528380
(Forrás: http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx)
4. sz. Melléklet. Magyarország helye a világ kukoricatermesztésében (zölden
learatott) Rangsor Ország Termelés (1000$) Termelés (t/év)
1 USA 831052 4223040 2 Mexikó 120158 Nincs adat 3 Nigéria 113941 Nincs adat 4 Franciaország 108234 550000 5 Magyarország 78976 421704 6 Peru 77025 391409 7 Indonézia 66121 336000 8 Dél-Afrika 61004 Nincs adat
(Forrás: http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx)
5. sz. Melléklet. Magyarország vezető mezőgazdasági terményei 2009-ben Rangsor Termény Termelés (1000 $) Termelés (t/év)
1 Kukorica 557571 7528380 2 Búza 548919 4419163 3 Sertéshús 456533 450830 4 Tehéntej 451690 1748468 5 Csirkehús 326828 280198 6 Napraforgómag 291502 1256185 7 Szőlő 255145 550000 8 Alma 164912 575368 9 Repcemag 159700 579365
(Forrás: http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx)
6. sz. Melléklet. A vizsgátokba bevont vírusizolátumok összefoglaló táblázata Vírus Szekvencia
azonosító Földrajzi eredet Gazdanövény Vonal vagy izolátum Hivatkozás
1 JGMV A27631 - - - Direct submission 2 JGMV AF032404 Australia/Queensland/Darling Downs Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) JGMV-Kr Suranto et al., (1998) 3 JGMV AY387806 Australia/Queensland/Bowen Sweet corn (Zea mays L. convar. saccharata) Zma2002Q2 Laidlaw et al., (2004) 4 JGMV AY387807 Australia/Queensland/Bowen Sweet corn (Zea mays L. convar. saccharata) Zma2001Q Laidlaw et al., (2004) 5 JGMV AY387808 Australia/Queensland/Bowen Forage sorghum (Sorghum vulgare var. frumentaceum) Sfo2002Q Laidlaw et al., (2004) 6 JGMV AY387809 Australia/Queensland/Cambooya Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers) Sha2003Q1 Laidlaw et al., (2004) 7 JGMV AY387810 Australia/Queensland/Warwick-Gatton Rd Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers) Sha2003Q2 Laidlaw et al., (2004) 8 JGMV AY387811 Australia/Queensland/Warwick Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers) Sha2003Q6 Laidlaw et al., (2004) 9 JGMV AY387812 Australia/Queensland/Silverdale Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers) Sha2003Q4 Laidlaw et al., (2004) 10 JGMV AY387813 Australia/Queensland/Pilton Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers) Sha2003Q3 Laidlaw et al., (2004) 11 JGMV AY387814 Australia/Queensland/Fassifern Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers) Sha2003Q5 Laidlaw et al., (2004) 12 JGMV AY387815 Australia/Queensland/Allora Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers) Sha2001Q Laidlaw et al., (2004) 13 JGMV AY387816 Australia/Queensland/Retro near Clermont Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers) Sha2000Q Laidlaw et al., (2004) 14 JGMV AY387817 Australia/Queensland/Biloela Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Sbi2001Q Laidlaw et al., (2004) 15 JGMV AY387818 Australia/Queensland/Darling Downs Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Sbi2000Q4 Laidlaw et al., (2004) 16 JGMV AY387819 Australia/Queensland/Bowen Sweet corn (Zea mays L. convar. saccharata) Zma2002Q1 Laidlaw et al., (2004) 17 JGMV AY387820 Australia/Western Australia/Ord Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Sbi1996W Laidlaw et al., (2004) 18 JGMV AY387821 Australia/New South Wales/Northern Star Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Sbi1996N1 Laidlaw et al., (2004) 19 JGMV AY387822 Australia/Queensland/Biloela Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Sbi2000Q3 Laidlaw et al., (2004) 20 JGMV AY387823 Australia/Queensland/Warwick Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Sbi1996Q Laidlaw et al., (2004) 21 JGMV AY387824 Australia/Queensland/Emerald Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Sbi2000Q2 Laidlaw et al., (2004) 22 JGMV AY387825 Australia/Queensland/Gatton Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Sbi2000Q5 Laidlaw et al., (2004) 23 JGMV AY387826 Australia/New South Wales/Liverpool Plains Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Sbi1996N2 Laidlaw et al., (2004) 24 JGMV AY387827 Australia/New South Wales/Gindie via Emerald Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Sbi2000Q1 Laidlaw et al., (2004) 25 JGMV AY387828 Australia/Queensland/Bowen Sweet corn (Zea mays L. convar. saccharata) Zma1996Q Laidlaw et al., (2004) 26 JGMV U07217 USA/Texas - MDO Direct submission 27 JGMV U07218 USA/Kansas - KS1 Direct submission 28 JGMV Z26920 Australia - Jg Gough and Shukla (1993) 29 MDMV A34974 - - strainA Direct submission 30 MDMV AF395135 Israel Maize (Zea mays L.) Israel Direct submission 31 MDMV AJ001691 Bulgaria - Bg Kong and Stainbiss (1998) 32 MDMV AJ416633 Spain - M1 Direct submission 33 MDMV AJ416634 Spain - M3 Direct submission 34 MDMV AJ416635 Spain - S1 Direct submission
83
Vírus Szekvencia
azonosító Földrajzi eredet Gazdanövény Vonal vagy izolátum Hivatkozás
35 MDMV AJ416636 Spain - M2 Direct submission 36 MDMV AJ416637 Spain - M4 Direct submission 37 MDMV AJ416638 Spain - S2 Direct submission 38 MDMV AJ416639 Spain - S3 Direct submission 39 MDMV AJ416640 Spain - M5 Direct submission 40 MDMV AJ416641 Spain - S4 Direct submission 41 MDMV AJ416642 Spain - S5 Direct submission 42 MDMV AJ416643 Spain - M6 Direct submission 43 MDMV AJ416644 Spain - M7 Direct submission 44 MDMV AJ416645 Spain Maize (Zea mays) Sp Achon et al., (1994) 45 MDMV AJ437348 Spain/Lleida - S6 Direct submission 46 MDMV AJ542536 Hungary/Szekszárd Sweet corn (Zea mays L. convar. saccharata) ScH / SYN Tóbiás and Palkovics (2004) 47 MDMV AJ563724 Hungary/Szekszárd Sweet corn (Zea mays L. convar. saccharata) GH2385 Tóbiás and Palkovics (2004) 48 MDMV AM110758 Spain Maize (Zea mays L.) SP Achon et al., (2007) 49 MDMV AM490848 Bulgaria/Burgas Maize (Zea mays L.) B2 Direct submission 50 MDMV AM490849 Bulgaria/Knyezsa Maize (Zea mays L.) K1 Direct submission 51 MDMV AM491607 Bulgaria/Sumen Maize (Zea mays L.) Sumen Direct submission 52 MDMV DQ973169 Argentina Maize (Zea mays L.) Arg Direct submission 53 MDMV FM883196 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar.dentiformis) Mv0603 Gell et al., 2010 54 MDMV FM883197 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar.dentiformis) Mv0614 Gell et al., 2010 55 MDMV FM883198 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar.dentiformis) Mv0615 Gell et al., 2010 56 MDMV FM883199 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar.dentiformis) Mv0621 Gell et al., 2010 57 MDMV FM883200 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar.dentiformis) Mv0702 Gell et al., 2010 58 MDMV FM883201 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar.dentiformis) Mv0704 Gell et al., 2010 59 MDMV FM883202 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar.dentiformis) Mv0705 Gell et al., 2010 60 MDMV FM883203 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar.dentiformis) Mv0708 Gell et al., 2010 61 MDMV FM883204 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar.dentiformis) Mv0709 Gell et al., 2010 62 MDMV FM883205 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar.dentiformis) Mv0710 Gell et al., 2010 63 MDMV FM883206 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar.dentiformis) Mv0712 Gell et al., 2010 64 MDMV FM883164 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar.dentiformis) Mv0801 Gell et al., 2010 65 MDMV FM883165 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar.dentiformis) Mv0802 Gell et al., 2010 66 MDMV FM883166 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0803 Gell et al., 2010 67 MDMV FM883167 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0804 Gell et al., 2010 68 MDMV FM883168 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0805 Gell et al., 2010 69 MDMV FM883169 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0806 Gell et al., 2010
84
Vírus Szekvencia
azonosító Földrajzi eredet Gazdanövény Vonal vagy izolátum Hivatkozás
70 MDMV FM883170 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0807 Gell et al., 2010 71 MDMV FM883171 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0808 Gell et al., 2010 72 MDMV FM883172 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0809 Gell et al., 2010 73 MDMV FM883173 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0810 Gell et al., 2010 74 MDMV FM883174 Hungary/Martonvásár Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers) Mv0811 Gell et al., 2010 75 MDMV FM883175 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0812 Gell et al., 2010 76 MDMV FM883176 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0813 Gell et al., 2010 77 MDMV FM883177 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0814 Gell et al., 2010 78 MDMV FM883178 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0815 Gell et al., 2010 79 MDMV FM883179 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0816 Gell et al., 2010 80 MDMV FM883180 Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0817 Gell et al., 2010 81 MDMV Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0901 82 MDMV Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0902 83 MDMV Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0903 84 MDMV Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0904 85 MDMV Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0905 86 MDMV Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0906 87 MDMV Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0907 88 MDMV Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays. L. convar. mikrosperma) Mv0908 89 MDMV Hungary/Martonvásár Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers) Mv0909 90 MDMV Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0910 91 MDMV Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0911 92 MDMV Hungary/Martonvásár Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Mv0912 93 MDMV FM883207 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0601 Gell et al., 2010 94 MDMV FM883208 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0602 Gell et al., 2010 95 MDMV FM883209 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0603 Gell et al., 2010 96 MDMV FM883210 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0604 Gell et al., 2010 97 MDMV FM883211 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0605 Gell et al., 2010 98 MDMV FM883212 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0606 Gell et al., 2010 99 MDMV FM883213 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0607 Gell et al., 2010 100 MDMV FM883214 Hungary/Szeged Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers) Sz0608 Gell et al., 2010 101 MDMV FM883215 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0609 Gell et al., 2010 102 MDMV FM883216 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0610 Gell et al., 2010 103 MDMV FM883217 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0611 Gell et al., 2010 104 MDMV FM883218 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0612 Gell et al., 2010 105 MDMV FM883219 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0701 Gell et al., 2010
85
Vírus Szekvencia
azonosító Földrajzi eredet Gazdanövény Vonal vagy izolátum Hivatkozás
106 MDMV FM883220 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0702 Gell et al., 2010 107 MDMV FM883221 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0703 Gell et al., 2010 108 MDMV FM883222 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0704 Gell et al., 2010 109 MDMV FM883223 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0705 Gell et al., 2010 110 MDMV FM883224 Hungary/Szeged Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers) Sz0706 Gell et al., 2010 111 MDMV FM883225 Hungary/Szeged Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Sz0707 Gell et al., 2010 112 MDMV FM883226 Hungary/Szeged Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Sz0708 Gell et al., 2010 113 MDMV FM883227 Hungary/Szeged Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Sz0709 Gell et al., 2010 114 MDMV FM883228 Hungary/Szeged Grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) Sz0710 Gell et al., 2010 115 MDMV FM883181 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0801 Gell et al., 2010 116 MDMV FM883182 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0802 Gell et al., 2010 117 MDMV FM883183 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0803 Gell et al., 2010 118 MDMV FM883184 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0804 Gell et al., 2010 119 MDMV FM883185 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0805 Gell et al., 2010 120 MDMV FM883186 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0806 Gell et al., 2010 121 MDMV FM883187 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0807 Gell et al., 2010 122 MDMV FM883188 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0808 Gell et al., 2010 123 MDMV FM883189 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0809 Gell et al., 2010 124 MDMV FM883190 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0810 Gell et al., 2010 125 MDMV FM883191 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0811 Gell et al., 2010 126 MDMV FM883192 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0812 Gell et al., 2010 127 MDMV FM883193 Hungary/Szeged Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers) Sz0813 Gell et al., 2010 128 MDMV FM883194 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0814 Gell et al., 2010 129 MDMV FM883195 Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0815 Gell et al., 2010 130 MDMV Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0901 131 MDMV Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0902 132 MDMV Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0903 133 MDMV Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0904 134 MDMV Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0905 135 MDMV Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. indurata) Sz0907 136 MDMV Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0908 137 MDMV Hungary/Szeged Maize (Zea mays L. convar. dentiformis) Sz0909 138 MDMV Hungary/Szeged Johnsongrass (Sorghum halepense (L.) Pers) Sz0910 139 MDMV AJ563726 Hungary/ Szekszárd Maize (Zea mays L. convar. saccharata) Royalty Tóbiás et al., (2004) 140 MDMV AJ563725 Hungary/ Szekszárd Maize (Zea mays L. convar. saccharata) Dallas Tóbiás et al., (2004)
86
Vírus Szekvencia
azonosító Földrajzi eredet Gazdanövény Vonal vagy izolátum Hivatkozás
141 MDMV MDU07216 - - StrainA Direct submission 142 MDMV NC003377 Bulgaria Maize (Zea mays L.) Bg Kong and Stainbiss (1998) 143 PeMV AY172336 China Whitegrass (Pennisetum flaccidum Griseb.) W1 Fan et al., (2003) 144 PeMV AY543166 China Maize (Zea mays L.) M Fan et al., (2004) 145 PeMV AY083684 China Whitegrass (Pennisetum flaccidum Griseb.) W2 Direct submission 146 NC_007147 China - B PeMV Direct submission 147 PeMV DQ977725 China Whitegrass (Pennisetum flaccidum Griseb.) C Deng et al., (2008) 148 SCMV AF006728 USA Sugarcane (Saccharum officinarum L. cv. Q145) Isis3 Alegria et al., (2003) 149 SCMV AF006729 USA Sugarcane (Saccharum officinarum L. cv. Q146) Isis2 Alegria et al., (2003) 150 SCMV AF006730 USA Sugarcane (Saccharum officinarum L. cv. Q124) Isis5 Alegria et al., (2003) 151 SCMV AF006731 USA Sugarcane (Saccharum officinarum L. cv. Q155) Isis7 Alegria et al., (2003) 152 SCMV AF006732 Australia Sugarcane (Saccharum officinarum L. cv. Q124) Namour2 Alegria et al., (2003) 153 SCMV AF006733 Australia Sugarcane (Saccharum officinarum L. cv. Q137) Namour7 Alegria et al., (2003) 154 SCMV AF006734 Australia Sugarcane (Saccharum officinarum L. cv. Q44) Brisbane Alegria et al., (2003) 155 SCMV AF006735 Australia Sugarcane (Saccharum officinarum L. cv. Q137) Bundaberg Alegria et al., (2003) 156 SCMV AF006736 USA/Louisiana Sugarcane (Saccharum officinarum L.) usla Alegria et al., (2003) 157 SCMV AF006737 USA/Florida Sugarcane (Saccharum officinarum L.) usfl Alegria et al., (2003) 158 SCMV AF006738 South Africa Sugarcane (Saccharum officinarum cv. B3337) sa Direct submission 159 SCMV AF494510 China/Henan - Henan Direct submission 160 SCMV AJ006199 - - G951 Direct submission 161 SCMV AJ006200 - - G952 Direct submission 162 SCMV AJ006201 - - Bg Ha et al., (2008) 163 SCMV AJ006202 - - G96 Direct submission 164 SCMV AJ271085 China/Zhejiang Maize (Zea mays L.) Zhejiang Chen et al., (2001) 165 SCMV AJ278405 Australia/Brisbane - strainA Direct submission 166 SCMV AJ297628 China/Zhejiang/Hangzhou Maize (Zea mays L.) HZ Direct submission 167 SCMV AJ310102 China/Zhejiang/Linping Sugarcane (Saccharum officinarum L.) LP Chen et al., (2002) 168 SCMV AJ310103 China/Zhejiang/Xhiangshan Sugarcane (Saccharum officinarum L.) XgS Chen et al., (2002) 169 SCMV AJ310104 China/Zhejiang/Yuhang Sugarcane (Saccharum officinarum L.) YH Chen et al., (2002) 170 SCMV AJ310105 China/Guangdong Maize (Zea mays L.) GD Chen et al., (2002) 171 SCMV AJ310106 China/Zhejiang/Dongyang Maize (Zea mays L.) DY Chen et al., (2002) 172 SCMV AJ310107 China/Jiangsu Maize (Zea mays L.) JS Chen et al., (2002) 173 SCMV AJ310108 China/Henan Maize (Zea mays L.) HN Chen et al., (2002) 174 SCMV AJ310109 China/Hebei Maize (Zea mays L.) HeB Chen et al., (2002) 175 SCMV AJ310110 China/Hubei Maize (Zea mays L.) HuB Chen et al., (2002)
87
Vírus Szekvencia
azonosító Földrajzi eredet Gazdanövény Vonal vagy izolátum Hivatkozás
176 SCMV AJ310111 China/Shandong Maize (Zea mays L.) SD Chen et al., (2002) 177 SCMV AJ311168 Spain/Lleida - clone s12 Achon et al., (2004) 178 SCMV AJ311169 Spain/Lleida - clone s15 Achon et al., (2004) 179 SCMV AM110759 Spain Maize (Zea mays L.) Sp Achon et al., (2007) 180 SCMV AM501531 Thailand Sugarcane (Saccharum officinarum L.) 83up2 Direct submission 181 SCMV AM501533 Thailand Sugarcane (Saccharum officinarum L.) KR2 Direct submission 182 SCMV AY149118 China/Shandong Maize (Zea mays L.) SD Direct submission 183 SCMV AY195610 Mexico/Veracruz/ Poza Rica Maize (Zea mays L.) Mx Espejel et al., (2006) 184 SCMV AY569692 China/Shanxi Maize (Zea mays L.) SX Zhong et al., (2005) 185 SCMV AY590778 China/Fujian - Fujian Direct submission 186 SCMV AY629310 Thailand Sugarcane (Saccharum officinarum L.) UT6.2 Gemechu et al., (2006) 187 SCMV AY629312 Thailand Maize (Zea mays L.) Saraburi Direct submission 188 SCMV AY639645 China/Taian Maize (Zea mays L.) Taian Direct submission 189 SCMV AY660663 China - Hebei Direct submission 190 SCMV AY836523 USA Sugarcane (Saccharum officinarum L.) strainE Direct submission 191 SCMV AY953351 China/Fuzhou - strainD Direct submission 192 SCMV D00948 Australia Sugarcane (Saccharum officinarum L.) Sc Frenkel et al., (1991) 193 SCMV D00949 Australia Maize (Zea mays L.) MDB (MDMV strain B) Frenkel et al., (1991)/Alegria et al., (2003) 194 SCMV DQ315489 Brazil - BR01 Direct submission 195 SCMV DQ315490 Brazil - B02 Direct submission 196 SCMV DQ315491 Brazil - BR06 Direct submission 197 SCMV DQ315492 Brazil - BR08 Direct submission 198 SCMV DQ315493 Brazil - BR9 Direct submission 199 SCMV DQ315494 Brazil - BR10 Direct submission 200 SCMV DQ315495 Brazil - BR11 Direct submission 201 SCMV DQ315496 Brazil - BR13 Direct submission 202 SCMV DQ315497 Brazil - BR14 Direct submission 203 SCMV DQ315498 Brazil - BR15 Direct submission 204 SCMV DQ438949 Iran Sugarcane (Saccharum officinarum L.) KhzQ86/strainA Direct submission 205 SCMV DQ647651 Thailand Maize (Zea mays L.) Mz-SB1 Direct submission 206 SCMV DQ647652 Thailand/Suphan Buri Sugarcane (Saccharum officinarum L.) UT1 Direct submission 207 SCMV DQ647653 Thailand/Kanchanaburi Sugarcane (Saccharum officinarum L.) KB1 Direct submission 208 SCMV DQ647659 Thailand Maize (Zea mays L.) NB1 Direct submission 209 SCMV DQ647660 Thailand Maize (Zea mays L.) Mz-TK1 Direct submission 210 SCMV DQ647661 Thailand Sugarcane (Saccharum officinarum L.) UD1 Direct submission
88
89
Vírus Szekvencia
azonosító Földrajzi eredet Gazdanövény Vonal vagy izolátum
211 SCMV DQ846832 China/Shaanxi Maize (Zea mays L.) Shaanxi Direct submission 212 SCMV DQ925432 Vietnam/Hanoi Arrowroot (Maranta arundinacea) VN/AR1 Ha et al., (2008) 213 SCMV DQ925428 Vietnam/Hanoi Sugarcane (Saccharum officinarum L.) VN/SC4 Ha et al., (2008) 214 SCMV DQ925429 Vietnam/Ha Tay Maize (Zea mays L.) VN/M2 Ha et al., (2008) 215 SCMV DQ925430 Vietnam/Bac Giang Sugarcane (Saccharum officinarum L.) VN/SC3 Ha et al., (2008) 216 SCMV DQ925431 Vietnam/Yen Bai Sugarcane (Saccharum officinarum L.) VN/SC1 Ha et al., (2008) 217 SCMV NC/003398 China/Zhejiang Maize (Zea mays L.) Zhejiang Chen et al., (2002) 218 SCMV S77088 China Maize (Zea mays L.) MDMV/CHI Alegria et al., (2003) 219 SCMV SMU57354 USA/Louisiana Sugarcane (Saccharum officinarum L.) strainA Alegria et al., (2003) 220 SCMV SMU57355 USA/Louisiana Sugarcane (Saccharum officinarum L.) strainB Alegria et al., (2003) 221 SCMV SMU57356 USA/Louisiana Sugarcane (Saccharum officinarum L.) strainD Alegria et al., (2003) 222 SCMV SMU57357 USA/Florida Sugarcane (Saccharum officinarum L.) strainE Alegria et al., (2003) 223 SCMV X98165 Germany/Seehausen Maize (Zea mays L.) Seehausen/s26 Oertel et al., (1997) 224 SCMV X98166 Germany/Seehausen Maize (Zea mays L.) Seehausen/s288 Oertel et al., (1997) 225 SCMV X98167 Germany/Borsdorf Maize (Zea mays L.) Borsdorf Oertel et al., (1997) 226 SCMV X98168 Germany/Boetzimg Maize (Zea mays L.) Boetzing Oertel et al., (1997) 227 SCMV X98169 Germany/Hoensted Maize (Zea mays L.) Hoensted Oertel et al., (1997) 228 SCMV DQ925426 Vietnam/Hoa Binh Maize (Zea mays L.) VN/M1 Ha et al., (2008) 229 SCMV AJ310194 China/Zhejiang/Xiangshan Hybrid sugarcane (S. inter-specific hybrids) XgS Chen et al., (2002) 230 SrMV AJ310195 China/Zhejiang/Linping Hybrid sugarcane (S. inter-specific hybrids) LP Chen et al., (2002) 231 SrMV AJ310196 China/Zhejiang/Linhai Hybrid sugarcane (S. inter-specific hybrids) LH Chen et al., (2002) 232 SrMV AJ310197 China/Zhejiang/Xiaoshan Hybrid sugarcane (S. inter-specific hybrids) XoS Chen et al., (2002) 233 SrMV AJ310198 China/Zhejiang/Yuhang Hybrid sugarcane (S. inter-specific hybrids) YH Chen et al., (2002) 234 SrMV DQ925433 Vietnam/Hoabinh Hybrid sugarcane (S. inter-specific hybrids) VN/SC5 Chen et al., (2002) 235 SrMV DQ925434 Vietnam/Hatay Hybrid sugarcane (S. inter-specific hybrids) VN/SC6 Chen et al., (2002) 236 SrMV NC/004035 China/Zhejiang Hybrid sugarcane (S. inter-specific hybrids) Xiaoshan Chen et al., (2002) 237 SrMV SMU07219 USA Sugarcane (Saccharum officinarum L.) strainH Direct submission 238 SrMV SMU57358 USA Sugarcane (Saccharum officinarum L.) SouthTexas/strainH Mirkov and Yang (1997) 239 SrMV SMU57359 USA Sugarcane (Saccharum officinarum L.) strainI Mirkov and Yang (1997) 240 SrMV SMU57360 USA Sugarcane (Saccharum officinarum L.) strainM Mirkov and Yang (1997) 241 SrMV AF228693 Israel - ISR Direct submission
Hivatkozás
7. sz. Melléklet. A két teljes hosszúságú MDMV klón nukleotid sorrendje
>Mv-0801-M AAAAACAACAAGACTCAACACAACACAACCAAACACGACCAAACACAACCAAACTTTACGTTATCGGAGCACATTCAGATTGTAGGCAACGGTTCGATTGCAAGGAGCATCGAAAAGCCTCTCTGAACACACGATCGCAATGGCAGGAACATGGACTCACGTTACTTACAAGTGGCAGCCAAACCTCGACAACCCTCGTGACGTTAGGAAGAGCATGGAATTGTTCGCTGCAAAGCGTCAAGTCTATGACGAGAAGCGGGCTCTGGAACACAACAGTAGACTACTTCGTAGAGCTCAGGTGGTGGATGTCAAACCAATAATCACGGCTCAACCAAAGAAATGTGCACAGATGTGGAAAGAAGTGGCGGATCATAATCCGACAAATGATTTCGTGTATGCACGCTTCTCTGAGATTAAGGAGCAGCAACCCACCAAACCAGTTGCAATCTCAGTTAATGAGCTGGTGAGGAAAACTCTTGAAATACGGAAGAAGTTTCCAGTGAACGTTGAGTTTGTTGGAAAGAAACGCAAGAATACAACAAGAGTTTCATTGAAGAAGGTTTTTAATAAAACGTTCCTACACTGTGGCACACGCCACGAAGAAAACCAGTTCAAGCGAATTGACACTAATATCACTCGGGACTGGATTCCAGTGTTATCAAGCGTAGCAAAATGTTACGCAACACTGTCTTCTAACATGATGCACAACATACACAAAGGACACAGTGGTTTAACGTTTATCCAGAATGATGAGCTTTTTATAATTCGAGGAAGACTTAGAGGCGAACTTTGCAATAGCTTGGATTACACCACAAACATTCAAGAGATAGAACACTATGCAGACCCACAAGCAGCTGACTTTTGGAGGGGGTACACCAATGCATATGTTGCAAATAGAAATATTTCAACAACGCACACAGAGCACACGCCTACAGTAAATCTAGAAATGTGTGGAAAGCGTATGGCCTTGCTAGAAGTTCTTTTCCACTCTACATTCAAAATCACATGCAAACACTGCAACACCGATGATCTCGAATTAGCTGATGATGAATTTGGAGATAAGCTTTATAAAAATATTCAGCGAATTGAGGATCAACAGAGTGAATATCTTGCTGAAGATCAGAAACTTAAGCGAATGTTAACATTCATCAAGGCTAGATGCACACCAAAGTTCGATCATCTACCACTAAATTGGCAAGTTGCAGACATTGTTGGACATTATTCAGACAATCAAACCAAGCAAATTCTTGATGTGAACGAGGCGCTGATTAGAATAAACACGCTCACACCATCAGATGCATTAAAGGCGAGCGCAGCTCTTCTTGAATTATCGAGATGGTACAAGAATAGGAAAGAATCAGCAAAGGAGGACAACTTATCCACATTTCGTAACAAGGTTTCCCCGAAGAGCACAATTAACTTAGCATTGATGTGTGACAATCAGCTCGATTCAAATGGCAACTTTGTCTGGGGAAAGAGAGAGTATCACGCAAAGAGATTCTTCTCAAATTACTTTGAAGCTGTGGATCCAACTGATTCATATGAGAAACACGTGACACGTTTTAATCCAAATGGACAAAGAAAGTTATCTATTGGCAAATTGGTTATCCCTTTGGACTTCCAACGTATCCGCGATTCATTTGCTGGCATACCTATCATGAAGCAGCCACTTTCAAACGCTTGTTTGAGCAGAATCGACAAAACTTACGTTTATCCTTGCCGCTGTGTGACAACAGAATTTGGACAGCCCGCTTATTCAGAAATTATACCTCCGACAAAGGGCCATTTAACAATTGGCAACTCTGTTGATCCAAAGATAGTGGACTTGCCAAATACAGATCCACCAACGATGTATATTTCAAAAGATGGATACTGTTATATAAACATTTTCTTGGCAGCTATGATAAATGTGAACGAAGATTCAGCCAAGGATTATACAAAATTCATCAGAGATGAACTCATAGAGAGACTTGGTAAGTGGCCTAAACTTAAGAATGTGGCAACAGCATGCTATGCATTATCAGTGATGTTCCCAGAAATCAAGAACGCTGAATTACCTCAGATTCTTGTGGATCATGAGAACAAAACAATGCATGTGGTGGACTCATATGGATCATTAAGCGTTGGCTATCATATCCTGAAAGCAAACACTGTAGGGCAGCTTATCAAAATGCAATATGAATCCATGGAGAGTGAAATGAGAGAATATGCAGTTGGTGGCACGATAACACACAAATCATTTTCTACCTTAATTAGCCATTTGATAAAGAATATGTTTAAGCCGCGTGAAATGAAGAAAATCATTGAGGAAGAGCCTTTTCAAATTATGTTGTCTGTTGTATCTCCAACTGTTCTCATAGCTCTATACAATAATTGTCATATTGAGAATGCAATGGCACATTGGATTACAAAGAACCAGGGAGTAGCAGCAATGCTCGCACAACTAGAAGCTCTAGCAAAAGAAACATCAAAGGCTGAGCTTTTAATTCAACAGATGACAATTCTAGAGAAAGCTTCAAGTCAGTTGAAATTAGCTGTAATGGGCTTGAATCATGTCGATCCAGCTAAGCGACTACTCTGGTCACACTTGGAAGTCATGTCATCAAGAGCTGAGACAAACAAAGATTTACTGGACCAAGGTTACGCTTTATACAGCGACAGGTTGTACACTATAGTTGAAAAAACCTATGTAGATCAGTTAAATCAAGCATGGACAGAGTTATCATTGTGTGGAAAATTTTCCGAAACATGGCGTGTGTACAAGGACAAGAAATACTACAAGCCATCTTTAGTCCTGAGAAAAAGCGTAGATTTAGGCGCTGTTTACAATATATCAGTTACGCATCGAATATCAAGTTTAGTGCAGAAAAGTCGCAGTCAAGTCAGCTCTACTTTAACCAAACTCCACCAAAGTTCATGTGATAAGTTACATACTTTGCGTACTAAAGCAATAAATACAATATATTGGTTTATCCCTGATATTTTTCGGCTTATTCACATCTTTATAGTACTAAGTTTATTATCGACAGTAGCAAACACTATTATAGTAACAATGCAAGATTACAAAAAACTACAAAAACAAGTTCGTGAAGAAGAATACGAGAAGGAGATAAGCGAAGTACGAGCTATACACGCAAAATTGCTCAAGATACATGAGAACGATCTCACTTGTGAACAGTTCTTGCAGTACATTCATGAAAACCATCCAAGGTTAATTGAAGCAGCTATTGAACT
90
ATCAGGAGTGGGAGTGATACACGAAGGTAAATCCAATCTTGAAATCAATCTGGAGCAAGCAATGGCCATTGGAACGTTAATCACGATGATATTCGATCCAACAAAAAGTGATGCTGTTTATAAAGTACTTAATAAGATGAGAACAATTCTGAGCACAGTCGAACAAGATGCACCTTTTCCGCGTATCGATTTCACAAATATCTTTCGAACACAAGTGACTCACCAAAGCTTAGATTTGGATGATCCTCTCACTATTAATACTGACAAGAAACTCACAGTTGATTTTGACACAACTCAAGATCTTCCAGCGGACACCTTCAGCAATGATGTGACATTTGATCAATGGTGGTCAAACCAACTTGAGAACAATAGAACTGTTCCGCATTATAGACTTGGTGGTGAATTTATTGAATTCACACGAGAGAAAGCAGCATCTGTGAGCATAAGTATTGCACATTCGCAAATTGAGAAGGAATATTTGCTCAGAGGAGCAGTTGGATCAGGAAAATCAACAGGCTTGCCATACCATTTGAGTCAGCGGGGAAAAGTTCTACTATTAGAGCCAACACGACCGCTTGCAGAGAACGTTTGTAGACAGCTGCAAGGGGCTCCGTTCAATGTAAGCCCTACGCTACAGATGAGAGGTTTGAGCTCTTTTGGATCAACACCCATCACAATCATGACATCGGGTTTTGCACTCCATATGTACGCGAATAATCCTGACAAACTATCAAATTATGATTTTGTCATATTTGATGAATGTCACATCATGGAAGCTCCAGCCATGGCTTTCTATTGTCTTCTTAAAGAATATGCATTTAACGGGAAGATAATCAAAGTTTCAGCTACACCACCAGGAAGGGAGTGTGAGTTCTCTACGCAACATCCAGTTGACATTCACGTTTGCGAGAATTTAACTCAAAACCAGTTCGTGCTTGAACTTGGCACTGGATCAAAAGCCGATGCCACTAAGTATGGTAACAATATCCTTGTATATGTGGCTAGCTATAATGATGTCGACTCATTAGCAAGAGCTCTGATCGAACGACATTACTCAGTAATTAAAGTTGATGGTCGAACGATGAAACAGAACACGAACGGAATCCATCCGAATGGACATGATGGGAAGAAGTGTTTCATAGTTGCTACCAACATAATCGAGAATGGAGTTACATTGGATGTCGACGTCGTTGTCGATTTCGGTCTCAAAGTCACGGCTGAATTGGATGTTGATAACAGAGCAGTAATGTATCGGAAAGTGAGCATATCCTATGGCGAAAGAATTCAGCGACTCGGAAGGGTTGGGAGAACAAAACCAGGAACTGTCATTAGGATTGGAACGACTATGAAAGGACTTCAAGAGATACCAGCTATGATAGCAACGGAAGCAGCCTTCCTTTGCTTTGCATATGGGCTTAAAGTTATCACACACAACGTTTCGACTACGCACCTGTCAAAATGTACAGTTAAGCAGGCTAGAACCATGATGCAATTTGAGCTTTCTCCATTTATTATGTCTGAACTGGTTAAATTTGATGGCTCAATGCATCCGCAAATACACGAAGTTCTCAAGAAGTATAAGCTCAGAGAATCTGTGATCATGTTACGACCTAATGCAATTCCTCACACGAATGTCCATAATTGGTTAACAGTTAAAGATTACAACAAAATCGGGTGTGATCTTGAATTAGATGACTATGTGAAAGTTCCATATTTTATTAGAGGCATTCCCGAGAAGGTATATTCAGATATTTATAAGATTGTGCTAGAGTATGGGTCCACAAGTTGTTATGGGAGACTCTCAAGTGCGTGTGCTGGAAAAGTTGCTTATACACTGCGCACAGATCCTTTTGCTTTACCACGAACAATTGCTATTGTAAATCAACTTATAGCTGAGGAGCACGCCAAACGTGACCATTATAATTCAATCACGTCAAATCCATCATCTTCACATGCATTTTCGCTTACAGGAATTTGCAACATGCTGGCTTCGAGGTACATGAAGGATCACTCAAGGGAAAACATAGAAAAATTGACACGTGTTAAAGATCAACTGATCGAGTTCAGAGGGACTGGAGGTGAATTCAAGAATCCAGAGGATTTACTTGAATTTGGTGGATTGGTTACAGTCATTCACCAAGGATTGGATTCTACCGCTCAATGCCTGCAGCTTAAAGGAAGGTGGAATGGAGATTTAATCCAACGCGATTTGATGATATCAGCTGGCGTTTTCACAGGCGGTCTACTGATGCTCTGGTTCCTTTTCCGAAAATGGTCAACCACAGACGTCAAACACGAAGCTAAGACAAAACGCAGCAGGCAAAAACTTAAGTTTAGGCAAGCACGTGACAACAAGTATGCTTACGATGTCACTGGATCCAAAGATGCGATTGAAGAAAATTTCGGATCAGCTTACGTCAAGAAAGACAAGAAGAAGGGAACAAAAGTTGGATTGGGAGTTAAGCAACATAAGTTCTATATGCTGTACAATTTTGATCCACAAGACTACAATCTAATTCGATTTGTGGATCCACTTACGGGTGCAACTCTTGATGAGCAGCTCAATGCAGATATTAAGATGGTCCAGGAACATTTCGCAGAGATTCGAGAGGCCGCTATAAACAACGATCAATTGGAGTATCAACACATTTACTCGAATCCAGGAATTAAAGCGTATTTTATACGGAATGGATCTCAAAATGCTCTTAAAGTGGACATGACACCACACGAACCTTTAAGGGTTGTTACTGGCAACAATATAGCAGGATTTCCCGAACAAGAAGGTACGTTGCGACAAACTGGAAAAGCACAAGTGATACCTCTTGGACAAGTACCGGCGCCAAACGAAGTGGAAGTAGAACATGAAGCAAAGTCCATGTTAACAGGTTTGGTGGATTACACGCCCATAGCCAATCAGATTTGCATAATTGAAAATCATTCAGATGATGTTAGGCTTTGCATGTATGCTATAGGATATGGATCGTACTTAATCACTCCTGCACACCTCTTCAAAGCAAACAATGGAGAATTAACATTTCGATCCACGCGAGGGGTGTACAAGATGAGAAACTCAGTGGAAGTAAAGCTACATCACGTTAAGGGGCGCGATTTAGTTATAATTCAACTACCCAAAGACTTTCCTCCATTTCCACAGAAACTTAAATTTCAGGCACCTAATCGTGAGAACAAGGTGTGTTTGGTTGGCGTTAACTTTCAACAGAACCATTCTTCATGTGTAATTTCTGAAAGTAGCACAATTGCGCCAAAAGGGAATAATACATTCTGGAGTCATTGGATCTCAACAACAGATGGTCAATGCGGTTTACCATTAGTTGACATTAAGACCAGAAGTATAGTTGGGGTACATAGCCTTGCATCCGTGAACTCAAACGTCAATTTCTTTGTATCAATGCCAGAAGACTTCAACGCATACCTTTGCGAACTCGTCTCAAAGAATGAATGGGAGAAAGGATGGCAATATAACCCAAACCTGATATC
91
TTGGAATGGGCTAAACCTAGTATCCTCTGCACCTAAGGGCGCTTTCAAGACAGCAAAACTAGTCGAGGACTTATCATTCGACGTCACAGAGCAAGGGATTCAACATGAAACATGGCTCACAAAGAATATACAGCAAAATTTGCAAGTTGTAGCCAAATGCCCTGGGCAGCTAGTCACGAAACATGTCGTTAAAGGCCCGTGCCCGCACTTTGCATTATATTTATCCACGCATGAGGACGCTGAGAAGTTCTTCAGGCCACTTATGGGCAAATACGACAAAAGTAGGCTTAACAAAGCAGCTTTCGTTAAAGATCTCACAAAATATGCAAAACCAACCTATATTGGCGAGGTTAACACTGCTTTATTTGAGAGAGCCGTTGAGCATGTCATCCGGATCTTGCGCGATGTTGGAATTCAAACATGTGAATATATTACAGATGAGGATGAAATCTTTAAATCTCTTAACATGAATGCTGCAGTTGGAGCATTATACACAGGAAAGAAAAGAGAATATTTTTCTGAGTACACACAGGAGGACAAAGCAGAGATAATCAAGCAATCGTGCGAAAGAGTATACGAGGGCAAGCTTGGAATTTGGAATGGGTCTCTTAAAGCTGAAATAAGACCTATAGAGAAAACGGAAGCAAACAAGACAAGAACATTCACAGCCGCACCATTAGAAACATTACTAGCGGGTAAGGTTTGTGTTGATGATTTCAATGGTCAATTTTATTCACAACACTTGAATGGACCGTGGACAGTTGGGATAACTAAGTTCTACGGTGGTTGGAACAAATTACTTGAGAAGCTACCAGATGGCTGGATCTACTGTGATGCAGATGGTTCGCAATTCGACAGTTCACTTACTCCTTATTTGATAAATGCAGTGCTCAACATTCGATTACGATTCATGGAACCATGGAATATTGGTGAACAAATGCTCAGAAATTTGTATACAGAAATTGTCTTCACACCAATTGCAACACCTGATGGATCCGTTATCAAGAAGTTTAAAGGCAATAACAGCGGACAGCCGTCAACAGTTGTCGATAACACGCTAATGGTAATCATAGCTTTCAACTATACGTTACTATCGTGTGGTATTGACTTGGAAAAAGCTGACGAAGTGTGTCGAATGTATGCAAATGGAGATGACTTACTACTTGCAGTGAACCCAACACATGTCGCCATTTTAAATGAGTTCGGAAAACACTTCGCAGCGTTGGGGCTTAATTTCGATTTTGAATCACGAACGAAAGACAAATCAGAACTTTGGTTCATGTCAACGCGGGGTATCAAATACGAGGAAATGTATATTCCGAAACTCGAGAAAGAGCGAATTGTTGCCATTCTCGAGTGGGATCGATCACTACTTCCCCAATACCGTCTCGAGGCGATTTGCGCGGCAATGGTCGAAGCGTGGGGTTACAAAGATTTGCTTCATGAGATACGTAAGTTCTATGCGTGGCTACTTGAAGTGCAACCTTTCTCTAACTTGGCAAAGGAAGGCTCAGCTCCATACATAGCTGAATCAGCTTTAAGAAATTTATACACAGGTGCCAAGGTTTCAGAAGACGAATTAAACGTCTATGCACGACAATTCTTTGACGACCTTCCAAACTATTTAGCAGACGAAGTTATAGATGTCAAACACCAAGCTGGTGAGAATGTTGACGTCGGACAGAAGACCGAAGCGCAGAAGGAGGCCGAAAAGAAAGCAGCTGAAGAAAAGAAAGCGAAGGAAGCTGAGGCTAAACAGAAAGAAGATAAGGAGAAAACAACTGAGAAGACTGGTGATGGTGCATCCACAAAGGAAACGACTGGGAAAACTGGTGATGGCACATCTACAGGAAAGGATAAGGACGTGGACGCTGGAACTTCGGGTTCAGTGTCAGTACCTAAACTCAAAGCCATGTCTAAAAAGATGCGTCTGCCTCAGGCAAAGGGAAAGAATATTCTTCATCTTGACTTCCTTTTGAAATATAAGCCACAACAACAAGATTTATCAAACACCCGAGCAACCAGGGCCGAATTCGATAGGTGGTATGAAGCAGTGCAGAAAGAGTATGAACTTGACGAAACACAAATGACAGTTGTCATGAGTGGATTGATGGTTTGGTGTATTGAAAACGGTTGCTCACCGAACATTAATGGTGTCTGGACCATGATGGACGGAGATGAACAGAGAACATTTCCTTTAAAACCAGTTATTGAGAATGCATCTCCAACTTTCAGACAAATTATGCATCACTTTAGTGATGCAGCTGAAGCGTATATCGAGTATAGAAATTCAACAGAAAAATATATGCCGAGATACGGACTTCAGCGCAACTTAACCGACTTTAGCCTTGCACGCTATGCATTCGATTTCTATGAGATATCATCTCGAACTCCAGTGCGTGCAAAGGAAGCCCACATGCAGATGAAGGCAGCAGCAGTCCGTGGTTCAAACACACGGATGTTTGGTCTTGATGGGAATGTCGGAGAAGCCCACGAAAACACAGAACGCCATACAGCTGGCGATGTTAGTCGCAATATGCACTCCCTTTTGGGAGTTCAGCAGGGGCACTGAAGCGGGGTTGAACTTTTACGCAGTAATTTAGTAATATATAAATAAGCTATTGTGGTGAGGTTCTACCTCGTTAGCTTTATATATATATTATGCTACGTACCTACTATGTCTGCAAGTGAGTGAGGTTACACCTCGACACTTATGGTAGGCACTATTACTAGCTTGGAATCACGATACGGACGGTCCATGGAGTGGTTTTACCACGAGGATGCAGCGAGTTTCGTGGTAAGGGCCAAAAAAAAAAAAAAAA
92
>Sz-0605-M AAAACAACAAGACTCAACACAACACAACCAAACACGACCAAACACAACCAAACTTATCGTTACTAGAGCACATTCAGATTGCAGGCAACGGTTCGATTGCAAGGCGCATCGAAAAGCCTCTCTGAACACACGATCGCAATGGCAGGAACTTGGACTCACGTGACTTACAAGTGGCAGCCAAACCTTGACAACCCTCGTGACGTTAGGAGGAGCATGGAACTGTTCGCTGCGAAGCGTCAGGTCTATGATGAGAAGCGAGCTCTGGAGCATAACAGCAAATTACTGCGTAGAGCTCAGGTGGTGGACGTCGAACCAATGATCACGGTTCAACCAAAGAAGTGTGCACAGACGTGGAAAGAGGTGGTGGATCATAATCCAACACATCATTTTGTGTATGCACGTTTCTCTGAGGTTAAGAAGCAGCAGCCTACCAAACCAGTTGCAACCTCAGTTAATAAACTAGTGAGAAAAACTCTTGAAATACGAGAGAAGTTTCCGGTGAATGTTGAGTTTATTGGAAAGAAACGCAAGAATACTACGAGAGTCTCACTGGGGAAGGTTTTCAACAAAACTTTCTTACACTGTGGCACACGGCATGAGGACAATCAATTTAAGCGAGTGGACACAAACATCACTCGGGACTGGATCCCAGTGTTGTCTAGTGTGGCAAAATGCTATGCAACATTGTCCTCCAACATGATGCACAACGTACATAAAGGACATAGTGGTTTGACGTTCATTCAGAACGATGAGCTTTTTATAATCCGAGGAAGACTGAAAGGTGAGCTGTGTAACAGTTTGGATTACACTCCAAACATCCAAGAGATAGAGCATTACGCAGACCCACAAGCAGCTGATTTCTGGAGGGGATATACCAATGCATACGTTGCAAATAGGAATATCTCAACAACACATACAGAGCACACGCCTACAATAAACCTGGAACAGTGTGGTAAGCGCATGGCCTTGTTAGAGATTCTTTTCCACTCAACATTTAAAATCACATGCAAGCACTGTAATAATGATGATCTTGAGCTAGCTGATGATGAATTTGGGGAAAAACTCTACAAAAATATTCAGCGTATTGAAGAGCAACAGAGTGAATATCTTGCTGAGGATCAAAAACTCAAGCGGATGTTATCATTTATCAAGGCAAGATGCACACCAAAGTTCGATCATCTACCACTAAATTGGCAAGTTGCAGACATTGTTGGACATTATTCAGACAATCAAACCAAGCAAATTCTTGATGTGAACGAGGCGCTGATTAGAATAAACACGCTCACACCATCAGATGCATTAAAGGCGAGCGCAGCTCTTCTTGAATTATCGAGATGGTACAAGAATAGGAAAGAATCAGCAAAGGAGGACAACTTATCCACATTTCGTAACAAGGTTTCCCCGAAGAGCACAATTAACTTAGCATTGATGTGTGACAATCAGCTCGATTCAAATGGCAACTTTGTCTGGGGAAAGAGAGAGTATCACGCAAAGAGATTCTTCTCAAATTACTTTGAAGCTGTGGATCCAACTGATTCATATGAGAAACACGTGACACGTTTTAATCCAAATGGACAAAGAAAGTTATCTATTGGCAAATTGGTTATCCCTTTGGACTTCCAACGTATCCGCGATTCATTTGCTGGCATACCTATCATGAAGCAGCCACTTTCAAACGCTTGTTTGAGCAGAATCGACAAAACTTACGTTTATCCTTGCTGCTGTGTGACAACAGAATTTGGACAGCCCGCTTATTCAGAAATTATACCTCCGACAAAGGGCCATTTAACAATTGGCAACTCTGTTGATCCAAAGATAGTGGACTTGCCAAATACAGATCCACCAACGATGTATATTTCAAAAGATGGATACTGTTATATAAACATTTTCTTGGCAGCTATGATAAATGTGAACGAAGATTCAGCCAAAGATTATACAAAATTCATCAGAGATGAACTCATAGAGAGACTTGGTAAGTGGCCTAAACTTAAGAATGTGGCAACAGCATGCTATGCATTATCAGTGATGTTCCCAGAAATCAAGAACGCTGAATTACCTCAGATTCTTGTGGATCATGAGAACAAAACAGTGCATGTGGTGGACTCATATGGATCATTAAGCGTTGGCTATCATATCCTGAAAGCAAACACTGTAGGGCAGCTTATCAAAATGCAATATGAATCCATGGAGAGTGAAATGAGAGAATATGCAGTTGGTGGCACGATAACACACAAATCATTTTCTACCTTAATTAGTCATTTGATAAAGAATATGTTTAAGCCGCGTGAAATGAAGAAAATCATTGAGGAAGAGCCTTTTCTAATTATGTTGTCTGTTGTATCTCCAACTGTTCTCATAGCTCTATACAATAATTGTCATATTGAGAATGCAATGGCACATTGGATTACAAAGAACCAGGGAGTAGCAGCAATGTTCGCACAACTAGAAGCTCTAGCAAAAGAAACATCAAAGGCTGAGCTTTTAATTCAACAGATGACAATTCTAGAGAAAGCTTCAAGTCAGTTGAAATTAGCTGTAATGGGCTTGAATCATGTCGATCCAGCTAAGCGACTACTCTGGTCACACTTGGAAGTCATGTCATCAAGAGCTGAGACAAACAAAGATTTACTGGACCAAGGTTACGCTTTATACAGCGACAGGTTGTACACTATAGTTGAAAAAACCTATGTAGATCAGTTAAATCAAGCATGGACAGAGTTATCATTGTGTGGAAAATTTTCCGAAACATGGCGTGTGTACAAGGACAAGAAATATTACAAACCATCTTTAATCCTGAAAAGAAGCGCCGATTTAGGCGCTGTGTACAATATACCAGTTACGCATCAAATATCAAGTTTGGTGCAGAAAAGTCGAAGTCAAGCCAGCTCTATTTTAACCAAACTCCACCAAAGTTCATGTGATAAGTTACATAATTTACGCATTAGAGCTATAAATACAATATATTGGTTTATTCCAGATATTTTCCGACTTATTCATATTTTCATAATACTAAGTTTGTTATCAACAGTTGCAAACACTATTATAGTAACAATGCAAGATTACAAAAAACTACAAAAACAAGTTCGCGAAGAAGAATATGAGAAAGAAATAAACGAGGTACGAACTATACACGCAAAGTTGCTCAAGATACATGAGGACGAGCTCACTTGTGAGCAGTTTCTACAATACATCAATGATAATCATCCAAGATTAATTGAGGCAGCCATCGAACTGACAGGGACAGGAGTGATACATGAAGGTAAATCCAACCTTGAAATCAATCTGGAGCAAGCAATGGCTATTGGTACATTAGTTACAATGATATTCGATCCTACAAAAAGCGATGCCGTATACAAAGTACTCAACAAAATGAGGACAATTTTGAGTACAGTTGAACAAGATGCACCTTTTCCACGTATTGATTTCACAAAT
93
ATCTTTCGGACACAGGTGGTTCACCAGAGTTTAGATCTCGATGATCCTCTCACTATTAACACCGACAAGAAACTCACAGTTGACTTTGACACAACTCAGGACCTTCCAGCGGACACTTTTAGTAATGATGTGACATTCGATCAGTGGTGGTCAAATCAACTTGAGAACAATAGAACTGTTCCGCATTACAGACTTGGTGGTGAGTTCATTGAATTCACACGGGAAAAAGCAGCATCTGTGAGCATTAGTATCGCGCATTCACAAATTGAAAAGGAATACTTGCTCAGAGGTGCAGTCGGATCAAGAAAATCAACAGGCTTGCCATACCATTTGAGTCAACGGGGAAAAGTCCTATTATTGGGACCAACACGACCGCTTGCAGAAAATGTTTGTAGGCAACTACAAGGCGCCCCATTTGATGTGAGTCCTACATTACAGATGAGAGGTTTGAGTTCATTCGGGTCATCACCCATCACAATAATGACATCAGGATTTGCACTCCATATGTACGCAAACAACCCTGACAAACTATCAAATTATGATTTCATCATATTTGATGAGTGTCATATCATGGAAGCTCCAGCGATGGCTTTTTACTGTCTTCTCAAAGAATACGCATTTAGTGGGAAAATAATCAAGGTTTCGGCTACACCACCAGGGAGAGAATGTGAATTCTCTACGCAACATCCAGTTGATATTCATGTTTGTGAAAATTTAACTCAGAACCAATTCGTGCTTGAACTTGGAACTGGATCAAAAGCTGATGCCACTAAATACGGTAACAACATTCTGGTTTATGTGGCTAGTTATAATGATGTTGATTCATTGGCAAGAGCACTAATTGAGCGACATTATTCAGTGATCAAAGTTGATGGCAGAACGATGAAGCAGGACACAAGTGGAATTCATCCAAACGGACATGACGGAAAGAAATGTTTCATAGTTGCCACCAATATTATTGAAAACGGAGTCACATTGGACGTTGACGTCGTTGTTGACTTTGGCCTCAAGGTTACGGCTGAATTGGCCGTTGATAATAGAGCAGTGATGTATCGCAAAGTGAGCATATCTTATGGTGAGAGGATTCAACGACTTGGAAGAGTTGGAAGAACAAAACCAGGGACTGTTATCAGAATCGGAACAACCATGAAGGGACTTCAAGAGATACCAGCTATGATAGCAACTGAAGCAGCTTTCCTTTGTTTTGCATACGGCCTCAAGGTTATAACACATAACGTTTCAACCACACACCTAGCGAAATGCACGGTCAAGCAAGCGAGAACTATGATGCAGTTTGAGCTTTCACCATTTATCATGTCTGAATTAGTCAAATTTGACGGCTCAATGCATCCTCAAATACATGAGGTTCTCAAGAAATACAGGCTTAGGGAATCCGTGATCATGCTGCGACCAAATGCAATCCCTCATACAAATGTTCACAACTGGTTAACAGTTAAAGACTACAACAAAATTGGCTGTGATCTTGAACTAGATGACTATGTAAAGGTTCCATATTTCATAAGAGGCATTCCTGAGAAAGTATATTCAGACATTTATAAGATTGTACTCGAATATGGATCGACCAGTTGCTATGGAAGGCTGTCAAGTGCATGTGCGGGAAAAGTAGCCTACACATTGCGCACGGATCCTTATGCTTTACCACGAACAATCGCTATTGTGAATCAACTCATAGCTGAGGAATACGCAAAACGCGATCACTACAACTCGATCACATCAAACCCATCATCTTCACACGCATTTTCTCTCACAGGAATTTGCAACATGTTAGCCTCAAGATATATGAAAGATCATTCAAGGGAAAACATAGAGAAATTGACACGTGTTAAAGATCAGCTGATCGAGTTTAGGGGAACTGGAGGCGAGTTTAAAAACCCAGAAGATTTGCTCGAATTTGGTGGACTAGTTACGGTCATTCATCAAGGATTGGACTCCACCACTCAGTGTCTACAACTTAAAGGAAGGTGGAACGGAGACTTAATTCAACGCGATCTGATGATATCAGCTGGTGTTTTCACAGGCGGTCTACTGATGCTCTGGTTTCTCTTCCGAAAATGGTCATCAACAGATGTCAAACATGAAGCTAAGACAAAACGCAGTAGGCAAAAGCTCAAGTTTAGGCAAGCGCGTGACAACAAATATGCCTATGGCGTCACTGGATCTAAAGATGCAATTGAAGAAAATTTCGGATCAGCTTACGTCAAGAAGGATAAGAAGAAGGGAACAAAAGTTGGATTGGGAGTCAAGCAACACAAGTTCTACATGCTATACAATTTCGATCCACAGGATTACAATCTAATTCGATTTGTGGACCCACTCACAGGTGCAACTCTTGACGAGCAGATCCACGCGGATGTCAAGATGGTGCAAGAACATTTCGCAGCAATTCGAGAGGCTGCAATAAATAATGACCAACTGGAATATCAACACATTTATTCAAATCCAGGCATCAAAGCGTATTTTATACGGAATGGCTCTCAAAACGCTCTGAAAGTGGACATGACTCCGCACGAACCATTAAGGGTTGTTACTGGCAACAATATAGCAGGGTTCCCTGAATATGAAGGTACACTACGACAAACTGGAAGAGCACAGGTAATACCTTCTGAACAAGTGCCAGCGCCAAACGAAATGGAAGTGGAACACGAAGCGAAATCCATGTTAACGGGTTTAGTAGATTACACACCTATAGCTAATCAAATTTGCATAATTGAAAATCATTCGGATGATGTTAGACTTTGCATGTATGCTATAGGATATGGATCATACTTAATCACTCCTGCACACCTTTTTAAAACGAACAATGGAGAGTTAACGTTTCGATCTTCGCGAGGAGTTTACAAGATGAGAAACTCAGTGGAAGTAAAGCTACACCACGTGAAGGGGCGCGATCTAGTTATAATTCAACTCCCCAAAGACTTTCCTCCATTTCCACAGAAGCTCAAGTTTCAAGCACCCAATCGCGAAAACAAAGTGTGTTTGGTTGGCGTCAATTTCCAGCAGAACCATTCTTCATGTGTAATTTCTGAAAGTAGCACAATTGCGCCAAAAGGAAATAATACATTCTGGAGTCACTGGATCTCAACAACAGATGGCCAATGCGGTTTACCATTAGTCGATATTAAAACTAGGAGCATAGTTGGGGTACATAGTCTTGCATCCATAAATGCGAACGTAAATTTCTTCGTAGCAATGCCAGAAGACTCCAACACTTATCTTGGTGAACTCGTTTCGAAGAATGAATGGGAAAAAGGATGGCAATATAATCCAAATTTAATATCTTGGAGTGGACTAAACCTTGTATCCTCCGCACCTAAAGGCGCTTTTAAAACAGCAAAACTTGTTGAGGATTTATCATTTGATGTCACAGAACAAGGGATCCAACATGAAACATGGCTGACAAAGCACATACAGCAAAATCTGCAAGTTGTAGCCAAATGTCCTGGGCAATTGGTCACAAAACATGTTGTCAAAGGCCCT
94
95
TGCCCGCACTTTGCACTATACCTATCAACGCACGAGGAAGCTGAGAAATTCTTTAGACCGCTTATGGGCAAATACGACAAGAGTAGACTTAATAAAGCAGCTTTCGTTAAAGATCCTACAAAATATGCAAAACCAACCTATATCGGCGAAGTGAACACTGCACTATTTGAAAAAGCTGTCGAACATGTCATCCAACTCCTACGCAATGTTGGAATTCCAACATGTGAGTACATCACAGATGAAGATGAAATCTTCAAATCTCTTAACATGAATGCCGCAGTTGGAGCGTTGTATACAGGAAAGAAAAGAGAATATTTTTCCGAGTACACGCAAGAAGATAGAGCAGAAATAATCAAGCAGTCATGCGAAAGGGTATACGAAGGAAAACTTGGAATTTGGAACGGATCTCTTAAAGCGGAAATAAGACCCATAGAGAAAACGGAAGCAAATAAGACAAGAACATTCACAGCCGCACCACTAGAAACATTATTAGCAGGTAAGGTATGTGTCGATGATTTCAATAATCAATTCTACGCGCATCACCTAGATGGACCATGGACGGTTGGAATAACTAAGTTTTATGGTGGTTGGAACAGATTGCTCGAGAAGCTTCCAGATGACTGGATCTACTGTGATGCAGATGGTTCACAATTCGACAGTTCACTCACTCCTTATTTGATAAATGCAGTACTCAACATTCGATTACAATTCATGGAACCGTGGAATATTGGTGAACAAATGCTTAGAAATTTATACACGGAAATTGTTTTCACACCAATTGCAACGCCCGATGGATCCGTAATCAAGAAGTTTAAAGGCAATAACAGTGGACAGCCGTCAACAGTTGTTGACAACACACTAATGGTGATCATAGCTTTTAACTATACGTTACTATCGTGTGGTGTTGACTTGGAGAAGGCCAATGATGTGTGTCGAATGTATGCAAATGGTGATGATTTATTACTTGCAGTGCACCCGACACATGTTAATATTCTGAACGACTTCGGAAAGCACTTTGCAGCGTTGGGACTAAATTTCGACTTTGAATCACGGACGAAAGACAAATCAGAACTTTGGTTCATGTCAACACGGGGTATCAAATATGAGGAGATGTACATCCCAAAATTGGAGAGAGAACGAATTGTAGCTATTCTTGAGTGGGATCGATCACTAATCCCTCAATATCGTCTTGAAGCGATTTGTGCAGCAATGGTTGAGGCATGGGGATACAAAGATTTACTCCATGAAATACGTAAGTTCTATGCGTGGCTACTTGAAATGCAACCTTTTGCTGATTTAGCAAAGGAAGGTTCAGCACCGTACATAGCCGAGTCTGCCCTGAGAAATTTATATACTGGTGCTAAGGTTTCAGAGGATGAATTGAATGTTTATGCACGACAGTTCTTCGATGATCTTTCAGATTATTTGGCTGACGAGGTTATAGACGTGAAGCATCAAGCCGGCGAGAATGTTGATGCTGGGCAGAAAACTGAAGCACAGAAGGAGGCAGAAAAGAAAGCAGCTGAAGAAAAGAAAGCAAAAGAGGCTGAAGCTAAGCAAAAGGAAACAAAGGAGAAAGCAACTGAGAAAACTGGCGAAGGCGGGTCCACAGGAAAAGACAAAGACGTGGACGCTGGAACCTCAGGCTCAGTATCAGTACCTAAGCTCAAAGCCATGTCCAAAAAGATGCGTTTGCCTCAAGCAAAAGGAAAGAATATCCTTCACCTCGACTTTCTTTTGAAATATAAACCACAACAGCAAGATTTATCAAACACTCGAGCAACTAGGGCTGAATTTGATAGATGGTATGAAGCAGTGCAGAAAGAGTACGAACTTGATGATACACAGATGACGGTTGTCATGAGTGGATTAATGGTATGGTGCATCGAAAATGGCTGCTCACCGAACATCAATGGTGTCTGGACCATGATGGACGGAGATGAACAGAGAACATTCCCCTTAAAACCAGTTATTGAGAATGCATCTCCAACTTTCAGACAAATTATGCACCACTTTAGTGATGCAGCTGAAGCATACATTGAGTATAGAAATTCAACAGAAAGATATATGCCGAGATATGGACTTCAGCGAAACTTAACCGACTTTAGCCTTGCACGCTATGCATTTGATTTTTACGAGATATCATCTCGAACTCCAGCACGTGCAAAGGAAGCCCACATGCAGATGAAGGCTGCAGCAGTCCGTGGTTCAAACACACGGATGTTTGGTCTTGATGGGAACGTCGGAGAATCCCAAGAAAATACAGAACGCCACACAGCTGGTGACGTTAGTCGCAACATACACTCCCTTTTGGGAGTCCAGCAGGGGCATTGATACGGGGTTCAACTTTTACGCAGTAATTTAGTAATATATAAGTAAGCTATTGTGGTGAGGTTGTACCTCGTTAGTTTTATATATATATTATGCTACGTACCTACTATGTCTGCAAGTGAGTGAGGTTGTACCTCGACACTTATAGTGGGCACTATTACTAGCTTCGAATCACGAGACGGACGATCCATTGAGTGGTTCTACCACGAGGATGCAGCGAGTTTCGTGGTGAGTGACAAAAAAAAAAAAAAAA
8. sz. Melléklet. Inszerciót tartalamzó MDMV köpenyfehérje gének MFE értékei (Vienna, Nupack és UNAfold)
ViennaRNA Nupack UNAfold
MDMV-0702 MDMV-0702 MDMV-0702 Átlag SD Min. Max. Átlag SD Min. Max. Átlag SD Min. Max.
Eredeti -260,95 NÉ NÉ NÉ Eredeti -208,3 NÉ NÉ NÉ Eredeti -216,4 NÉ NÉ NÉ Random -253,91 14,36 -304,20 -211,20 Random -196,6 13,3 -239,1 -158,4 Random -200,3 13,6 -242,9 -157,7
Kevert -256,43 8,08 -283,30 -231,57 Kevert -197,2 8,2 -228,7 -176,1 Kevert -201,4 8,2 -236,4 -178,6 Random környezet -253,65 14,22 -300,60 -204,44 Random környezet -196,5 13 -244,9 -152,4 Random környezet -200,1 13,3 -250,3 -157,8
Random inszert -262,81 3,66 -276,36 -253,60 Random inszert -211,7 3,2 -222,3 -202,9 Random inszert -218,2 3,3 -229,1 -207,8 MDMV-0801 MDMV-0801 MDMV-0801
Átlag SD Min. Max. Átlag SD Min. Max. Átlag SD Min. Max. Eredeti -276,02 NÉ NÉ NÉ Eredeti -221,2 NÉ NÉ NÉ Eredeti -221,4 NÉ NÉ NÉ
Random -254,13 14,59 -298,49 -206,90 Random Random Kevert -259,31 8,04 -286,02 -235,16 Kevert -200,1 8,2 -229,3 -172,4 Kevert -204,7 8,2 -231 -176,7
Random környezet -256,30 14,22 -298,81 -210,24 Random környezet -199,4 12,9 -246,1 -156,1 Random környezet -202,8 13,3 -251,8 -163,2 Random inszert -275,61 3,37 -288,00 -266,90 Random inszert -218,6 3,3 -229,1 -209,9 Random inszert -222,5 3,3 -234,6 -214,2
MDMV-0814 MDMV-0814 MDMV-0814 Átlag SD Min. Max. Átlag SD Min. Max. Átlag SD Min. Max.
Eredeti -277,60 NÉ NÉ NÉ Eredeti -210,3 NÉ NÉ NÉ Eredeti -214,6 NÉ NÉ NÉ Random -253,91 14,83 -302,20 -205,60 Random Random
Kevert -255,15 8,04 -282,74 -234,02 Kevert -197,3 7,9 -220,9 -172,4 Kevert -201,7 8,1 -227,5 -178 Random környezet -253,35 14,20 -299,52 -206,54 Random környezet -196,3 13,1 -240,7 -152,6 Random környezet -199,8 13,4 -248 -159,5
Random inszert -278,23 3,46 -290,30 -269,90 Random inszert -210,7 3,3 -222,2 -202,2 Random inszert -214,7 3,4 -229,3 -205,8 MDMV-0905 MDMV-0905 MDMV-0905
Átlag SD Min. Max. Átlag SD Min. Max. Átlag SD Min. Max. Eredeti -284,70 NÉ NÉ NÉ Eredeti -222,60 NÉ NÉ NÉ Eredeti -226 NÉ NÉ NÉ
Random -253,99 14,60 -299,85 -211,44 Random -196,49 13,0 -237,90 -158,76 Random -199,99 13,40 -246,10 -163,16 Kevert -253,15 7,70 -285,28 -232,72 Kevert -195,06 7,70 -222,60 -171,40 Kevert -199,36 7,80 -226,90 -175,00
Random környezet -254,48 14,70 -312,40 -208,24 Random környezet -196,39 13,3 -255,80 -153,70 Random környezet -199,75 13,60 -258,20 -156,60 Random inszert -283,06 3,60 -298,10 -274,10 Random inszert -222,44 3,3 -237,50 -214,60 Random inszert -225,43 3,40 -240,60 -216,13
96
9. sz. Melléklet. MDMV köpenyfehérje gének, Vienna, Nupack és UNAfold programokkal számított MFE értékei.
ViennaRNA Nupack UNAfold
Átlag Std. Dev. Átlag Std. Dev. Átlag Std. Dev. MDMV izolátumok inszerció nélkül -253,8680 6,4507 MDMV izolátumok inszerció nélkül -195,2566 7,1701 MDMV izolátumok inszerció nélkül -200,5159 7,1701
MDMV izolátumok Magyarországról -253,9086 6,5922 MDMV izolátumok Magyarországról -193,5089 6,7445 MDMV izolátumok Magyarországról -199,1185 6,7445
MDMV izolátumok Bulgáriából -257,9240 10,2322 MDMV izolátumok Bulgáriából -204,1000 9,8110 MDMV izolátumok Bulgáriából -208,4000 9,8110
random1000876bp -242,4896 14,1287 random1000876bp -188,3111 13,2934 random1000876bp -191,7057 13,0012
MDMV izolátumok Spanyolországból -253,5747 3,9793 MDMV izolátumok Spanyolországból -199,7333 4,1749 MDMV izolátumok Spanyolországból -204,1467 4,1749
random1000867 -239,6475 13,7498 random1000867 -186,3096 12,5006 random1000867 -189,6678 12,3639
MDMV izolátumok inszercióval -275,3520 8,8645 MDMV izolátumok inszercióval -216,6880 6,0362 MDMV izolátumok inszercióval -219,8000 4,0104
random1000915bp -253,9088 14,3614
random1000915bp -196,6470 13,5718
random1000915bp 13,3010
-200,2724
NÉ: Nem értelmezhető
97
10. sz. Melléklet. Az SCMV alcsoport CP génjének RDP programmal végzett rekombinációs vizsgálatainak eredményei Breakpoint Positions Relative to
In Alignment In Rec.
Sequence JGMV-Z26920
Rec. Event Num.
RDP File Num. Begin End Begin End Begin End Rec. Sequence(s) Minor Parental Sequence(s) Major Parental Sequence(s)
1 1 275 505 268 498 199 429 SCMV-DQ315497 Unknown (SCMV-SMU57357) SCMV-DQ315492
1 SCMV-DQ315495 Unknown(SCMV-AY836523) SCMV-DQ315498
1 SCMV-DQ315494 Unknown(SCMV-AJ278405) SCMV-DQ315496
1 SCMV-DQ315489 Unknown(SCMV-AY953351) SCMV-DQ315495
1 Unknown(SCMV-AY590778) SCMV-DQ315494
1 Unknown(SCMV-D00948) SCMV-DQ315493
1 Unknown(SCMV-AF006738) SCMV-DQ315491
1 Unknown(SCMV-AF006737) SCMV-DQ315490
1 Unknown(SCMV-AF006736) SCMV-DQ315489
1 Unknown(SCMV-AF006735)
1 Unknown(SCMV-AF006734)
1 Unknown(SCMV-AF006733)
1 Unknown(SCMV-AF006732)
1 Unknown(SCMV-AF006731)
1 Unknown(SCMV-AF006730)
1 Unknown(SCMV-AF006729)
1 Unknown(SCMV-AF006728)
1 Unknown(SCMV-SMU57356)
1 Unknown(SCMV-SMU57355)
1 Unknown(SCMV-SMU57354)
1 Unknown(SCMV-DQ438949)
Detection Methods
RDP GENECON
V Bootscan Maxchi Chimaera SiSscan PhylPro LARD 3Seq
2,90E-12 2,50E-10 9,00E-13 3,00E-05 1,46E-07 2,24E-15 NS NS 7,85E-15
2 2 537 932 484 876 460 852 SCMV-DQ925428 SCMV-AJ006199 SCMV-DQ925430
2 SCMV-DQ846832
2 SCMV-DQ647661
2 SCMV-DQ647659
2 SCMV-DQ647653
2 SCMV-DQ647652
98
Breakpoint Positions Relative to
In Alignment In Rec.
Sequence JGMV-Z26920
Rec. Event Num.
RDP File Num. Begin End Begin End Begin End Rec. Sequence(s) Minor Parental Sequence(s) Major Parental Sequence(s)
2 SCMV-AY195610
2 SCMV-AM110759
2 SCMV-AY569692
2 SCMV-AJ297628
2 SCMV-AJ311169
2 SCMV-AJ311168
2 SCMV-AY629310
2 SCMV-AY639645
2 SCMV-AY629312
2 SCMV-AF494510
2 SCMV-AJ006201
2 SCMV-AJ006200
2 SCMV-AY149118
2 SCMV-AJ310111
2 SCMV-AJ310110
2 SCMV-AJ310109
2 SCMV-AJ310108
2 SCMV-AJ310107
2 SCMV-AJ310106
2 SCMV-AJ271085
2 SCMV-X98166
2 SCMV-X98169
2 SCMV-X98167
2 SCMV-X98168
2 SCMV-DQ925431
2 SCMV-S77088
2 SCMV-AY660663
Detection Methods
RDP GENECON
V Bootscan Maxchi Chimaera SiSscan PhylPro LARD 3Seq
1,09E-05 5,36E-04 1,55E-06 1,57E-04 3,06E-05 3,81E-02 NS NS 5,89E-08
3 5 879 275 871 271 799 199 SrMV-SMU57358 SrMV-AJ310196 Unknown (SCMV-AJ310105)
99
Breakpoint Positions Relative to
In Alignment In Rec.
Sequence JGMV-Z26920
Rec. Event Num.
RDP File Num. Begin End Begin End Begin End Rec. Sequence(s) Minor Parental Sequence(s) Major Parental Sequence(s)
3 SrMV-SMU57360 SrMV-NC004035 Unknown(SCMV-DQ925432)
3 SrMV-SMU57359 SrMV-AJ310197 Unknown(SCMV-DQ315498)
3 SrMV-SMU07219 Unknown(SCMV-DQ315496)
3 Unknown(SCMV-DQ315493)
3 Unknown(SCMV-DQ315491)
3 Unknown(SCMV-DQ315490)
3 Unknown(SCMV-AM110759)
3 Unknown(SCMV-AY836523)
3 Unknown(SCMV-AJ278405)
3 Unknown(SCMV-AJ310104)
3 Unknown(SCMV-AJ311169)
3 Unknown(SCMV-AJ311168)
3 Unknown(SCMV-AY629312)
3 Unknown(SCMV-AJ310110)
3 Unknown(SCMV-D00948)
3 Unknown(SCMV-AF006737)
3 Unknown(SCMV-AF006735)
3 Unknown(SCMV-AF006734)
3 Unknown(SCMV-AF006731)
3 Unknown(SCMV-AF006728)
3 Unknown(SCMV-SMU57357)
3 Unknown(SCMV-DQ925430)
Detection Methods
RDP GENECON
V Bootscan Maxchi Chimaera SiSscan PhylPro LARD 3Seq
5,99E-05 1,68E-05 NS 4,20E-07 7,10E-06 3,34E-20 NS NS NS
4 6 247 680 240 672 171 603 SCMV-DQ315493 SCMV-AY836523 SCMV-D00949
4 SCMV-DQ315498 SCMV-AJ278405 SCMV-A34976
4 SCMV-DQ315496 SCMV-D00948
4 SCMV-DQ315495 SCMV-AF006738
4 SCMV-DQ315494 SCMV-AF006736
4 SCMV-DQ315492 SCMV-AF006735
4 SCMV-DQ315491 SCMV-AF006734
100
Breakpoint Positions Relative to
In Alignment In Rec.
Sequence JGMV-Z26920
Rec. Event Num.
RDP File Num. Begin End Begin End Begin End Rec. Sequence(s) Minor Parental Sequence(s) Major Parental Sequence(s)
4 SCMV-DQ315490 SCMV-AF006733
4 SCMV-DQ315489 SCMV-AF006732
4 SCMV-AF006731
4 SCMV-AF006728
4 SCMV-SMU57357
4 SCMV-DQ438949
Detection Methods
RDP GENECON
V Bootscan Maxchi Chimaera SiSscan PhylPro LARD 3Seq
6,34E-05 1,77E-04 1,10E-05 3,26E-06 3,36E-05 7,66E-08 NS NS 7,06E-05
5 8 70 210 7 144 7 144 JGMV-AY387808 MDMV-FM883198 Unknown (SCMV-AM501533)
5 JGMV-Z26920 MDMV-FM883196 Unknown(SCMV-DQ925432)
5 JGMV-AY387828 MDMV-FM883197 Unknown(SCMV-AM501531)
5 JGMV-AY387827 MDMV-FM883199 Unknown(SCMV-DQ647660)
5 JGMV-AY387826 MDMV-FM883201 Unknown(SCMV-DQ647651)
5 JGMV-AY387825 MDMV-FM883203 Unknown(SCMV-AJ310105)
5 JGMV-AY387824 MDMV-FM883204 Unknown(SCMV-AJ310104)
5 JGMV-AY387823 MDMV-FM883165 Unknown(SCMV-AJ310103)
5 JGMV-AY387822 MDMV-FM883166 Unknown(SCMV-AJ310102)
5 JGMV-AY387821 MDMV-FM883168 Unknown(SCMV-AY953351)
5 JGMV-AY387820 MDMV-FM883169 Unknown(SCMV-AY629310)
5 JGMV-AY387819 MDMV-FM883170 Unknown(SCMV-AY629312)
5 JGMV-AY387818 MDMV-FM883171 Unknown(SCMV-AY590778)
5 JGMV-AY387817 MDMV-FM883172 Unknown(SCMV-AF006737)
5 JGMV-AY387816 MDMV-FM883173 Unknown(SCMV-AF006736)
5 JGMV-AY387815 MDMV-FM883175 Unknown(SCMV-SMU57354)
5 JGMV-AY387814 MDMV-FM883176 Unknown(SCMV-DQ925431)
5 JGMV-AY387813 MDMV-FM883178 Unknown(SCMV-DQ925429)
5 JGMV-AY387812 MDMV-FM883179 Unknown(SCMV-DQ925426)
5 JGMV-AY387810 MDMV-FM883207
5 JGMV-AY387809 MDMV-FM883208
5 JGMV-AY387807 MDMV-FM883209
5 JGMV-AY387806 MDMV-FM883210
101
Breakpoint Positions Relative to
In Alignment In Rec.
Sequence JGMV-Z26920
Rec. Event Num.
RDP File Num. Begin End Begin End Begin End Rec. Sequence(s) Minor Parental Sequence(s) Major Parental Sequence(s)
5 JGMV-AF032404 MDMV-FM883211
5 JGMV-A27631 MDMV-FM883212
5 JGMV-U07218 MDMV-FM883213
5 JGMV-U07217 MDMV-FM883214
5 MDMV-FM883216
5 MDMV-FM883217
5 MDMV-FM883218
5 MDMV-FM883220
5 MDMV-FM883221
5 MDMV-FM883222
5 MDMV-FM883223
5 MDMV-FM883224
5 MDMV-FM883226
5 MDMV-FM883227
5 MDMV-FM883181
5 MDMV-FM883182
5 MDMV-FM883183
5 MDMV-FM883184
5 MDMV-FM883185
5 MDMV-FM883186
5 MDMV-FM883187
5 MDMV-FM883188
5 MDMV-FM883189
5 MDMV-FM883190
5 MDMV-FM883191
5 MDMV-FM883193
5 MDMV-FM883194
5 MDMV-FM883195
5 MDMV-A34974
5 MDMV-MDU07216
5 MDMV-NC003377
5 MDMv-AJ001691
102
Breakpoint Positions Relative to
In Alignment In Rec.
Sequence JGMV-Z26920
Rec. Event Num.
RDP File Num. Begin End Begin End Begin End Rec. Sequence(s) Minor Parental Sequence(s) Major Parental Sequence(s)
5 MDMV-AJ563724
5 MDMV-AJ41663
Detection Methods
RDP GENECON
V Bootscan Maxchi Chimaera SiSscan PhylPro LARD 3Seq
7,23E-05 8,45E-04 NS 6,02E-04 1,80E-02 NS NS NS NS
6 9 952 385 821 258 872 309 MDMV-AJ416637 MDMV-AJ416644 MDMV-DQ973169
6 MDMV-AM110758 MDMV-AJ416634 MDMV-FM883200
6 MDMV-AJ416635 MDMV-FM883164
6 MDMV-AJ416645 MDMV-FM883174
6 MDMV-FM883177
6 MDMV-J563725
6 MDMV-A34974
6 MDMV-MDU07216
Detection Methods
RDP GENECON
V Bootscan Maxchi Chimaera SiSscan PhylPro LARD 3Seq
1,64E-04 NS 7,07E-04 2,96E-05 4,57E-04 1,10E-07 NS NS 1,24E-04
7 10 614 67 495 7 537 4 MDMV-AJ542536 MDMV-FM883202 MDMV-J563725
7 MDMV-FM883197 MDMV-DQ973169
7 MDMV-FM883212
7 MDMV-FM883217
7 MDMV-FM883219
7 MDMV-FM883220
7 MDMV-FM883181
7 MDMV-NC003377
7 MDMv-AJ001691
7 MDMV-AM491607
Detection Methods
RDP GENECON
V Bootscan Maxchi Chimaera SiSscan PhylPro LARD 3Seq
2,76E-04 4,70E-04 7,60E-06 3,42E-05 1,95E-05 1,37E-07 NS NS 7,56E-12
8 11 619 791 566 738 542 714 SCMV-AM501531 Unknown (SCMV-AJ310103) SCMV-DQ925426
103
Breakpoint Positions Relative to
In Alignment In Rec.
Sequence JGMV-Z26920
Rec. Event Num.
RDP File Num. Begin End Begin End Begin End Rec. Sequence(s) Minor Parental Sequence(s) Major Parental Sequence(s)
8 SCMV-DQ647661 SCMV-AM501533
8 SCMV-DQ647659
8 SCMV-DQ647653
8 SCMV-DQ647652
8 SCMV-DQ647651
8 SCMV-AY629310
8 SCMV-AY629312
8 SCMV-DQ925431
8 SCMV-DQ925429
Detection Methods
RDP GENECON
V Bootscan Maxchi Chimaera SiSscan PhylPro LARD 3Seq
8,29E-03 NS 4,33E-02 NS NS NS NS NS NS
9 12 329 397 301 369 253 321 SrMV-NC004035 MDMV-NC003377 Unknown (MDMV-FM883175)
9 SrMV-DQ925433 MDMV-AJ001691
9 SrMV-AJ310198
9 SrMV-AJ310197
9 SrMV-AJ310196
9 SrMV-AJ310195
Detection Methods
RDP GENECON
V Bootscan Maxchi Chimaera SiSscan PhylPro LARD 3Seq
3,30E-02 NS NS NS NS NS NS NS NS
* = The actual breakpoint position is undetermined (it was most likely overprinted by a subsequent recombination event),
Minor Parent = Parent contributing the smaller fraction of sequence, Major Parent = Parent contributing the larger fraction of sequence,
Unknown = Only one parent and a recombinant need be in the alignment for a recombination event to be detectable, The sequence listed as unknown was used to infer the existance of a missing parental sequence,
NS= No significant P-value was recorded for this recombination event using this method.
104
Breakpoint Positions
In Alignment In Rec. Sequence Relative to Burg_NC_003377
Rec. Event Num. Num. In.RDP File Begin End Begin End Begin End Recombinant
Sequence(s) Minor Parental Sequence(s)
Major Parental Sequence(s)
1 1 1071 2798 1070 2797 1071 2798 Sz-0605-M MV0801-M Burg_NC_003377
1 Bulgaria_AJ001691
Detection Methods
RDP GENECONV Bootscan Maxchi Chimaera SiSscan PhylPro LARD 3Seq
5,54E-74 4,31E-79 6,32E-78 2,66E-25 1,93E-20 1,15E-39 NS NS 2,71E-38
2 2 8668 64 8668 64 8629 64 MV0801-M Sp Sz-0605-M
2 Burg_NC_003377
2 Bulgaria_AJ001691
Detection Methods
RDP GENECONV Bootscan Maxchi Chimaera SiSscan PhylPro LARD 3Seq
6,13E-04 NS 3,08E-04 4,06E-02 1,55E-02 2,67E-07 NS NS NS
3 3 7215 7629 7215 7629 7215 7629 Bulgaria_AJ001691 MV0801-M Sz-0605-M
3 Burg_NC_003377
Detection Methods
RDP GENECONV Bootscan Maxchi Chimaera SiSscan PhylPro LARD 3Seq
2,40E-03 NS 6,95E-04 6,23E-04 5,06E-04 NS NS NS NS
4 4 3443 3787 3442 3786 3443 3787 Sz-0605-M MV0801-M Burg_NC_003377
4 Bulgaria_AJ001691
Detection Methods
RDP GENECONV Bootscan Maxchi Chimaera SiSscan PhylPro LARD 3Seq
3,30E-02 NS NS NS NS NS NS NS NS
* = The actual breakpoint position is undetermined (it was most likely overprinted by a subsequent recombination event), Minor Parent = Parent contributing the smaller fraction of sequence, Major Parent = Parent contributing the larger fraction of sequence, Unknown = Only one parent and a recombinant need be in the alignment for a recombination event to be detectable, The sequence listed as unknown was used to infer the existance of a missing parental sequence,NS= No significant P-value was recorded for this recombination event using this method.
11. sz. Melléklet. MDMV teljes hosszúságú elsődleges szerkezete alapján végzett rekombinációs vizsgálatok eredményei
(RDP)
105
106
9 Köszönetnyilvánítás
Hálásan köszönöm Dr. Balázs Ervin akadémikusnak, az MTA-MGKI Alkalmazott
Genomikai Osztály vezetőjének munkámban nyújtott útmutatását, szakmai irányítását, valamint,
hogy biztosította számomra, hogy kutatásaimat jól felszerelt laboratóriumában végezhettem.
Szeretném megköszönni Dr. Petrik Kathrinnak az együtt töltött évek során átadott
tapasztalatokért, segítőkész munkájáért.
Nagyon köszönöm Dr. Divéki Zoltánnak, tudományos munkatársnak munkám során nyújtott
segítségét, értékes tanácsait.
Köszönettel tartozom Dr. Hornok László akadémikusnak, munkám nyomon követéséért és
segítőkészségéért.
Szeretném megköszönni Sebestyén Endre PhD hallgatónak, hogy idejét nem sajnálva
segítségemre volt minden bioinformatikai kérdés megoldásában.
Köszönöm szépen Dr. Mészáros Annamária kukorica transzformálás terén végzett
kísérleteit.
Köszönettel tartozom Dr.Spitkó Tamás és Pók István PhD hallgatónak, valamint Dr. Tóth
Évának a Szegedi Gabonakutató Kht. munkatársának a mintagyűjtésekben való segítségükért.
Köszönettel tartatozom Dr. Darkó Évának, a pollen-életképesség vizsgálatokban nyújtott
segítségéért.
Köszönöm Fábián Attila PhD hallgatónak az elektronmikroszkópos képek elkészítésénél
nyújtott segítségét.
Nagyon szépen köszönöm laboratóriumunk asszisztensének, Babirák Teréznek a gondos és
lelkiismeretes technikai segítségéért.
Valamint köszönöm az osztály összes dolgozójának, kiemelten Bakó Ambrusnak, Juhász
Angélának és Soós Vilmosnak, hogy munkámat családias légkörben végezhettem velük.
107