kuliah 2 isolasi polifenol
TRANSCRIPT
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
1/28
FITOKIMIA II
METODE ISOLASI POLIFENOL
Lusi Indriani, M.Farm, Apt
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
2/28
Senyawa Fenolik atau Polifenol
sekelompok metabolit sekunder yang
mempunyai cincin aromatik terikat satu atau
lebih substituen gugus hidroksil (OH) yang
berasal dari jalur metabolisme asam sikimat dan
fenil propanoid.
Kelompok senyawa fenolik/polifenol :
Fenol sederhana, asam fenolat, kumarin, tannin,
dan flavonoid.
Dalam tanaman berada dalam bentuk glikosida
atau esternya.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
3/28
Golongan senyawa fenolik sederhana
antara lain meliputi guaiakol, vanilli dan
kresol.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
4/28
Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air
karena umumnya berikatan dengan gula sebagai
glikosida dan biasanya terdapat dalam vakuola
sel.
Bagi tanaman, senyawa fenol berperan sbg:
(misalnya lignin sebagai bahan pembangundinding sel, antosianin sebagai pigmen bunga).
Senyawa fenolik sangat penting untuk
pertumbuhan dan reproduksi tanaman, di mana
diproduksi sebagai respon untuk mempertahankan tanaman dari serangan
patogen.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
5/28
Pada industri makanan dan minuman,
senyawa fenolik berperan dalam memberikanaroma yang khas pada produk makanandan
minuman, sebagai zat pewarna makanan dan
minuman, dan sebagai antioksidan.
Pada industri farmasi, senyawa ini
banyak digunakan sebagai antibakteri,
antijamur, antioksidan, sedatif, antikanker dan
lain-lain. Senyawa ini juga banyak digunakan
sebagai insektisida dan fungisida.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
6/28
Namun, kemampuannya membentuk kompleks dengan protein melalui ikatantunggal dapat mengganggu dalam penelitian.
Selain itu, fenol sendiri sangat peka terhadapoksidasi enzim dan mungkin hilang padaproses isolasi akibat kerja enzim fenolaseyang terdapat dalam tumbuhan.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
7/28
Senyawa fenol dan asam fenolat lebih baik dibahas bersama karena biasanya, padaanalisa tumbuhan, mereka diidentifikasi
bersama. Senyawa asam fenolat ada hubungannya
dengan lignin terikat sebagai ester atauterdapat pada daun di dalam fraksi yang
tidak larut dalam etanol, atau mungkinterdapat di dalam fraksi yang larut dalametanol, yaitu sebagai glikosida sederhana.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
8/28
Fenil propanoid adalah senyawa fenol alamyang mempunyai cincin-cincin aromatik
dengan rantai samping terdiri atas tiga
atom karbon.
Secara biosintesis senyawa ini turunan
asam amino protein aromatik, yakni
fenilalanina dan fenil propanoid, dapat
mengandung satu sisi C6 – C3 atau lebih.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
9/28
Struktur Fenil propanoid
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
10/28
Yang paling tersebar luas adalah asamhidroksisinamat, suatu senyawa yang penting,bukan saja sebagai bangunan dasar lignintetapi juga sebagai pertahanan terhadap
penyakit.
Yang termasuk fenil propanoidhidroksikumarin, fenil propena, dan lignan.
Empat macam asam hidroksisinamat terdapatumum dalam tumbuhan adalah asam fenolat,sinapat, kafeat, dan p-kumarat.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
11/28
Pada prinsipnya,sifat-sifat kimia dari semuasenyawa fenol adalah sama, tetapi dari segibiogenetik senyawa-senyawa ini dapat dibedakanatas dua jenis utama:
1. Senyawa fenol yang berasal dari asam shikimatatau jalur shikimat.
2. Senyawa fenol yang berasal dari jalur asetatmalonat.
Namun ditemukan pula senyawa fenol yangberasal dari kombinasi kedua antara jalurbiosintesa ini, antara lain ialah senyawa flavonoid.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
12/28
Sejumlah besar senyawa aromatik alam dapatdianggap turunan fenilpropan, karenamempunyai cicin benzene yang terikat padarantai 3 karbon.
Kelompok senyawa ini berasal dari shikimat. Senyawa-senyawa fenol ditemukan dalam
berbagai organisme,mulai darimikroorganisme sampai pada tumbuhan
tinggi dan hewan. Kapang merupakan sumber yang kaya
akan senyawa fenol yang berasal dari jalurshikimat.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
13/28
Beberapa jenis senyawa yang termasuk fenilpropanoid ialah turunan asam
sinamat,turunan alifenol,turunan
propilfenol,turunan kumarin.
Turunan sinamat : asam sinamat, asam
kafeat
Turunan kumarin : kumarin, umbeliferon
Turunan alifenol : Cavicol, eugenol, miristin
Turunan propilfenol : anitol, isoeugenol
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
14/28
JALUR SHIKIMAT
Jalur shikimat untuk biosintesafenilpropanoid ditemukan pertama kalidalam mikroorganisme seperti
bakteri,kapang dan ragi. Asam shikimat sendiri pertama kali
ditemukan pada tahun 1885 daritumbuhan IIIicium religiosum,yang dalam
bahasa jepang disebubut shikiminoki,dankemudian ditemukan pula dalam banyak tumbuhan.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
15/28
Metode standar yang digunakan dalampenentuan kandungan polifenol atau Total
Phenolic Content (TPC) adalah Folin-
Ciocalteu dengan asam galat sebagaisenyawa standarnya.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
16/28
Uji Fitokimia Polifenol
Sebanyak 4 gram sampel segar dirajang halus dandididihkan dengan 25 ml etanol selama lebih kurang25 menit, disaring dalam keadaan panas, kemudianpearut diuapkan sampai kering.
Ekstrak dikocok kuat dengan kloroform lalu
ditambahkan air suling, biarkan sampai terbentuk dualapisan, yakni lapisan kloroform dan lapisan air.
Beberapa tetes dalam tabung reaksi ditambahkan besi(III) klorida 1% dalam air dan etanol warna hijau,merah, ungu, biru atau hitam yang kuat (hijau sampai
ungu) menandakan positif mengandung fenolik. Ekstraksi senyawa fenol tumbuhan dengan etanol
mendidih biasanya mencegah terjadinya oksidasienzim.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
17/28
◦ Skema Uji Fitokimia
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
18/28
Metode Ekstraksi Polifenol
Metode ekstraksi yang sering digunakanadalah maserasi dan refluks
Hasil penelitian metode refluks lebih
optimal. Pelarut : heksana, metanol
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
19/28
ISOLASI SENYAWA FENOLAT DARI FRAKSI
ETIL ASETAT KULIT BATANG TUMBUHAN
GANDARIA
Fraksi etil asetat kulit batang tumbuhan
Gandaria pemilihan eluen melalui krom
atografi lapis tipis (KLT)
kromatografikolom gravitasi.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
20/28
Fraksi etil asetat sebanyak 0,9 gramdilakukan kromatografi kolom gravitasimenggunakan silika gel G 60 (35-70 mesh)sebagai fase diam.
Sampel disiapkan secara preabsorbsi dengan0,9 gr silika gel G 60 (35-70 mesh).
Sampel dielusi menggunakan eluen etil asetat
dan metanol dengan komposisi sebagaiberikut: etil asetat: metanol; 9,5 : 0,5 sampaietil asetat : metanol ;4:6.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
21/28
Hasil KLT yang menunjukan pola noda yangsama dikelompokkan menjadi satu fraksi.
Pemisahan ini menghasilkan 3 fraksi yaitu F1-F3.
Berdasarkan pola noda dari kromatogramKLT yang diperoleh maka noda pada F3 danF2 yang akan dipisahkan lebih lanjut.
Pemisahan selanjutnya dilakukan terhadap
fraksi F2. Fraksi F2 sebanyak 29,1 mgdipisahkan dengan kromatografi kolomgravitasi menggunakan fase diam silika gel G60 (35-70 mesh).
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
22/28
Sampel disiapkan secara preabsorbsimenggunakan silika gel G 60 (35-70 mesh)sebanyak 29,1 mg, kemudian dielusi menggunakaneluen etil asetat dengan komposisi 100%, eluat
ditampung didalam vial-vial yang masing-masingberisi ±50 ml.
Vial-vial yang memberikan pola noda yang samadikelompokan kedalam satu fraksi . Pemisahan ini
menghasilkan 4 fraksi yaitu F2.1 - F2.4.Berdasarkan pola noda pada KLT maka nodautama yang dipisahkan adalah noda pada F2.4.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
23/28
Fraksi F2.4 sebanyak 19,7 mg dipreabsorbsi,kemudian dipisahkan dengan kromatografi
kolom gravitasi dengan menggunakan silika
gel G 60 (35-70 mesh) sebagai fase diam,kemudian dielusi dengan menggunakan etil
asetat 100 %.
Eluat ditampung di dalam vial-vial. Pemisahan
dengan kromatografi kolom gravitasi ini
menghasilkan 4 fraksi yaitu F2.4.1 − F2.4.4.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
24/28
Uji kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukandengan menggunakan KLT dengan berbagaieluen, KLT dua dimensi serta pengukurantitik leleh.
Identifikasi hasil senyawa hasil isolasidilakukan dengan uji fitokimia,spektrofotometer UV dan IR.
Pemurnian dilakukan dengan cara pencucian
dengan menggunakan eluen yang sesuai. Pemurnian dilakukan dengan cara pencucian
kristal menggunakan eluen etil asetat : aseton(9:1) pada masing - masing fraksi.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
25/28
Uji kemurnian dilakukan dengankromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan
eluen yang berbeda yaitu etil asetat : aseton
(9:1 dan 7:3) dan etil asetat : metanol (8:2)dengan harga Rf 0,5; 0,75; dan 0,7.
Hasil KLT menunjukan noda tunggal pada
lampu UV dan berwarna kuning setelah
diberi pereaksi penampak noda serium sulfat
pada plat KLT.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
26/28
Spektrum UV dari kristal dalam pelarut etil asetatmemberikan serapan maksimum (nm) (absorbansi) :289 (0,989).
Adanya absorbsi pada panjang gelombang 289 nmmengindikasikan bahwa senyawa hasil isolasi ini
mempunyai ikatan rangkap terkonjugasi yang lazimnyamerupakan cincin aromatis, dimana muncul padapanjang gelombang yang lebih panjang dengankenaikan intensitas yang besar (200-400 nm).
Hasil uji KLT dua dimensi terhadap kristal FE dengan
eluen etilasetat metanol 8:2 dan etilasetat aseton 9:1dengan penampak noda lampu UV.
Hasil uji KLT dua dimensi terhadap kristal FE denganpereksi penampak noda serium sulfat.
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
27/28
Adanya sistem aromatis ini dikuatkan oleh spektrumIR yang menunjukan adanya serapan karakteristik aromatik pada bilangan gelombang 1465-1519 cm−1.
Hasil pengukuran spektroskopi IR memperlihatkanadanya serapan karakteristik pada daerah bilangan
gelombang (cm−
1). Identifikasi senyawa hasil isolasi dengan spektrometer
IR menunjukan adanya serapan pada bilangangelombang 3417 cm−1 dengan satu puncak serapanagak melebar dengan intensitas yang kuat yang
mengindikasikan adanya gugus hidroksil. Gugus hidroksil ini merupakan OH terikat (dapat
berikatan hidrogen).
-
8/16/2019 Kuliah 2 Isolasi Polifenol
28/28
Adanya gugus hidroksil diperkuat denganmunculnya ulur C-O alkohol pada daerah 1165-1033 cm−1.
Serapan gugus karbonil terlihat pada bilangangelombang 1643 cm−1 sedangkan untuk sistemaromatis dengan serapan pada bilangan gelombang1465-1519 cm−1.
Munculnya serapan pada bilangan gelombang 2931cm−1 berasal dari vibrasi ulur C-H alifatik yang
didukung dengan vibrasi tekuk C-H alifatik padabilangan gelombang 1381-1288 cm−1.