Kỹ thuật xét nghiệm lai tại chỗ nhiễm sắc thể gắn huỳnh quang (fish) phát hiện yếu tố HER-2/NEU trong ung thư biểu mô (10:36 | 19/10/2011) - 1. MỞ ĐẦU Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị, song cho đến nay ung thư vẫn là vấn đề lớn của Y học và tỷ lệ gây tử vong vẫn rất cao. Có thể điều trị ung thư bằng nhiều cách như phẫu thuật, xạ trị, hóa chất, tăng cường miễn dịch… và nhiều khi phải kết hợp các phương pháp trên với nhau (phương pháp điều trị đa mô thức), song nhìn chung, kết quả vẫn còn nhiều hạn chế, nhất là đối với những trường hợp ung thư ở giai đoạn muộn, đã có di căn, không còn khả năng phẫu thuật. Gần đây, người ta đã tìm ra một số loại thuốc mới, với bản chất là các kháng thể đơn dòng, điều trị trúng đích (target therapy) với hiệu quả rất tốt như: Gefitinib, erlotinib, lapatinib, cetuximab… Một trong những loại thuốc đã và đang được sử dụng khá phổ biến cho nhiều loại ung thư biểu mô hiện nay là trastuzumab (Herceptin), một kháng thể đơn dòng tác động trực tiếp trên thụ thể Her-2/neu ở bề mặt tế bào u [5], [13], [16], [29]. Tuy nhiên, các thuốc điều trị trúng đích, sản phẩm quen thuộc nhất đã và đang được nhiều nước trên thế giới sử dụng là trastuzumab, là loại thuốc rất đắt tiền. Sẽ là hết sức lãng phí nếu Her-2/neu âm tính mà vẫn điều trị bằng trastuzumab. Vì thế, trước hết cần đánh giá chính xác tình trạng biểu lộ của yếu tố Her-2/neu ở các tế bào ung thư, vì đó là điều tiên quyết cho sự thành công của liệu pháp trastuzumab mà không sợ lãng phí tiền một cách không cần thiết [24].

2. GIỚI THIỆU VỀ HER-2/NEU, EGF VÀ EGFR 2.1. Yếu tố Her-2/neu, EGF và EGFR

Her-2/neu, còn gọi là c-erbB-2; CD340 hay p185, là 1 trong 4 thành viên của gia đình thụ thể biểu bì người (Human epidermal receptor - HER). Nhóm này gồm 4 loại là: HER-1 (Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì - Epidermal growth factor receptor - EGFR), HER-2, HER-3 và HER-4. Các thụ thể HER-3 và HER-4 ít gặp ở các ung thư của người, ngược lại, HER-2 và EGFR đã được biết đến và được nghiên cứu rất nhiều.

Yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal growth factor - EGF) là nhóm yếu tố tăng trưởng được biết đến sớm nhất. Chúng được Stanley Cohen và cộng sự (CS) phát hiện lần đầu tiên vào năm 1962. Đó là một nhóm gồm nhiều yếu tố như: Yếu tố tăng trưởng chuyển dạng alpha (TGF-α), amohiregulin, yếu tố tăng trưởng biểu bì gắn heparin (heparin-binding HbEGF), β-cellulin, cripto-1...

Thụ thể của EGF (EGFR) nằm trên bề mặt của màng tế bào. Đây là một glycoprotein xuyên màng, phần nằm bên trong màng tế bào của thụ thể này gắn với men tyrosine kinaze. Men này được hoạt hóa khi EGF gắn với thụ thể EGFR. Thụ thể EGFR do một gene nằm trong tế bào quy định, đó là một tiền gene sinh ung thư. Gene quy định EGF và thụ thể EGFR đã được tìm thấy ở mô tuyến vúbình thường và nhiều loại mô khác. 2.2. Sự biểu lộ của HER-2/neu và giá trị tiên đoán đáp ứng với điều trị

Có khoảng 25-30% các ung thu vú có biểu lộ quá mức của thụ thể Her-2/neu trên bề mặt màng tế bào. Ngoài ra, có thể gặp sự khuếch đại gene HER-2/neu trong nhiều loại ung thư khác như: ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (UTP KTBN), các ung thư biểu mô (UTBM) tuyến của đại trực tràng, dạ dày, tuyến nước bọt, bàng quang, tiền liệt tuyến, buồng trứng, nội mạc tử cung…[5], [11], [14], [15], [17], [18]…

2.3. Tình hình nghiên cứu về Her-2/neu trong một số bệnh ung thư

2.3.1. Trong UTBM tuyến vú

Mặc dù sự tăng biểu lộ và khuếch đại gene HER-2/neu có ở nhiều loại ung thư khác nhau nhưng vấn đề này được nghiên cứu nhiều nhất là trong UTBM tuyến vú [4], [6], [8], [19], [21], [27]... Các số liệu nghiên cứu thường cho thấy khoảng 25-30% các trường hợp UTBM tuyến vú có tăng biểu lộHER-2/neu (khoảng 7% đối với ung thư tại chỗ và 41,5% khi ung thư đã di căn) [4]. Tuy nhiên, các số liệu công bố còn chưa thống nhất. Có nghiên cứu nêu tỷ lệ Her-2/neu dương tính chỉ là 14%, trong khi một nghiên cứu khác lại đưa ra con số rất cao, tới 90% [4], [28]…

2.3.2. Trong ung thư phổi loại không phải tế bào nhỏ (UTP KTBN) Theo Andre và CS (2004) [5], tỉ lệ các trường hợp UTP KTBN có tăng biểu lộ HER-2/neu không nhiều lắm và dao động khá lớn giữa các nghiên cứu [4], [5], [10], [12]. Số liệu từ các nghiên cứu thường cho thấy tỷ lệ các trường hợp UTP KTBN có tăng biểu lộ HER-2/neu qua xét nghiệm HMMD khoảng từ 19% - 30%; Tuy nhiên, cũng có nghiên cứu công bố tỷ lệ cao hơn nhiều: tới 40-80% [5]. 2.3.3. Trong ung thư tiền liệt tuyến Nghiên cứu của các tác giả thường cho thấy khoảng 25-30% số bệnh nhân ung thư tiền liệt tuyến có tăng biểu lộ gene HER-2/neu [5], [20], [23].

2.3.4. Trong ung thư đại trực tràng: Ý nghĩa của sự khuếch đại gene và gia tăng biểu lộ protein Her-2/neu trong UTBM đại trực tràng còn ít được nghiên cứu và các số liệu rất khác nhau giữa các tác giả (21% - 59,4%)

2.3.5. Trong ung thư dạ dày Gần đây, đã có khá nhiều nghiên cứu về sự biểu lộ của HER-2/neu trong ung thư dạ dày và các thử nghiệm điều trị bằng trastuzumab. Tuy nhiên, các số liệu thu được từ những nghiên cứu khác nhau chưa thực sự thống nhất

Tại Việt Nam, cũng đã có một vài công trình nghiên cứu dựa trên xét nghiệm HMMD về tình trạng biểu hiện của yếu tố Her-2/neu nhưng chủ yếu là trong UTBM tuyến vú và một vài nghiên cứu trong UTBM của đại trực tràng, với số lượng bệnh nhân ít, các kết quả nghiên cứu cũng còn khác nhau nhiều:

- Nghiên cứu của Nguyễn Văn Thành và CS (2009) tại Bệnh viện Ung bướu TP. Hồ Chí Minh [2], trong UTBM tuyến vú cho thấy tỉ lệ Her-2/neu dương tính là 29,74%; trong khi nghiên cứu của Tạ Văn Tờ (2009) tại Bệnh viện K, trên các bệnh nhân UTBM tuyến vú có tuổi đời ≤ 35 lại cho thấy tỉ lệ này khá cao, tới 42,3% [3].

- Hoàng Kim Ngân và CS, nghiên cứu trong bệnh UTBM đại trực tràng thấy Her-2/neu (+) ở 27,27% số bệnh nhân; tỉ lệ này ở những khối UTBM với độ ác tính cao (high-grade) cao hơn rất nhiều so với các trường hợp có độ ác tính thấp (low-grade) (63,64% so với 18,18%) [1].

Hầu như chưa thấy có công trình nghiên cứu nào về vấn đề này đối với UTBM của phổi, tuyến tiền liệt và các loại ung thư khác… 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ YẾU TỐ HER-2/NEU

Có thể chia các phương pháp đánh giá yếu tố Her-2/neu thành 3 nhóm chính sau [24]:

- Đánh giá mức độ khuyếch đại của gene HER-2/neu (bằng các kỹ thuật lai tại chỗ NST: FISH, CISH, SISH).

- Xác định sự biểu lộ quá mức của thụ thể Her-2/neu trên bề mặt tế bào thông qua việc phát hiện các protein đặc hiệu (bằng xét nghiệm HMMD).

- Định lượng protein Her-2/neu trong huyết thanh (phương pháp ELISA). Trong các phương pháp nói trên, hiện nay có 2 phương pháp thường được sử

dụng rộng rãi nhất là HMMD và FISH. 3.1. Kỹ thuật xét nghiệm HMMD HMMD là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay trong việc đánh giá thụ thể Her-2/neu. Nguyên lý của xét nghiệm này là sử dụng các KT đặc hiệu đã biết, bán sẵn trên thị trường để phát hiện các kháng nguyên (KN) tương ứng là protein Her-2/neu - sản phẩm của gene HER-2/neu - trên bề mặt tế bào. Ưu điểm của HMMD là tiện lợi, rẻ tiền, tiêu bản xét nghiệm dễ bảo quản sau khi đã phân tích, và chỉ cần sử dụng kính hiển vi quang học thông thường để quan sát. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là kết quả không thật khách quan, do có thể bị ảnh hưởng của một số yếu tố như: điều kiện bảo quản mẫu trước đó, thời gian và kỹ thuật cố định bệnh phẩm, loại KT sử dụng (đơn dòng hay đa dòng), và quan trọng hơn cả là khó khăn khi áp dụng bảng tính điểm để có kết luận chính xác. Có một tỉ lệ khá lớn trường hợp kết quả biểu hiện là 2+ khi dùng phương pháp HMMD lại không thấy có sự khuyếch đại gene tương ứng khi dùng phương pháp FISH. Trong những trường hợp này thì FISH cho nhiều thông tin về tiên lượng, về đáp ứng với điều trị trastuzumab hơn là phương pháp HMMD. Vì thế, ở Hoa Kỳ và các nước phát triển quy định khi kết quả xét nghiệm HMMD không thật rõ ràng (2+) thì phải xét nghiệm lại bằng kỹ thuật FISH. 3.2. Kỹ thuật xét nghiệm FISH

Đây là phương pháp đánh giá mức độ khuyếch đại của gene HER-2/neu trên NST 17 của tế bào.

Cũng như các phương pháp xét nghiệm dựa trên DNA khác, FISH có lợi điểm là các nuclieotid có khả năng biến tính và tái tổ hợp lại. Một đặc tính rất quan trọng là, ở dạng chuỗi đơn DNA, mỗi axít nucleic sẽ bắt cặp với 1 axít nucleic khác theo nguyên tắc bổ sung để tái cấu trúc lại chuỗi xoắn kép DNA. Trong kỹ thuật FISH thường quy, đoạn DNA đích được cố định trên bề mặt tiêu bản sẽ được lai với đoạn DNA đã được đánh dấu huỳnh quang (đầu dò DNA), tạo thành 1 chuỗi xoắn kép DNA lai. 3.2.1. Nguyên lý của xét nghiệm FISH (xem sơ đồ dưới)

Hình 2. Sơ đồ về nguyên lý của kỹ thuật FISH

Chú thích: Đoạn DNA đích (màu xám nhạt) được cố định trên bề mặt tiêu bản và làm biến tính. Đầu dò DNA (màu đen) được đánh dấu bằng 1 chất nhuộm huỳnh quang (fluorochrome) và / hoặc 1 hapten không nhuộm hunỳnh quang (nonfluorescent

hapten), biến tính và lai trước với DNA lặp lại không đánh dấu (màu xám sẫm). Sau đó, đầu dò DNA được lai với DNA đích. Sau khi rửa để loại bỏ chuỗi đơn DNA không gắn cũng như những đoạn NDA gắn một cách không đặc hiệu. Sau khi rửa bỏ hapten không gắn huỳnh quang và cho dung dịch chống phai màu với DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol.2HCl l), quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh quang. 3.2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

3.2.2.1. Thiết bị, dụng cụ

Ngoài các máy móc, thiết bị để làm tiêu bản mô bệnh học thường quy như: máy xử lý mô, máy đúc block paraffin, máy cắt tiêu bản vi thể… còn cần thêm các máy móc, thiết bị sau:

- Kính hiển vi huỳnh quang (với đủ các lọc huỳnh quang cần thiết). - Máy lai biến tính DNA (ThermoBrite). - Máy trộn mẫu (Vortexer). - Hot plate (điều chỉnh được nhiệt độ). - Bể ổn nhiệt (Waterbath). - Máy khuấy từ gia nhiệt. - Máy đo pH. - Cân điện tử. - Pippet tự động. - Buồng tạo ẩm. - Tủ lạnh. - Coplin jar. - Tiêu bản, lá kính…

3.2.2.2. Dầu dò DNA gắn huỳnh quang và hóa chất

• Các đầu dò DNA gắn huỳnh quang cho FISH (có nhiều loại đầu dò DNA gắn huỳnh quang cho FISH bán sẵn trên thị trường bởi các hãng như Vysis, Abbott, Kreatech, MetaSystems, ASI và Cytocell...). • Vectashield antifade.

• Biotinylated antiavidin.

• Biotin nick translation kit.

• Bovine serum albumin (BSA).

• DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol.2HCl) stock solution.

• dNTP: dung dịch stock dATP, dCTP, dGTP, dTTP.

• Các nucleotis gắn huỳnh quang 1 mM (FITC-12-dUTP).

• Các chuỗi mồi Oligonucleotide 50 pmol ml/1 (đặc hiệu cho chuỗi đích).

• Dung dịch PBS (phosphate buffered saline).

• Xi măng cao su (rubber cement): Fixogum™. • Taq DNA polymerase với đệm 10× Taq. 3.2.3. Quy trình xét nghiệm FISH

1. Mảnh mô được cắt từ chính các bệnh phẩm đã sử dụng để cắt nhuộm, chẩn đoán mô bệnh học thường quy và xét nghiệm HMMD trước đó, với độ dày lát cắt 3-4µm, trải phẳng trên lam kính chuyên dụng, khử paraffin. 2. Giỏ 100µl dung dịch đệm biến tính lên tiêu bản và đậy lá kính 24×50mm. 3. Ủ tiêu bản trên 1 hot plate ở nhiệt độ 75°C x 2-4 phút.

4. Bỏ lá kính, cho tiêu bản vào coplin jar chứa cồn 70% (4°C) để giữ DNA đích ở dạng chuỗi đơn.

5. Loại nước trên tiêu bản bằng cồn ethylic (70%, 90%, 100%, 4°C, mỗi chặng 3 phút) và để khô trong không khí.

6. Thêm 20µl dung dịch đầu dò (probe solution) lên mỗi tiêu bản biến tính, đậy 1 lá kính 24 × 50mm rồi gắn chất xi măng cao su xung quanh lá kính. 7. Ủ tiêu bản 1-3 đêm ở 37°C trong hộp tạo ẩm.

8. Lấy tiêu bản ra để ở buồng 37°C và bỏ xi măng cao su bằng kẹp và tháo lá kính bằng cách ngâm tiêu bản trong dung dịch Tween 4× SSC/0.2% (ở nhiệt độ phòng trong bể coplin jar 100ml).

9. Rửa tiêu bản 3 × 5 phút trong dung dịch formamide (45°C), sau đó trong dung dịch 2× SSC (37°C) 3 × 5 phút trong 1 bể coplin jar 100ml.

10. Chuyển tiêu bản vào dung dịch Tween 4× SSC/0.2% (100ml ở nhiệt độ phòng) trong vài giây.

11. Thêm 50µl dung dịch I vào mỗi tiêu bản, đậy lá kính 24 × 50mm và ủ ở 37°C trong 30 phút trong buồng ẩm.

12. Bỏ lá kính và rửa 3 lần × 3 phút trong dung dịch Tween 4× SSC/0.2% (ở nhiệt độ phòng và lắc nhẹ nhàng).

13. Thêm 50µl dung dịch II vào mỗi tiêu bản, đậy lá kính 24 × 50mm và ủ ở 37°C x 45 phút trong hộp tạo ẩm. 14. Làm lại bước 12.

15. Nhuộm tiêu bản với dung dịch DAPI (trong bể coplin jar 100ml, ở nhiệt độ phòng) x 8 phút.

16. Rửa tiêu bản 3 lần trong nước vài giây và để khô tự nhiên trong không khí.

17. Thêm 15µl dung dịch chống phai màu, đậy lá kính

18. Quan sát và phân tích kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang. 3.2.4. Đánh giá kết quả - Đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại 400 lần.

- Trước hết, cần xem lại tiêu bản mô bệnh học nhuộm HE thường quy để xác định vị trí vùng ung thư xâm lấn.

- Sau đó, quan sát, tìm và xác định chính xác vùng u tương ứng trên tiêu bản FISH.

- Tìm và đếm trên 20 tế bào u các tín hiệu màu đỏ (tín hiệu của Her-2/neu) và các tín hiệu màu xanh lục (tín hiệu tâm động của NST 17).

- Lấy trung bình cộng của các tín hiệu màu đỏ, chia cho trung bình cộng của các tín hiệu màu xanh.

+ Nếu kết quả > 22 là FISH (+).

+ Nếu kết quả < 18 là FISH (-).

+ Nếu kết quả từ 18-22 thì phải đếm lại trên 60 tế bào và tính toán tương tự như trên. FISH là một phương pháp xét nghiệm cho kết quả khách quan hơn. Nó được coi là một xét nghiệm tiêu chuẩn với độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện sự khuyếch đại của gene HER-2/neu. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là giá thành khá cao, mất nhiều thời gian hơn, phải quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, việc đọc kết quả khó khăn hơn do khó ghi nhận những dấu hiệu hình thái học kèm theo, đôi khi rất khó xác định vùng ung thư xâm lấn trên tiêu bản FISH, tiêu bản không thể lưu giữ lâu để có thể xem lại vì tín hiệu huỳnh quang bay màu dần theo thời gian… 3.3. Một số phương pháp khác đánh giá yếu tố Her-2/neu

Ngoài 2 kỹ thuật xét nghiệm HMMD và FISH nói trên, còn có thể đánh giá yếu tố Her-2/neu bằng một số phương pháp khác như: - Kỹ thuật lai tại chỗ NST gắn màu / hoặc gắn bạc(Chromogenic / Silver in situ hybridization - CISH / SISH). - Kỹ thuật khuyếch đại gene RT-PCR (Reverse transcription - polymerase chain reaction). - Phương pháp ELISA (Enzyme-Link ImmunoSorbent Assay).

4. DỰ KIẾN CÁCH THỨC TRIỂN KHAI XÉT NGHIỆM FISH

4.1. Điều kiện để triển khai kỹ thuật FISH tại Khoa Giải phẫu bệnh lý

- Về đào tạo kỹ thuật: BS Trịnh Tuấn Dũng đã được học về kỹ thuật này tại Nhật Bản (năm 2007) và Singapore (năm 2009). Trong thời gian tới sẽ mời chuyên gia Singapore sang đào tạo trực tiếp tại Bệnh viện cho các bác sĩ và kỹ thuật viên của Khoa. - Về thiết bị, dụng cụ, vật tư và hóa chất: hện tại, Khoa Giải phẫu bệnh lý đã được trang bị tương đối đầy đủ các thiết bị, dụng cụ cho kỹ thuật này. Các vật tư tiêu hao và hóa chất ban đầu sẽ sử dụng từ nguồn kinh phí của đề tài cấp Bộ Quốc phòng.

4.2. Kế hoạch triển khai

Dự kiến, trong khoảng 2 năm đầu sẽ lựa chọn khoảng 120 trường hợp UTBM, gồm 4 nhóm, mỗi nhóm 30 BN:

+ Nhóm 1: UTP KTBN. + Nhóm 2: UTBM tuyến vú.

+ Nhóm 3: UTBM đại trực tràng. + Nhóm 4: UTBM tiền liệt tuyến.

(Đây là những loại ung thư hay gặp ở các bệnh nhân cao tuổi của Việt Nam và cũng là đối tượng hay gặp tại Bệnh viện TWQĐ 108 nói riêng).

- Trước hết, cần xét nghiệm mô bệnh học, chẩn đoán xác định là UTBM: + Các mảnh bệnh phẩm u sẽ được cố định bằng dung dịch formol 10% trung

tính, sau đó được xử lý bằng máy xử lý mô tự động STP 120 (của Hãng Microm - Đức), rồi đúc trong khối paraffin bằng máy EC 350-2 (của Đức).

+ Cắt mảnh với độ dày 3-4µm, nhuộm Hematoxylin - Eosin và PAS bằng máy nhuộm tiêu bản tự động HMS 70 (của Đức).

+ Đọc và phân tích kết quả dưới kính hiển vi quang học Axioscope 40 của Hãng Calzeiss (Đức). Phân type MBH, phân độ ác tính và giai đoạn của khối u theo phân loại của Tổ chức Y tế thế giới năm 2010.

- Sau đó, tiến hành xét nghiệm HMMD và FISH để đánh giá về sự biểu lộ của yếu tố Her-2/neu.

- So sánh kết quả giữa HMMD và FISH, rút kinh nghiệm và hoàn thiện kỹ thuật, sau đó sẽ triển khai rộng rãi hơn cho các loại ung thư khác. 5. KẾT LUẬN Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị, song cho đến nay, ung thư vẫn là vấn đề lớn của y học và tỷ lệ gây tử vong vẫn rất cao.

Trên thế giới, việc khảo sát yếu tố Her-2/neu bằng xét nghiệm FISH đã trở thành thường quy. Tuy nhiên, ở Việt Nam, cho đến nay vẫn rất ít cơ sở Y tế có thể thực hiện được xét nghiệm này.

Hiện tại, Khoa Giải phẫu bệnh lý đã được trang bị khá đầy đủ các thiết bị, máy móc cần thiết, cán bộ đã được đào tạo khá cơ bản, có thể triển khai xét nghiệm FISH, và nếu làm tốt tốt thì đây sẽ là một trong những cơ sở đầu tiên tại Việt Nam ứng dụng kỹ thuật này để tìm hiểu về sự biểu lộ của yếu tố Her-2/neu trong ung thư, giúp các Bác sĩ có thêm hiểu biết, kinh nghiệm và căn cứ khoa học để áp dụng liệu pháp điều trị đích bằng trastuzumab cho các bệnh nhân ung thư, cải thiện chất lượng và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân.

Dự kiến, sau khi kỹ thuật này được triển khai và hoàn thiện, Khoa Giải phẫu bệnh lý của Bệnh viện TWQĐ 108 sẽ là nơi tiếp nhận và xét nghiệm cho hầu hết các trường hợp ung thư có nhu cầu về loại xét nghiệm FISH, vì hiện tại chưa có cơ sở nào ở miền Bắc thực hiện xét nghiệm này cho các bệnh nhân UTBM. Mặt khác, sẽ có thêm điều kiện để tiến hành các nghiên cứu khoa học, đào tạo và huấn luyện tại Bệnh viện TWQĐ 108 nói riêng và Việt Nam nói chung.

Kỹ thuật đã được Thường trực Hội đồng KHKT Bệnh viện thông qua và nhận định đây là kỹ thuật có nhiều lợi thế và có tính ứng dụng cao.