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SIBS – SOCIETA’ ITALIANA DI BIOLOGIA SPERIMENTALE
85° CONVEGNO SIBS
LA BIOLOGIA SPERIMENTALE:
DALLE MOLECOLE ALL’ORGANISMO
Aula Magna dell’Università di Parma
29 - 30 novembre 2012
| 3
Con il patrocinio di:
Università degli studi di Parma
Accademia ligure di scienze e lettere
Museo di storia naturale di Parma
Provincia di Parma
Comune di Parma
Si ringraziano:
Stardea S.r.l.
Physik Instrumente (PI) S.r.l.
4 |
PRESIDENTE NAZIONALE
Emma Rabino Massa –Università degli studi di Torino
VICE PRESIDENTE
Proto Pippia – Università degli studi di Sassari
SEGRETARIO NAZIONALE
Giovanni Pizzuti – Università degli studi di Napoli Federico II
COMITATO ORGANIZZATORE
M. G. Bridelli - Università degli studi di Parma
R. Antolini - Università degli studi di Trento
M. Cocchi - Università degli studi di Bologna
M. A. Dessì - Università degli studi di Cagliari
L. Pane - Università degli studi di Genova
P. Pippia - Università degli studi di Sassari
G. Pizzuti - Università degli studi di Napoli Federico II
E. Rabino Massa - Università degli studi di Torino
COMITATO SCIENTIFICO
M. G. Bridelli
S. De Iasio
M. Miragoli
E. Polverini
M. Zaniboni
| 5
Sommario
PROGRAMMA .................................................................................................................................... 9
LETTURA MAGISTRALE SIBS “GAETANO QUAGLIARIELLO” ........................................ 13
Dal neurone al comportamento: il sistema mirror e la cognizione sociale .................................... 13
ABSTRACT ........................................................................................................................................ 15
Sindrome metabolica ......................................................................................................................... 17
Simmetrie e rotture di simmetrie tra biologia molecolare, disturbi dell’umore ed emergentismo
personalistico. .................................................................................................................................. 19
Sindrome metabolica e performance cognitiva nell’anziano ........................................................... 22
Sindrome metabolica ....................................................................................................................... 23
Metabolic syndrome and cardiovascular risk: contribution of ultrasonography .............................. 25
Fisiologia cardiaca .............................................................................................................................. 27
A protocol which combines current – and voltage-clamp provides a novel useful three-dimensional
representation of the cardiac action potential ................................................................................... 29
Spontaneous electrical activity of guinea pig sinoatrial cells under modulation of two different
pacemaker mechanisms.................................................................................................................... 32
Arrhythmia susceptibility in senescent rat hearts ............................................................................. 35
Single low-intensity premature stimuli can induce ventricular arrhythmias in the normal heart ..... 38
Antropologia ed evoluzione molecolare ............................................................................................ 41
Complementarietà di spettroscopia FT-IR ed analisi istologiche per lo studio del degrado della pelle
mummificata. ................................................................................................................................... 43
Stature estimation using mandibular morphometric parameters in Italian population: a preliminary
report ................................................................................................................................................ 46
Variabilità di marcatori uniparentali in popolazioni italiane a diverso grado di isolamento ............ 49
Ancient DNA studies: new perspectives on old samples ................................................................. 50
Mine, yours, ours? sharing data on human genetic variation ........................................................... 51
Metodologie e tecniche della biologia sperimentale......................................................................... 53
Synthesis and antimicrobial activity of new 1-R-3-(2-PIRiDYL)- 4-nitroso- 5-carboxiethyl-1H-
pyrazoles. ......................................................................................................................................... 55
Light regulated enzyme activities .................................................................................................... 57
Towards nano-physiology in mammalian cells: a multi-parametric analysis with scanning ion
conductance microscopy .................................................................................................................. 58
Biomolecular NMR, a versatile tool for the understanding of protein science; retinoid-binding
proteins as an example ..................................................................................................................... 60
Application of the multiuse encapsulator agent F-500 for environmental remediation ................... 62
A photochromic bacterial photoreceptor as a novel tool for super-resolution microscopy .............. 65
Study of the interaction of myelin basic protein with membranes by means of molecular dynamics
simulations ....................................................................................................................................... 67
Modulation of the photocycle of a flavin-based photoreceptor by site-directed mutagenesis ......... 69
Nuove metodologie per antichi rimedi: il caso del fungo di malta .................................................. 70
6 |
POSTER............................................................................................................................................... 73
Qualitative comparision of olive oil mediterranean .......................................................................... 75
Relationship between maximal fat oxidation and oxygen uptake: comparison between patients with
type 2 diabetes and healthy sedentary subjects ................................................................................. 77
The influence of hypocaloric diet, associated with moderate physical activity and cbt (cognitive
behavioral therapy), on self-esteem and self-efficacy and their modulator role on emotional eating.
.......................................................................................................................................................... 80
The control of abstinence in the treatment of alcohol dependence: the use of acamprosate in relapse
prevention. ........................................................................................................................................ 82
Cellular drug delivery system based on vaterite particles ................................................................ 85
Modelli biologici di stress ossidativo per lo studio delle proprietà antiossidanti del carciofo .......... 86
Micro-Raman mapping of bio-carbonates and polyenic pigments in corals and shells .................... 93
La popolazione del vergante attraverso lo studio dei cognomi ......................................................... 95
Ricerche sulla popolazione di Giaglione (TO) in epoca preunitaria ................................................. 96
Distribution and phylogeny/distance-trees of prokaryotic photoreactive domains ........................... 99
Biomarcatori per la diagnosi precoce del tumore al polmone ......................................................... 101
Comparative analysis of cytotoxic effects INDUCED BY N4-ethylmorpholine
citronellalthiosemicabazone complexes in different human cancer cell lines ................................. 104
Effetti citotossici degli ossidi di cobalto e di titanio su cellule A549. ............................................ 107
Enzimatic biomarkers in the gilthead seabream juveniles fed with graded concentrations of
alchylphenols .................................................................................................................................. 109
Hepatic activities in Sparus Aurata L. juveniles fed with bisphenol A enriched diet. .................... 111
K:D-Rib un inibitore della proliferazione delle cellule tumorali ed un promotore del folding di
DNAzima. ....................................................................................................................................... 113
Contenuto e mappa di distribuzione del magnesio intracellulare in cellule farmaco-resistenti e -
sensibili ........................................................................................................................................... 115
Modificazioni del contenuto intracellulare di magnesio durante l’apoptosi mitocondrio-mediata:
studi degli eventi precoci correlati al potenziale mitocondriale ...................................................... 117
Valutazione dell’efflusso di magnesio indotto da cAMP in cellule HL60 mediante un nuovo
chemosensore fluorescente derivato dall’8-idrossichinolina .......................................................... 119
Nuove prospettive nella determinazione del magnesio intracellulare ............................................. 121
La carenza di magnesio inibisce la progressione del ciclo cellulare in cellule di osteosarcoma
umano ............................................................................................................................................. 123
Cadmium contamination and sense of smell in Danio rerio ........................................................... 125
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SESSIONI PLENARIE
29 NOVEMBRE 2012
Sindrome metabolica
Fisiologia cardiaca
30 NOVEMBRE 2012
Antropologia ed evoluzione molecolare
Metodologie e tecniche della Biologia Sperimentale
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PROGRAMMA GIOVEDI’ 29 NOVEMBRE
9.30 Saluto delle Autorità
9.45 Saluto del Presidente Emma Rabino Massa
10.00 Lettura magistrale “Gaetano Quagliariello”:
Leonardo Fogassi (Università di Parma)
Dal neurone al comportamento: il sistema mirror e la cognizione sociale.
11.15-13.00 SINDROMI METABOLICHE moderatore G. L. Mariottini
F. Gabrielli (Istituto “Paolo Sotgiu” per la ricerca in Psichiatria e Cardiologia
Quantitativa e Quantistica, L.U.de.S. University, Lugano)
Biologia ed emergentismo personalistico
M. Gualerzi (Prevenzione e Riabilitazione cardiovascolare, Don Gnocchi, Parma)
Sindrome Metabolica
M. Rinaldi (Università di Torino)
Sindrome metabolica e performance cognitiva nell’anziano
V.O. Palmieri (Università di Bari)
Metabolic syndrome and cardiovascular risk: contribution of ultrasonography
14.00-15.00 SESSIONE POSTER
15.00-16.30 METODOLOGIE E TECNICHE DELLA BIOLOGIA SPERIMENTALE
moderatore E. Polverini
S. Aiello (Università di Palermo)
Synthesis and antimicrobial activity of new 1-R-3-(2-piridyl)-4-nitroso-5-carboxiethyl-
1H-pyrazoles.
W. Gärtner (Max Planck Muelheim)
Light regulated enzyme activities
M. Miragoli (Humanitas Milano)
Towards nano-physiology in mammalian cells: a multi-parametric analysis with
scanning ion conductance microscopy
L. Franzoni (Università di Parma)
Biomolecular NMR, a versatile tool for the understanding of protein science;
retinoid-binding proteins as an example
G.L. Mariottini (Università di Genova)
Application of the multiuse encapsulator agent F-500 for environmental
remediation.
10 |
17.00 FISIOLOGIA CARDIACA moderatore R. Antolini
M. Zaniboni (Università di Parma)
A protocol which combines current- and voltage-clamp provides a novel usefull
three-dimensional representation of the cardiac action potential.
F. Cacciani (Università di Parma)
Spontaneous electrical activity of guinea pig sinoatrial cells under modulation of two
different pacemaker mechanisms.
S. Rossi (Università di Parma)
Arrhythmia susceptibility in senescent rat hearts.
E. Macchi (Università di Parma)
Single low-intensity premature stimuli can induce ventricular arrhythmias in the
normal heart.
18,00 ASSEMBLEA DEI SOCI
VENERDI’ 30 NOVEMBRE
9.00-11.00 ANTROPOLOGIA ED EVOLUZIONE MOLECOLARE
moderatore E. Rabino Massa
C. Stani (Università di Parma)
Complementarietà di spettroscopia FTIR ed analisi istologiche per lo studio del
degrado della pelle mummificata.
C. Milani (Università di Torino)
Stature extimation using mandibular morphometric parameters in italian
population: a preliminary report.
A. Boattini S. Sarno (Università di Bologna)
Variabilità di marcatori uniparentali in popolazioni italiane di diverso grado di
isolamento.
D. Caramelli (Università di Firenze)
Ancient DNA studies: new perspectives on old samples.
P. Anagnostou (Università di Roma “La Sapienza”)
Mine, yours, ours? Sharing data on human genetic variation.
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11.30 – 13.00 METODOLOGIE E TECNICHE DELLA BIOLOGIA SPERIMENTALE
Moderatore S. Abbruzzetti
C. Mandalari (Università di Parma)
A photochromic bacterial photoreceptor as a novel tool for super-resolution
microscopy
E. Polverini (Università di Parma)
Study of the interaction of myelin basic protein with membranes by means of
molecular dynamics simulations.
A. Losi (Università di Parma)
Modulation of the photocycle of a flavin-based photoreceptor by site-directed
mutagenesis
14.00 – 15.30 VISITA AL MUSEO BOTTEGO
Assistenza culturale Prof. C. Modonesi
15.30 – 16.30 PROSEGUE TAVOLA ROTONDA
Moderatore E. Polverini
P. Zizzi (Università di Pavia)
Aspetti non-algoritmici della biologia quantistica
E. Pessa (Università di Pavia)
Verso un modello generale della dinamica del citoscheletro.
A. Rosa (Università di Cagliari)
Nuove metodologie per antichi rimedi: il caso del fungo di Malta.
17.00 PREMIO SIBS
SALUTO CONCLUSIVO DEL PRESIDENTE SIBS
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LETTURA MAGISTRALE SIBS “Gaetano Quagliariello”
Dal neurone al comportamento: il sistema mirror e la cognizione
sociale
Leonardo Fogassi
Dipartimento di Neuroscienze, Università di Parma
Nella concezione classica si considerava che le funzioni cognitive fossero il risultato
di un livello superiore di elaborazione sensoriale, lasciando alla corteccia motoria un
ruolo prevalentemente esecutivo. Gli studi neuroanatomici e neurofisiologici delle
ultime due decadi hanno rivoluzionato questo concetto, portando al riconoscimento
che dal sistema motorio possano emergere numerose capacità cognitive. Un ottimo
esempio di tali capacità è il sistema dei neuroni mirror, originariamente scoperti nella
corteccia premotoria della scimmia. Questi neuroni si attivano sia quando una
scimmia esegue un atto motorio finalizzato (ad esempio afferrare un oggetto) sia
quando osservano un altro individuo svolgere lo stesso atto. Tale funzione è resa
possibile dal fatto che la corteccia motoria contiene le rappresentazioni degli atti
motori contenuti nel repertorio della specie. Confrontando quindi l’atto svolto da un
altro individuo con la rappresentazione motoria dello stesso atto è possibile
comprendere automaticamente lo scopo del comportamento altrui. Se nella scimmia
la comprensione degli atti altrui è probabilmente la funzione preminente del sistema
mirror, nell’uomo un sistema omologo, dimostrato nella corteccia parieto-frontale,
sottostà verosimilmente a svariate funzioni sociali. Tra le funzioni proposte vi sono
l’imitazione, la comprensione dell’intenzione altrui, la comprensione del linguaggio
e l’empatia. Numerosi studi ormai hanno dimostrato la presenza del sistema mirror
nell’uomo e il suo coinvolgimento nelle funzioni suddette. Per il futuro, tre nuovi
sviluppi della ricerca su tale sistema neuronale sembrano essere promettenti. Uno è
l’investigazione di come la funzione di “rispecchiamento” si sviluppi nel bambino e
quale ne possa essere il ruolo. Studi comportamentali, neurofisiologici e di
neuroimmagine suggeriscono che il sistema mirror sia già presente precocemente
nell’ontogenesi e abbia un ruolo importante nello sviluppo della comprensione
dell’azione e, verosimilmente, nell’intersoggettività. Un secondo sviluppo riguarda lo
studio delle sindromi che possono coinvolgere il sistema mirror, quali, ad esempio,
l’autismo. Negli ultimi anni svariati lavori convergono nel proporre che un’anomalia
nell’organizzazione del sistema mirror o del sistema motorio ad esso soggiacente,
possano spiegare alcuni degli aspetti sociali di tale sindrome. Il terzo sviluppo
rappresenta la possibilità di utilizzare le proprietà del sistema mirror per riabilitare
adulti e bambini con deficit motori, basandosi su terapie osservazionali. Alcuni studi
di questi ultimi anni sembrano suggerire un effetto positivo di queste terapie, in
parallelo a modificazioni plastiche delle aree contenenti il sistema mirror.
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Simmetrie e rotture di simmetrie tra biologia molecolare, disturbi
dell’umore ed emergentismo personalistico.
1,2
Massimo Cocchi, 1Fabio Gabrielli
1Istituto “Paolo Sotgiu” per la ricerca in Psichiatria e Cardiologia Quantitativa e Quantistica
2Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie
Il ruolo della membrana cellulare (neurone e piastrina)
La membrana delle cellule del cervello sembra offrire una via promettente verso una
migliore comprensione della psicopatologia nei suoi differenti aspetti: Depressione
Maggiore, Disturbo Bipolare e le loro conseguenze sul deficit cognitivo. Diversi
approcci hanno fornito elementi di prova a proposito di quest’argomento. In
particolare, un'ampia letteratura scientifica supporta il suggerimento del gruppo di
Rasenick, cioè, che le piastrine umane servano come marcatori biologici per la
depressione.
Altri autori, vale a dire Cocchi e Tonello (1, 2, 3) hanno studiato le membrane delle
piastrine di soggetti depressi, evidenziando i profili degli acidi grassi come possibile
misura dello stato di membrana.
In particolare, hanno confrontato il profilo delle piastrine degli acidi grassi di
membrana di un gruppo di soggetti clinicamente depressi contro un gruppo di
soggetti sani. I risultati ottenuti con l’impiego di una Rete Neurale Artificiale, nei
due gruppi, hanno evidenziato la possibilità di classificare i Disordini dell’Umore
dalla cosiddetta normalità e, all’interno dei Disordini dell’Umore, di distinguere i
soggetti con Depressione Maggiore da quelli con Disordine Bipolare. I risultati,
inoltre, degli esperimenti degli autori sembrano molto coerenti con quelli ottenuti
sulle proteine-G e sulle zattere lipidiche di membrana delineati dal gruppo di
Rasenick.
La membrana cellulare vive, dunque, in una costante condizione di mobilità e,
quando le oscillazioni degli acidi grassi varcano gli intervalli di tolleranza della
membrana, possono essere espressi fenomeni patologici.
“The mechanical factors of membrane lipids constitute lipid dependent factors that
can dramatically affect protein functions or protein-protein interactions (4). In realtà
la costante condizione di mobilità della membrana, sia per livelli fisiologici sia
sconfinando in conseguenze patologiche, si traduce in una deformazione della stessa
a diversi livelli d’intensità con conseguenze che coinvolgono il raft lipidico di
membrana, la proteina Gsα e il citoscheletro (5).
Adhesion between membrane and cytoskeleton is influenced by a number of factors,
including the lipid composition, cytoskeleton density and distribution, membrane
surface area–to-volume ratio, and internal cellular pressure (6).
In letteratura sono state ampiamente descritte le risposte alle modificazioni indotte
sul citoscheletro da forze di tipo meccanico (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14) esercitate sulla
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membrana.
Tutte le conoscenze acquisite, lo studio delle ipotesi quantistiche della coscienza,
l’opportunità del dialogo che si è aperto all’interno del Quantum Paradigm
Psychopathology Group (QPP), tutto questo ha certamente contribuito alla
costruzione di un nuovo tentativo d’ipotesi che parrebbe potere conciliare quelle
precedenti le quali, in realtà, sono solamente frutto di modi diversi di guardare allo
stesso fenomeno.
Lo stato di continuo rinnovo e scambio di acidi grassi da parte della membrana con
conseguente deformazione del bilayer lipidico, può essere pensato nei termini di una
forza meccanica, sia in condizioni fisiologiche sia patologiche, che si esercita sul
citoscheletro con carattere di continuità consentendo, quando sussistano condizioni
fisiologiche per la membrana, periodi di decoerenza dei microtubuli (500ms), che
danno origine alla manifestazione cosciente che si tradurrà in coscienza classica,
neurocorrelata.
Il problema che si pone è di comprendere come, nelle diverse condizioni dei
disordini dell’umore, la decoerenza possa modificarsi allungando o accorciando il
periodo (< o > di 500ms).
Avendo avuto la possibilità di comprendere che una maggiore mobilità della
membrana caratterizza la DM e una minore il DB, si è percepito che esistono
condizioni patologiche di deformazione della membrana che possono esercitare
differenti forze meccaniche sul citoscheletro dall’interno della stessa membrana e
che potrebbero compromettere il fisiologico fenomeno di superposition dei
microtubuli e conseguentemente il periodo di oscillazione.
Nel caso del DB ci sarebbe un accorciamento del periodo di decoerenza mentre nel
caso della DM un allungamento.
A questa eventualità potrebbero corrispondere, in casi di estrema criticità dei tempi
di decoerenza, profonde e decisive modificazioni dello stato cosciente.
Avendo dimostrato che fra DM e DB esiste una rottura di simmetria, tenendo sempre
presenti le caratteristiche di mobilità della membrana, che esiste un”domain wall”
governata da forze elettromagnetiche che sono verosimilmente l’unica forma di
comunicazione fra i due fenomeni (DM e DB) e che l’unica cosa, pertanto, che può
accumunare le due condizioni è il suicidio, sembra coerente pensare che tal evento
possa realizzarsi per condizioni critiche dell’allungamento o accorciamento dei
periodi di decoerenza, quindi della capacità di coscienza.
Questa forza, che nel caso del neurone potrebbe essere definita “neuromeccanica”,
rappresenterebbe, di fatto, l’elemento condizionante la cabina di regia dei
microtubuli e condizionante il loro rapporto di criticità con le sinapsi, la corteccia e
la serotonina (15).
L’accostamento ai processi di coscienza, nelle loro dinamiche normali e patologiche,
non puó, tuttavia, fissarsi su elementi e piani isolati, osservabili da un osservatore
privilegiato e distaccato, bensì pensando, e agendo operativamente, per connessioni,
relazioni, reti. Il tutto, sempre nella convinzione che la scienza è narrazione di un
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mondo espressivo di stati emergenti - per questo mai riducibile alla semplice somma
dei suoi ingredienti elementari - e in cui le rotture di simmetria garantiscono
molteplicità, creatività, vitalità, nel segno dell’autorganizzazione naturale,
dell’evolversi dei sistemi, grazie alle rotture spontanee di simmetrie, verso stati
vieppiú complessi e imprevedibili, tra cui la persona come relazione emergente.
Bibliografia
1. Cocchi M, Tonello L (2010). Bio molecular considerations in Major Depression and
Ischemic Cardiovascular Disease. Central Nervous System Agents in Medicinal
Chemistry.10: 2, 97-107.
2. Cocchi M, Tonello L, Rasenick Mark M (2010) Human depression: a new approach in
quantitative psychiatry. Annals of General Psychiatry. 9:25.
3. Tonello L, Cocchi M. (2010). The Cell Membrane: Is it a Bridge from Psychiatry to
Quantum Consciousness? NeuroQuantology. 8: 1, 54-60.
4. McIntosh TJ, Simon SA (2006) Roles of bilayer material properties in function and
distribution of membrane proteins. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36:177–98.
5. Cocchi M, Gabrielli F, Tonello L, Pregnolato M (2010) The Interactome Hypothesis of
Depression. NeuroQuantology, 4: 603-613).
6. Sheetz MP, Sable JE and Döbereiner HG (2006) Continuous Membrane-Cytoskeleton
Adhesion Requires Continuous Accommodation to Lipid and Cytoskeleton Dynamics.
Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35:417–34.
7. Chifflet S and Hernandez JA (2011) The PlasmaMembrane Potential and the Organization of
the Actin Cytoskeleton of Epithelial Cells, International Journal of Cell Biology Volume
2012 Article ID 121424, 13 pages, doi:10.1155/2012/121424.
8. Sun M, Northup N, Marga F, Huber T, Byfiel dFJ, Levitan I and Forgacs G (2007) The effect
of cellular cholesterol on membrane cytoskeleton adhesion, J Cell Sci 120: 2223-31.
9. Yap B, Kamm RD (2005) Cytoskeletal remodeling and cellular activation during
deformation of neutrophils into narrow channels. J Appl Physiol 99: 2323–2330.
10. Hoover RL, Fujiwara K, Klausner RD, Bhalla DK, Tucker R, Karnovsky MJ (1981) Effects
of Free Fatty Acids on the Organization of Cytoskeletal Elements in Lymphocytes,
MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY 10: 939-948.
11. Apodaca G (2002) Modulation of membrane traffic by mechanical stimuli. AJP-Renal
Physiol 282: F179-F190.
12. Namikoshi M, Suzuki S, Meguro S, Kobayashi H, Mine Y and Kasuga I (2002) Inhibitors of
Microtubule Assembly Produced by the Marine Fungus Strain TUF 98F139 Collected in
Palau. Journal of Tokyo University of Fisheries 88: 1-6.
13. Janmey P. (1995) Cell Membranes and the Cytoskeleton, Chapter 17, Handbook of
Biological Physics, Volume 1, edited by R. Lipowsky and E. Sackmann, Elsevier Science
B.V.
14. Janmey PA, and McCulloch CA (2007) Cell Mechanics: Integrating Cell Responses to
Mechanical Stimuli, Annu. Rev. Biomed. Eng 9:1–34.
15. Cocchi M, Tonello L, Gabrielli F, Pregnolato M. & Pessa E. (2011). Quantum Human &
Animal Consciousness: A Concept Embracing Philosophy, Quantitative Molecular Biology
& Mathematics. Journal of Consciousness Exploration & Research, 2: 547-574).
Corresponding Author: Massimo Cocchi e-mail [email protected]
22 | S I N D R O M E M E T A B O L I C A
Sindrome metabolica e performance cognitiva nell’anziano
Marianna Rinaldi (1)
, Giuseppe Graffi (2)
, Salvatore Gallone (3)
, Emma Rabino
Massa.(1)
(1)
Laboratorio di Antropologia, Dipartimento di Biologia Animale e dell’Uomo, Università degli
Studi di Torino, Via Accademia Albertina 13, 10123 Torino. (2)
ASL TO3, Distretto di Susa, piazza San Francesco 4, 10059, Susa (TO). (3)
Laboratorio di Neurogenetica, Dipartimento di Neuroscienze, Via Cherasco 15, 10126 Torino.
La Sindrome Metabolica (MetS) è un insieme di alterazioni ognuna delle quali
rappresenta di per sé un fattore di rischio cardiovascolare (obesità di tipo centrale,
iperglicemia, dislipidemia ed ipertensione). In diversi studi recenti la MetS è stata
correlata ad un accelerato declino cognitivo in età senile. Il nostro studio si è
proposto di analizzare la relazione tra MetS e performance cognitiva in un gruppo di
anziani appartenenti ad alcune comunità rurali della Val Cenischia (Piemonte).
È stato reclutato un campione di 199 persone (111 donne e 88 uomini) di età
superiore ai 60 anni in cui è stata valutata la presenza di MetS secondo i criteri
diagnostici previsti dal NCEP ATP III aggiornato (2004). Inoltre ad ogni paziente è
stato somministrato il Mini Mental State Examination (MMSE) per valutarne lo stato
cognitivo.
La prevalenza della MetS nel campione esaminato è pari al 50,3% (donne: 49,5%;
uomini: 51,3%). I dati relativi al MMSE rivelano un declino cognitivo nel 10,1% del
campione (MMSE 23,9). Il 6,6% del campione presenta risultati borderline (MMSE
tra 24,0 e 24,9), mentre l’83,3% ottiene un punteggio normale (MMSE 25,0).
I risultati confermano il legame esistente tra sindrome metabolica e peggiori
performance cognitive nell’anziano in quanto dall’elaborazione dei dati emerge che
esiste una associazione significativa tra punteggi borderline al test MMSE e presenza
di sindrome metabolica (OR=3,78; IC95%: 1,0-14,3).
La ricerca ha ricevuto l’approvazione del Comitato di Bioetica d’Ateneo
dell’Università di Torino.
Corresponding Author: Marianna Rinaldi e-mail [email protected]
S I N D R O M E M E T A B O L I C A | 23
Sindrome metabolica
Massimo Gualerzi
Fondazione Don Gnocchi - Parma
Il termine “sindrome metabolica” descrive un insieme di fattori di rischio metabolici
che aumentano la possibilità di sviluppare malattie cardiache, ictus e diabete. La
causa della sindrome metabolica risiede principalmente nelle cattive abitudini di
vitacee a loro volta conducono all’affermarsi di quelle condizioni che
determineranno la sindrome stessa come l’ipertensione la dislipidemia l’obesita e il
diabete. Tra i fattori acquisiti predisponesti quello di maggiore interesse è presenza
di una eccessiva quantità di grasso corporeo, specie a livello dell’addome,
determinata dalle cattive abitudini alimentari e dallo scarso esercizio fisico.
La sindrome metabolica viene diagnosticata quando sono presenti tre o più dei
seguenti fattori di rischio:
elevata quantità di tessuto adiposo addominale (valutata mediante la
misurazione della circonferenza della vita): sono considerati patologici valori
superiori a 94 cm nell’ uomo e superiori a 80 cm nella donna)
basso colesterolo HDL (il cosiddetto “colesterolo buono”): meno di 40 mg/dl
nell’uomo e meno di 50 mg/dL nella donna)
elevati livelli di trigliceridi: valori superiori a 150 mg/dL
elevati valori di pressione arteriosa: superiore a 135/85 mmHg o qualora sia
già in corso una terapia antipertensiva)
elevati livelli di glicemia: glicemia a digiuno superiore a 100 mg/dL.
La presenza di tre o più di questi fattori di rischio è un segno che l’organismo è
resistente all’azione dell’ insulina, un importante ormone prodotto dal pancreas.
Quando è presente una condizione di resistenza all’insulina è necessaria una quantità
di insulina maggiore rispetto alla norma per mantenere normali livelli di glicemia. Il
riscontro di valori elevati di insulina nel sangue a fronte di valori normali di glicemia
rappresenta un indice indiretto di tale condizione.
Chi corre il rischio di sviluppare la sindrome metabolica?
La sindrome metabolica è molto frequente nella popolazione, e il rischio di
sviluppare la sindrome cresce con l’aumentare dell’età.
Una persona può considerarsi a rischio per lo sviluppo della sindrome metabolica se
non svolge attività fisica e se:
-è aumentato di peso, specie a livello della circonferenza della vita (questa semplice
misurazione è un indice di eccessiva espansione del tessuto adiposo viscerale, quello,
cioè, che si trova all’interno dell’addome e circonda i visceri)
24 | S I N D R O M E M E T A B O L I C A
-ha una storia di diabete
-ha elevati livelli di trigliceridi nel sangue
-ha elevati valori di pressione arteriosa
La maggior parte delle persone che ha la sindrome metabolica si sente bene e
frequentemente non presenta sintomi; tuttavia queste persone hanno un rischio
maggiore di sviluppare in futuro malattie gravi come diabete e patologie
cardiovascolari, soprattutto in presenza di familiarità positiva e sono chiamate quindi
a modificare fortemente le proprie abitudini alimentari e iniziare un trattamento.
Come si cura la sindrome metabolica?
Il modo migliore per curare la sindrome metabolica è aumentare l’attività fisica e
ridurre il peso corporeo; è oggi inoltre possibile agire associando alla dieta
nutraceutici, prodotti che, sfruttando l’effetto, noto, di alcune componenti naturali,
agiscono in modo deciso e sostanziale in associazione alla modifica dello stile di vita
nel ridurre il rischio e nel riequilibrare le alterazioni biochimiche presenti. Stiamo
parlando principalmente degli Omega 3 e del riso rosso fermentato Monascus
purpureus come elementi in grado di sfiammare, ridurre i trigliceridi il colesterolo e
quindi di ridurre notevolmente il rischio cardiometabolico.
Conclusioni
Ricordare che la perdita di peso e l’attività fisica sono le armi migliori per prevenire
e trattare la sindrome metabolica; è importante sapere se si è affetti o meno dalla
sindrome metabolica per poter mettere in atto cambiamenti nello stile e iniziare ad
assumere adiuvanti nutraceutici prima che compaiano severe complicazioni.
Corresponding Author: Massimo Gualerzi
Specialista in Cardiologia
U.O. Prevenzione e Riabilitazione Cardiovascolare
Fondazione Don Gnocchi - Parma
S I N D R O M E M E T A B O L I C A | 25
Metabolic syndrome and cardiovascular risk: contribution of
ultrasonography
Santovito D, Graziano G(*), Moschetta A, Minerva F, Sacco C, Pontrelli D,
Palmieri V.O., Palasciano G
Clinica Medica “A. Murri” – Dipartimento di Scienze Biomediche ed Oncologia Umana – Università
degli Studi di Bari
(*) Istituto Mario Negri Sud - Chieti
Background and aims: Metabolic syndrome (MetS) is a term used to explain the co-
occurrence of several conditions related to central obesity and insulin resistance that
also includes impaired glucose metabolism, dyslipidemia, and high blood pressure.
The presence of MetS increases the cardiovascular risk. The distribution of regional
fat as well as the presence and the severity of steatosis and the intima media
thickness are believed to have a specific role as cardiovascular risk factors.
Ultrasonography may play a unique role in this context since it allows to evaluate in
a single clinical session most of these factors and therefore to give specific
information on the prognosis of patients affected by MetS and diabetes.
The aim of this work is therefore to evaluate the contribution of ultrasonograpghy to
the study of MetS and the cardiovascular risk.
Patients and methods: we enclosed in the study 404 patients (F 203, mean age 56,9;
M 201, mean age 53,6) admitted in our department for the evaluation of MetS. The
diagnosis of MetS on the basis of the NCEP ATP III criteria (2001) was confirmed in
309 patients (F 165, mean age 57,3, M 144, mean age 53,8). All patients underwent a
complete clinical and biochemical standard evaluation for each component of MetS;
abdominal ultrasonography was performed and the presence and severity of steatosis
as well as the thickness of subcutaneous, preperitoneal and visceral fat were
recorded; the cardiac ultrasonography revealed ventricular mass and interventricular
septum thickness; intima media thickness was finally evaluated. Data are expressed
as M+SD. Comparison between means and frequency and multivariate logistic
analysis were ruled out for the statistical evaluation.
Results: Patients with and without MetS differed for ALT [53.71 (26.26)vs50.98
(29.33)], BMI [32.93 (5.75)vs30.36 (6.70)], waist circumference [110.62
(11.71)vs102.78 (13.14)], HDL chol [40.61 (9.69)vs52.35 (11.10)], GGT [53.98
(50.60)vs42.89 (43.44)], glycemia [119.88 (41.68)vs95.22 (21.15)], steatosis grade
[1.27 (0.69)vs0.92 (0.74)], US visceral fat (mm) [84.60 (85.07)vs64.71 (28.81)],
HbA1C [6.56 (1.53)vs5.90 (1.33)], HOMA test [7.55 (6.42)vs3.43 (2.99)], insulin
[26.87 (19.39)vs15.48 (14.14)], microalbuminuria [74.62 (277.64)vs24.94 (51.14)],
systolic pressure [136.53 (15.65)vs130.18 (15.99)], cardiovascular risk (PROCAM)
26 | S I N D R O M E M E T A B O L I C A
[16.47 (16.39)vs8.24 (7.66)], tryglicerides [185.62 (163.61)vs101.92 (39.37)].
Patients with (n=368) and without (n=36) steatosis differed for BMI [32.76
(5.98)vs27.86 (5.32)], waist circumference [109.88 (12.02)vs97.46 (11.73)], HDL
chol [42.64 (10.42)vs50.83 (15.56)], LDL chol [131.12 (35.10)vs110.06 (33.77)],
GGT [52.97 (50.77)vs34.53 (21.00)], glycemia [115.90 (39.93)vs95.53 (25.68)], US
preperitoneal fat [14.46 (13.24)vs12.01 (6.19)], US subcutaneous fat [17.17
(12.83)vs13.60 (4.73)], US visceral fat [82.85 (78.86)vs50.51 (26.24)], HOMA test
[6.93 (6.13)vs1.86 (1.42)], n criteria MetS [3.30 (1.11)vs2.14 (1.17)], tryglicerides
[171.51 (153.21)vs109.03 (67.05)].Patients with (n=107) or without (n=297)
microalbuminuria differed for ALT [54.58 (24.77)vs52.53 (27.77)], HDL chol [40.60
(10.00)vs44.34 (11.44)], Ejection fraction [56.73 (2.85)vs57.36 (3.03)], GGT [58.17
(40.42)vs48.96 (51.85)], glycemia [129.43 (44.16)vs108.64 (35.91)], US steatosis
grade [1.38 (0.72)vs1.11 (0.70)], US visceral fat [81.07 (25.63)vs79.57 (87.48)],
HOMA test [8.81 (7.25)vs5.80 (5.37)], n. criteria for MetS [3.50 (1.05)vs3.09
(1.19)], systolic pressure [138.50 (17.74)vs133.79 (15.08)], PROCAM risk [19.00
(16.87)vs12.95 (14.28)], tryglicerides [189.03 (198.88)vs157.62 (125.06)],
visceral/subcutaneous ratio [6.08 (3.30)vs5.05 (2.62)]. Multivariate logistic analysis
(O.R., 95% OR CI) showed for: MetS a correlation with systolic pressure (1.04,
1.01-1.06), PROCAM risk (1.06, 1.02-1.11), glycemia (1.04, 1.02-1.07),
tryglicerides (1.01, 1.01-1.02), HDL chol (0.92, 0.88-0.95); steatosis a correlation
with HDL chol (0.96, 0.92-1.00), LDL chol (1.03, 1.01-1.05), US visceral fat (1.03,
1.01-1.06), insulin levels (1.14, 1.04-1.24); microalbuminuria a correlation with
RCV PROCAM (1.02, 1.00-1.03) and the diagnosis of MetS (1); cardiovascular
risk a correlation with HDL chol (0.91, 0.88-0.94), LDL chol (1.02, 1.01-1.03), age
(1.15, 1.10-1.19), smoking (1.06, 1.04-1.09), subcutaneous fat (0.91, 0.86-0.96),
diabetes (4.80, 2.52-9.14).
Conclusions: a complete evaluation of MetS and of the related cardiovascular risk
seems to need the execution of ultrasonography not only for the detection of well
known conditions associated to the MetS (e.g. biliary litiasis, steatosis, PCOS) but
also in order to gain important information for the prognosis of this syndrome. Our
data show that US regional fat distribution study has a predictive value for steatosis,
microalbuminuria and cardiovascular risk higher than the waist circumference in
patients with MetS.
F I S I O L O G I A C A R D I A C A P a g . | 29
A protocol which combines current – and voltage-clamp provides a
novel useful three-dimensional representation of the cardiac action
potential
Massimiliano Zaniboni*#, Francesca Cacciani
*
* Department of Biosciences, University of Parma, Italy
# Center of Excellence for Toxicological Research, University of Parma, Italy
The cardiac cellular action potential (AP) describes the electrical activity of heart
cells by means of a function (membrane potential Vm) of a single variable (time).
Though invaluable for the study of cardiac electrophysiology, this type of
representation is intrinsically limited by the fact that substantially different
membranes can display very similar or even identical APs (1,2), endowed with quite
different dynamical properties. A compact representation of cardiac AP properties in
terms of current source, would be beneficial for cardiac electrophysiological
research.
Based on previous patch clamp (3) and modelling (1,4-6) studies, we present here a
protocol which combines current- and voltage-clamp in order to measure
instantaneous current-voltage relationships during AP repolarization, and generates
three-dimensional time-voltage-current surfaces, which compactly describe several
key dynamic features of the corresponding membrane.
A preliminary and incomplete version of the
procedure has been applied on real
enzymatically isolated guinea pig cardiac
ventricular myocytes (Figure 1). During the
repolarization of an electrically elicited
(current clamp) AP, and at different time
delays after AP overshoot (see arrows in
Figure 1), the membrane was voltage
clamped for 50 ms at the Vm occupied by AP
trajectory at that time (Vmt), and, in
subsequent runs, at Vmt -10 mV, and at Vmt
+10 mV. The ion current (Iion) flowing
during each step was recorded (bottom panel
of Figure 1) and allowed to draw
instantaneous current-voltage relations at
each repolarization time. The “in silico”
version of the protocol allows higher time and voltage (and therefore current) –
resolution, and is applied here on a human ventricular AP model (7). Voltage clamp
30 | F I S I O L O G I A C A R D I A C A
steps were applied every 1 ms during AP repolarization (only 5 representative
examples are reported in Figure 2A), and Vm clamped, at each time, every 1 mV
starting from - 120 mV up to + 40 mV. From the Iion density generated by the models
equation system during each step (Figure
2B), the Iion value (measured 1 ms after
the onset of the step) was taken to
construct an instantaneous Iion-Vm curve
at any given time of AP repolarization
(Figure 2C). Furthermore, the capacitive
current (IC) density (-dV/dt), flowing at
each time during AP repolarization, was
added to Iion for each Iion-Vm curve,
leading to a collection of Im-Vm curves,
where Im is membrane current (Im = IC +
Iion) density. The collection of Im-Vm
plots (see representative examples in
panel D) generates a 3D surface (panel
E) where x is time, y is Vm and z is Im.
The AP profile lies on the region where
such surface intersects the Im = 0 plane.
The model was recompiled in its Matlab
version by means of COR facility at
“http://cor.physiol.ox.ac.uk”. The three-
dimensional AP representation allows to easily estimate membrane resistance (the
inverse of the slope of Im-Vm slices) during repolarization, which is a key factor
involved in its electrotonic modulation. The 3D surface also shows that, during late
repolarization phase, membrane conductance becomes negative (white arrow in
figure 2E), which leads to the novel finding that, at this time, repolarization is auto-
regenerative, i.e. the ventricular membrane acts as a repolarizing source of current.
An additional number of relevant features concerning repolarization dynamics are
compactly contained in the 3D AP representation that we present here, and which we
propose therefore as a new useful tool for both in vivo and in silico cardiac cellular
electrophysiological investigations.
Reference
1. M. Zaniboni, I. Riva, F. Cacciani, and M. Groppi, “How different two almost identical action
potentials can be: a model study on cardiac repolarization”, Math. Biosci. vol. 228(1), pp. 56-70.
2010.
2. E.M. Cherry and F.H. Fenton, “A tale of two dogs: analyzing two models of canine ventricular
electrophysiology.” Am J Physiol Heart Circ Physiol. vol. 292:H43-55, 2007.
3. M. Zaniboni, A.E. Pollard, L. Yang, and K.W. Spitzer, “Beat-to-beat repolarization variability in
ventricular myocytes and its suppression by electrical coupling”, Am J Physiol Heart Circ
Physiol. vol. 278, pp. H677-87, 2000.
F I S I O L O G I A C A R D I A C A P a g . | 31
4. M. Zaniboni, “3D current-voltage-time surfaces unveil critical repolarization differences
underlying similar cardiac action potentials: A model study”, Math Biosci. Vol. 233, pp.98-110.
2011.
5. M. Zaniboni, “Late phase of repolarization is autoregenerative and scales linearly with action
potential duration in mammals ventricular myocytes: a model study” IEEE Trans Biomed Eng
2012 Jan;59(1):226-33.
6. M. Zaniboni, “Heterogeneity of Intrinsic Repolarization Properties within the Human Heart: New
Insights from Simulated Three-Dimensional Current Surfaces” IEEE Trans Biomed Eng. 2012
Jun 15. in press.
7. L. Priebe and D.J. Beuckelmann, “Simulation study of cellular electric properties in heart
failure”. Circ Res. vol. 82, pp. 1206-23, 1998.
Corresponding Author: Dott. Massimiliano Zaniboni – Dipartimento di Bioscienze,
Università degli Studi di Parma, Tel 0521 905623
e-mail: [email protected]
32 | F I S I O L O G I A C A R D I A C A
Spontaneous electrical activity of guinea pig sinoatrial cells under
modulation of two different pacemaker mechanisms
Massimiliano Zaniboni*#, Francesca Cacciani
*
* Department of Biosciences, University of Parma, Italy
# Center of Excellence for Toxicological Research, University of Parma, Italy
Spontaneous electrical activity of cardiac pacemaker cells is caused by two main
mechanisms (1): one related to voltage-gated membrane channels, mainly the
hyperpolarization-activated cationic current If (2), the other linked to the
intracellular calcium handling via the Na+/Ca
2+ exchanger, which, activated by the
release of calcium by sarcoplasmic reticulum, provides a cyclic source of inward
current (3). The relative contribution of these two mechanisms to cardiac
pacemaking is still object of debate, and their regulation is of great clinic and
pharmacological interest. The aim of our study was to compare the effect of 3µM
Ivabradine (specific If blocker (4)) and of the same concentration of Ryanodine
(blocker of sarcoplamic calcium release channels (5)) on action potential (AP)
parameters of single cells isolated from guinea-pig sinoatrial node. Analogous
studies have been performed previously on different species (6).
Sinoatrial pacemaker cells, enzimatically isolated from guinea-pig hearts (male
Dunkin Harley weighing 300-400 gr) (2) were transferred in the cell chamber of an
inverted microscope, and perfused in physiological Normal Tyrode (NT) solution at
36°C. Only cells displaying spontaneous and regular contractions were brought in
patch-clamp whole cell configuration, and underwent membrane potential
recordings.
For each of these cells, a sequence of spontaneous APs was recorded for 2-3 minutes,
until a steady-state AP waveform was reached; perfusion solution was then rapidly
switched, by means of an electrovalve, to Ivabradine solution (IVA), and
spontaneous APs recorded until a new steady-state was gained (usually 3 to 5
minutes), then again to NT until recovery of the starting intrinsic configuration. This
protocol was applied on 20 cells; on seven of these, the whole cell patch clamp
configuration lasted enough time to allow testing of Ryanodine solution (RYA) as
well.
Data analysis was performed by means of a dedicated software (Scaldyn), which we
developed in collaboration with the University of Utah (7). The software
automatically calculates, for each beat, the following parameters: maximum diastolic
potential (MDP, mV), AP peak (Vpeak, mV), AP amplitude (APA, mV) and duration
(APD, ms), take-off potential (TOP, mV), and the diastolic depolarization rate
(DDR, V/s). Also, cycle length (the inverse of the pacing frequency, CL, ms) and its
F I S I O L O G I A C A R D I A C A P a g . | 33
coefficient of variability (CV, %) are calculated. Fig. 1 shows representative
examples of the effect of IVA (top) and RYA (bottom) on APs (left column) and on
CL (right column). Though the time taken to reach the new steady state is quite
different in the examples shown, no stastical difference in this parameter was found
between IVA and RYA.
IVA significantly changed all parameters of AP (n = 20), increasing CL, CV and
APD, depolarizing MDP and TOP and decreasing Vpeak, APA and DDR. On the 7
cells treated with both IVA and RYA, blockers displayed, with respect to NT,
comparable effects on every AP parameter (as shown in the hystogram in Fig. 2). In
particular, both blockers increased CL (by 27 and 30% respectively), and APD (by
31 e 26%), decreased DDR (by 34 and 42%), depolarized TOP (by 7 and 10%). The
only difference recorded was that IVA increased CV of CL much more than RYA
(+59% and +16% respectively). These results, though incomplete, suggest a possible
interest in new pharmacological modulators of cardiac sinus rhythm, which could be
used in addition or as substitutes of the molecules (e.g. Ivabradine, β-blockers)
presently in use.
Fig.1 Fig.2
Fig. 1: Left column: representative examples of the effect of Ivabradine (top) and Ryanodine (bottom)
on steady state AP sequences of guinea-pig sinoatrial cells; controls in black, and blockers in red.
Right column: representative example of time-course of changes of CL secondary to blockers
application.
Fig. 2: Hystogram of the overall effects of blockers on action potential parameters. Data are
normalized to the mean value in NT.
34 | F I S I O L O G I A C A R D I A C A
References:
1) Eisner DA & Cerbai E (2009). Beating to time: calcium clocks, voltage clocks, and cardiac
pacemaker activity. Am J Physiol Heart Circ Physiol 296, H561-H562.
2) DiFrancesco D, Ferroni A, Mazzanti M, & Tromba C (1986). Properties of the hyperpolarizing-
activated current (If) in cells isolated from the rabbit sino-atrial node. J Physiol 377, 61–88.
3) Bogdanov KY, Vinogradova TM & Lakatta EG (2001). Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor
and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circ Res 88, 1254-
1258.
4) Bucchi A, Baruscotti M & DiFrancesco D (2002). Current-dependent block of rabbit sino-atrial
node If channels by Ivabradine. J Gen Physiol 120, 1-13.
5) Rousseau E, Smith JS & Meissner G (1987). Ryanodine modifies conductance and gating
behavior of single Ca2+ release channel. Am J Physiol 253, C364-C368.
6) Bucchi A, Baruscotti M, Robinson RB, & DiFrancesco D (2007). Modulation of rate by
autonomic agonists in SAN cells involves changes in diastolic depolarization and the pacemaker
current. J Mol Cell Cardiol 43, 39-48.
7) Lux RL & Ershler PR (2003). Cycle length sequence dependent repolarization dynamics. J
Electrocardiol 36, Suppl:205-208.
Corresponding Author: Dott.ssa Francesca Cacciani – Dip. Bioscienze, Università
degli Studi di Parma Tel 0521 906119 e-mail [email protected]
F I S I O L O G I A C A R D I A C A P a g . | 35
Arrhythmia susceptibility in senescent rat hearts
Stefano Rossi1, Silvana Baruffi
1, Domenico Corradi
2,3, Sergio Callegari
4, Ezio
Musso1, Andrea Sgoifo
5, Luca Carnevali
5 Michele Miragoli
3 and Emilio Macchi
1,3
1 Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi, Parma;
2 Dipartimento di Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali, Università degli Studi,
Parma; 3 Centro di Eccellenza di Ricerca Tossicologica, Università degli Studi, Parma;
4 Reparto di Cardiologia, Ospedale di Vaio, Fidenza;
5 Dipartimento di Neuroscienze, Università degli Studi, Parma.
Background.
Cardiovascular disease increases with age. Significant alterations of cardiac
electrophysiological properties occur during the normal aging process as a result of
structural remodeling of the extracellular matrix, modifications of cell-to-cell
connection between neighboring cardiac myocytes (gap junctions) and changes in
active membrane properties. Even if advanced age appears to be a risk factor for
increased susceptibility to ventricular arrhythmia, a detailed knowledge about
changes in cardiac electrophysiology relevant to arrhythmogenesis in the elderly is
relatively lacking.
Objective.
Thus the aim of the study was to determine specific age-related changes in
electrophysiological properties and myocardial structure of the ventricles which can
be related to a structural-functional arrhythmogenic substrate.
Methods.
Multiple epicardial electrograms were recorded on the ventricular surface of in vivo
control (10 months) and aged (24 months) rats during normal sinus rhythm and
ventricular pacing. Arrhythmia inducibility was tested by premature stimulation and
burst pacing. Fiber architecture, connexin43 (Cx43), connexin40 (Cx40), interstitial
fibrosis and tissue collagen content were determined by (immune)histology, while
proteins content was performed by Western blotting.
Results.
Spontaneous supraventricular and ventricular rhythm disturbances were frequently
observed in aged hearts1. Ectopic beats during premature stimulation and sustained
ventricular arrhythmias during burst pacing were frequently induced in aged hearts
but not in control hearts (Fig.1). Electrophysiological analysis in aged hearts
36 | F I S I O L O G I A C A R D I A C A
revealed that PQ duration and total ventricular activation time (QRS duration) were
significantly delayed as compared to control hearts while anisotropic conduction
velocity did not change significantly2. Ventricular activation patterns displayed
variable number, location and time of appearance of epicardial breakthrough points1.
Morphological analysis in aged hearts revealed that heart weight and myocyte
transverse diameter increased significantly, scattered microfoci of interstitial fibrosis
were mostly present in the ventricular subendocardium and gap junction Cx43 and
Cx40 expression decreased significantly in ventricular myocardium, as compared to
controls2.
Fig.1 Different cycles of arrhythmia events in aged heart characterized either by slow propagating
wavefronts circulating around a functionally refractory region or by multiple wavefronts (A).
Subsequent cycles of the arrhythmia were characterized by slow circus movement of reentrant
activation sequences around the same region of functional block or by focal activation spreading with
slow anisotropic conduction velocity (B). Subsequently some of the cycles displayed the same focal
origin as in previous arrhythmic episodes and interestingly the focal activation is localized in the same
point of the BTP during sinus rhythm (C). The arrhythmia terminated with a 5 Hz monomorphic
sequence characterized by wavefronts circulating counter-clockwise around an obstacle in the lower
right area of the electrode array (D). Arrhythmia terminates with spontaneous ventricular activation
characterized by low heart rate (E). During a II episode of VT few beats of focal activation spreading
with slow anisotropic conduction velocity were observed (F).
Conclusion.
Delayed QRS duration, abnormal activation patterns and unchanged ventricular
F I S I O L O G I A C A R D I A C A P a g . | 37
conduction velocity in aged hearts suggest the occurrence of impaired impulse
conduction through the Purkinje system leading to uncoordinated myocardial
excitation despite structural changes. Impaired interaction between Purkinje system
and ventricular myocardium might create a potential reentry substrate, contributing
to higher vulnerability to ventricular arrhythmias observed in aged hearts. This is
consistent with the occurrence of intermittent focal anisotropic activations, possibly
originating from Purkinje-ventricular junctions, among sequences of wide wavefront
circus movements around a functionally refractory region.
References
1 Rossi S, Baruffi S, Bertuzzi A, Mastorci F, Sgoifo A, Musso E, Corradi D, Maestri R, Brisinda D,
Fenici R, Macchi E. Susceptibility to ventricular arrhythmias in aged hearts. Conf Proc IEEE Eng
Med Biol Soc. 2007; 2007: 410-414.
2 Rossi S, Baruffi S, Bertuzzi A, Miragoli M, Corradi D, Maestri R, Alinovi R, Mutti A, Musso E,
Sgoifo A, Brisinda D, Fenici R, Macchi E. Ventricular activation is impaired in aged rat hearts. Am J
Physiol Heart Circ Physiol. 2008; 295: H2336-2347.
Corresponding Author: Stefano Rossi; Address: Dipartimento di Bioscienze, Parco
Area delle Scienze 11/A, 43124, Parma; Tel Number: 0521905621; e-mail:
38 | F I S I O L O G I A C A R D I A C A
Single low-intensity premature stimuli can induce ventricular
arrhythmias in the normal heart
Stefano Rossi1, Silvana Baruffi
1, Sergio Callegari
2, Luca Carnevali
3, Domenico
Corradi4,5
, Michele Miragoli5, Ezio Musso
1, Andrea Sgoifo
3, Mimosa Trombini
1,
Emilio Macchi1,5
1) Dipartimento di Bioscienze, Università degli Studi, Parma
2) Reparto di Cardiologia, Ospedale di Vaio, Fidenza
3) Dipartimento di Neuroscienze, Università degli Studi, Parma
4) Dipartimento di Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali, Università degli Studi,
Parma
5) Centro di Eccellenza di Ricerca Tossicologica, INAIL, ex-ISPESL, Università degli Studi, Parma
Background
It is very unusual for single low-intensity premature stimuli to induce ventricular
arrhythmias in the normal heart, even when delivered in succession, whereas strong
electrical stimuli, when properly timed, usually do [1, 2, 3]. Still, we observed that a
single low-intensity premature stimulus could occasionally induce ectopic beats in
normal rat hearts. Surprisingly, by repeating the premature stimulation at the same
ventricular location and with the same coupling interval, the ectopic beats were
consistently induced. Based on these observations, possible hypothesis for the
arrhythmogenesis is that the premature beat can encounter a zone of unidirectional
conduction block to initiate reentry [4]. However, enhanced dispersion of
refractoriness, a necessary condition for initiation of reentry, is unlikely to be present
in normal myocardium [5, 6, 7]. Accordingly, the mechanisms underlying the origin
of the ectopic beats induced by single low-intensity premature stimuli are not
definitely manifest.
Objective
The main objective of the present study was to characterize pacing sites and
critical premature intervals which can induce ectopic beats in the normal heart and to
identify their arrhytmogenic substrate. Therefore we performed high spatial
resolution potential mapping while pacing numerous epicardial sites in normal rats
with a view to identify temporal and spatial properties of possible reentrant
excitations. To evaluate whether spatial dispersion in recovery of excitability might
be important for the occurrence of unidirectional block, we also measured the
effective refractory period (ERP) at each pacing site. These measurements were then
related with the spread of excitation during the onset of the arrhythmia.
Methods
F I S I O L O G I A C A R D I A C A P a g . | 39
Unipolar electrograms (EGs) were recorded from the anterior ventricular surface
of 20 in vivo adult rats using a 8x8, 1 mm resolution, epicardial electrode array
during sinus rhythm (SR) and premature stimulation. At 18 evenly distributed array
electrodes, regular trains of low-intensity stimuli (two times diastolic threshold) were
followed by a premature stimulus (eight times diastolic threshold) at progressively
shorter coupling intervals, until ERP was reached.
Results
Gradual increase in stimulus prematurity determined a corresponding increase in
latency in impulse initiation as well as decrease in anisotropic conduction velocity.
Ectopic beats were induced when pacing was performed at well-defined sites of right
(RV) and left ventricle (LV) and the premature intervals were almost equal to ERP
values. Ectopic activation patterns were characterized by the appearance on the
paced ventricle of epicardial breakthrough points (BTPs) which gave rise to
wavefronts rapidly propagating in all directions. The location of BTPs was either
coincident with SR BTPs or new BTPs could appear. When the pacing sites were
located on the epicardial projection of the septum, BTPs appeared, in the proximity
of the pacing sites, either on the RV or LV. Regions of critical degree of conduction
and reentry were not observed on the epicardial surface, consistent with the measured
uniform ERP spatial distribution.
Conclusion
The appearance of BTPs during the ectopic activation patterns is the epicardial
manifestation of wavefronts originating from underlying Purkinje fiber-ventricular
muscle junctions (PVJs). Thus, our findings suggest that a critically premature beat
can encounter an appropriate substrate for unidirectional block and reentrant
excitation at underlying PVJs where intrinsically different action potential durations
are normally present at the two sides of the PVJ due to appreciably longer
repolarization time of Purkinje fibers [8, 9].
Exactly the same issue would face a local spontaneous excitation in normal
myocardium, such as a premature ventricular complex eventually caused by an early
afterdepolarization, originating at a critical time during the repolarization phase of a
sinus beat. Although in the normal myocardium ventricular arrhythmias rarely occur
spontaneously, their incidence might be favored by the presence of reentrant ectopic
beats especially when dispersion of refractoriness is increased, such as during
enhanced activity of the sympathetic nervous system [10].
References
1) Winfree AT. Electrical instability in cardiac muscle: phase singularities and rotors. J Theor Biol.
1989; 138: 353-405.
40 | F I S I O L O G I A C A R D I A C A
2) Gotoh M, Uchida T, Mandel WJ, Fishbein MC, Chen PS, Karagueuzian HS. Cellular graded
responses and ventricular vulnerability to reentry by a premature stimulus in isolated canine
ventricle. Circulation. 1997; 95: 2141–2154.
3) Janse MJ. Vulnerability to ventricular fibrillation. Chaos. 1998; 8: 149-156.
4) Kléber AG, Rudy Y. Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated
arrhythmias. Physiol Rev. 2004; 84: 431-88.
5) Allessie MA, Bonke FI, Schopman FJ. Circus movement in rabbit atrial muscle as a mechanism
of tachycardia. II. The role of nonuniform recovery of excitability in the occurrence of
unidirectional block, as studied with multiple microelectrodes. Circ Res. 1976; 39: 168-177.
6) Burton FL, Cobbe SM. Dispersion of ventricular repolarization and refractory period. Cardiovasc
Res. 2001; 50: 10-23.
7) Coronel R, Wilms-Schopman FJ, Opthof T, Janse MJ. Dispersion of repolarization and
arrhythmogenesis. Heart Rhythm. 2009; 6: 537-43.
8) Myerburg RJ, Stewart JW, Hoffman BF. Electrophysiological properties of the canine peripheral
A-V conducting system. Circ Res. 1970; 26: 361-378.
9) Mendez C, Mueller WJ, Merideth J, Moe GK. Interaction of transmembrane potentials in canine
Purkinje fibers and at Purkinje fiber–muscle functions. Circ Res 1969;24:361-372.
10) Schwartz PJ, Stone HL. The role of the autonomic nervous system in sudden coronary death. Ann
N Y Acad Sci. 1982; 382: 162-80.
Corresponding author: Emilio Macchi; address: Dipartimento di Bioscienze, Viale
Parco Area delle Scienze 11/A, Università degli Studi, Parma; telephone: 0521 906
116; e-mail: [email protected]
A N T R O P O L O G I A E D E V O L U Z I O N E M O L E C O L A R E | 43
Complementarietà di spettroscopia FT-IR ed analisi istologiche per
lo studio del degrado della pelle mummificata.
Mariachiara Stani1, Andrea Baraldi
1, Rosa Boano
2, Rosangela Cinquetti
3, Maria
Grazia Bridelli1
1.Dipartimento di Fisica e Scienze della Terra, Università di Parma.
2.Dipartimento di Biologia Animale ed Umana, Università di Torino.
3.Dipartimento di Bioscienze, Università di Parma.
La collezione di mummie egiziane del museo di Antropologia ed Etnografia
Giovanni Marro dell’Università degli Studi di Torino rappresenta un patrimonio di
informazioni preziosissime per poter comprendere quali fossero le antiche tecniche
di mummificazione. La presenza sia di mummie naturali (di epoca predinastica) che
di mummie sottoposte a procedimenti di imbalsamazione (tipici delle epoche
dinastiche) permette, utilizzando specifiche tecniche diagnostiche, di stabilire quale
sia lo stato di conservazione di questi reperti sia in riferimento al diverso
procedimento di mummificazione subito, sia in relazione alle diverse condizioni di
seppellimento a cui furono sottoposte. E’ inoltre possibile monitorarne costantemente
i processi di invecchiamento e di deterioramento da parte di fattori endogeni ed
esogeni al fine di stilare specifici protocolli di conservazione. Le tecniche utilizzate
in questo studio sono state la Spettroscopia Infrarossa a Trasformata di Fourier (FT-
IR) e una serie di analisi istologiche. Tutti i campioni antichi sono stati messi a
confronto con campioni di riferimento di pelle moderna analizzati con le medesime
tecniche.
La pelle è costituita da una serie di strati che è possibile distinguere sommariamente
in epidermide, derma ed ipoderma. L’epidermide a sua volta è costituita da differenti
strati di cellule che si differenziano fra loro per un progressivo accumulo,
dall’interno verso l’esterno, di cheratina. Il derma è costituito invece
prevalentemente da fasci di fibre collagene, intervallati da sottili fibre elastiche, il
tutto immerso insieme ad una serie di altri elementi come ghiandole e bulbi piliferi in
una matrice di glicosaminoglicani. Infine l’ipoderma è costituito prevalentemente da
tessuto adiposo.
Dallo spettro infrarosso della pelle è possibile ottenere informazioni che riguardano
tutte le classi di composti che costituiscono questo tessuto ma in particolare le
proteine. Nell’intervallo di frequenze compreso tra 1650 cm-1
e 1550 cm-1
infatti si
riscontrano gli assorbimenti della banda Amide I, dovuta allo stretching del legame
C=O, e della banda Amide II dovuta al bending del legame N-H ed allo stretching
del legame peptidico C-N (1). Attraverso un procedimento di curve fitting iterativo
eseguito sulla banda Amide I, si possono ottenere informazioni sulla struttura
secondaria delle proteine. Il risultato generale delle misure suggerisce una
diminuzione del quantitativo di struttura ad alfa elica a favore di un incremento della
44 | A N T R O P O L O G I A E D E V O L U Z I O N E M O L E C O L A R E
struttura beta (2, 3), con notevole variabilità da un campione all’altro, in dipendenza
dal trattamento di imbalsamazione subito. Questo dato è indicativo di una
modificazione conformazionale delle proteine presenti dovuta a fenomeni di degrado
occorsi nel tempo. Le informazioni ottenute dall’analisi degli spettri FTIR possono
essere correlate alle diverse classi di proteine della pelle quali cheratina, elastina e
collagene, mediante studi istologici dei campioni. L’analisi istologica ha permesso
l’osservazione morfologica dei tessuti mummificati, l’identificazione dei diversi
strati costituenti la pelle e il loro stato di conservazione. È stato infatti possibile
notare che, oltre alla totale assenza dell’epidermide, sono presenti sostanziali
differenze fra reperti sottoposti ai due differenti processi di mummificazione,
evidenziabili in particolare nel diverso aspetto morfologico e livello di conservazione
delle fibre collagene (4-5).
L’accostamento delle due tecniche di indagine, in conclusione, si è rivelato
estremamente utile perché è stato possibile confrontare i dati ottenuti separatamente
mediante le due metodologie e constatare che questi risultano complementari ed
integrativi gli uni degli altri.
Bibliografia:
1. Torii, H., Tasumi, M. (1996). Theoretical analyses of the Amide I infrared bands of globular
proteins, in Infrared Spectroscopy of Biomolecules. H. H. Mantsch and D. Chapman eds., J.
Wiley & sons, inc. NY. Pp. 1-18.
2. Byler, D. M., and Susi, H. (1986). Examination of the secondary structure of proteins by
deconvolved FTIR spectra. Biopolymers, 25(3): 469 – 487.
3. Bridelli, M. G., Dell’Anna, A., Stani, C., Baraldi, A., Boano, R., De Iasio, S. FT-IR spectroscopy
and microspectroscopy of ancient Egyptian embalmed heads from the Museum of Anthropology
and Ethnography of the University of Turin. 2nd Bolzano Mummy Congress – Mummies from
the ice (Bolzano, Italy, 20 – 22 October 2011). Proceedings pp. 51.
4. Byung Soo Chang, Chang Sub Uhm, Chang Hyun Park et al. (2006). Preserved skin structure of a
recently found fifteenth-century mummy in Daejeon, Korea. Journal of Anatomy 209: 671- 680.
5. Montes, G.S., Kriszta´n, R.M., Junqueira, L.C., (1985). Preservation of elastic system fibers and
of collagen molecular arrangement and stainability in an Egyptian mummy. Histochemistry
83:117–119.
A N T R O P O L O G I A E D E V O L U Z I O N E M O L E C O L A R E | 45
FIG. 1: a – Confronto spettri FT-IR delle pelle moderna e della pelle di mummia predinastica; b –
Fitting della banda Amide I della pelle moderna; c – Fitting della banda Amide I della pelle di
mummia predinastica; Tabella: Confronto tra le percentuali delle strutture secondarie.
FIG 2: a – Immagine al microscopio ottico della pelle di mummia predinastica; b – Immagine al
microscopio ottico della pelle di mummia imbalsamata.
46 | A N T R O P O L O G I A E D E V O L U Z I O N E M O L E C O L A R E
Stature estimation using mandibular morphometric parameters in
Italian population: a preliminary report
Chantal Milani, Rolando Milani, Gian Luigi Panattoni.
Department of Neurosciences, University of Turin.
INTRODUCTION
Stature estimation is one of the most important parameters in personal identification.
Physical and forensic anthropologists can extimate stature from human remains in
order to define a general profile of the victims [1-5]. It often occurs that fragmented
or incomplete human remains are found by investigators. In literature, anatomical
methods based on measurements of the whole skeleton or mathematical methods
based on measurements of single bones, have been developed. By these methods
regression formulae for calculating the stature were obtained. Since abnormal
development of the mandible is involved in growth disorders [6-8], we investigated
possible correlations between some mandibular morphometric parameters and stature
in normal subjects of Italian population in relation to personal identification in
anthropologic or forensic practice.
MATERIALS AND METHODS
Measures were acquired in 41 individuals of both sexes (31 males ranging from 20 to
56 years old, 10 females ranging from 20 to 61 years old) from Caucasian Italian
population (born in Italy and with Italian parents). Stature and distances between the
following cephalometric landmarks of both mandibular sides were measured: co-co
(bicondylar distance); go-go (bigonial distance); co-go (condylion-gonion distance);
go-gn (gonion-gnathion distance). The stature of the subjects was measured in
standing position to the vertex by using a non-stretch, retractable anthropometric
tape. The mandibular parameters were measured by a digital anthropometric head
caliper. Mandible dimension (MD) were considered as the sum of the co-go-gn
distances of both sides. The possible statistical relationships between MD and the
measured living stature (MLS) were investigated by Pearson correlation analysis (r
coefficient) in order to obtain the estimated living stature (ELS).
A N T R O P O L O G I A E D E V O L U Z I O N E M O L E C O L A R E | 47
RESULTS
Mean age and MLS of the specimens are reported in Table 1.
MEAN AGE
(in years)
MEAN MLS
(in cm)
MALES 30.5 176
FEMALES 29.8 161.6
Table 1. Mean age and MLS of the observed specimens.
In the whole sample, ELS is expressed by the regression formula:
ELS= 2.6965 x P + 89.879
with Standard Deviation = 4% and Standard Error = 5%.
The r coefficient between MD and MLS is 0.63.
DISCUSSION
As the estimated living stature obtained by mathematical method is population-
specific, in this preliminary report we examined in particular a sample of Caucasian
Italian population. We choose the sum of bilateral co-go-gn distances as a reference
dimension of the mandible because these values seem to be the most significant for
representing mandibular growth. In fact, the mandible grows with a progressive
posterior increase in length of the body and in height of the rami. In literature, some
researches [9-11] show a very low correlation between mandibular morphometry and
stature, while in other works [12] the correlation is moderate like the one showed by
our data; these differences could be due to the various factors that affect the
mandibular growth (e.g., orthodontic treatments).
References:
1) Fully G., Pineau H. Détermination de la stature au moyen du squelette. Ann. Med. Leg., 1960, 40:
145–154.
2) Raxter M.H., Auerbach B.M., Ruff C.B. Revision of the Fully technique for estimating statures.
Am. J. Phys. Anthropol., 2006,130: 374-84.
3) Krogman W.M., İşcan M.Y. Calculation of stature. In: Human skeleton in forensic medicine
(W.M. Krogman, M.Y. İşcan, Eds.), Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, U.S.A., 1986, 302–
351.
4) Trotter M., Gleser G. A re-evaluation of estimation of stature based on measurements of stature
taken during life and of long bones after death. Am. J. Phys. Anthropol., 1958, 16: 79-123.
5) Wilson R.J., Herrmann N.P., Jantz L.M. Evaluation of stature estimation from the database for
48 | A N T R O P O L O G I A E D E V O L U Z I O N E M O L E C O L A R E
forensic anthropology. J. Forensic Sci., 2010, 55: 684-689.
6) Takakura M., Kuroda T. Morphologic analysis of dentofacial structure in patients with
acromegaly. Int. J. Adult Orthodon. Orthognath. Surg., 1998, 13: 277-288.
7) Dostálová s., Sonka K., Amahel Z., Weiss v., Marek J. Cephalometric assessment of cranial
abnormalities in patients with acromegaly. J. Craniomaxillofac Surg., 2003, 31: 80-87.
8) Kjellberg H, Wikland K.A. A longitudinal study of craniofacial growth in idiopathic short stature
and growth hormone-deficient boys treated with growth hormone. Eur. J. Orthod., 2007, 29: 243-
250.
9) Agnihotri A.K., Kachhwaha S., Googoolye K., Allock A. Estimation of stature from cephalo-
facial dimensions by regression analysis in Indo-Mauritian population. J. Forensic Leg. Med.,
2011, 18: 167-172.
10) Pelin C., Zağyapan R., Yazici C., Kürkçüoğlu A. Body height estimation from head and face
dimensions: a different method. J. Forensic Sci. 2010, 55: 1326-1330.
11) Sahni D., Sanjeev, Sharma P., Harjeet, Kaur G., Aggarwal A. Estimation of stature from facial
measurements in northwest Indians. Leg. Med., 2010, 12: 23-27.
12) Kalia S., Shetty S.K., Patil K., Mahima V.G. Stature estimation using odontometry and skull
anthropometry. Indian J. Dent. Res., 2008, 19: 150:154.
Corresponding author: Gian Luigi Panattoni. Dipartimento di Neuroscienze,
Università di Torino, Corso M. D’Azeglio 52, 10126 – Torino. Tel: 011-6707726 /
333-3825517. E-mail: [email protected]
A N T R O P O L O G I A E D E V O L U Z I O N E M O L E C O L A R E | 49
Variabilità di marcatori uniparentali in popolazioni italiane a
diverso grado di isolamento
Alessio Boattini, Stefania Sarno, Donata Luiselli, Davide Pettener
Dipartimento di Scienze Biologiche, Geologiche e Ambientali, Laboratorio di Antropologia
Molecolare, Università di Bologna,
Lo studio di marcatori uniparentali del cromosoma Y – accoppiato ad una adeguata
strategia di campionamento basata su variabili biodemografiche (ad es. cognomi) –
consente di ricostruire strutture genetiche di popolazioni umane rivelatrici dei
processi storici che hanno condotto alla situazione attuale. Presentiamo alcuni
risultati preliminari di ricerche di antropologia molecolare in corso presso il nostro
laboratorio. Il caso della Partecipanza di S. Giovanni in Persiceto – un peculiare
isolato socio-culturale di origine medioevale legato all'eredità patrilineare della terra
– è di particolare interesse in quanto consente di effettuare inferenze sulla storia del
popolamento dell'area padana e di ricostruire tassi di mutazione per alcuni marcatori
all'interno di genealogie documentate. Uno studio che coinvolge popolazioni non
isolate dell'intero territorio italiano ha invece rivelato la presenza di discontinuità
genetiche (legate alla geografia) la cui origine risale probabilmente al tardo Neolitico
e alle successive Età dei Metalli.
50 | A N T R O P O L O G I A E D E V O L U Z I O N E M O L E C O L A R E
Ancient DNA studies: new perspectives on old samples
David Caramelli
Dipartimento di Biologia Evoluzionistica, Università di Firenze, Firenze, Italy
In spite of past controversies, the field of ancient DNA is now a reliable research
area due to recent methodological improvements. A series of recent large-scale
studies have revealed the true potential of ancient DNA samples to study the
processes of evolution and to test models and assumptions commonly used to
reconstruct patterns of evolution and to analyze population genetics and
palaeoecological changes. Recent advances in DNA technologies, such as next-
generation sequencing make it possible to recover DNA information from
archaeological and paleontological remains allowing us to go back in time and study
the genetic relationships between extinct organisms and their contemporary relatives.
With the next-generation sequencing methodologies, DNA sequences can be
retrieved even from samples (for example human remains) for which the technical
pitfalls of classical methodologies required stringent criteria to guaranty the
reliability of the results. In this paper, we review the methodologies applied to
ancient DNA analysis and the perspectives that next-generation sequencing
applications provide in this field.
A N T R O P O L O G I A E D E V O L U Z I O N E M O L E C O L A R E | 51
Mine, yours, ours? sharing data on human genetic variation
Nicola Milia1,3, Alessandra Congiu1,3, Paolo Anagnostou1,2, Francesco
Montinaro2, Marco Capocasa2, Emanuele Sanna3 and Giovanni Destro Bisol1,2
1 Università di Roma “La Sapienza”, Dipartimento di Biologia Ambientale, Roma Italy
2 Istituto Italiano di Antropologia, Roma, Italy
3 Università di Cagliari, Dipartimento di Biologia Sperimentale, Cagliari, Italy
The achievement of a robust, effective and responsible form of data sharing is currently
regarded as a priority for biological and bio-medical research. However, it has been
argued that its possible advantages in terms of better exploitation of data and optimized
use of resources may be counteracted by the time and economic costs required, by
underlying ethical concerns, and conflicts of interest with patenting discoveries. In this
contrasting scenario, empirical evaluations of data sharing may be regarded as an
indispensable first step in the identification of critical aspects and the development of
strategies aimed at increasing availability of research data for the scientific community
as a whole. Research concerning human genetic variation represents a potential
forerunner in the establishment of widespread sharing of primary datasets. However, no
specific analysis has been conducted to date in order to ascertain whether the sharing of
primary datasets is common-practice in this research field. To this aim, we analyzed a
total of 543 mitochondrial and Y chromosomal datasets reported in 508 papers indexed
in the Pubmed database from 2008 to 2011. A substantial portion of datasets (21.9%)
was found to have been withheld, while neither strong editorial policies nor high impact
factor proved to be effective in increasing the sharing rate beyond the current figure of
80.5%. Disaggregating datasets for research fields, we could observe a substantially
lower sharing in medical than evolutionary and forensic genetics, more evident for
whole mtDNA sequences (15.0% vs 99.6%). The low rate of positive responses to e-
mail requests sent to corresponding authors of withheld datasets (28.6%) suggests that
sharing should be regarded as a prerequisite for final paper acceptance, while making
authors deposit their results in open online databases which provide data quality control
seems to provide the best-practice standard. Finally, we estimated that 29.8% to 32.9%
of total resources are used to generate withheld datasets, implying that an important
portion of research funding does not produce shared knowledge. By making the
scientific community and the public aware of this important aspect, we may help
popularize a more effective culture of data sharing.
| 55
Synthesis and antimicrobial activity of new 1-R-3-(2-PIRiDYL)- 4-
nitroso- 5-carboxiethyl-1H-pyrazoles.
Stefania Aielloa, Carmelo Massimo Maida
b, Fabio Venturella
b, Diego
Planeta,cMarco Giammanco
d, M.Milici
b
a Dipartimento di Scienze e Tecnologie Molecolari e Biomolecolari, Università degli Studi di Palermo
bDipartimento di Scienze per la Promozione della Salute
G. D’ Alessandro, Università degli Studi di
Palermo cDipartimento dei Sistemi Agro-Abientali,Università degli Studi di Palermo
d Dipartimednto di Studi Giuridici, Economici, Biomedici e Psicosociopedagogici delle Scienze
Motorie e Sportive, Università degli Studi di Palermo
In recent years, epidemiological studies confirm the significant impact on human
health by infections caused by pathogenic fungi. In fact, although the Candida genus
is commensal and a constituent of the normal gut flora, it is responsible for
opportunistic infections and can become pathogenic secondary to predisposing
factors related to the host, like a comprimised immune system (AIDS, anti-cancer
therapy, transplants), excessive prophylaxis with antimicrobial agents, and use of
invasive catheters. Large-scale surveillance for fungal infections has demonstrated an
increasing incidence of drug-resistant fungal pathogens. As a matter of fact, a
significant number of fungi species (especially Candida glabrata and Candida krusei)
exhibited primary resistance to Fluconazole or were less susceptible to Amphotericin
B.
Furthermore, as a consequence of the toxicity of the currently used polyene
antifungal drugs, which leads to interrupt the therapy, and the emergence of Candida
species resistance to azole-based agents, there is an urgent need for developing
alternative drug therapies.
In our previous study we have disclosed the synthesis and antifungal activity of a
series of 4-nitrosopyrazoles that mainly displayed in vitro potent antifungal activity
at no cytotoxic concentrations and that some of these compounds were 4 times more
potent than Amphotericine B and Fluconazole respectively against Cryptococcus
neoformans and Candida Krusei [1-4]
As part of our Structure Activity Relationships studies, we were interested in
learning the influence of the steric and electronic effects of the substituent in position
5 of the 4-nitrosopyrazoles which had already showed powerful antimycotic activity.
Therefore, we synthetized title compounds and evaluated their antimycotic activity
(fig1).
56 | P O S T E R
N
NN
COOC2H5ON
R
R: a=H, b= CH3,
c=C2H5
Fig 1. Synthetized compounds
The 5-carboxiethylester group has made the antimycotic actity dramatically decay, confirming the
necessity, for a good antimicotic activity, of derivatives in which the position 5 is free or substituted
with little groups as a methyl shown the best antifungal activity.
Bibliography
[1] E. Aiello, S. Aiello, F. Mingoia, A. Bacchi, G. Pelizzi, C. Musiu, M. G. Setzu, A. Pani, P. La Colla
and M. E. Marongiu. Synthesis and Antimicrobial activity of New 3-(1-R -3-methyl-4-nitroso-1H-5-
pyrazolyl)-5-methylisoxazole derivatives, Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2000, 8, 2719-2728
[2] Stefania Aiello; Enrico Aiello, Marica Orioli, Marina Carini, 3-(1-R-3-methyl-4-nitroso-1H-5-
pyrazolyl)-5-methylisoxazoles: a new class of antifungal compounds. In vitro metabolism by rat
liver:LC and LC-MS studies. Convegno Nazionale, Sorrento 18-22 Settembre 2002.
[3] S. Aiello, E. Aiello and M. Milici: “Synthesis and Antifungal Activity of new 3(5)-methyl-5(3)-(2-
thiophenyl) and -(2-quinolyl)-1H-1-R-4-nitrosopyrazoles.Part V”. Polish-Austrian-German-
Hungarian-Italian Joint Meeting on Medicinal Chemistry, Krakow, October 15-18, 2003
[4] Stefania Aiello, Antonio Macchiarulo, Maria Milici and Enrico Aiello, Sintesi e studi QSAR di
nuovi derivati 3(5)-(2-X)-1R-1H-4-nitrosopirazoli: una classe di composti con potente attività
antifungina in vitro. Parte VI XVII Convegno Nazionale della Divisione di Chimica Farmaceutica
della SCI, Pisa 6-10 settembre 2004.
Corresponding author: Stefania Aiello, Dipartimento di Scienze e Tecnologie
Molecolari e Biomolecolari, Università degli Studi di Palermo, Via Archirafi 32,
90123 Palermo, Italy; tel:+39.091 23896802; email: [email protected]
| 57
Light regulated enzyme activities
Aba Losi1, Wolfgang Gärtner
2*
1, Physics department, University Parma, Italy;
2, Max-Planck-Institute for Chemical Energy
Conversion, Mülheim, Germany
In collaboration with Georg Nagel, Univ. Würzburg, Germany, Peter Hegemann, Humboldt-Univ.
Berlin, Germany
Biological photoreceptors fulfill a double duty in (i) receiving information by
absorption of light and (ii) transmitting information by generating and transducing a
biological signal (which eventually will enable the organism to adjust its lifestyle
according to the environmental conditions). In many cases, both functions are located
in distinct protein domains that are fused to each other through a “connector”
peptide. Genome-wide screens reveal that often one type of sensing domain is
connected to different types of signaling domains and vice versa, i.e., the same type
of signaling domain is fused to different types of sensing functions.(1) The fact that
photoreceptors are instantaneously activated or de-activated in a non-invasive
manner (light activation!), and the demonstration by nature that combinations of
various domains yield functional receptors, has triggered activities to employ
naturally occurring or synthetically formed hybrid photoreceptors in biotechnological
applications.(2,3)
In this presentation, two types of naturally occurring nucleotide cyclases will be
discussed: AMP-cyclases(4) and c-di-GMP cyclases/hydrolases.(5,6) Their function
in the natural environment is well documented, as cAMP is an important second
messenger in many (micro)organisms, and c-di-GMP is identified as a molecule that
can regulate pathogenicity, biofilm formation, or motility.
Literature cited:
(1) Losi, A. and Gärtner, W. (2008) Photochem. Photobiol.. Sci. 7, 1168-1178.
(2) Christie, J.M., et al. (2012) Molecular Plant 5, 533-544.
(3) Olson, E.J. and Tabor J.J. (2012) Curr. Op. Chem. Biol. 16, 300-306.
(4) Stierl, M., et al. (2011) J. Biol. Chem. 286, 1181-1188.
(5) Wu, Y.I., et al. (2009) Nature 461, 104-108.
(6) Cao, Z., Livoti, E., Losi, A., and Gärtner, W. (2010) Photochem. Photobiol 86, 606-611.
58 | P O S T E R
Towards nano-physiology in mammalian cells: a multi-parametric
analysis with scanning ion conductance microscopy
Michele Miragoli1,4
, Stefano Rossi2, Max J. Lab
3, Julia Gorelik
3
1. Centro di Eccellenza per la Ricerca Tossicologica, CERT, INAIL ex-ISPESL, Universita’ degli
studi di Parma
2. Dipartimento di Bioscienze, Universita’ degli studi di Parma
3. NHLI, Myocardial Function, Functional Microscopy Unit, Imperial College London
4. Humanitas Clinical and Research Center, Rozzano, Milano
Nanotechnologies has opened new avenues for the comprehension of physiological
processes at nano-scale levels. Indeed, atomic force microscopy, scanning probe
microscopy and scanning tunneling microscopy provide details of imaging surface
and physiological processes at the atomic range. Notwithstanding, that those
techniques provide insights into various cellular function, they necessary require
manipulation, contact or destruction of the samples. In the context of the complex
nature of cell disease, in addition to the use of multiple conventional methods that
address individual questions, it would be extremely useful to develop a novel
universal technique capable of correlating cell function with morphology,
macroscopic structural remodeling in intact tissue, and spatial-temporal aspects of
intracellular signalling or ion channel activity measured in single cells and
subcellular compartments. We have modified scanning ion conductance microscopy
invented by Hansma et al . in hopping probe ion conductance microscopy (HPICM)
to image and analyze surface topography of live cells without contact with the
samples. HPICM and a battery of associated innovative methods are unique among
current imaging techniques, not only in spatial resolution, but also in the rich
combination of imaging modalities with other functional and dynamic methods. Here
we describe HPICM technique as a converging technology to perform highly
resolved dynamic and integrative analysis of cell structure, nanophysiology and
mechanisms of cardio and vascular diseases. We have combined HPICM with i)
surface confocal microscopy to study nanoparticles-cell membrane interaction in
lung and cardiac cells[1], with ii) FRET for receptors localization [2] and with
localized intracellular electrode impalement for study myofibroblast membrane
potential in the presence of anti-arrhythmic drugs [3]. Using this technique, we show
that the physicochemical nature of nanoparticles play a pivotal role in modification
of cardiac membrane excitability and ion trafficking (Figure 1) by leading to
arrhythmia in clusters of neonatal rat ventricular myocytes. We also describe how
2-receptors are de-localized from T-tubules to crest in heart failure cells and how in
such pathological conditions it is possible to study the role of myofibroblasts as
target cell for cardiac arrhythmia. In conclusion, HPICM provides a highly
| 59
informative multimodal imaging platform for functional analysis of the mechanisms
of cell diseases, which should facilitate identification of novel therapeutic strategies.
Reference:
M.Miragoli, P.Novak, P. Ruenraroengsak, A.I. Shevchuk, Y.E. Korchev, M.J. Lab, T.Tedley and J.
Gorelik. Functional interaction between charged nanoparticles and cardiac tissue: a new paradigm for
cardiac arrhythmia? Nanomedicine UK, in press.
M.Miragoli, A.Moshkov, P.Novak, A.Shevchuk, V.O. Nikolaev I.El-Hamamsy, C.M.F. Potter, A.R.
Lyon, S.E. Harding. J.A. Mitchell, A.H Chester, M.J. Lab, Y.E. Korchev, J. Gorelik. Scanning Ion
Conductance Microscopy: A Convergent High-resolution Technology for Multiparametric Analysis of
Living Cardiovascular Cells. Journal of Royal Society of Interface. J R Soc Interface. 2011 Jul
6;8(60):913-25. Epub 2011 Feb 16.
Miragoli M, Kadir SH, Sheppard MN, Salvarani N, Virta M, Wells S, Lab MJ, Nikolaev VO,
Moshkov A, Hague WM, Rohr S, Williamson C, Gorelik J. A protective antiarrhythmic role of
ursodeoxycholic acid in an in vitro rat model of the cholestatic fetal heart. Hepatology. 2011
Oct;54(4):1282-92.
Figure1. Topographical height-coded images, obtained by HPICM, of neonatal rat ventricular
myocyte affected by 50 nm carboxyl-modified latex nanoparticles. A. 50 nm nanoparticles induced
life-compatible nanopores in the membrane. B. Zoom in the square area in A (yellow) identifies three
nanopores (a,b,c) with a 50nm profile.
Corresponding author: Michele Miragoli, CERT c/o Dipartimento di Bioscienze,
Address: Viale G.P Usberti 11/A 43124 Parma Tel: 0521905665 Email:
60 | P O S T E R
Biomolecular NMR, a versatile tool for the understanding of protein
science; retinoid-binding proteins as an example
Lorella Franzoni1, Fabio Baroni
1, Davide Cavazzini
2, Gian Luigi Rossi
2, Christian
Lücke3
1Department of Biomedical, Biotechnological and Translational Sciences and
2Department of
Biosciences, University of Parma, Italy; 3Max Planck Research Unit for Enzymology of Protein
Folding, Halle (Saale), Germany. 1Plesso Biotecnologico, via Volturno 39, 43125 Parma; 0521-033823; [email protected]
Protein science stands at the heart of modern life sciences because it unravels
fundamental biological mechanisms and forms the basis for rapid advances in
biomedicine and biotechnology. NMR spectroscopy is uniquely suited to study
various aspects of protein structure, dynamics, molecular interactions and function,
because information for individual residues can be obtained; moreover, kinetic data,
low-populated states and the possible formation of intermediates on the reaction
pathway can be determined.
The case of retinoid-binding proteins is discussed here, as an example. Vitamin A
has diverse biological functions and is
essential for human survival. It circulates
in blood bound to serum retinol binding
protein (RBP) and is transported into
cells by a membrane receptor termed
STRA6 (1). The cellular trafficking and
metabolism of vitamin A are regulated
primarily by specific high-affinity
carriers called CRBP-I and CRBP-II.
They represent an interesting case where
structure determination as well as the
study of fast dynamics (ps-ns time scale)
(2) failed to elucidate the mode of retinol
binding and thus to explain their diverse
tissue distribution, functional roles and
different ligand affinities.
The highly similar structure of the apo and holo forms (a b-barrel with two short
a-helices, see the cartoon) exhibits a closed conformation in both proteins, that
seemingly offer no access for the ligand. Given the biological relevance of retinoids,
the characterization of their protein interactions and targeted release is of special
interest. To tackle this challenging subject we have employed a suite of NMR
techniques: 15
N relaxation dispersion experiments to investigate the proteins
| 61
dynamics in the slower ms-ms timescale, line-shape analysis of 15
N-HSQC spectra
recorded during a retinol titration to get insights into the mechanism of ligand
binding and H/D exchange experiments to investigate conformational stability. The
results allowed to derive a model of retinol uptake, which is different for CRBP-I and
CRBP-II (3, 4); moreover, a distinct local flexibility was found to modulate their
binding properties (5).
The two proteins deliver retinol to microsomal membrane-bound enzymes, either
for esterification with fatty acids (LRAT) (6, 7) or for oxidation to retinaldehyde
(RDH) (8). Our current understanding of these processes remains incomplete, but
there is evidence that the membrane microenvironment plays a role in the
interactions of holo CRBPs with enzymes (8). To address this hypothesis, we have
performed a series of NMR experiments with retinol-bound CRBP-I and CRBP-II in
the presence of model membranes composed of either anionic or zwitterionic
phospholipids, at varying protein:lipid molar ratios and ionic strength.
Both homologues interact with liposomes of anionic phospholipids, but in a
significantly different way (9). A conformational rearrangement of the portal region,
coupled to a change in protein dynamics, are required for retinol exchange; these
processes seem to be triggered by a membrane-collision.
All the differences between CRBP-I and CRBP-II, when dissolved either in buffer
or in the presence of biomembrane mimetic systems, may account for their distinct
functional roles in the modulation of intracellular retinoid metabolism. Further
experiments are in progress to better describe the ongoing processes in a biological
context.
References
(1) Kawaguchi R., Yu J., Honda J., Hu J., Whitelegge J., Ping P., Wiita P., Bok D., Sun H. (2007)
Science, 315, 820-825.
(2) Franzoni L., Lücke C., Pérez C., Cavazzini D., Rademacher M., Ludwig C., Spisni A., Rossi
G.L., Rüterjans H. (2002) J. Biol. Chem., 277, 21983-21997.
(3) Mittag T., Franzoni L., Cavazzini D., Schaffhausen B., Rossi G.L., Günther U.L. (2006) J. Am.
Chem. Soc., 128, 9844-9848.
(4) Franzoni L., Reed M., Cavazzini D., Rossi G.L., Günther U.L., in preparation.
(5) Franzoni L., Cavazzini D., Rossi G.L., Lücke C. (2010) J. Lipid Res., 51, 1332-1343.
(6) Amengual J., Golczak M., Palczewski K., von Lintig J. (2012) J. Biol. Chem., 287, 24216-
24227.
(7) Jiang W., Napoli J.L. (2012) Biochim. Biophys. Acta, 1820, 859-869.
(8) Napoli J.L. (2012) Biochim. Biophys. Acta, 1821, 152-167.
(9) Franzoni L., Baroni F., Cavazzini D., Rossi G.L., Lücke C., in preparation.
62 | P O S T E R
Application of the multiuse encapsulator agent F-500 for
environmental remediation
Luigi Pane, Elisabetta Giacco, Gian Luigi Mariottini
Department of Earth, Environment and Life Sciences (DISTAV), University of Genova,
In the framework of the “Risk Assessment” procedure for the ecotoxicological
evaluation of compounds used in the aquatic environment, tests with target species
have been carried out. This paper reports the results concerning the evaluation on
cladocerans Daphnia magna of the acute toxicity of F-500 micelle encapsulator
(Hazard Control Inc., USA), a mixture of ionic and non-ionic surfactants based on
fatty acid esters with aliphatic polyalcohols in watery solution used as fire fighter
agent as well as dispersant against hydrocarbon pollution, with the purpose to verify
its compatibility for the aquatic environment and its potential usefulness for the
remediation of soils polluted with hydrocarbons. F-500 has been indicated to be able
to reduce hydrocarbon concentrations within the soil environment and therefore to be
active for soil remediation [1]. As a matter of fact, F-500 has high affinity for soil
particles and was demonstrated that 0.1% F.500 solutions are adsorbed almost
completely (>99%) in soils; furthermore, after elution of soil with water less than 1%
of F-500 was found into the eluate [2]. For ecotoxicological tests the artificial soil
was prepared according to standardized procedures [3]. Soil constituents were
previously dried and subsequently dampened with deionized water in order to obtain
40-60% of the maximum water retention. The artificial soil was treated with
commercial diesel and with F-500 at the concentration (1.5%) known to be non-toxic
for the organisms [4], packed up in 5 cm diameter glass columns and subsequently
eluted with deionized water to obtain the eluate, according to the EPA method [5].
The elutriate was obtained placing soil aliquots and deionized water (1:4) in glass
beakers and stirring them for 1 hour [5, 6]. For both eluate and elutriate testings the
following four samples were prepared and subsequently tested: 1) control (only soil),
2) soil + diesel, 3) soil + 1.5% F-500, 4) soil + diesel + 1.5% F-500. Two different
tests were carried out with the eluate using two different amounts of both compounds
(Test A: Diesel 10 ml, F-500 5 ml. Test B: Diesel 20 ml, F-500 10 ml), thus
maintaining unchanged the Diesel/F-500 rate (2:1). Four different tests were carried
out with the elutriate maintaining unchanged the diesel amount and varying the
diesel:F-500 rate, namely 2:1 (A), 1:1 (B), 1:2 (C), 1:4(D). Daphnia magna
specimens have been obtained from Daphtoxokit ephippia (Microtox, Milano, Italy;
batch DM281009) and maintained at 25 2°C in aerated and properly screened
mineral water supplemented with 0.45 m-filtered 1:100 CaCl2 solution and 0.45
m-filtered 1:100 NaHCO3 solution. Before the test 30 Daphnia magna females were
| 63
isolated and maintained starved for 24 hours; the offspring born during this period
were used in the test and exposed for 24 hours at 20±2°C, 16:8 light:dark period, to
the eluates and to the elutriates in multiwell plates with polyethilene inserts provided
with 74 mm porosity basal membrane (NetwellTM
Corning, NY, USA). Five
organisms per test in quadruplicate against control test were utilized. The tested F-
500 concentrations were chosen considering the results of preliminary assays. The
acute toxicity was evaluated estimating as end-point the percent immobilization of
treated newborn specimens after 10 sec. according to OECD [7].
The results of tests are shown in table 1 (a, b). The data confirm that F-500 is not
toxic to daphnids and show clearly that mixing F-500 to a soil pollutant (commercial
diesel) the acute toxicity induced by eluates and elutriates on cladocerans decreases
remarkably. This allows to confirm the ecocompatibility of F-500 and its suitability
for soil remediation.
F-500 is an easy-to-use compound useful for the remediation of soils and effective
mainly under aerobic conditions; it is able to improve the biological degradation of
contaminants by natural microbial populations as well as to stimulate the
biodegradation reducing the toxicity of the environmental pollutants or making them
innocuous. F F-500 allows to restore the usage of the treated areas accelerating the
self-regeneration of contaminated soils and restoring rapidly the ecological
equilibrium (http://www.fctservices.co.uk/F-500-land-application/).
a
Test Control F-500 1.5% Diesel Diesel + F-500
1.5%
A 6.0 8.9 0 31.8 24.4 12.7 20.0
B 0 5.0 0 46.7 17.5 16.7 12.5
b
A 0 0 70.0 14.1 70.0 14.1
B 0 0 30.0 14.1 40.0 28.2
C 2.0 4.5 0 70.0 7.0 31.8 23.5
D 2.0 4.5 0 70.0 7.0 16.0 14.0
Table 1. Percent immobilization of Daphnia magna exposed to different amounts of
contaminated soil eluate (a) and elutriate (b).
Furthermore, the overall ecocompatibility [4, 9] and the low toxicity against marine
crustaceans and fish [4, 10, 11] of F-500, evaluated through standardized parameters
64 | P O S T E R
[8], are known. The tests carried out in this study have shown an evident decrease of
the toxicity in soils treated with diesel + F-500 in comparison to those treated with
only diesel. This result is supposed to be due to the power of the compound to
encapsulate the hydrocarbon molecules maintaining them in watery solution and
consequently making them more accessible for the remediation process and
decreasing both their toxicity and bio-availability. Like this, the hydrocarbons could
be made less available to the organisms thus resulting less toxic. Therefore, the
results show a potential protective effect of F-500 against the damage exerted by
pollution on aquatic organisms and, as recently reported [1], the suitability of this
compound to counteract the hydrocarbon contamination of soil.
References
[1] Alberta Environment and Patch H2S Services Limited 2010. F-500: Canadian Testing. Case
Study Testing. Details of tests completed in Canada utilising F-500 in various contaminated land
scenarios. http://www.fctservices.co.uk/docs/Alberta-and-Patch-tests.pdf
[2] National Industrial Chemicals Notification and Assessment Scheme (NICNAS) 2004. Full public
report. Chemical in F-500. Australian Government Publishing Service, Canberra. File No:
EX/42(NA/976): 23 pp.
http://www.nicnas.gov.au/publications/car/new/ex/exfullr/ex0000fr/ex42fr.pdf
[3] OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) 1984. Guidelines for testing
of chemicals No. 207. Earthworm, acute toxicity test. OECD, Paris.
[4] Giacco E., Mariottini G.L., Pane L. 2008. Valutazione ecotossicologica del prodotto estinguente
F-500 su organismi d’acqua dolce appartenenti a diversi livelli trofici. XVIII Congresso della
Società Italiana di Ecologia, “Ecologia, emergenza, pianificazione”. Riassunti (a cura di G.
Benassi, G. Giordani, P. Viaroli), Parma 1-3 settembre 2008. P.10.5 144-145.
[5] EPA 2001. Methods for collection, storage and manipulation of sediments for chemical and
toxicological analyses: Technical Manual. EPA-823-B-01-002 Oct. 2001. Chapter 5, Pp. 14-15.
[6] APAT 2002. Guida tecnica su metodi di analisi per il suolo e i siti contaminati. Utilizzo di
indicatori ecotossicologici e biologici. P. Nappi, C. Jacomini (APAT)RTI CTN_SSC 2/2002.
[7] OECD (2004). Guideline for testing of chemicals. "Daphnia sp., acute immobilisation test and
reproduction test". Guideline 202.
[8] GESAMP 2002. The revised GESAMP hazard evaluation procedure, Report and Studies n. 64.
[9] Clemson Final Report: Tiwet-Project – 09440 1997. A study of the physical properties, biological
effects and possible usages of F-500 in environmental protection and restoration. The Institute of
Wildlife and Environmental Toxicology Clemson University Pendleton, SC 29670 George P.
Cobb, Section Leader Analytical Toxicology.
[10] EPA 2002. Oil Program Center. Technical Product Bulletin sw-30.
[11] ARPA Ferrara 2005. Rapporto di prova 002971/05/FE.
Corresponding author: Luigi Pane - Department of Earth, Environment and Life
Sciences (DISTAV), University of Genova, Viale Benedetto XV 5, 16132 Genova,
Italy. Tel. +390103538071; email: [email protected]
| 65
A photochromic bacterial photoreceptor as a novel tool for super-
resolution microscopy
Carmen Mandalari1,*
, Aba Losi1, Wolfgang Gärtner
2, Sarah Raffelberg
2, Francesca
Cella Zanacchi3, Paolo Bianchini
3, Alberto Diaspro
3, Stefania Abbruzzetti
1,4,
Cristiano Viappiani1,4
1Dipartimento di Fisica, Università di Parma
2Max-Planck-Institute for Bioinorganic Chemistry, Mülheim a.d. Ruhr, Germany,
3Istituto Italiano di Tecnologia, Genova,
4NEST, Istituto Nanoscienze-CNR
We introduce a novel fluorescent reporter for super-resolution microscopy, based on
the bacterial photoreceptor YtvA [1]. YtvA (from Bacillus subtilis) comprises a
photosensitive flavin based LOV domain, efficiently photo-switchable between
fluorescent and non fluorescent states [2]. The remarkable thermal and
photochemical stability of YtvA and its excellently suited properties for imaging
make flavin-binding LOV domains a powerful new class of autofluorescent proteins,
which adds to the already available GFPs toolbox. We demonstrate FPALM studies
of live Escherichia coli cells, expressing YtvA molecules (Figura 1).
Figura 1: A comparison between the conventional wide-field fluorescence image (Fig. 1a,b) and the
FPALM image (Fig. 1c) shows the remarkable resolution improvement and clearly demonstrates the
suitability of YtvA for super-resolution applications in cells.
66 | P O S T E R
References:
1. A. Losi, A. and W. Gärtner, Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy
applications: flavins in LOV and BLUF photoreceptors. Photochem. Photobiol., 2011, 87, 491 510.
2. The LOV2 domain of phototropin: a reversible photochromic switch. J.T.M. Kennis, I.H.M. van
Stokkum, S. Crosson, M. Gauden, K. Moffat, and R. van Grondelle, J. Am. Chem. Soc., 2004, 126,
4512 4513.
*Corresponding author: University of Parma (www.unipr.it), Department of Physics
and Earth Sciences, viale G.P. Usberti 7/A, 43100-Parma (I) Tel: +39-0521905256
e-mail: [email protected]
| 67
Study of the interaction of myelin basic protein with membranes by
means of molecular dynamics simulations
Eugenia Polverini1*
Mauro De Donatis1 and George Harauz
2
1. Department of Physics and Earth Science - University of Parma, Parma, Italy.
2. Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1,
Canada.
Myelin basic protein (MBP) is a highly basic multifunctional protein of the central
nervous system, whose principal role is to maintain the compactness and integrity of
the myelin sheath, acting as a “biological glue”. Because of its involvement in human
demyelinating diseases, the investigation of the interaction of MBP with membrane
is particularly relevant. The three-dimensional structure of MBP is still unknown,
due to its intrinsic flexibility and dependence of conformation on environment and
on its multiple biological roles. However, three regions of the protein can potentially
be amphipathic alpha-helices [1] and, therefore, are good candidates as interaction
sites with membranes. In this study, we investigate the first, N-terminal region,
ranging from residue R29 to G48 (murine sequence numbering), which also contains
a double Phe-Phe site that can strongly contribute to anchor this segment to the
membrane. Molecular dynamics (MD) simulations were performed on this peptide in
the presence of both neutral (DMPC) and mixed neutral-negatively charged (DMPC-
DMPS) lipid bilayer, to explore the effects of the electrostatic driving force. The
results show a tilt and a deep penetration of the amphipathic helix into the DMPC
membrane, anchored by its hydrophobic surface. In the mixed DMPC-DMPS bilayer,
instead, the peptide remains more at the membrane surface, due to the stronger
electrostatic interaction of MBP charged residues with the charges of the lipidic
headgroups. In both cases, the helix conformation is very stable and strongly anchors
the peptide to the membrane.
Several post-translational modifications (PTMs) are known to be present all along
the whole protein, acting as a “molecular barcode” that modulates the interaction of
MBP with membrane or with signaling proteins. Among these, the more studied are
the arginine deimination and the serine/threonine phosphorylation, also present in
R29-G48 peptide. In particular, deimination seems to limits MBP’s ability to
maintain compact myelin and correlates strongly with disease severity. In this
context, the effect of R31 deimination on the conformation and membrane
interaction of R29-G48 fragment was investigated by MD, both in the neutral and in
the mixed bilayer system. While in neutral lipids the arginine modification does not
influence the depth and the tilt of the helix in respect of the unmodified peptide, in
the DMPC-DMPS mixed bilayer it causes the exposition to the solvent of the region
around the deimination itself and, at the same time, the tilt of the N-terminal side of
68 | P O S T E R
the helix, that consequently becomes less deeply inserted.
The exposition by deimination was already experimentally observed for the second
-helix region (V83-T92), that is the primary immunodominant
epitope, and this effect was supposed to trigger the initiation of autoimmune response
in MS patients [2]. Our results are in agreement with this behavior and not only
support the hypothesis of R29-G48 as a membrane interaction site in MBP, but also
underline the importance of simulating the negative charges present at the membrane
surface to take into account the effect of the electrostatic driving force. This is
particularly relevant for studying the post-translational modifications that, like the
deimination, change the net charge of the molecule.
References
[1] G. Harauz, V. Ladizhansky, J.M. Boggs, Structural polymorphism and multifunctionality of
Myelin Basic Protein, Biochemistry, 2009, 48: 8094-8104.
[2] A.A. Musse, J.M. Boggs, G. Harauz, Deimination of membrane-bound myelin basic protein in
multiple sclerosis exposes an immunodominant epitope, PNAS, 2006, 103: 4422-4427.
* Corresponding author: Eugenia Polverini, Dipartimento di Fisica e Scienze della
Terra, Parco Area delle scienze 7/A, 43124 Parma, Italia. Phone: +39 0521 905254.
E-mail: [email protected]
| 69
Modulation of the photocycle of a flavin-based photoreceptor by
site-directed mutagenesis
Aba Losi1,*
, Sarah Raffelberg2, Carmen Mandalari
1, Wolfgang Gärtner
2, Cristiano
Viappiani1, Stefania Abbruzzetti
1
1: Dept. of Physics and Earth Sciences, Univ. of Parma (Italy), www.unipr.it
2: Max Planck Institute for Chemical Energy Conversion, Mülheim (Germany)
The non-covalently bound flavin chromophore in blue light-sensing LOV domain
proteins is stabilized through an extended hydrogen-bonding network. Preferential
interactions take place between the C(2)=O, N(3)H, C(4)=O, and N(5) groups and a
conserved bunch of glutamine and asparagine residues (1). Less conserved
aminoacids establish interactions with the apolar part of the isoalloxazine ring. This
extended network of weak interactions renders the chromophore cavity extremely
rigid and may affect both spectral properties and dynamics of the photocycle that
involve the reversible formation of a covalent FMN-cysteine adduct. In this work we
studied the influence of the network of weak interactions on the efficiency, kinetics,
and energetics of a LOV protein photocycle, specifically the protein YtvA from
Bacillus subtilis. By means of site-directed mutagenesis, aimed to change the
interactions at the polar and/or apolar sides of the flavin chromophore, and an array
of biophysical techniques, we show that it is possible to modulate the fluorescence
and photocycle quantum yields, the spectral properties in the UVA region, the
dynamics of excited states and the thermal relaxation to the dark-adapted state. All
mutated proteins investigated exhibit blue-light driven formation of the FMN-cys
adduct, but can be driven into a dark/adduct photoequilibrium by illumination with
UVA/violet light. The results reported here have implications for understanding the
mechanisms underlying thermal recovery and for advanced biophysical applications
such as super-resolution fluorescence microscopy (nanoscopy, Losi et al., 2012).
References
1. S. Raffelberg, M. Mansurova, W. Gärtner and A. Losi, Modulation of the photocycle of a LOV
domain photoreceptor by the hydrogen bonding network, J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 5346-5356.
2. A. Losi, W. Gärtner, S. Raffelberg, F. Cella Zanacchi, P.Bianchini, A. Diaspro, C. Mandalari, S.
Abbruzzetti and C. Viappiani, A photochromic bacterial photoreceptor with potential for super-
resolution microscopy, Photochem. Photobiol. Sci, 2012, DOI: 10.1039/c2pp25254f
*Corresponding author: University of Parma (www.unipr.it), Department of Physics
and Earth Sciences, viale G.P. Usberti 7/A, 43100-Parma (I)
Tel: +39-0521905293 e-mail: [email protected]
70 | P O S T E R
Nuove metodologie per antichi rimedi: il caso del fungo di malta
Antonella Rosaa, Antonio Rescigno
a, Alessandra Piras
b, Angela Atzeri
a, Paola
Scanob, Silvia Porcedda
b, Paolo Zucca
a, M. Assunta Dessì
a
aDip. Scienze Biomediche,
bDip. Scienze Chimiche e Geologiche, Università degli Studi di Cagliari,
Cittadella Universitaria, SS 554, Km 4.5, 09042 Monserrato, Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39
70 675 4124; e-mail: [email protected].
I grassi e gli oli hanno un ruolo importante nell'industria alimentare e farmaceutica.
Vi è un crescente interesse per le caratteristiche dei lipidi di oli vegetali non
convenzionali come fonte di componenti bioattivi e nutrienti funzionali1.
Il Cynomorium coccineum L. è una pianta non-fotosintetica, perenne e parassita,
della famiglia delle Cynomoriaceae, presente in diversi paesi del Bacino del
mediterraneo (Spagna,
Corsica, Sardegna,
Sicilia, Malta e Creta),
nella costa africana
occidentale e Penisola
Araba2-4
. È conosciuta
con nomi diversi, tra i
più comuni Fungo
melitensis,
Champignon o Éponge
de Malt, Fungo di
Malta e Tarthuth nei
paesi arabi2-4
. Le
proprietà terapeutiche
del Fungo di Malta
sono state tenute in
grande considerazione
nel corso dei secoli. È
stato ampiamente utilizzato in molte culture come rimedio medicinale per la cura di
ulcere, emorragie, dissenteria, impotenza, disordini mestruali e infezioni2-4
. Studi in
vitro e in modelli animali hanno evidenziato proprietà antiemorroidali, antiossidanti,
afrodisiache, toniche, antivomitive, ipotensive e di stimolazione della
spermatogenesi, degli estratti ottenuti da questa pianta2-5
. In letteratura si trovano
esempi sull'uso del C. coccineum come cibo durante i periodi di carestia.
0
20
40
60
80
100
120
ctrl 50 100 250 500 750 1000
% V
iita
lità
Olio fisso ( g/mL)
af a
adgl
adglo adglo
AB
Figura 1. Immagine digitale del Cynomorium coccineum (fungo di Malta)
raccolto in un’area costiera del sud-est della Sardegna, Italia (A). Vitalità
(% del controllo) misurata nelle cellule Caco-2 tumorali dopo 24 ore di
incubazione in presenza dell’olio fisso di C. coccineum (test MTT) (B). a =
P < 0.001, c = P < 0.05 versus ctrl; d = P < 0.001, f = P < 0.05 vs cellule
incubate con 50 g/mL; g = P < 0.001 vs 100 g/mL; l = P < 0.001, vs 250
g/mL; o = P < 0.001, vs 500 g/mL; (n = 16).
| 71
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di evidenziare eventuali proprietà funzionali
e potenziali effetti benefici sulla salute umana correlabili al consumo dell’olio
ottenuto dal fungo di
Malta. A tal fine,
attraverso l’azione
congiunta di diversi
gruppi di ricerca, sono
state studiate la
composizione chimica e
l'attività biologica
dell’olio fisso isolato dal
Fungo di Malta (Figura
1A) raccolto in
Sardegna6. L'olio è stato
ottenuto mediante
estrazione con anidride
carbonica in fase
supercritica (CO2-SFE)6.
La CO2-SFE è una
tecnica di estrazione
rispettosa dell'ambiente,
utilizzata industrialmente
per l’ottenimento di oli
essenziali/fissi da spezie/piante, in alternativa ai metodi classici. L’analisi quali-
quantitativa delle principali classi lipidiche è stata effettuata mediante risonanza
magnetica nucleare (13
C NMR)6. Le analisi in GC e HPLC hanno fornito dettagliate
informazioni sui singoli acidi grassi e sullo stato ossidativo dell'olio estratto6. Sono
stati quindi valutati gli effetti modulatori dell’olio sulla vitalità cellulare, sul profilo
dei componenti lipidici (acidi grassi e colesterolo) in cellule Caco-2 differenziate,
come modello di cellule epiteliali intestinali normali, e in cellule coloniche tumorali
(Caco-2 non differenziate)6.
L’estrazione mediante CO2-SFE (250 bar, 40 °C) ha portato all’ottenimento di un
olio giallo (resa 7%). Tra i principali componenti sono stati identificati triacilgliceroli
(42.4%), 1,3 diacilgliceroli (13.1%), 1,2 diacilgliceroli (4.3%), monoacilgliceroli
(3.8%) e acidi grassi liberi (36.3%). L’olio ha mostrato un composizione particolare,
con elevati livelli di 18:1 n-9 (38%, 303 mg/g) e degli acidi grassi essenziali 18:2 n-6
(20%, 159 mg/g) e 18:3 n-3 (11%, 93 mg/g). Diversi oli fissi hanno mostrato, in
colture cellulari e modelli animali, interessanti proprietà antitumorali7. L’olio del C.
coccineum ha indotto in cellule Caco-2 coloniche tumorali una significativa
riduzione della vitalità da 100 g/mL (Figura 1B), e del 90% a 500 g/mL, mentre
non ha indotto alcuna riduzione della vitalità in monostrati di cellule intestinali Caco-
0
25
50
75
100
125
Ctrl 50 100 150 250 350 500 600 750 1000
Vit
ali
tà (
%
con
tro
llo
)
Olio fisso ( g/mL)
0
10
20
30
40
50
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Ctrl 50 100
18
:2 e
18
:3 (
g/p
iast
ra)
16
:1 e
18
:1 (
% c
on
tro
llo
)
Olio fisso ( g/mL)
16:1
18:1
18:2 n-6
18:3 n-3 c
c
ad
a
ad
a
B
A
Figura 2. Vitalità (% del controllo, test Alamarblue) (A) e valori degli acidi
grassi 16:1, 18:1 (% controllo), 18:2 e 18:3 ( g/piastra) (B) misurati nelle
cellule Caco-2 differenziate di controllo e dopo 24 ore di incubazione in
presenza dell’olio fisso di C. coccineum (B). a = P < 0.001, c = P < 0.05
versus Ctrl; d = P < 0.001, vs 50 g/mL; (n = 16).
72 | P O S T E R
2 differenziate (Figura 2A). Le cellule epiteliali intestinali sono state quindi incubate
con l’olio per una valutazione dell’effetto modulatorio sui componenti lipidici e della
biodisponibilità. Dopo 24 ore di incubazione è stato osservato nelle cellule trattate un
significativo cambiamento nel profilo degli acidi grassi, con un marcato incremento
degli acidi grassi essenziali 18:2 n-6 e 18:3 n-3 (rispettivamente 4 e 14 volte
superiori rispetto alle cellule di controllo) e, in minor misura, di 18:1 n-9 (Figura
2B). L’olio ha inoltre indotto un selettivo aumento anche nei livelli di 20:3, 22:5 n-3
e, in misura minore di 20:5 n-3. Non è stato osservato un accumulo di colesterolo
rispetto alle cellule di controllo, mentre è stato misurato un lieve incremento del
livello di idroperossidi, correlato allo stato ossidativo dell’olio. Un simile effetto sul
profilo lipidico è stato osservato nelle cellule Caco-2 tumorali. La composizione
degli acidi grassi è molto importante in relazione alle caratteristiche nutrizionali e
funzionali di un olio. L’olio del Fungo di Malta è risultato una fonte naturale,
biodisponibile, di acidi grassi essenziali; ha mostrato la capacità di influenzare la
vitalità in cellule tumorali intestinali, senza alcuna tossicità nelle cellule normali. Si
qualifica quindi come una risorsa per applicazioni farmaceutiche e alimentari,
potenzialmente in grado di esercitare effetti positivi sul mantenimento della salute e
di agire nella prevenzione/trattamento di condizioni patologiche.
Bibliografia
1) Al Ashaal, H.A., Farghaly, A.A., Abd El Aziz, M.M., Ali, M.A., 2010. Phytochemical
investigation and medicinal evaluation of fixed oil of Balanites aegyptiaca fruits (Balantiaceae).
J. Ethnopharmacol. 127, 495–501.
2) IUCN, 2005. International Union for Conservation of Nature and Natural Resources, Centre for
Mediterranean Cooperation, Cynomorium coccineum L., in: IUCN Centre for Mediterranean
Cooperation Malaga (Spain) (Ed.), A Guide to Medicinal Plants in North Africa, pp. 99–100.
3) Dharmananda, S., 2011. Cynomorium - Parasitic plant widely used in traditional medicine.
<http://www.itmonline.org/arts/cynomorium.htm>.
4) Lebling, R.W., 2003. The treasure of tarthuth. Saudi Aramco World 54, 12–17.
5) Abdel-Magied, E.M., Abdel-Rahman, H.A., Harraz, F.M., 2001. The effect of aqueous extracts of
Cynomorium coccineum and Withania somnifera on testicular development in immature Wistar
rats. J. Ethnopharmacol. 75, 1–4.
6) Rosa, A., Rescigno, A., Piras, A., Atzeri, A, Scano, P., Porcedda, S., Zucca, P., Dessì, A. 2012.
Chemical composition and effect on intestinal Caco-2 cell viability and lipid profile of fixed oil
from Cynomorium coccineum L. Food Chem. Toxicol. 50, 3799–3807.
Corresponding author: Antonella Rosa - Dip. Scienze Biomediche, Università degli
Studi di Cagliari, Cittadella Universitaria, SS 554, Km 4.5, 09042 Monserrato,
Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39 70 675 4124; e-mail: [email protected]
P O S T E R | 75
Qualitative comparision of olive oil mediterranean
Diego Planeta a, Stefania Aiello
b, Marco Giammanco
c, Walter Randazzo
d, Valerio
Mineo a
a Dipartimento Sistemi Agro-Ambientali, Università degli Studi di Palermo
b Dipartimento di Scienze e Tecnologie Molecolari e Biomolecolari, Università degli Studi di Palermo
c Dipartimento di Studi Giuridici, Economici, Biomedici e Psicosociopedagogici delle Scienze
Motorie e Sportive, Università degli Studi di Palermo d Dipartimento DEMETRA, Università degli Studi di Palermo
The interest in the last few decades for olive cultivation is expanding is because they
have been achieved levels of mechanization that make olive growing economically
competitive with other tree crops, and because the recognition of the nutritional and
health qualities of olive oil resulted in an increase and a geographic expansion of
demand.
The revaluation of olive oil which fat essential for a balanced diet is due to the
particular lipid fatty acid composition which, in addition to being rich in
monounsaturated fatty acids, has a budget balanced essential polyunsaturated fatty
acids, with positive effects on adjustment of the level of cholesterol in blood, on the
mechanisms of cell permeability and the formation of free radicals.[1,2]
Among the minor constituents of virgin olive oils carotenes, tocopherols and
phenolic substances are hydrophilic compounds Healthy mostly related to the quality
of virgin olive oil due to its antioxidant properties.[3]
The overall quality of an oil is determined by genetic factors (cultivar), soil
(chemical-physical characteristics of the soil), climatic and cultural practices. From
the interaction of these factors depend on the chemical characteristics of an oil.[4]
The main purpose of this work was to compare quality parameters of chemical
samples monovarietal oils extracted from cultivar Sicilian and Spanish. The Sicilian
cultivars are divided into three categories: major, minor and neglected, while the oil
samples were produced by Spanish cultivar originating in Andalusia, southern Spain.
The analyzes were carried out in 2010 on 24 samples of olive oil olive oil products in
the year 2008/2009, of which 19 produced by native Sicilian cultivars and 5 from
Spanish cultivars.
The samples were analyzed according to the Regulation EC 1989/03 and the
following parameters were determined; free acidity, number of peroxides,
spectrophotometric indices at 232 nm and 270 nm, fatty acid composition, by
analysis by gas chromatography of methyl esters, phenolic substances, by UV
76 | P O S T E R
spectrophotometric analysis.
Revealed a high biological variability and agronomic feature of Sicilian varietal
platform, unlike other distribution areas such as the Spanish olive sector.
This genetic polymorphism is primarily responsible for the variability that affects all
aspects of olive production, including chemical and physical indices adopted for the
qualitative assessment. The survey conducted on monovarietal oils of cultivars
germplasm native Sicilian and Spanish, it was found that all the oils meet the
European standards of the law, but at the same time there was a different overall
quality that contrasts the Sicilian oils to those Iberians.
The oils are collectively discreetly equipped with polyphenols, except that in the case
of Manzanilla resulting deficient. The analysis of fatty acid composition showed an
imbalance in cultivars Spanish tied to values meager of oleic acid, linoleic acid at
high values and, consequently, to relations of oleic / linoleic quite low, less than 6.
Chemical-physical precious have been found in the oils of the cultivar Biancolilla
Nerba, Crastu, Iacona, Pizzutella, Vaddarica and to a greater extent Montonica.
Bibliography
[1] L. Franzetti, M. Scarpellini, M, A. Vecchio, D. Planeta. Microbiological and safety evaluation of
green table olives marketed in Italy. Annals Of Microbiology, Vol. 61, Issue: 4, Pages: 843-851
[2] P. Conte, V. Mineo, S. Bubici, C. De Pasquale, F. Aboud, A. Maccotta, D. Planeta, G. Alonzo.
Dynamics of pistachio oils by proton nuclear magnetic resonance relaxation dispersion Analytical and
bioanalytical chemistry, Vol. 400, Issue: 5, Pages: 1443-1450
[3] V. Mineo, D. Planeta, C. Finoli, S. Giuliano.
Fatty acids, Sterols and Antioxidant compounds of minor and neglected cultivar of Sicilian virgin
olive oils.Progress in nutrition, Vol. 9 Issue: 4 Pages: 259-263
[4]G. Aiello, P. Catania, M. Enea, G. La Scalia, F. Pipitone, M. Vallone.
Real time continuous oxygen concentration monitoring system during malaxation for the production
of Virgin Olive Oil. Grasas y Aceites, Vol. 63 Issue 4, Pages 475-483.
Corresponding author: Diego Planeta, Dipartimento Sistemi Agro-Ambientali,
Università degli Studi di Palermo, Viale Scienze 11, 90128 Palermo, Italy;
tel:+39.091 23897080; email: [email protected]
P O S T E R | 77
Relationship between maximal fat oxidation and oxygen uptake:
comparison between patients with type 2 diabetes and healthy
sedentary subjects
Angelo Cataldo, Giuseppe Russo, Dario Cerasola, Danila Di Majo, Stefania Aiello,
Marco Giammanco, Marcello Traina
Department of Sports Science (DISMOT), University of Palermo, Italy
Purpose
Carbohydrate and fatty acids are the dominant fuels oxidized for energy production
during exercise. Their contribution is influenced by intensity of exercise1, with a
progressive increase in the relative contribution of carbohydrate oxidation to energy
expenditure, whereas the absolute rate of fat oxidation increases from low to
moderate intensities of exercise and declines as exercise becomes more intense2. In
patients with type 2 diabetes (T2D) the altered metabolism and the lower capacity to
sustain efforts3 changed the choice and regulation of energy substrates for oxidation
4.
Purpose of our study was to assess the relationship between the highest value of fat
oxidation rate (FATmax) and the oxygen uptake (VO2) in sedentary T2D patients and
to compare with healthy sedentary subjects.
Methods
Fifteen sedentary T2D patients (nine males, six females), mean age 58 (range 39 –
65) and fifteen healthy sedentary subjects (eight males, seven females), mean age 53
(range 37 – 71), were studied. All T2D patients were being treated with diet and
antiglycemic agents. Significant cardiovascular disease was excluded in all subjects
by an instrumental examination. The exercise testing started in the laboratory at
08.00 hours after an overnight fast. All subjects performed a graded exercise test to
exhaustion on treadmill, using modified Bruce protocol. Oxygen uptake (VO2) and
carbon dioxide (VCO2) were recorded and maximum fat oxidation rate (FATmax) was
determined using indirect calorimetry, with the assumption that urinary nitrogen
excretion rate was negligible. Substrate oxidation rates were then plotted as a
function of exercise intensity, expressed as percentage of maximal oxygen uptake
(VO2max). Experimental data are presented as means standard error of the mean,
and for the statistical analysis of the data linear regression analysis was used.
Results
The physical and physiological characteristics of subjetcs are shown in table 1. The
average VO2max for T2D patients and healthy subjects was 22.29 1.06 ml/Kg/min
and 28.63 2.03 ml/Kg/min respectively (P < 0.01). In T2D patients, absolute fat
oxidation rate reached a maximum of 6.71 0.46 mg/Kg/min at VO2 of 15.41 0.68
ml/Kg/min (70 1.27% of VO2max) while in healthy subjects 7.19 0.77
mg/Kg/min at VO2 of 18.23 1.28 ml/Kg/min (64 2.61% of VO2max). When linear
78 | P O S T E R
regression analysis was performed, a positive linear correlation between FATmax and
VO2 (r = 0.85; p = 0.0001) in both groups has been found (Fig. 1). Also, positive
linear correlation between FATmax and VO2max in both T2D (r = 0.76; p = 0.001) and
healthy subjects (r = 0.73; p = 0.002) has been found (Fig. 2).
Conclusions
Our data, comparable with those reported in the literature5, indicate that in T2D
patients fat oxidation rate is not impaired. VO2max, index of exercise capacity, was
significantly lower in T2D patients so that, in T2D compared to healthy subjects, we
found a maximal fat rate oxidation at higher exercise intensity. Moreover, the
positive linear correlation between FATmax and both VO2 and VO2max suggests that
even in T2D patients the muscle oxidative capacity might increase in response to
aerobic training.
Table 1: Physical and physiological characteristics of subjetcs.
T2D patients Healthy subjects
n 15 15Age (y) 58 ± 1.78 53 ± 2.04
Height (cm) 168 ± 2.32 167 ± 2.58Weight (Kg) 81 ± 3.20 75 ± 4.69
BMI 28.7 ± 1.07 26.6 ± 1.3VO2max (ml/Kg/min) 22.29 ± 1.06 28.63 ± 2.03 **
FATmax (ml/Kg/min) 6.71 ± 0.46 7.19 ± 0.77
VO2 at FATmax (ml/Kg/min) 15.41 ± 0.68 18.23 ± 1.28 *
%VO2max at FATmax (%) 70 ± 1.27 64 ± 2.61 *
Data are means ± SE
* P < 0.05 for difference between healthy and T2D subjects
** P < 0.01 for differences between healthy and T2D subjects
.
Fig.1 Correlations between FATmax and VO2 in T2D (A) and Healthy (B) subjects
Fig.2 Correlations between FATmax and VO2max in T2D (A) and Healthy (B) subjects.
9.00
11.00
13.00
15.00
17.00
19.00
21.00
23.00
3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00
VO
2 (
ml/
Kg/
min
)
FATmax (mg/Kg/min)
T2D subjects
r = 0.85
A
9.00
14.00
19.00
24.00
29.00
3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00
VO
2 (
ml/
Kg/
min
)
FATmax (mg/Kg/min)
r = 0.85 p = 0.0001
Healthy subjects
B
9.00
14.00
19.00
24.00
29.00
34.00
3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00
VO
2m
ax (m
l/K
g/m
in)
FATmax (mg/Kg/min)
T2D subjects
A
r = 0.76 p = 0.001
9.00
19.00
29.00
39.00
49.00
3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00 VO
2m
ax (
ml/
Kg/
min
)
FATmax (mg/Kg/min)
Healthy subjects
r = 0.73 p = 0.002
B
P O S T E R | 79
References
1) Romijn JA, Coyle EF, Sidossis LS, Gastaldelli A, Horowitz JF, Endert E, and Wolfe RR.
Regulation of endogenous fat and carbohydrate metabolism in relation to exercise intensity and
duration. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 265: E380–E391, 1993.
2) Martin III, Klein W and S. Use of endogenous carbohydrate and fat as fuels during exercise. Proc.
Nutr. Soc. 57:49–54, 1998.
3) Regensteiner JG, Sippel J, McFarling ET, Wolfel EE, and Hiatt WR. Effects of non-insulin
dependent diabetes on oxygen consumption during treadmill exercise. Med. Sci. Sports Exerc.
27(6): 875–881, 1995.
4) Vranic M. Physiology and biochemistry of exercise in insulin-resistant states. Presented at the 60th
Scientific Sessions of the American Diabetes Association; San Antonio, Texas; June 11, 2000.
5) Borghouts LB, Wagenmakers AJM, Goyens PLL, Keizer HA. Substrate utilization in non-obese
Type II diabetic patients at rest and during exercise. Clinical Sc. 103: 559-566, 2002.
Corresponding Author:
Marco Giammanco, fax+390916236407, Email: [email protected]
80 | P O S T E R
The influence of hypocaloric diet, associated with moderate physical
activity and cbt (cognitive behavioral therapy), on self-esteem and
self-efficacy and their modulator role on emotional eating.
Giulia Giammanco, Danila Di Majo, Marco Giammanco, Maurizio La Guardia
Dipartimento DISMOT, Unità Operativa Didattico Scientifica di Fisiologia e Farmacologia
Università degli Studi di Palermo
There are many evidences that emotional factors have great influence on eating
habits; this phenomenon is defined “emotional eating” and increases the risk of
obesity (1). Few studies demonstrate that patients affected by binge eating disorder
felt negative emotions before binges; the main emotion reported was anxiety, then
sadness and tiredness. The emotional factors can interfere with a diet therapy and
with keeping results at the end of a diet. Emotional eating is related to the stress (2),
so when subjects feel anxiety and depression, is more probable that they use food as
modulator of their emotions, in this way the weight develops fast with all risks of
obesity.
The obesity is often attended by a specific syndrome called metabolic syndrome; the
main symptoms are insulin resistence, hyperinsulinemia, not-insulin-dependent
diabetes mellitus, dyslipidemia, central obesity, hyperuricemia, hypertension; this
clinic condition predisposes to cardiovascular diseases. So the aim of our study is to
observe how two psychological constructs as “self-esteem” and “self-efficacy”, that
are demonstrated to have a protective role against negative emotions as anxiety e
depression (5), can modulate the emotional eating. For this aim, we used CBT
(Cognitive Behavior Therapy). We began to select a sample of obese subjects, and
gave them few questionnaires to evaluate the degree of anxiety and depression
(STAI/BDI), the level of self-esteem (BASIC SE), and if there was a diagnosis of
Binge Eating Disorder (BED) by a Binge Eating Scale (BES). The first results show
a significant relation between anxiety and depression and low level of self-esteem,
and their relation with BED. The one subject of the sample with low self-esteem and
high depression and anxiety, but without BED, uses pharmacological therapy for
anxiety and depression. Is probable that modulator effect of food is displaced by
drugs.
P O S T E R | 81
sesso età BMI BES BDI STAI BASIC SE
F 30 37,2 1 6 27 >80°
F 47 53,7 39 40 77 <1°
F 50 40,1 6 33 67 <5°
M 30 52,8 31 13 59 15°
M 36 37,1 4 1 35 >90°
Bibliography 1) DallmanMF. “Stress-induced obesity and the emotional nervous system.”
Trends EndocrinolMetab. 2010 Mar; 21(3):159-65. Epub 2009 Nov 18.
1) MashebR.M., Grilo C.M.“Emotional overeating and its associations with eating disorder
psychopatology among overweight patients with Binge Eating Disorder”. International Journal of
Eating Disorders; 2006 39: 141-146.
2) Marci E. Gluck “Stress response and binge eating disorder” Appetite 46 (2006) 26–30
3) G. M. Reaven (1988). Role of insulin resistance in human disease. Diabetes, Banting lecture 37:
1595-1607
4) Baumesteir, R.F., Campbell, G.D., Krueger, J.D., Vohs, K.D.,“Does high self-esteem cause better
performance, interpersonal success, happiness, or healthier lifestyle?” Psychological Science in the
Public Interest, 2003 4, 1-44. 4
Corresponding Author: Giulia Giammanco, email: [email protected]
82 | P O S T E R
The control of abstinence in the treatment of alcohol dependence:
the use of acamprosate in relapse prevention.
Fabio Venturellaa, Asaro Anna
a, Guido Faillace
b, Gianpaolo Spinnato
c, Danila Di
Majoe; Maurizio La Guardia
e, Marco Giammanco
e, Stefania Aiello
d
a Dipartimento di Scienze per la Promozione della Salute G. D’ Alessandro, Università di Palermo
b Ser.T Alcamo;
c Sevizio di Psichiatria ASL Palermo 2.
d Dipartimento di Scienze e Tecnologie Molecolari e Biomolecolari, Università di Palermo
e. Dipartimento DISMOT, U.O. di Fisiologia e Farmacologia, Università di Palermo
"The alcoholism can also deal with drug treatments."
This is the message that emerges from the press conference of presentation of
Campral, trade name of acamprosate, a neuromodulator specifically indicated in the
maintenance of abstinence in alcohol-dependent patients.Alcoholism is a disease
characterized by: craving, loss of control, tolerance and physical dependence.For
many years the prevention of relapse in use of alcohol after detoxification was
supported almost exclusively by psychosocial procedures and techniques with
modest success. Treatment with acamprosate is a valid tool to complement
psychotherapy as it does not cause addiction, abuse or withdrawal of its suspension
and does not interfere with other medications that patients often alcoholics must
take.To evaluate the effectiveness, our study evaluated the effects of Acamprosate
compared to GHB in clinical-physiological and social health in a way indicators of a
possible therapeutic success in terms of abstinence from alcohol and social
reintegration. The hypothesis of the project is that pharmacotherapy anticraving with
acamprosate integrated with psycho-social support, can reduce relapse in alcohol
together with the reduction of the risk of abuse arising from the use of GHB. This
work purports to be an account of 11 months of observation of patients treated with
acamprosate.
Results: A total of 36 patients were observed, of which 5, 4 men and 1 woman at the
Ser.T Alcamo and 31, 21 men and 10 women at the Ser.T of Palermo. In the fight
against alcoholism, this therapy with acamprosate offers significant potential:
decreases, in fact, the incidence, severity and frequency of relapses (Fig. 1). As
regards the craving, during the period of treatment with acamprosate, there has been
a change, in the sense of reduction, of craving for alcohol: if before therapy was in
68% of cases, medium-high, becomes after 3-4 months after therapy in low-nil in
89% of patients observed.
It has been recorded that, after 3-4 months after receiving acamprosate, the clinical
picture of the patient is greatly improved by referring to biological markers (Fig. 2). Conclusions: The study shows that treatment with acamprosate is an exciting
P O S T E R | 83
55,6%
13% Relapse
relapse with GHB
relapse with acamprosate
opportunity within a project of integrated care for the treatment of alcohol addiction.
The acamprosate may also be used early in the pharmacological treatment of
dependence on alcohol to prevent the appearance of excitability neuronal associated
abstinence.On the other hand, its use must have a duration sufficient to allow
neuronal excitability to normalize in the most enduring possible: the treatment, in
fact, is recommended for one year. In any case, the use can be continued even in the
face of relapses, with the aim to reduce the frequency or severity.In particular, the
strong point seems to be the ability for the user to experience a new sense of
normalcy and to remove the desire for significant periods of alcohol.
Fig.1: Percentage of
relapse during treatment
with acamprosate.
Fig.2: Laboratory findings on biological markers before and after treatment with acamprosate.
Bibliography:
1. Mason BJ, Lehert P. Effect of acamprosate on protracted withdrawal symptoms: anxiety,
dysphoria and insomnia. Scottsdale, AZ, Dec 7-11-2008.
2. Mason BJ, Heyser CJ: the neurobiology, clinical efficacy and safety of acamprosate in the
treatment of alcohol dependence. Expert Opin Drug Saf. 9. 177-188, 2010a.
3. Mason BJ, Heyser CJ. Acamprosate: a prototypic neuromodulator in the treatment of alcohol
dependence. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9: 23-32, 2010b.
4. Mason BJ, Lehert P: the effects of current subsyndromal psychiatric symptoms or past
psychopathology on alcohol dependence treatment outcomes and acamprosate efficacy. Am J
Addict. 19: 147-154, 2010.
95 77
43.3
356.8
91.5
17 21
61
0 40 80
120 160 200 240 280 320 360 400
MCV AST ALT G-GT
Biological markers
BEFORE
AFTER
84 | P O S T E R
5. Ootemen W, Naassila M, Koeter MW, Verheul R, schippers GM, Houchi H, Daoust M, Van Den
Brink W: predicting the effect of naltrexone and acamprosato in alcohol-dependent patients using
genetic indicators. Addict boil. 14: 328-337, 2009.
6. Pilling S, Yesufu-Udechuku A, Taylor C, Drummond C. Diagnosis, assessment and management
of harmful drinking and alcohol dependence: summary of NICE guidance. BMJ. 342: d700, 2011.
7. Rosenthal RN, Gage A, Perhach JL, Goodman AM. Acamprosate: safety and tolerability in the
treatment of alcohol dependence. J Addict Med. 2: 40-50, 2008.
8. Rosner S, Leucht S, Lehert P, Soyka M: acamprosate supports abstinence, naltrexone prevents
excessive drinking. Evidence from a meta-analysis with unreported outcomes. J
Psychopharmacol. 22: 11-23, 2008.
9. Rosner S, Hackl-Herrwerth A, Leucht S, Lehert P, Vecchi S, Soyka M. Acamprosate for alcohol
dependence. Cochrane Database Syst Rev: CD004332, 2010.
10. Witkiewitz K, Saville K, Hamreus K.Acamprosate for treatment of alcohol dependence:
mechanisms, efficacy and clinical utility. Ther Clin Risk Manag. 2012;8:45-53. Epub 2012 Feb 1.
11. Petrov I, Krogh J, Nordentoft M. [Meta-analysis of pharmacological therapy with acamprosate,
naltrexone, and disulfiram--a systematic review]. [Meta-analysis of pharmacological therapy
with acamprosate, naltrexone, and disulfiram--a systematic review].
12. Mason BJ, Lehert P. Acamprosate for alcohol dependence: a sex-specific meta-analysis based on
individual patient data. Epub 2011 Sep 6.
13. Brager A, Prosser RA, Glass JD. Acamprosate-responsive brain sites for suppression of ethanol
intake and preference. 2011 Oct;301(4):R1032-43. Epub 2011 Jun 22.
Corresponding author: Dott. Fabio Venturella, Dipartimento di Scienze per la
promozione della salute G. D’ Alessandro,Via Del Vespro 127 Università degli Studi
di Palermo, Tel. 3203354997,
Email: [email protected]
P O S T E R | 85
Cellular drug delivery system based on vaterite particles
B. Parakhonskiy1, 2
, C. Foss1, E. Carletti
1, A. Haase
1, A. Motta
1, C. Migliaresi
1, and
R. Antolini1
1. BIOtech, University of Trento, via delle Regole 101, 38123 Mattarello, Italy
2. Shubnikov Institute of Crystallography, Russian Academy of Science, Moscow, Russia
The novel technique for the synthesis of vaterite submicron containers were
developed in our work. We present the characterization of these carriers, their
loading and experiments on possible release strategies controlling of the release rates
of encapsulated substances. Biocompatibility analyses were performed, evaluating
the cytotoxicity of vaterite containers and their influence on the cell metabolism.
Finally we present in vitro cellular uptake experiments for different molecular-
weight cargos.
CaCO3 vaterite spherical particles were fabricated with controllable average sizes
from 400nm up to 10 micron. As proof-of-principle experiments, fluorescent markers
(low-molecular-weight Rhodamine 6G and high-molecular-weight TRITC-dextran)
were encapsulated into the vaterite containers, so that payload release dynamics
could be studied by fluorescence microscopy and spectrofluorimetry. An increase of
the release rate of Rhodamine 6G into water and cell growth medium was found with
respect to ethanol coinciding with the recrystallization phase transition from vaterite
to calcite after 3 days. For samples loaded with TRITC-dextran, this phase transition
was inhibited, causing only small amounts of the encapsulated markers being
desorbed during one week.
Human ovarian carcinoma ES2 cells were cultured with a suspension of vaterite
particles in culture medium. Neither cytotoxicity was noticed after 2 days of
incubation, nor cell reproduction was significantly affected proving the
biocompatibility of the vaterite containers. The uptake dynamics was monitored by
confocal laser microscopy after staining live cells with Calcein-AM. High- and low-
molecular-weight payload for cell uptake experiments showed diverse dynamics.
While the first exhibited fast dye release into the cells, the later showed strong
indications of intact containers accumulating within the cell also after 48h. These
contrasting dynamics can be further controlled by covering the microcontainers with
additional layers of biocompatible polyelectrolyte, which will further increase the
payload release time. A change of the pH from neutral to acid conditions instead,
will lead to a destruction of the vaterite matrix followed by a quick release of the
encapsulated materials. These flexible control mechanisms make this system an
interesting candidate for pharmaceutical applications.
86 | P O S T E R
Modelli biologici di stress ossidativo per lo studio delle proprietà
antiossidanti del carciofo
Melis M. Paola, Atzeri Angela, Cabboi Barbara, Deiana Monica, Incani Alessandra,
Loru Debora, Rosa Antonella, Massimiliano Melis, Dessì M. Assunta
Dip. Scienze Biomediche, Università degli Studi di Cagliari, Cittadella Universitaria, SS 554, Km 4.5,
09042 Monserrato, Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39 70 675 4127; e-mail: [email protected].
É oramai ben riconosciuto il ruolo funzionale, in relazione al miglioramento dello
stato di salute e di benessere e/o riduzione del rischio di malattia, di una serie di
alimenti che rientrano nelle normali abitudini alimentari e che mostrano la loro
efficacia nelle quantità normalmente consumate nella dieta.
Il carciofo, alimento da sempre apprezzato nella regione mediterranea, è una verdura
caratterizzata da elevati livelli di polifenoli (≈ 2% del peso fresco), composti in grado
di esercitare un’importante azione di prevenzione nei confronti di differenti
condizioni patologiche. Tradizionalmente è stato utilizzato nella medicina popolare
per le sue proprietà coleretiche-colagoghe, diuretiche, epatoprotettive ed
ipocolesterolemizzanti, proprietà confermate da vari studi sperimentali, che hanno
avvalorato l’azione benefica del carciofo nei confronti di alcuni disturbi epatici e
digestivi1, la capacità di esplicare effetti anti-iperlipidemici
2 sia ostacolando
l’aumento di trigliceridi sia inibendo lo svuotamento gastrico. È stata inoltre
evidenziata un’azione ipoglicemizzante negli animali e nell’uomo oltre ad un effetto
ipocolesterolemico3 dovuto sia ad aumentato flusso biliare (e conseguente aumento
di escrezione di colesterolo), sia all’ostacolo di neo-sintesi di colesterolo (tramite
l’inibizione dell’enzima idrossi-metilglutaril CoA reduttasi). Numerosi studi hanno
mostrato l’importante azione antiossidante esplicata dal carciofo o dai suoi estratti in
diversi modelli sperimentali, in particolare in leucociti umani stimolati con diversi
ossidanti tra cui H2O2, in colture di cellule endoteliali e di monociti4, in colture
primarie di epatociti di ratto trattati con cumene idroperossido o tert-butil
idroperossido5 o durante l’ossidazione di LDL mediata da ioni rameici
4,6. Le
proprietà antiossidanti del carciofo sono state correlate al contenuto di composti
polifenolici presenti, in particolare ai livelli di acido caffeico e dei suoi derivati. Altri
importanti composti fenolici identificati nel carciofo sono i flavonoidi apigenina e
luteolina e i loro glucosidi e rutinosidi.
P O S T E R | 87
Questo studio è volto a valutare l’azione antiossidante del carciofo della cultivar
“Spinoso Sardo”, clone “Spinoso”, con l’obiettivo di fornire una nuova
caratterizzazione delle proprietà di questo pregiato ortaggio, molto importante
nell’economia della Sardegna, per renderlo da squisito alimento apprezzato
soprattutto per la sua bontà, oltre che per le sue proprietà benefiche nei confronti di
vari disturbi epatici-biliari, a nuova potenziale fonte di molecole antiossidanti. A tale
scopo è stato studiato e comparato il potere antiossidante di una serie di estratti
metanolici ottenuti da differenti parti (foglie, capolini e gambi) del carciofo Spinoso
Sardo attraverso l’utilizzo di diversi modelli di stress ossidativo di rilevanza
biologica, quali la degradazione ossidativa dell’acido linoleico a 37 °C e
l’ossidazione del colesterolo a 140 °C. Inoltre è stato valutato l’effetto citotossico nei
confronti delle cellule Caco-2 differenziate, quale modello di cellule intestinali. Tutti
gli estratti di carciofo hanno ostacolato la degradazione dell’acido linoleico ma in
maniera differente: i capolini hanno mostrato un potere protettivo maggiore rispetto
agli estratti dei gambi e delle foglie; infatti, già da 1 g hanno protetto l’acido
linoleico di circa il 50% e permesso un recupero maggiore di acidi grassi
idroperossidi a dieni coniugati (HP). Una protezione totale dell’acido grasso si è
riscontrata con 5 g degli estratti dei capolini e con 50 g degli estratti dei gambi
(Figura 1). Tale capacità antiossidante probabilmente è esplicata dagli estratti di
carciofo attraverso un meccanismo di donazione di atomi idrogeno, confermato dalla
0
50
100
150
200
250
300
0
20
40
60
80
100
120
HP
to
t (%
del
l'o
x)
ac.
lin
ole
ico
(%
del
co
ntr
oll
o 0
°C)
estratti di carciofo
1ug 2.5ug 5ug 10ug 50ug
1ug 2.5ug 5ug 10ug 50ug
Figura 1: Acido linoleico residuo (barre) espresso in % del controllo a 0 C e acidi grassi
idroperossidi totali (HP tot) (linee) espressi in % dell’ossidato (ox), formati dopo
incubazione, a 37 C per 32 ore alla luce, di 1mg di acido linoleico in assenza (ox) o in
presenza di 1-50 g di estratti in metanolo di gambi, foglie e capolini di carciofo, clone
“Spinoso”, cultivar “Spinoso Sardo”. (Valori del controllo: ac. linoleico= 0.95 0.05mg;
HP= 86.66 11.44 g, analisi in HPLC7).
88 | P O S T E R
capacità degli estratti di spostare il rapporto c,t/t,t degli HP formati durante
l’autossidazione dell’acido linoleico a favore degli isomeri c,t7. La protezione verso
il colesterolo è stata più simile tra gli estratti (100% di protezione da 5 g), 1 g
dell’estratto dei capolini ha permesso una protezione paragonabile tra foglie e
capolini, mentre i gambi sono stati meno efficaci.
Sulle cellule Caco-2 differenziate, (modello ampiamente utilizzato per la valutazione
delle proprietà delle cellule intestinali8), gli estratti in metanolo dei capolini del clone
“Spinoso” non hanno mostrato alcuna azione citotossica, valutata con il test Alamar
Blue9, nel range di concentrazione 1-1000 mg/ml, al contrario degli estratti
metanolici delle foglie totalmente tossici già a concentrazione di 25 mg/ml (Figura
2). Dai risultati ottenuti si evince come l’uso di metodiche semplici, poco costose e
di routine siano risultate utili per mettere in luce virtù benefiche di un alimento da
tanti apprezzato per il suo gusto oltre che per le sue proprietà quale “alimento
funzionale”.
Bibliografia
1) Sannia A. (2010). Un’esperienza di fitoterapia con una associazione di fitocomplessi ad attività
epatoprotettrice contenente un estratto di foglie di carciofo per il controllo dei sintomi della
dispepsia funzionale. Minerva Gastroenterol. Dietol., 56: 93-99.
2) Shimoda et al., (2003). Anti-hyperlipidemic sesquiterpenes and new sesquiterpene glycosides
from the leaves of artichoke (Cynara scolymus L.): structure requirement and mode of action.
Bioorg. Med. Chem. Lett., 13: 223-228.
0
20
40
60
80
100
120
1 2,5 5 10 25 50 100 250 500 750 1000
Mo
rta
lità
cel
lula
re (
% d
el c
on
tro
llo
)
concentrazione estratti ( g/ml)
gambi
capolini
foglie
a, d a, #
Figura 2: Mortalità cellulare (% del controllo, 0% di mortalità o 100% di vitalità) di
cellule Caco-2 tenute in coltura per 24 ore con diverse concentrazioni (1-1000 g/ml) di
estratti di carciofo. [a= p<0.001 vs i controlli; d= p<0.001 foglie vs gambi e capolini;
#= p<0.001 gambi e foglie vs capolini]. La citotossicità degli estratti (1-1000 g/ml) è
stata saggiata su cellule CaCo-2 differenziate8, utilizzando il test Alamar Blue9.
P O S T E R | 89
3) Bundy et al., (2008). Artichoke leaf extract (Cynara scolymus) reduces plasma cholesterol in
otherwise healthy hypercholesterolemic adults: A randomized, double blind placebo controlled
trial. Phytomedicine, 15: 668-675.
4) Zapolska-Downar et al., (2002). Protective properties of artichoke (Cynara scolymus) against
oxidative stress induced in cultured endothelial cells and monocytes. Life Sciences, 71: 2897-
2908.
5) Gebhard (1997). Antioxidative and protective properties of extracts from leaves of the artichoke
(Cynara scolymus L.) against hydroperoxide-induced oxidative stress in cultured rat hepatocytes.
Toxicol. App. Pharmacol., 144: 279-286.
6) Jiménez-Escrig et al., (2003). In vitro antioxidant activities of edible artichoke (Cynara scolymus
L.) and effect on biomarkers of antioxidants in rats. J. Agric. Food Chem., 51: 5540-5545
7) Rosa et al., (2002). Antioxidant activity of capsinoids. J. Agric. Food Chem., 50: 7396-7401
8) Deiana et al., (2010). Protective effect of simple phenols from extravirgin olive oil against lipid
peroxidation in intestinal Caco-2 cells. Food Chem. Toxicol., 48: 3008–3016.
9) O'Brien et al., (2000). Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the
assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur. J. Biochem., 267: 5421-5426.
Corresponding author: Melis M.Paola - Dip. Scienze Biomediche, Università degli
Studi di Cagliari, Cittadella Universitaria, SS 554, Km 4.5, 09042 Monserrato,
Cagliari. Autore di riferimento Tel. +39 70 675 4127; e-mail: [email protected].
90 | P O S T E R
Cardiac regeneration by pharmacologically active microcarriers
releasing growth factors and/or transporting adipose-derived stem
cells
Monia Savi1,7
, Leonardo Bocchi1,4
, Emanuela Fiumana2,4
, Caterina Frati3,
Francesca Bonafé2,4
, Stefano Cavalli3, Paolo Giovanni Morselli
6, Jean-Pierre
Karam2,5
, Claudia Montero-Menei5, Claudio Marcello Caldarera
,2,4, Carlo
Guarnieri2,4
, Claudio Muscari2,4
, Donatella Stilli1,4
, Federico Quaini7,4
, Ezio
Musso1,4
.
Dipartimento di Bioscienze-Università di Parma1, Dipartimento di Biochimica-Università di
Bologna2, Dipartimento di Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali-Università di
Parma3, Istituto Nazionale per le Ricerche Cardiovascolari (INRC)
4, INSERM U 646 – Università di
Angers5, Dipartimento d Scienze Chirurgiche Specialistiche ed Anestesiologiche-Università di
Bologna6, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale - Università di Parma
7.
AIMS. In preclinical studies, cell transplantation has definitely emerged as a
potential treatment strategy for heart failure secondary to myocardial infarction (MI)
whereas data from large sample size clinical trials are conflicting (1). To ameliorate
the unsatisfactory outcome of cell therapy in clinical settings attention has been paid
to several factors such as tailoring of cell type, fine tuning of procedural aspects, and
optimization of engraftment techniques with the use of scaffolds. In recent years,
several studies documented the existence in adipose tissue of stem cells (Adipose-
derived Stem Cells: ASCs) which can be safely transplanted to an autologous or
allogeneic host and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes
(2). Further, Hepatocyte Growth Factor and Insulin-Like Growth Factor-1 (GFs)
were shown to repair the infarcted heart and improve its electromechanical
competence by respectively mobilizing resident cardiac stem cells (CSCs) and
promoting their survival and proliferation (3). Finally, pharmacologically active
microcarriers (PAMs) formed by biodegradable and non-cytotoxic poly (lactic-co-
glycolic acid) microspheres which interact with cells/molecules conveyed on their
surface and tissue microenvironment were proposed for enhancing cell engraftment
in the injured myocardium (4). In the present study, we tested the hypothesis that
stem cell based cardiac regeneration through intra-myocardial delivery of ASCs, GF-
mediated local activation of CSCs, or both, can be improved by PAMs.
METHODS. ASCs were isolated by human lipoaspirates. PAMs were coated with
fibronectin and poly-lysine to improve cell adhesion and biological function. GFs
were encapsulated into PAMs during the microsphere formulation. Thirty-eight adult
male Wistar rats with one-month old MI were treated with ASCs (MI_ASC group,
n=8), ASCs+PAMs (MI_ASC+PAM, n=7), GF-releasing PAMs (MI_PAM+GF,
n=6), ASCs+GF-releasing PAMs (MI_PAM+ASC+GF, n=6) or vehicle (MI_V,
n=6). Five additional rats were sham operated (SHAM). Two weeks after treatment,
hemodynamic parameters were invasively determined in Millar conductance catheter
P O S T E R | 91
+dP/dt (mmHg/s)
- 22%-13%
-18%-15%
0
100020003000
400050006000
7000
80009000
-dP/dt (mmHg/s)
-8000
-6000
-4000
-2000
0
- 33%
-23%
-29%-33.6%
studies and inducibility of ventricular arrhythmias was assessed during programmed
stimulation in Langendorff-perfused hearts, by Microelectrode Array (MEA) system.
Eventually, the hearts were subjected to anatomical, morphometric, and
immunohistochemical analyses. ASC tracking was achieved by the detection at tissue
level of both pre-labeled cells with Dil fluorochrome and human specific sex
chromosomes by FISH.
RESULTS. The deterioration of ventricular function in untreated MI rats was
represented by an approximately 22% reduction in the maximal rate of ventricular
pressure rise and decline (±dP/dt; Figure 1 a-b) and a 35% prolongation of
isovolumic contraction and relaxation times. PAM+ASC+GF was the most effective
treatment leading to a substantial improvement of all hemodynamic parameters
whose values approached those measured in SHAM rats (Figure 1 a-b). The recovery
of left ventricular (LV) hemodynamics in MI_PAM+ASC+GF group had a structural
counterpart in a 10% reduction in LV chamber dilation together with a 20% increase
in mass-to-chamber-volume ratio, thus cancelling out the unfavorable LV
remodeling induced by MI (no significant difference vs. SHAM). In the same
animals a considerable amount of cell engraftment within the infarcted hearts was
clearly documented by FISH immunohistochemical studies. Lastly, all treatments
involving the use of PAM had beneficial effects on myocardial perfusion by
significantly increasing the number of arterioles in the regenerated hearts. Again, the
best results were obtained in MI_PAM+ASC+GF group (+75%; p<0.01 vs. MI-V ).
a) b)
* * * * * * * *
Figure 1. Mean values±SE of (a) +dP/dt and (b) –dP/dt, measured in the 6 experimental groups. *
p<0.05, significant differences vs. SHAM
By contrast, the improvement in cardiac mechanical function and structure mediated
by PAM+ASC+GF treatment was not accompanied by a similar positive effect on
electrical function. Indeed, arrhythmias occurring during programmed stimulation
trended to be larger in all treated animals and more so in MI_PAM+ASC+GF group.
SHAM
MI_V
MI_ADSC
MI_ADSC+PAM
MI_PAM+GFs
MI_PAM+ADSC+GFs
SHAM
MI_V
SHAM
MI_V
MI_ADSC
MI_ADSC+PAM
MI_ADSC
MI_ADSC+PAM
MI_PAM+GFs
MI_PAM+ADSC+GFs
MI_PAM+GFs
MI_PAM+ADSC+GFs
92 | P O S T E R
CONCLUSION. PAMs appeared to improve ASC- or GF-based approaches to
regenerate the infarcted heart and ameliorate cardiac function although caution
should be paid on the electrophysiological impact of the physical interaction of
microspheres with the myocardium.
References: 1) Malliaras K, Marbán E. Cardiac cell therapy: where we've been, where we are, and where we
should be headed. Br Med Bull. 2011;98:161-85.
2) Mizuno H, Tobita M, Uysal AC. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for
future regenerative medicine. Stem Cells. 2012;30:804-10.
3) Urbanek K, Rota M, Cascapera S, Bearzi C, Nascimbene A, De Angelis A, Hosoda T, Chimenti
S, Baker M, Limana F, Nurzynska D, Torella D, Rotatori F, Rastaldo R, Musso E, Quaini F, Leri
A, Kajstura J, Anversa P. Cardiac stem cells possess growth factor-receptor systems that after
activation regenerate the infarcted myocardium, improving ventricular function and long-term
survival. Circ Res. 2005;97:663-73.
4) Karam JP, Muscari C, Montero-Menei CN. Combining adult stem cells and polymeric devices for
tissue engineering in infarcted myocardium. Biomaterials. 2012;33:5683-95.
Corresponding author: Donatella Stilli, Dipartimento di Bioscienze, Parco Area
delle Scienze 11A, Università di Parma, 43100 PARMA. Tel.: +390521905624. E-
mail [email protected]
P O S T E R | 93
Micro-Raman mapping of bio-carbonates and polyenic pigments in
corals and shells
L. Bergamonti1, G. Predieri
1, P.P. Lottici
2
1 Chemistry Department, University, Parco Area delle Scienze 17/a, 43124 Parma – Italy
2 Physics and Earth Sciences Department, University, Parco Area delle Scienze 7/a, 43124 Parma –
Italy
Calcifying organisms are widely studied to investigate the complex organic-
inorganic structure of the biogenic carbonates and the environmental factors
influencing their formation (1). The nature of the pigments in marine and terrestrial
biogenic carbonates found in corals, shells or pearls is still debated and, in addition, a
deeper understanding of the intricate biomineralization processes is looked for to
mimic the “natural” growth techniques for specific applications.
Raman microscopy is a powerful technique to investigate both the spatial distribution
of the inorganic phases (calcite, aragonite or vaterite) and to define the nature of the
organic pigments in corals, shells and pearls, especially when resonance conditions
are attained (2-6). Mixtures of methylated (carotenoids) or non-methylated polyenes
with different UV-VIS absorption spectra and chain lengths (i.e. number N of C=C
bonds) are responsible for the colors and their variations in mineralized organisms
(4-5).
Here we report on Raman mapping measurements at 632.8 nm and at 473.1 nm
(resonance) in calcitic and/or aragonitic samples: terrestrial pulmonate gastropod
mollusk shells of the Liguus virgineus species (family Orthalicidae) compared with
corals (Stylaster roseus and Corallium rubrum).
The pigment in Corallium rubrum (calcitic) shows Raman frequencies typical of
polyenic unmethylated chains whereas in Stylaster roseus coral (aragonitic) the
spectrum is similar to that found in a methylated carotenoid pigment as astaxanthin
or canthaxanthin. On the other hand, for the peculiar Liguus virgineus shells
investigated (mainly aragonitic), the pigments show both methylated and
unmethylayed polyenic nature. The results of the Raman mapping distribution of
carbonate species are discussed and compared with those found in marine gastropoda
or bivalve shells, where methylated polyenes are hardly found.
94 | P O S T E R
References:
1 - Urmos, J.; Sharma, S. K.; Mackenzie, F. T., Am. Mineral. 1991, 76, 641–646.
2 - Bergamonti, L.; Bersani, D.; Csermely, D.; Lottici, P.P., Spectrosc. Lett. 2011, 44, 453-458.
3 - Soldati, A. L.; Jacob, D. E.; Wehrmeister, U.; Hager, T.; Hofmeister, W., J. Raman Spectrosc.
2008, 39, 525–536.
4 - Karampelas, S.; Fritsch, E.; Mevellec, J.-Y.; Gauthier, J.-P.; Sklavounos, S.; Soldatos, T., J.
Raman Spectrosc. 2007, 38, 217–230.
5 - Barnard, W.; de Waal, D. J. Raman Spectrosc. 2006, 37, 342–352.
6 - Hedegaard, C.; Bardeau, J.-F.; Chateigner, D., J. Mollus. Stud. 2006, 72, 157–162.
P O S T E R | 95
La popolazione del vergante attraverso lo studio dei cognomi
L. Pedrini1, B. Pedrini
1, E. Rabino Massa
2
1Collaboratore scientifico: Museo di Antropologia ed Etnografia - Università di Torino
2Dipartimento di Scienze della vita e Biologia dei Sistemi - Università di Torino
Nel Vergante, zona collinare situata a sud-ovest del Lago Maggiore, sino a pochi
decenni fa, la migrazione dai paesi montani e collinari verso il fondovalle era scarsa.
La pastorizia e l’agricoltura fornivano alle popolazioni mezzi appena sufficienti per
vivere ma non di più, per cui non vi era neanche immigrazione. Abbiamo verificato
se questa stanzialità c’è stata o c’è ancora in alcuni paesi collinari del Vergante.
La presente ricerca si prefigge lo scopo: a- Di verificare quali siano stati i flussi
migratori delle popolazioni del Vergante nel corso delle ultime cinque generazioni;
b- Di accertare l’eventuale esistenza di una omogeneità biologica valutata sui
cognomi; c- Di avviare indagini genetiche, previo accertamento dell’ isolamento
delle comunità vergantesi, d- Di utilizzare i risultati al fine di un completamento e
confronto con quelli degli studi in corso sulle popolazioni isolate delle Alpi e degli
ambienti lagunari (Progetti Antico Delfinato e L’Uomo e il Lago).
La presente ricerca rappresenta, quindi, uno studio pilota per esaminare, attraverso
l’analisi dei cognomi, l’isolamento dei seguenti 8 paesi del Vergante: Ghevio,
Colazza, Pisano, Corciago, Tapigliano, Nebbiuno Fosseno e Massino. Per ciascuno
dei paesi sopra ricordati abbiano rilevato la frequenza dei cognomi di tre decenni
scelti a caso compresi nel periodo 1866- 1994 (1866-’ 75, 1930-’39 e 1985-‘94).
Dall’esame in dettaglio dei singoli Comuni si evince che, a partire dal 1866, il ceppo
originario appare conservato, pur incidendo meno sulla totalità della popolazione. Le
peculiarità più salienti si rilevano per il Comune di Massino, che mostra il più altro
grado di omogeneità, in quanto il ceppo originario ha mantenuto un alto grado di
persistenza, ed anzi il numero medio degli abitanti con lo stesso cognome è
aumentato. Al contrario del Comune di Corciago, dove il ceppo originario si è
disperso, più che dimezzandosi in 120 anni.
In conclusione si può affermare che nella maggior parte dei Comuni si è potuti
risalire, attraverso ai cognomi, alle famiglie presenti da cinque generazioni e che
l’acquisizione di nuovi patronimici ha permesso di individuare i cambiamenti dovuti
all’ immigrazione.
96 | P O S T E R
Ricerche sulla popolazione di Giaglione (TO) in epoca preunitaria
Sergio De Iasio (1), Giulia Levati (1), Marilena Girotti (2), Marcello Fagiano (2),
Rosa Boano (2)
(1) Dipartimento di Bioscienze, Universita' di Parma
(2) Dipartimento di Scienze della Vita e Biologia dei Sistemi , Università di Torino
La ricerca biodemografica ha storicamente privilegiato l’utilizzo di fonti di flusso
(nascite, matrimoni, morti) per le analisi sui meccanismi microevolutivi delle
popolazioni. In particolare l’attenzione dei ricercatori è stata rivolta ai registri di
matrimonio. Varie circostanze hanno portato a operare verso tale scelta: la possibilità
piuttosto comune di disporre di tali documenti; la facilità nella stima di alcuni
parametri biodemografici da essi desumibili, quali ad esempio i livelli di endogamia
ed esogamia. Tuttavia le fonti di flusso non rendono sufficientemente conto della
frazione di popolazione che ha effettivamente perpetuato la comunità nel tempo,
come pure non danno informazioni sulle modalità di aggregazione dei suoi
componenti, né consentono di valutare l’importanza dei diversi fattori
socioeconomici che possono avere inciso sul processo di continuità della
popolazione. Una valida alternativa alle fonti di flusso può essere l’utilizzo di fonti di
stato censuarie, civili (censimenti) o parrocchiali (gli “status animarum”), che danno
una fotografia molto dettagliata sullo stato della popolazione in un preciso momento.
É bene tuttavia ricordare che esse non sono sempre facilmente reperibili, in
particolare quelle in epoca preunitaria.
In questa prospettiva di studio, il recupero e l’analisi della documentazione censuaria
assume un ruolo prioritario al fine di ovviare alle carenze proprie delle fonti di
flusso.
Nel presente lavoro vengono comparati alcuni stimatori demografici relativi alla
popolazione di Giaglione (Val Susa, Torino) desunti utilizzando i censimenti civili
del marzo 1799 (all’epoca facente parte della effimera Repubblica Piemontese) e del
dicembre 1858 (allora Giaglione era sotto il Regno di Sardegna, riformato dallo
Statuto Albertino, in provincia di Susa, divisione di Torino).
Al 1799 la popolazione di Giaglione risulta costituita da 1348 individui, compresi in
266 unità abitative e ripartiti in 7 frazioni geografiche di dimensioni variabili da 120
a 303 abitanti. Al 1858 la comunità si è accresciuta a 1695 soggetti e 344 famiglie,
dislocate sul territorio in 9 frazioni, più un certo numero di toponimi riferibili
essenzialmente a piccoli gruppi di case sparse.
Le dimensioni degli aggregati abitativi al 1799 evidenziano un numero ristretto di
unità formate da solitari o da due persone soltanto, mentre quelle costituite da 3 a 7
persone sono le più comuni. Molto poche sono le unità di ampie dimensioni (9 o più
P O S T E R | 97
individui). Al censimento sabaudo del 1858 risultano aumentate in modo
significativo le proporzioni sia dei nuclei formati da due persone che da quelli
costituiti da almeno 9 individui, mentre si riducono percentualmente quelli di
dimensioni intermedie, segnali di un cambiamento in atto nelle modalità di
aggregazione della popolazione.
Le unità abitative sono state classificate e comparate sulla base del codice
predisposto da P. Laslett (Laslett, 1977) che consente di individuare gli aggregati
domestici secondo criteri di natura geografica (gli individui che “dormono sotto lo
stesso tetto”), di relazione o affinità familiare (legami familiari naturali o acquisiti
tramite matrimonio) o funzionale (coloro che condividono una certa attività). In linea
con quanto riscontrato nella letteratura demografica (Soliani et al, 1985), la
popolazione risulta strutturata principalmente in aggregati composti da coppie
nucleari, con o senza figli, anche in condizione di vedovanza, specie da parte della
femmina. Tuttavia tra il 1799 e il 1858 si rileva una accresciuta proporzione di
coppie senza figli e di vedovi (maschi) con figli, mentre risulta diminuita la quota di
aggregati estesi (comprendenti anche altri parenti non costituenti un ulteriore nucleo
familiare) e soprattutto multipli (più nuclei famigliari coresidenti), sintomi che al
momento della formazione della coppia si dovrebbe avere avuto una preponderanza
di matrimoni “neolocali”, costituenti cioè nuclei familiari nuovi, senza che il partner
fosse aggregato alla famiglia d’origine del coniuge.
Nella composizione per sesso, le femmine risultano in surplus rispetto ai maschi
rispettivamente di 50 individui (su 1346 totali) nel 1799 e di 17 (su 1695) nel 1858.
Lo sbilanciamento si avverte soprattutto nella fascia d’età degli adulti giovani (dai 20
ai 34 anni), difettose di maschi, presumibilmente causato dal reclutamento di soldati
per l’esercito; lo squilibrio rispetto al rapporto sessi 1:1 è rilevante anche nelle classi
più avanti con gli anni, dai 45 ai 59, ma stavolta a sfavore delle femmine. In assenza
degli atti di morte che lo possano attestare, sembra ragionevole imputare la carenza
di donne dai 45 ai 59 anni alla maggior mortalità femminile collegata al logoramento
fisico e all’indebolimento conseguenti gli stress da parto.
E’ stata inoltre effettuata una analisi della discendenza legittima, conteggiando i figli
minori ancora conviventi con i genitori (almeno uno ancora in vita al momento del
censimento). Naturalmente non può che trattarsi di una stima parziale della
discendenza finale in quanto molte delle spose considerate non avevano ancora
concluso il proprio periodo fertile. Inoltre dal computo mancano i figli deceduti che
non dovevano essere pochi in quanto negli anni censiti la popolazione doveva essere
caratterizzata da un “ancient regime” demografico di tipo pretransizionale, con
valori di natalità e mortalità ancora decisamente elevati. Mancano infine anche i figli
sposatisi precocemente e/o che per vari motivi si erano allontanati dalla famiglie
d’origine. La distribuzione dei nuclei familiari in funzione dei figli censiti evidenzia
una differenza importante tra le due rilevazioni nel numero di coppie coniugali
giovani ancora senza figli, con una quantità di coppie ancora “sterili” molto
98 | P O S T E R
maggiore nel censimento più antico. Probabilmente le modalità di scrittura dei
registri del 1799 per quanto concerne l’indicazione delle relazioni tra ciascun
individuo con il capofamiglia può avere dato adito ad errori interpretativi e forse
avere influito sulla correttezza dell’attribuzione di alcuni figli ai genitori giusti. Ne è
prova il rigetto dell’ipotesi di adattamento della distribuzione di frequenza osservata
a quella teorica di Poisson (p=0,04%), attesa per le popolazioni in regime di
fecondità naturale. Detta sovrastima di coppie senza figli sembra invece non
verificarsi per la distribuzione di frequenza delle dimensioni della prole per il 1858
(p=8,07%). Come suggerito da Cavalli-Sforza e Bodmer (1971), è possibile ovviare
all’errata stima delle coppie senza figli togliendole dalla distribuzione: così è stata
riscontrata la validità nell’adattamento al modello poissoniano (17,4% e 12,3%
rispettivamente per il 1799 e 1958) senza evidenziare fenomeni sistematici di
perturbazione sulla distribuzione dei figli vivi in regime di fecondità naturale.
Malgrado i limiti di analisi già illustrati, è stato possibile osservare la riduzione della
fecondità all’aumentare dell’ordine di nascita cumulando i figli legittimi (ancora)
vivi e rapportando fra loro i valori di ciascun ordine di nascita con il precedente (Livi
Bacci, 1981) . La riduzione della fecondità attesa nelle popolazioni “naturali”
dovrebbe essere attorno al 20% passando da un ordine al successivo. Nel presente
lavoro la riduzione percentuale della fecondità aumenta progressivamente al
succedersi degli ordini di nascita in quanto si assommano tra loro la mancata
conclusione della fecondità delle spose e gli effetti depauperativi della mortalità,
soprattutto di quelli in età preriproduttiva. Si osserva in entrambe i censimenti una
caduta molto più forte nella numerosità dei nuclei familiari passando dalle famiglie
con 4 figli vivi a quelle con 5, indice della criticità nella quale venivano a trovarsi i
nuclei una volta raggiunta una certa dimensione.
Bibliografia: L.L. Cavalli-Sforza, W.F. Bodmer, 1971, The genetics of human populations, H. Freeman, S.
Francisco (USA)
P. Laslett, 1977, Famiglia ed aggregato domestico, in: (a cura di M. Barbagli) Famiglia e
mutamento sociale, 30-54, Il Mulino, Bologna.
M. Livi Bacci, 1981, Introduzione alla demografia, Loescher editore, Torino.
L. Soliani, A. Anelli, R. Zanni, 1985, Aspetti della dinamica delle strutture familiari, in: (a cura di
A. Moroni, A. Anelli, O. Ravera) Atti S.IT.E., 5: 765-776, Zara Edizioni, Parma.
Corresponding author: Sergio De Iasio, Dipartimento Di Bioscienze, V.le Usberti
11/a, Parma tel. 0522 905664 e-mail [email protected]
P O S T E R | 99
Distribution and phylogeny/distance-trees of prokaryotic
photoreactive domains
Carmen Mandalari1, Aba Losi
1, Wolfgang Gärtner
2
1: Dept. of Physics and Earth Sciences, Univ. of Parma (Italy),
2: Max Planck Institute for Chemical Energy Conversion, Mülheim (Germany)
Light is very important for the metabolism of many prokaryotic and eukaryotic
organisms. Prokaryotic organisms often use dedicated red- and blue light sensing
photoreceptor functional domains. There are two main superfamilies of non-
membrane bound photoreceptors: the first ones are bilin-binding phytocrome-related
proteins based on GAF (cGMP-specific phosphodiesterases, cyanobacterial
adenylate cyclases, and formate hydrogen lyase transcription activator FhlA)
domains (bilin-GAF proteins); the second are flavin-binding proteins,
photoreceptive thanks to their LOV (Light, Oxygen and Voltage) and BLUF (Blue
Light sensing Using Flavins) domains [1].
Our model sequence for LOV domains is from the LOV-protein Ytva from B.
subtillis. For BLUF we used the corresponding domain from the T. elongatus PixJ
protein. We searched protein sequences similar to LOV and BLUF domains
employing the BLAST algorithm and then we try to find possible evolutionary paths.
From the research we find 498 proteins with LOV domains in 379 different species
and 751 with BLUF region in 558 organisms. Many species have more than one
protein with these domains and in some cases there is co-presence of both domains.
In most cases LOV and BLUF proteins are modular, with the photoreceptive
modules associated to diverse effector or/and regulative domains. In some
organisms beyond LOV and BLUF there are also phytocrome-related proteins. We
can say that in every bacterial phyla there is at least a photoreactive domain
bleonging to LOV, BLUF or bilin-GAF, whereas archaea possess solely LOV
proteins as soluble photoreceptors.
As for the phylogeny we use neighbouring-method to obtain a branching pattern,
limited to LOV and BLUF sequences, given the uncertainties in alligning bilin-GAF.
We can observe that most of proteins coming from different strains of the same
organism are in the same cluster and, in general, domains from organisms of the
same phyla are neighbour. We can also observe that proteins with the same
functional domains are in the same cluster, so that we should more correctly speak of
distance-trees.
From these observation we can think that proteins could have the same function or
they could be involved in similar signal-transduction/metabolic pathways.
100 | P O S T E R
References 1. A. Losi, W. Gartner, “Bacterial bilin- and flavin-binding photoreceptors”, Photochem. Photobiol.
Sci., 2008, 7, 1168-1178
*Corresponding author: Mandalari Carmen - University of Parma (www.unipr.it),
Department of Physics and Earth Sciences, viale G.P. Usberti 7/A, 43100-Parma (I)
Tel: +39-0521905256, e-mail: [email protected]
P O S T E R | 101
Biomarcatori per la diagnosi precoce del tumore al polmone
Paola Mozzoni1,2
, Iris Banda1,Matteo Goldoni
1,2, Michele Rusca
3, Paolo
Carbognani3, Angelo Casalini
3, Massimo Corradi
1, Antonio Mutti
1.
1 Università degli studi di Parma; 2 INAIL Istituto Nazionale per l’Assicurazione contro gli Infortuni
sul Lavoro; 3 Azienda Ospedaliera di Parma
Il cancro al polmone è la prima causa di morte per patologia neoplastica nei paesi
industrializzati. La prognosi di tale malattia è limitata a causa della mancanza di
validi approcci finalizzati al riconoscimento tempestivo delle lesioni che permettano
di attuare una diagnosi precoce. Appare perciò evidente l’importanza di sviluppare
metodiche in grado di individuare lesioni iniziali. (1-2).
Numerose evidenze sperimentali mostrano il coinvolgimento dei miRNA nella
regolazione di processi biologici che portano alla formazione del tumore, tra cui
l’adesione, l’invasione, la migrazione, la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT)
e l’angiogenesi (3). I microRNA (miRNA) sono una classe di piccoli RNA non
codificanti, generalmente lunghi tra i 18-25 nucleotidi, in grado di regolare
l’espressione genica a livello post-trascrizionale attraverso la degradazione di
specifici RNA messaggeri o attraverso l’inibizione della traduzione in proteina (4).
Il presente lavoro si pone l’obbiettivo di identificare potenziali biomarcatori da
utilizzare nella diagnosi precoce del tumore polmonare non a piccole cellule
(NSCLC) in matrici di facile accesso, quali il plasma e, per la prima volta, il
condensato dell’aria espirata (CAE) con lo scopo di ottenere un test diagnostico non
invasivo con una buona sensibilità e specificità. Sono stati valutati come
biomarcatori due microRNA: il miRNA-21 e il miRNA-486, correlati all’espressione
di oncogeni e oncosoppressori tumorali
Nel plasma l’espressione del miRNA-21 è risultata essere significativamente
maggiore nei soggetti con NSCLC rispetto ai soggetti di controllo sani (P<0.0001),
mentre l’espressione del miRNA-486 ha evidenziato una significativa riduzione di
espressione nei soggetti malati rispetto ai soggetti sani (P<0.0001). Lo stesso
andamento è stato evidenziato nel CAE, anche in questo caso il miRNA-21
presentava una maggiore espressione nei soggetti affetti da NSCLC, rispetto ai
soggetti sani (P=0.0253); al contrario il miRNA-486 mostrava una minore
espressione nei soggetti malati rispetto ai sani. (P=0.0294). Inoltre, considerando il
fatto che i soggetti con valori elevati di miRNA-21 presentavano generalmente bassi
livelli di miRNA-486, è stato valutato il loro rapporto in entrambe le matrici,
ottenendo un aumento del potere discriminante messo in evidenza dalle rispettive
curve ROC (Fig.1 e 2). La curva ROC generata dal rapporto tra il miRNA-21 e il
102 | P O S T E R
miRNA-486 nel plasma presentava una sensibilità dell’87.5% e una specificità
dell’86.8%. L’area sotto la curva era di 0.901 (IC95 0.827-0.975), significativamente
diversa da 0.5. La curva ROC generata dal rapporto tra il miRNA-21 e il miRNA-
486 nel CAE presentava una sensibilità dell’60% e una specificità dell’71.1%. L’area
sotto la curva era di 0.678 (IC95 0.549-0.806), significativamente diversa da 0.5.
Utilizzando gli indicatori valutati nel plasma e nel CAE, che nel confronto tra gruppi
erano risultati statisticamente differenti come variabili predittive e come variabile
dipendente lo status (malato o sano), è stata effettuata la regressione logistica binaria
per valutare la capacità di tali indicatori nel classificare i soggetti. Nell’insieme il
miRNA-21 e il miRNA-486 erano in grado di distinguere correttamente i soggetti
con tumore polmonare nel 76.5% dei casi (13/17) e i soggetti senza tumore nel
96.6% dei casi (28/29), con una percentuale globale dell’89.1%.
Questi risultati, seppur preliminari, evidenziano come i miRNA possano essere
considerati dei buoni biomarcatori precoci per la diagnosi di NSCLC, in matrici
periferiche di facile accesso, quali il sangue e per la prima volta il condensato
dell’aria espirata. Questo risultato è molto importante perché permetterebbe di
diagnosticare la malattia senza l’utilizzo di esami strumentali invasivi. Si potrebbe
quindi pensare ad un loro ipotetico utilizzo a fianco delle tradizionali tecniche di
imaging a scopo diagnostico e prognostico.
Figura 1
Fig. 1. A: Rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel plasma di soggetti sani (CTR, ) e di soggetti affetti
da NSCLC(▲). B: Curva ROC del rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel plasma. E’ indicato il punto
di flesso
P<0.0001
***
A
CTR NSCLC0.1
1
10
100
Rel
ativ
e E
xpre
ssio
n
miR
NA
-21/m
iRN
A-4
86 P
lasm
a
B
P O S T E R | 103
Figura 2
Fig. 2. A: Rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel CAE di soggetti sani (CTR,) e di soggetti affetti da
NSCLC (▲). B: Curva ROC del rapporto miRNA-21/miRNA-486 nel CAE. E’ indicato il punto di
flesso.
Bibliografia
1. Al-Kattan K, Sepas E, Fountain SW, Townsend ER. (1997), “Disease recurrence after resection
for stage I lung cancer”. Eur J Cardiothorac Surg;12:380-384.
2. Westeel V, Choma D, Clement F, Woronoff-Lemsi MC, Pugin JF, Dubiez A, Depierre A.
Relevance of an intensive postoperative follow-up after surgery for non-small cell lung cancer.
Ann Thorac Surg 2000; 70:1185-1190.
3. Lages E, Ipas H, Guttin A, Nesr H, Berger F, Issartel JP. MicroRNAs: molecular features and role
in cancer. Front Biosci. 2012 Jun 1;17:2508-40.
4. Hussain MU. Micro-RNAs (miRNAs): genomic organisation, biogenesis and mode of action. Cell
Tissue Res. 2012 Aug;349(2):405-13.
Corresponding author: Dott.ssa Paola Mozzoni Dipartimento di Medicina Clinica e
Sperimentale, Via Gramsci, 14 – 43126 Parma; Tel 0521-033078; e-mail:
A B
CTR NSCLC0.001
0.01
0.1
1
10
100
1000
Rel
ativ
e E
xpre
ssio
n
miR
NA
-21/m
iRN
A486 C
AE
P=0.0289
*
104 | P O S T E R
Comparative analysis of cytotoxic effects INDUCED BY N4-
ethylmorpholine citronellalthiosemicabazone complexes in different
human cancer cell lines
Franco Biscegliea, Rossella Alinovi
b, Silvana Pinelli
b, Pieralberto Tarasconi
a,
Annamaria Buschinic, Francesca Mussi
c, Giorgio Pelosi
a
a Department of Chemistry,
b Department of Clinical and Experimental Medicine,
c Department
of Biosciences, University of Parma,
Thiosemicarbazone and their metal complexes are a class of compounds that
present interesting biological properties among which the ability to inhibit
proliferation of a wide variety of cancerous cell lines. In the course of our studies,
we have assessed that their activity is certainly due to more than one cellular target
and, interestilngly, is strongly dependent on the typology of tumour cells.[1] Their
high selectivity is highlighted in in vitro models: some cell lines are very sensitive
and others are totally insensitive. In previous papers we have reported that in
human leukaemia cell line U937 two N4-ethylmorpholine
citronellalthiosemicarbazone complexes, [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] and [Cu(Etmorph-
S-tcitr)2], showed strong antiproliferative activities.[2, 3] The aim of this study is
therefore to perform a comparative analysis of cytotoxic effects (apoptosis and
oxidative stress induction) of these two compounds in four cancer cell lines of
different malignancies: the histiocytic lymphoma cell line U937, the promyelocytic
leukemia cell line HL-60, the colon adenocarcinoma cell line HT-29 and the
neuroepithelioma cell line SK-N-MC.
A first comparison of IC50 values evidenced that the copper complex is
systematically more potent. Both complexes exhibit the highest cytotoxic activity
on U937, while SK-N-MC cells resulted to be the most resistant (Tab. 1).
IC50 (µM)
[Ni(Etmorph-S-tcitr)2] [Cu(Etmorph-S-tcitr)2]
U937 12.3 + 0.9 2.3 + 0.4
HL60 15.4 + 1.8 6.0 + 0.9
HT29 52.6 + 6.3 14.9 + 3.4
SK-N-MC 21.2 + 2.7 5.7 + 1.2
Table 1. IC50 values for the tested cell lines exposed to compounds
[Ni(Etmorph-S-tcitr)2] and [Cu(Etmorph-S-tcitr)2]
P O S T E R | 105
More specifically, treatment with the IC50 concentration of each compound
resulted in a significant induction of apoptosis in U937, HL 60 and SK-N-MC cells
but not in HT-29 line. These results were confirmed by the DNA fragmentation
assay and caspase activation: no modification of caspase activities was observed in
HT-29.
Figure 1. Caspase activity (above) and ROS levels (below) induced by compounds [Ni(Etmorph-S-
tcitr)2] (left) and [Cu(Etmorph-S-tcitr)2] (right)
The same trends in ROS (Reactive Oxygen Species) intracellular levels were
observed for U937 and SK-N-MC cells: [Cu(Etmorph-S-tcitr)2] caused a time-
dependent increase and [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] only an early transient increase.
These oxidative stress markers were not modified in HL-60 cells by both
U937 HL60 HT29 SK-N-MC
100
1000
***
*
**
**
*
***
*
***
Casp
ase
activity
(% a
s compare
d t
o c
ontr
ols)
U937 HL60 HT29 SK-N-MC
100
1000
Cas-8
Cas-9
Cas-3
*
***
* *
***
* **
U937 HL60 HT29 SK-N-MC0
100
200
300
400
500
**
***
***
****
ROS
(% a
s compare
d t
o c
ontr
ols)
[Ni(Etmorph-S-tcitr)2] [Cu(Etmorph-S-tcitr)
2]
U937 HL60 HT29 SK-N-MC0
100
200
300
400
5001 h
4 h
24 h
*****
***
***
*
***
[Ni(Etmorph-S-tcitr)2] [Cu(Etmorph-S-tcitr)
2]
106 | P O S T E R
complexes. Intracellular ROS of HT-29 were more than 4 fold the control value
during the early phases of [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] exposure; a lower and later
increase of ROS was observed during [Cu(Etmorph-S-tcitr)2] treatment (Fig. 1).
The effects of [Ni(Etmorph-S-tcitr)2] and [Cu(Etmorph-S-tcitr)2] on different
cell lines are extremely heterogeneous. This different “sensitivity” makes difficult
to hypothesise a general action mechanism and to generalize structure-activity
correlation. The choice of the cellular model used to investigate the interaction of
thiosemicarbazone complexes with the biological systems has come out to be a
crucial phase in in vitro studies.
References [1] G. Pelosi Thiosemicarbazone Metal Complexes: From Structure to Activity The Open
Crystallography Journal, 2010, 3, 16-28.
[2] M. Belicchi-Ferrari, F. Bisceglie, A. Buschini, S. Franzoni, G. Pelosi, S. Pinelli, P. Tarasconi
and M. Tavone Synthesis, structural characterization and antiproliferative and toxic bio-activities of
copper(II) and nickel(II) citronellal N4-ethylmorpholine thiosemicarbazonates, J. Inorg. Biochem.
2010, 104, 199-206.
[3] F. Bisceglie, S. Pinelli, R. Alinovi, P. Tarasconi, A. Buschini, F. Mussi, A. Mutti and G.
Pelosi, Copper(II) thiosemicarbazonate molecular modifications modulate apoptotic and oxidative
effects on U937 cell line, J. Inorg. Biochem. 2012, 116, 195-203.
Corresponding author: Giorgio Pelosi - Department of Chemistry, University of
Parma, Parco Area delle Scienze 17A 43124 Parma (Italy), tel. +390521905420, e-
mail: [email protected]
P O S T E R P a g . | 107
Effetti citotossici degli ossidi di cobalto e di titanio su cellule A549.
Rossella Alinovi2,
Silvana Pinelli2,
Matteo Goldoni1,
Paola Mozzoni1, Davide
Dallatana3, Alessio Perotti
2, Antonio Mutti
2
1CERT Centro di Eccellenza per la Ricerca Tossicologica,
2Dipartimento di Medicina Clinica e
Sperimentale, 3Dipartimento di Scienze Biomediche, Biotecnologiche e Traslazionali, Università degli
Studi di Parma.
La continua e rapida espansione delle nanotecnologie ha comportato la diffusione
negli ambiente di vita e di lavoro di nanoparticelle (NP) che costituiscono un
rilevante problema sanitario: per le loro dimensioni (inferiori a 100 nm) sono in
grado di penetrare nell’apparato respiratorio fino a raggiungere gli alveoli polmonari,
con conseguenti insorgenze od aggravamenti di patologie respiratorie e
cardiopolmonari (1). Un contributo fondamentale alla comprensione dell’interazione
fra NP e sistemi biologici, dei meccanismi d’azione e dei possibili effetti viene
fornito dagli studi in vitro (2). In seguito ad esposizione a NP costituite da metalli e
dai loro ossidi sono stati evidenziati alterazioni mitocondriali, danni al DNA,
produzione di radicali liberi e fattori pro-infiammatori (3, 4).
Tra le NP di interesse industriale quelle di diossido di Titanio (TiO2) e di ossido di
Cobalto (Co3O4) sono diffusamente utilizzate, oltre che come pigmenti e
catalizzatori, nella produzione di schermi per raggi UV (Ti NP) e di sensori (Co NP).
In questo studio sono stati confrontati gli effetti di NP di ossido di Co e di ossido di
Ti su cellule A549, derivate da un adenocarcinoma polmonare. Questa linea cellulare
è stata scelta perché l’apparato respiratorio costituisce la principale via di inalazione
ed assorbimento di NP e quindi un potenziale bersaglio (5).
Nel medium di coltura le NP tendono ad aggregarsi, formando agglomerati di
notevoli dimensioni (alcuni µm).
Solo concentrazioni molto elevate di NP riducono la vitalità cellulare senza indurre
processi apoptotici: IC50 201.13+59.51 e 459.03+83.37 µg/ml rispettivamente per Co
e Ti. Concentrazioni non letali (50 e 100 µg/ml) di entrambe le NP sono tuttavia in
grado di disturbare l’adesione delle cellule al substrato di coltura ed di provocare
alterazioni nel ciclo cellulare di A549 esposte a Co, con una significativa
diminuzione delle cellule in fase S e G2/M.
Nel corso dell’esposizione a Co si osserva inoltre un elevato incremento dose-
dipendente di specie reattive dell’ossigeno (ROS), con conseguente significativo
aumento dei prodotti dello stress ossidativo sulle proteine (gruppi carbonilici), sui
lipidi di membrana (TBARS-Thiobarbituric acid reactive substances) e con
108 | P O S T E R
induzione di attività enzimatiche scavenger (eme ossigenasi-1). Nelle fasi iniziali del
trattamento (1 h) compare anche un lieve danno genotossico, evidenziato col metodo
del Comet alcalino. Questo effetto precoce è reversibile ed il recupero, presente già
dopo 4 h, è completato dopo 24 h.
Il nostro studio ha dimostrato che modelli sperimentali in vitro costituiscono una fase
importante per la comprensione dei meccanismi di tossicità di nanoparticelle di uso
industriale e che le peculiari caratteristiche chimico-fisiche delle NP rendono
impossibile qualsiasi generalizzazione.
E’ inoltre stato confermato che NP metalliche, in particolare Co NP, producono
ROS, in grado di provocare danni a livello di macromolecole e strutture cellulari. E’
tuttavia ipotizzabile che l’azione delle NP si esplichi con un meccanismo multi-
target.
Finanziato dalla Ricerca Finalizzata RF-2009-1472550: Integrated approach to
evaluate biological effects on lung, cardiovascular system and skin of occupational
exposure to nanomaterials (NanO I-LuCaS).
Bibliografia:
1. NIOSH National Institute for Occupational Safety and Health. Approaches to the safe
nanotechnology. Managing the health and safety concerns associated with engineered
nanomaterials. USA, 2009.
2. Han X., Corson N., Wade-Mercer P. et al. Assessing the relevance of in vitro studies in
nanotoxicology by examining correlations between in vitro and in vivo data. Toxicology 2012,
297; 1-9.
3. Lewinski N., Colvin V., Drezek R. Cytotoxicity of nanopartcles. Small 2008, 4: 26-49.
4. Rivera Gil P., Oberdorster G., Elder A., Puntes V., Parak W.J. Correlating physico-chemical with
toxicological properties of nanoparticles: the present and the future. ACS Nano 2010, 4, 5527-
5531.
5. Yang W., Peters J.I., Williams R.O. Inhaled nanoparticles. A current review. Int. J. Pharm. 2008,
356: 239-247.
Corresponding author: Alinovi Rossella - Dipartimento di Medicina Clinica e
Sperimentale, Università degli Studi di Parma, Via Gramsci, 14 - 43126 Parma
Tel. 0521 033093 e-mail: [email protected]
P O S T E R P a g . | 109
Enzimatic biomarkers in the gilthead seabream juveniles fed with
graded concentrations of alchylphenols
Ilaria Traversi1,3*
, Eugenia Gambetta1, Valentina Nozzi
2, Francesca Maradonna
2,
Oliana Carnevali2,3
, Alberta Mandich1,3
1Dipartimento di Scienze della Terra, dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi di Genova,
viale Benedetto XV 5,16132 Genova 2Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente, Università Politecnica delle Marche, via Brecce
Bianche, 60131 Ancona 3INBB Consorzio Interuniversitario di Biosistemi e Biostrutture, via Medaglie d’Oro, 00136 Roma
The presence of different types of organic pollutants, in both wild and cultured
teleosts, has been widely reported. Among organic pollutants, 4-t-octylphenol
(OCT), and 4-nonylphenol (NP) are man-made contaminants possessing
controversial endocrine disruption properties [1]. Gilthead seabream (Sparus aurata
L) is one of the most important commercial species for Mediterranean aquaculture
and one of the marine species more frequently used as bioindicator of endocrine
disruption [2]. The aim of this study was to investigate in seabream juveniles the
effects of OCT and NP enriched diet on biotransformation, measured as
ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity (phase I) and glutathione-S-
transferase (GST) activity (phase II). The effects on the activity of antioxidant
defences was determined by measuring catalyse (CAT) activity. Vitellogenin (Vtg)
and Zona radiata protein (Zrp) expressions were used as endocrine biomarkers of
exposure [3]. Seabream juveniles were divided into 8 groups of 20 animals (10g/bw)
each: control, solvent control (ethanol) and 6 groups exposed to 3 graded
concentrations of OCT (5, 50 e 100 mg /kg/day OCT1, OCT2, OCT3 respectively)
and NP (5, 50 e 100 mg /kg/day NP1, NP2, NP3 respectively) for 21 days. At the end
of the exposure, liver was immediately frozen for the enzymatic activity assays and
for RNA extraction for Vtg and Zrp mRNA assay. Liver weight was recorded for
hepatosomatic index (HSI). VTG e Zrp gene expression was evaluated by Q-RT-
PCR by using Sybergreen method. EROD activity was measured in microsome
suspension recording the increase in fluorescence for the resorufin formation; GST
activity in the cytosolic fraction was analyzed with spectrophotometer, following the
formation of s-2,4-dinitro phenyl glutathione, at 340 nm; CAT was
spectrophotometrically assayed at 240 nm, by consumption of H2O2. Significant
increase of HIS was observed in NP1, NP2 and OCT1. mRNA Vtg expression was
significantly higher in both NP1 and NP2 and in OCT2. Vtg and Zrp gene expression
valuation on NP3 and OCT3 groups are still in progress. OCT significantly inhibited
CAT activity (p<0,0005) in all groups, while CAT activity was significantly
(p<0,0005) inhibited only in NP1 and in NP3 (p<0,01). GST activity was
110 | P O S T E R
significantly increased in NP1 and NP2 (p<0,05) and decreased in OCT3 (p<0,005).
EROD activity was significantly lower (p<0,05) only in NP2 and NP3, while all
OCT concentrations induced lower EROD activity. Concluding the obtained results
evidenced negative effects of both NP and OCT exposure in every concentrations
here analyzed, although a dose dependent response was not evidenced, suggesting a
detrimental effects on the reproduction of this important economic model.
Progetto F-2009-1536185, finanziato dal Ministero della Salute.
Bibliografia.
[1] Pérez Carrera E., García-López A., Martín del Río M.P., Martínez-Rodríguez G., Solé M.,
Mancera J. M. Effects of 17β-estradiol and 4-nonylphenol on osmoregulation and hepatic
enzymes in gilthead sea bream (Sparus auratus). Comparative Biochemistry and Physiology, Part
C (2007), 145: 210–217
[2] Teles M., Pacheco M., Santos M. A. Sparus aurata L. liver EROD and GST activities, plasma
cortisol, lactate, glucose and erythrocytic nuclear anomalies following short-term exposure either
to 17h-estradiol (E2) or E2 combined with 4-nonylphenol. Science of the Total Environment
(2005) 336: 57– 69
[3] Arukwe, A., Goksory, A. Eggshell and egg yolk proteins in fish: hepatic proteins for the next
generation: oogenetic, population, and evolutionary implications of endocrine disruption. Review.
Comparative Hepatology (2003) 2:4 http://www.comparative-hepatology.com/content/2/1/4
Corresponding author: Traversi Ilaria, Dipartimento di Scienze della Terra,
dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi di Genova, viale Benedetto XV
5,16132 Genova tel 0103538046 – 3202622463 e-mail [email protected]
P O S T E R P a g . | 111
Hepatic activities in Sparus Aurata L. juveniles fed with bisphenol A
enriched diet.
Ilaria Traversi1,3
, Annalisa Scorolli2, Giorgia Gioacchini
2, Gabriele Roncoli
1,
Oliana Carnevali2,3
, Alberta Mandich1,3
1Dipartimento di Scienze della Terra, dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi di Genova,
viale Benedetto XV 5,16132 Genova 2Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente, Università Politecnica delle Marche, via Brecce
Bianche, 60131 Ancona 3INBB Consorzio Interuniversitario di Biosistemi e Biostrutture, via Medaglie d’Oro, 00136 Roma
A large number of compounds have been reported to exhibite endocrine modulating
activity. These include chemicals such as Bisphenol-A (BPA), a man-made
contaminant, extensively used for human-manufactured products [1]. Recently, from
60 to 90% BPA-contamined fish has been found along South-Italian coasts,
demonstrating increasing impact of this contaminant in the marine environment [2].
Gilthead seabream (Sparus aurata L) is one of the most important commercial
species for Mediterranean aquaculture and one of the marine species more frequently
used as bioindicator of endocrine disruption [3]. This study aimed to relate the
effects of BPA-enriched diet to catalase (CAT), CYP1A-dependent 7-
ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) and glutathione S-transferase (GST) activities
in seabream juveniles. Vitellogenin (Vtg) and Zona radiata protein (Zrp) expressions
were measured as endocrine biomarkers of exposure [4]. Eight groups 8-10g/bw
seabream juveniles (n=20) were reared for 21 days under laboratory condition in 200
l tanks, at 18°C, 10L/14D photoperiod. Two groups were kept as control (C) and
solvent control (CSP). Experimental groups were fed on commercial diet enriched
with increasing concentrations of BPA (BPA1:5 mg/g/day, BPA2: 50 mg/g and
BPA3: 100 mg/g). At the end of the exposure, liver was immediately frozen for
enzymatic activities and mRNA extraction. Liver weight was recorded for
hepatosomatic index (HSI). EROD activity was measured in microsome suspension
recording the increase in fluorescence for the resorufin formation; GST activity in
the cytosolic fraction was analyzed to spectrophotometer, following the formation of
s-2,4-dinitro phenyl glutathione, at 340 nm; CAT was spectrophotometrically
assayed at 240 nm, by consumption of H2O2. VTG e Zrp gene expression was
evaluated by Q-RT-PCR by using Sybergreen method. More than 50% BPA3
exposed juveniles died after two week exposure and only two groups (BPA1 and
BPA2) were available for analyses at the end of the trials. Significant increase of
HSI, Zrp and Vtg expression was observed in both BPA1 and BPA2 (p<0,05) with
significantly higher levels of both biomarkers in BPA1. EROD and CAT activities
were significantly (p<0,001) inhibited in BPA1 and BPA2.
112 | P O S T E R
In conclusion the results here obtained clearly showed that the selected biomarkers
will be useful for monitoring the presence of Bisphenol-A on marine environment as
well as on commercial diet widely employed on aquaculture practice.
Progetto F-2009-1536185, finanziato dal Ministero della Salute.
Bibliografia
[1] Vandenberg L. N., Maffini M. V., Sonnenschein C., Rubin B. S., Soto A. M. Bisphenol-A and the
Great Divide: A Review of Controversies in the Field of Endocrine Disruption. Endocrine
Reviews (2009) 30(1):75–95.
[2] Mita L., Bianco M., Viggiano E., Zollo F., Bencivenga U., Sica V., Monaco G., Portaccio M.,
Diano N., Colonna A., Lepore M., Canciglia P., Mita D.G. Bisphenol A content in fish caught in
two different sites of the Tyrrhenian Sea (Italy). Chemosphere (2011), 82: 405–410.
[3] Teles M., Pacheco M., Santos M. A. Sparus aurata L. liver EROD and GST activities, plasma
cortisol, lactate, glucose and erythrocytic nuclear anomalies following short-term exposure either
to 17h-estradiol (E2) or E2 combined with 4-nonylphenol. Science of the Total Environment
(2005) 336: 57– 69.
[4] Arukwe, A., Goksory, A. Eggshell and egg yolk proteins in fish: hepatic proteins for the next
generation: oogenetic, population, and evolutionary implications of endocrine disruption. Review.
Comparative Hepatology (2003) 2:4 http://www.comparative-hepatology.com/content/2/1/4
Corresponding author: Traversi Ilaria, Dipartimento di Scienze della Terra,
dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi di Genova, viale Benedetto XV
5,16132 Genova tel 0103538046 – 3202622463 e-mail [email protected]
P O S T E R P a g . | 113
K:D-Rib un inibitore della proliferazione delle cellule tumorali ed un
promotore del folding di DNAzima.
L.Bruni1,2,3
S.Croci1,2
1. Dipartimento di Neuroscienze - Unità di Biofisica e Fisica Medica - Università di Parma
2. INBB Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi - ROMA
3. Fondazione Valsè Pantellini
Le cellule tumorali mostrano un aumento della glicolisi anche in presenza d’ossigeno
disponibile. Questo processo chiamato “Effetto Warburg” è uno dei fondamentali
switch metabolici che una cellula cancerosa manifesta se paragonata ad una cellula
non cancerosa. Tra i trasportatori del glucosio c’è la famiglia SGLT (cotrasportatore
Na+/glucosio). L’elevata concentrazione totale di sodio in lesioni mammarie tumorali
misurata con 23
Na-MRI sembra essere un indicatore del livello cellulare di malignità
[1].
Il ruolo del D-ribosio e dello ione potassio (K+) sono ampiamente noti: il D-ribosio è
un aldopentoso, assiste il metabolismo energetico della cellula oltre ad esser un
precursore d’alcuni aminoacidi; lo ione K+ è coinvolto in molti processi tra cui
apoptosi, genesi e mantenimento del potenziale di membrana e stabilizza il folding
dei G-quadruplex. C'è un interesse crescente nell’utilizzo di G-quadruplex anche
come sensori per lo ione K+ [2].
Per saggiare l’effetto del K:D-Rib sulla proliferazione delle linee cellulari non si
sono potuti utilizzare i comuni saggi metabolici (MTT assay, WST-1 assay ecc) in
quanto K:D-Rib interagisce con il bromuro di tetrazolio riducendolo a formazan [3].
Ci siamo perciò avvalsi di un metodo d’uso comune: le cellule (4000 cell/ml trattate
con K:D-Rib 5mM e incubate per 12 gg) sono state contate utilizzando il programma
ImageJ ed in seguito si è calcolato il tempo di duplicazione. Il controllo ha mostrato
un tempo di duplicazione di 44 ore, mentre il trattato di 59 ore. L’effetto rilevato è un
progressivo rallentamento della proliferazione cellulare del trattato rispetto al
controllo.
Il saggio delle colonie, nel quale si contano gruppi cellulari di almeno 50
unità, ha confermato i risultati delle curve di crescita, mostrando ancora una volta un
effetto antiproliferativo del K:D-Rib sia sulla linea HTB-126 [3] che HTB-30
(metastasi pleurica di carcinoma mammario). Quest’ultima linea cellulare ha
mostrato 15 colonie per il controllo e nessuna colonia per i trattati. Questi dati
sperimentali unitamente ad una ricca bibliografia sui canali K+ [2] e sul ruolo stesso
del K+ ci hanno portato a ipotizzare che una fine regolazione della concentrazione di
K+ stia alla base del “corretto funzionamento” delle cellule. Da qui l’esigenza di
114 | P O S T E R
valutare se K+
entri o no nelle cellule in seguito al trattamento con K:D-Rib. La
concentrazione di K+ è stata misurata sfruttando la formazione di una macromolecola
chiamata DNAzima [4]. Dalla concentrazione di DNAzima si è in grado, attraverso
spettroscopia UV-VIS, di misurare se lo ione K+ è presente nella soluzione.
Abbiamo quindi verificato la formazione di questa molecola in presenza di K:D-Rib
5mM. Il DNAzima così formato può essere utilizzato come biosensore per la misura
della concentrazione del K+ nel mezzo cellulare, prima e dopo il trattamento.
Risultati preliminari sembrano indicare che il surnatante delle HTB-126 trattate con
K:D-Rib 5mM per 48h mostrano una concentrazione di DNAzima inferiore rispetto
al DMEM (terreno di coltura delle cellule) con K:D-Rib 5mM, ma superiore al solo
DMEM ed al surnatante del controllo (HTB-126 non trattate). Possiamo dire che una
parte di K+
entri all’interno della cellula e che il DNAzima possa essere utilizzato
come biosensore di K+.
Bibliografia:
[1] Ronald Ouwerkerk, Michael A. Jacobs , Katarzyna J. Macura, Antonio C. Wolff, Vered Stearn,
Sarah D. Mezban, Nagi F. Khouri, David A. Bluemke, Paul A. Bottomley Elevated tissue sodium
concentration in malignant breast lesions detected with non-invasive 23Na MRI. Breast Cancer Res
Treat (2007) 106:151–160.
[2] Zhiguo Wang Roles of K+ channels in regulating tumour cell proliferation and apoptosis. Eur J
Physiol (2004) 448: 274–28:
[3] S. Croci, L. Bruni, S. Bussolati, M. Castaldo, M. Dondi Potassium bicarbonate and D-ribose
effects on A72 canine and HTB-126 human cancer cell line proliferation in vitro. Cancer Cell
International (2011) vol. 11 11-30.
[4] Travascio P, Li Y, Sen D.. DNA-enhanced peroxidase activity of a DNA-aptamer-hemin complex.
Chem Biol (1998) 5:5 05–517.
P O S T E R P a g . | 115
Contenuto e mappa di distribuzione del magnesio intracellulare in
cellule farmaco-resistenti e -sensibili
Emil Malucelli,1,5
, Stefano Lagomarsino2, Lucia Merolle
1, Chiara Marraccini
3,
Azzurra Sargenti1, Concettina Cappadone
1, Giovanna Farruggia
1,5, Alessia Cedola
4,
Michela Fratini4, Andrea Notargiacomo
4, Marco Lombardo
6, Claudio Trombini
6,
7Alessandra Gianoncelli, Stefano Iotti
1,5.
1Dipartimento Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;
2Istituto per i Processi Chimico-
Fisici, c/o Dipartimento di Fisica, Università la Sapienza, Roma, 3Dipartimento di Scienze della Vita,
Università di Modena e Reggio Emilia; 4Istituto di Fotonica e Nanotecnologie - CNR, Roma;
5Istituto
Nazionale Biostrutture e Biosistemi; 6Dipartimento di Chimica, Università di Bologna;
ELETTRA -
Sincrotrone Trieste S.c.p.A., Basovizza Trieste
Introduzione
Il magnesio nelle cellule gioca un ruolo importante sia strutturale che di regolazione.
Nonostante la copiosa mole di dati che si possono trovare sulla biochimica del
magnesio, la fotografia della sua distribuzione e la comprensione della sua omeostasi
sono ancora incomplete sia per limitazioni strumentali che per difficoltà concettuali.
I recenti sforzi nell’applicazione di nuove tecniche di imaging nel campo della
ricerca sul magnesio non hanno permesso ancora l'accurata mappatura édella
distribuzione e del contenuto intracellulare di questo ione perché l'acquisizione di
informazioni dettagliate su processi intracellulari richiede una elevata risoluzione
spaziale, dati quantitativi e informazioni chimiche.
Per riuscire a soddisfare tutti questi requisiti, abbiamo dimostrato in un recente
articolo [1] che è possibile unire informazioni sulla composizione degli elementi
chimici, utilizzando X-Ray Fluorescence Microscopy (XRFM) e sulla morfologia
cellulare, tramite Atomic Force Microscopy (AFM). Combinando queste due
tecniche è possibile quantificare la concentrazione di qualsiasi elemento. Grazie ai
recenti miglioramenti delle sorgenti di raggi X dei sincrotroni di terza generazione e
al miglioramento delle ottiche di focalizzazione, la XRFM rappresenta la tecnica
ideale per effettuare questo tipo di misure. In particolare, la XRFM è un metodo con
elevata sensibilità per mappare la distribuzione di elementi all’interno delle cellule
come Carbonio, Azoto, Ossigeno, Sodio e Magnesio in una singola acquisizione.
Obiettivo
Lo scopo di questo studio è confrontare il contenuto e la distribuzione di Magnesio in
linee cellulari tumorali chemio-resistenti e -sensibili fissate chimicamente. Il modello
sperimentale utilizzato è una linea cellulare umana di carcinoma del colon (LoVo)
sensibili e resistenti alla doxorubicina, uno dei farmaci maggiormente utilizzato nella
terapia di tumori solidi.
Metodi
XRFM può mappare il contenuto degli elementi ma non la concentrazione, che è la
variabile rilevante nel contesto biologico. Abbiamo affrontato questo problema
116 | P O S T E R
combinando XRFM (risoluzione spaziale 0.5x0.5 micrometri) con la AFM
(risoluzione spaziale 0.12x0.12 micrometri) che consente di misurare lo spessore
della cellula analizzata. Questa combinazione di tecniche ha richiesto
l'implementazione di un nostro algoritmo di "multimodal fusion" che consente di
allineare immagini ottenute con tecniche e risoluzioni spaziali diverse. Questo nuovo
approccio sperimentale offre il vantaggio di combinare le informazioni sul contenuto
degli elementi con informazioni morfologiche di una singola cellula entrambe con
risoluzione spaziale sub-micrometrica.
Risultati
Utilizzando questo approccio abbiamo determinato:
i) Nella cellule farmaco resistenti analizzate, il contenuto (espresso in frazione
in peso) di magnesio è maggiore che nelle cellule sensibili. In particolare
nelle cellule resistenti abbiamo ottenuto un valore di magnesio oltre 5 volte
superiore rispetto alla sensibile in una ROI (8x8 mm) posizionata in
corrispondenza del nucleo.
ii) La mappa di magnesio intracellulare mostra una marcata differenza nel
pattern di distribuzione tra le cellule farmaco-resistenti e -sensibili.
Conclusioni
I risultati di questo lavoro confermano anche in cellule doxorubicina resistenti un
maggiore contenuto di magnesio intracellulare rispetto alle sensibili come
recentemente osservato con assorbimento atomico in una linea cellulare cis-platino
resistente [2]. Inoltre la diversa distribuzione riscontrata fornisce una ulteriore
evidenza del ruolo del magnesio nella genesi del fenotipo della farmaco-resistenza.
Riteniamo quindi che questa metodologia di analisi possa diventare un sistema di
riferimento non solo per la misura del Magnesio, ma anche per altri elementi leggeri.
Inoltre rappresenta un prezioso strumento per un’accurata mappatura di diversi
elementi intracellulari sia in condizioni patologiche che normali.
Bibliografia 1. Lagomarsino S., Iotti S., Farruggia G., Cedola A., Trapani V., Fratini M., Bukreeva I.,
Notargiacomo A., Mastrototaro L., Marraccini C., Sorrentino A., McNulty I., Vogt S., Legnini
D., Kim S., Giagnoncelli A. Maier J.A.M, Wolf. F.I. Intracellular concentration map of
magnesium in whole cells by combined use of X-ray fluorescence microscopy and atomic force
microscopy. Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 66 (11–12), 834–840, 2011
2. Marverti G., Ligabue A., Montanari M., Guerrieri D., Cusumano M., Di Pietro M.L., Troiano L.,
Di Vono E., Iotti S., Farruggia G., Wolf F.I., Monti M.G., Frassineti C. Characterization of the
cell growth inhibitory effects of a novel DNA-intercalating bipyridyl-thiourea-Pt(II) complex in
cisplatin-sensitive and-resistant human ovarian cancer cells. Invest New Drugs, 29(1), 73-86,
2011.
Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e
Biotecnologie, Via S. Donato 19/2, 40127 Bologna, tel. 051 2095625, e-mail
P O S T E R P a g . | 117
Modificazioni del contenuto intracellulare di magnesio durante
l’apoptosi mitocondrio-mediata: studi degli eventi precoci correlati
al potenziale mitocondriale
1Lucia Merolle,
1Concettina Cappadone,
1,2Giovanna Farruggia,
3Chiara
Marraccini, 1Azzurra Sargenti,
4Alessia Colanardi,
1,2Stefano Iotti
1Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;
2 Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi,
3Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio Emilia;
4Istituto di Farmacologia Traslazionale- CNR L'Aquila.
L’apoptosi non solo è un processo geneticamente controllato per il mantenimento
dell’omeostasi tissutale, ma è uno degli effetti antineoplastici indotti da molti agenti
chemioterapici. Diversi cationi sono coinvolti nei processi apoptotici, e la maggiore
enfasi è stata posta sul ruolo giocato dagli ioni calcio, considerato un importante
secondo messaggero intracellulare. Più recentemente l’attenzione si e' focalizzata nel
coinvolgimento del magnesio nei processi apoptotici, anche se la letteratura
sull'argomento è tuttora piuttosto scarsa e spesso presenta risultati contraddittori.
Uno studio recente ha evidenziato l’attività antitumorale di un nuovo derivato
indolico, MM67, che è in grado di attivare l’apoptosi mitocondrio-mediata e di
determinareun calo del contenuto intracellulare di magnesio in cellule di
adenocarcinoma umano del colon, HT-29 [1]. Le cellule trattate con questo agente
proapoptotico mostrano un arresto nella fase G2/M del ciclo cellulare, un aumento
significativo dell’espressione di Bax, la depolarizzazione della membrana
mitocondriale e un netto rilascio di citocromo c dal compartimento mitocondriale
[2]. Il mitocondrio è l’organello di stoccaggio del magnesio intracellulare [3], e
l’osservazione che nell’apoptosi indotta da MM67 si osserva una diminuzione dello
ione ci ha fatto ipotizzare che il magnesio sia coinvolto nella via intrinseca di
induzione di apoptosi.
Scopo di questo lavoro è stato quello di seguire le variazioni temporali del magnesio,
sia libero che totale, durante l’apoptosi indotta da MM67 e di valutarne la
correlazione con le variazioni del potenziale mitocondriale (Δ m). Tutte le analisi
sono state effettuate in citofluorimetria: il potenziale mitocondriale è stato valutato
mediante la marcatura delle cellule con la sonda mitocondriale DiOC6(3), mentre il
magnesio libero è stato determinato mediante marcatura con la sonda commerciale
MagFluo4-AM [4] e il magnesio totale mediante marcatura con la sonda non
commerciale di recente sintesi DCHQ5 [5].
Nei primi trenta minuti dopo il trattamento si è riscontrato un aumento del Δ m,
seguito da una marcata depolarizzazione nelle successive 48 ore. Il magnesio libero
118 | P O S T E R
intracellulare ha mostrato un andamento parallelo, con un incremento nella prima
mezzora, seguito da una diminuzione nelle ore successive. Il magnesio totale invece
decresceva fino dai primi minuti.
Possiamo quindi concludere che l’apoptosi indotta da MM67 è caratterizzata da una
diretta correlazione tra il ΔΨm e il magnesio libero intracellulare, in accordo con
quanto riportato in letteratura [3]. I nostri dati inoltre confermano che i due pool
cellulari di magnesio, quello libero e quello totale hanno ruoli diversi e meccanismi
indipendenti di regolazione.
Questo rappresenta uno studio preliminare perché rimane da chiarire se questi
movimenti del magnesio che seguono il trattamento con MM67 siano un
epifenomeno o se siano coinvolti nei meccanismi della cascata apoptotica
mitocondrio-mediata.
Bibliografia 1. Cappadone C, Merolle L, Marraccini C, Farruggia G, Sargenti A, Locatelli A, Morigi R, Iotti S.,
Intracellular magnesium content decreases during mitochondria-mediated apoptosis induced by a
new indole-derivative in human colon cancer cells (2012) Magnes. Res. 25(3):104-11.
2. Andreani A, Granaiola M, Locatelli A, Morigi R, Rambaldi M, Varoli L, Calonghi N, Cappadone
C, Farruggia G, Stefanelli C, Masotti L, Nguyen TL, Hamel E, Shoemaker RH, Substituted 3-(5-
imidazo[2,1-b]thiazolylmethylene)-2-indolinones and analogues: synthesis, cytotoxic activity, and
study of the mechanism of action (2012) Med Chem; 55:2078-88.
3. Kubota T, Shindo Y, Tokuno K, Komatsu H, Ogawa H, Kudo S, Kitamura Y, Suzuki K, Oka K.
Mitochondria are intracellular magnesium stores: investigation by simultaneous fluorescent
imagings in PC12 cells (2005) Bioch. et Biophys. Acta 1744 19–2 .
4. Lee S, Lee HG, Kang SH. Real-time observations of intracellular Mg2+
signaling and waves in a
single living ventricular myocyte cell (2009) Anal Chem.,812:538-42.
5. Farruggia G, Iotti S, Lombardo M, Marraccini C, Petruzziello D, Prodi L, Sgarzi M, Trombini C,
Zaccheroni N. Microwave assisted synthesis of a small library of substituted N,N'-bis((8-hydroxy-
7-quinolinyl)methyl)-1,10-diaza-18-crown-6 ethers (2010) J.Org.Chem.,75,6275-6278
Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e
Biotecnologie, via S. Donato 19/2, 40127 Bologna, tel. 0512095625, e-mail
P O S T E R P a g . | 119
Valutazione dell’efflusso di magnesio indotto da cAMP in cellule
HL60 mediante un nuovo chemosensore fluorescente derivato dall’8-
idrossichinolina
1Marraccini Chiara,
2Sargenti Azzurra,
2Merolle Lucia,
2Cappadone Concettina,
2,3Giovanna Farruggia,
2,3Stefano Iotti.
1Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio Emilia;
2Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;
3Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi.
L’omeostasi del magnesio intracellulare è attivamente oggetto di studio, poiché è
noto l’importante ruolo che questo ione ricopre nelle funzioni cellulari. Molti studi
hanno evidenziato che stimoli metabolici o ormonali possono indurre flussi di
magnesio attraverso la membrana plasmatica in brevi intervalli di tempo. Questi
flussi sono caratterizzati da piccole variazioni del magnesio libero intracellulare ed
elevate variazioni del magnesio totale. In particolare, è stato riportato che la
stimolazione con AMP ciclico (cAMP) provoca una variazione del magnesio totale
entro 10 minuti dal trattamento in cardiomiociti, suggerendo che questo stimolo
induca un efflusso di magnesio nelle cellule eccitabili [1]. In questo studio abbiamo
voluto verificare se altri tipi di cellule manifestino un'analoga risposta al trattamento
con cAMP. A questo scopo abbiamo come modello la linea leucemica promielocitica
umana HL60, cellule non eccitabili ma altamente proliferanti. Per valutare le
variazioni del magnesio totale abbiamo utilizzato la sonda fluorescente DCHQ5,
derivato fenilico della famiglia di sonde basate su un estere azacrown coniugato con
due 8-idrossichinoline. Questa sonda ha una kd per il magnesio nell’ordine
micromolare e pertanto è adatta alla determinazione del magnesio totale
intracellulare; inoltre è molto ritenuta all’interno delle cellule e la fluorescenza
intracellulare è stabile per piu’ di 30 minuti [2].
Il magnesio intracellulare è stato valutato mediante un saggio fluorimetrico,
marcando le cellule con la sonda alla concentrazione 15 microM. Le cellule sono
state trattate con il sale butirrico del cAMP a diverse concentrazioni, comprese tra
0,6 e 2 mM, e la fluorescenza è stata seguita per 10 minuti dopo la stimolazione. In
tutti i casi si è verificata una diminuzione della fluorescenza entro i primi tre minuti
dallo stimolo, diminuzione che poi è proseguita in modo molto più moderato nei
minuti successivi. L’analisi quantitativa rivela che circa il 10% del magnesio viene
estruso, confermando che cAMP induce un efflusso di magnesio anche in questo tipo
di cellule. Abbiamo inoltre verificato, con un saggio citofluorimetrico con Propidio
Ioduro che la diminuzione della fluorescenza non è imputabile a fenomeni aspecifici
che inducono una permeabilizzazione membrana plasmatica.
Inoltre, mediante la marcatura delle cellule sonde commerciali e analisi
120 | P O S T E R
citofluorimetriche, abbiamo confermato che anche in questo modello cellulare la
stimolazione con cAMP non comporta una variazione della frazione libera ionizzata
[3] mentre induce una iperpolarizzazione del mitocondrio, come riportato in
letteratura [4].
In conclusione abbiamo dimostrato che la stimolazione con cAMP correla con
l’efflusso extracellulare di magnesio anche in cellule proliferanti. Questo fornisce
ulteriori evidenze all’ipotesi che il magnesio possa considerarsi un secondo
messaggero intracellulare. Infine queste misure hanno confermato che la DCHQ5 è
uno strumento di analisi estremamente utile per lo studio dell’omeostasi del
magnesio, e che può essere utilizzata sia per la determinazione quantitativa del
magnesio cellulare che per monitorare i flussi di questo ione.
Bibliografia
1. Romani A, Dowell E, Scarpa A. Hormonal stimulation of Mg2+ uptake in hepatocytes.
Regulation by plasma membrane and intracellular organelles (1991), J Biol Chem, 266:24376-
24384;
2. Marraccini C, Farruggia G, Lombardo M, Prodi L, Sgarzi M, Trapani V, Trombini C, Zaccheroni
N, Wolf F.I, Iotti S. Diaza-18-crown-6 hydroxyquinoline derivatives as flexible tools for the
assessment and imaging of total intracellular magnesium (2012), Chemical Science, 3, 727-734
3. Romani AM. Cellular magnesium homeostasis. (2011), Arch. Biochem. Biophys., 512:1-23.
4. Zungu IL, Hawkins Evans D, Abrahamse H. Mitochondrial responses of normal and injured
human skin fibroblasts following low level laser irradiation-an in vitro study (2009),
Photochem. Photobiol., 85(4):987-996;
5. Li FY, Chaigne-Delalande B, Kanellopoulou C, Davis JC, Matthews HF, Douek DC, Cohen JI,
Uzel G, Su HC, Lenardo MJ. Second messenger role for Mg2+ revealed by human T-cell
immunodeficiency (2011), Nature, 475(7357):471-6.
Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e
Biotecnologie, Via S. Donato 19/2, 40127 Bologna, tel. 051 2095625, e-mail
P O S T E R P a g . | 121
Nuove prospettive nella determinazione del magnesio intracellulare
1Sargenti Azzurra,
1Merolle Lucia ,
1Malucelli Emil,
2Andreani Giulia,
1Cappadone
Concettina, 1,4
Farruggia Giovanna, 1,4
Iotti Stefano, 3Marraccini Chiara,
4Trombini
Claudio, 4Lombardo Marco.
1Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;
2Dipartimento di Scienze Mediche
Veterinarie, Università di Bologna; 3Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e
Reggio Emilia; 4
Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi, 4Dipartimento di Chimica, Università di
Bologna.
Il magnesio è essenziale per moltissimi processi biologici, ma la sua omeostasi
cellulare non è ancora stata completamente chiarita. In particolare è noto che il
magnesio libero ionizzato e quello totale sono sottoposti a meccanismi di regolazione
diversi e indipendenti tra loro: risulta quindi cruciale potere discriminare tra le due
frazioni. Mentre per il magnesio libero ionizzato sono disponibili molte sonde
fluorescenti, non esistono sonde commerciali in grado di valutare il magnesio totale.
Pertanto è di notevole interesse una nuova famiglia di sonde ottenuta coniugando ad
un etere corona due residui di 8-idrossichinolina (DCHQ) diversamente sostituita.
Queste sonde mostrano una notevole affinità e specificità per il magnesio [1]. In
particolare, la sonda capostipite (DCHQ1) ha permesso di visualizzare la
distribuzione intracellulare del magnesio in cellule vitali e di determinare, con un
saggio spettrofluorimetrico, il contenuto di magnesio in campioni cellulari. I dati
sono sovrapponibili a quelli ottenuti mediante spettrometria di assorbimento atomico
(AAS). Rispetto a questa tecnica, il dosaggio effettuato mediante questa sonda
presenta l’indubbio vantaggio di richiedere campioni molto più ridotti (di almeno
dieci volte), e l'utilizzo di strumentazioni di più larga diffusione e con minori
problematiche riguardanti la sicurezza [2].
Tuttavia, la sonda DCHQ1 ha mostrato alcune limitazioni di utilizzo, come una bassa
ritenzione intracellulare e un parziale "fotobleaching". Inoltre è eccitabile solo
nell’UV, limitandone l'uso in citofluorimetria o in microscopia confocale.
Un nuovo derivato fenilico, DCHQ5, mostra invece caratteristiche molto più
interssanti: è altamente ritenuta nelle cellule, il complesso con il magnesio è
altamente fluorescente, è molto stabile e può essere eccitato anche nel visibile [3].
Lo scopo di questo lavoro è quindi stato quello di valutare l’applicabilità della
DCHQ5 alla determinazione del magnesio totale intracellulare attraverso saggi
citofluorimetrici e spettrofluorimetrici.
Il modello cellulare utilizzato sono cellule leucemiche umane HL60, una leucemia
promielocitica che può essere indotta a differenziare con dimetilsolfossido (DMSO).
Questo trattamento induce già dopo 3 giorni il blocco proliferativo delle cellule in
fase G0/G1 e parallelamente il dimezzamento del magnesio totale, che passa da una
media di 25 nmoli/106 cell a circa 12 nmoli/10
6 cell [2].
122 | P O S T E R
L’analisi citofluorimetrica effettuata utilizzando la sonda DCHQ5 sia eccitando
nell’UV che nel visibile evidenzia che l’intensità di fluorescenza nelle cellule
differenziate è circa dimezzata rispetto alle cellule proliferanti, come mostrato nella
tabella I che riporta i dati di un tipico esperimento.
Dato che l’analisi citofluorimetrica fornisce solo un dato semiquantitativo, abbiamo
valutato la capacita' analitica di questa sonda ad un classico saggio di tipo
fluorimetrico, utilizzando campioni di cellule lisate per sonicazione. I risultati
ottenuti hanno mostrato un’ottima sovrapponibilità con i quelli ottenuti sugli stessi
campioni in AAS, come riportato nella tabella II.
Possiamo quindi concludere che la sonda DCHQ5 risulta un ottimo chemosensore
per la determinazione sia quantitativa che qualitativa del magnesio intracellulare,
ampliando l'applicabilità di questa famiglia di sonde a sistemi biologici.
Bibliografia 1] Farruggia G., Iotti S., Prodi L., Montalti M., Zaccheroni N., Savage P.B., Trapani V., Sale P., Wolf
F.I. 8-hydroxyquinoline derivatives as fluorescent sensors for magnesium in living cells. Journal of
the American Chemical Society 128, 344-50, 2006
2] Farruggia G., Iotti S., Prodi L., Zaccheroni N., Montalti M., Savage P., Andreani G., Trapani V.,
Wolf F.I., Hydroxyquinoline derivatives as Fluorescent Probes to Measure Intracellular Magnesium:
Insight into Characteristics and Biological Applications, Journal of Fluorescence, 19, 11–19, 2009
3] Marraccini C., Farruggia G., Lombardo M., Prodi L., Sgarzi M., Trapani V., Trombini C.,
Zaccheroni N., Wolf F.I., Iotti S. Diaza-18-crown-6 hydroxyquinoline derivatives as flexible tools for
the assessment and imaging of total intracellular magnesium. Chemical Science, 3, 727-734, 2012
Tab. II Quantificazione del magnesio intracellulare in diversi
campioni di cellule, utilizzando il saggio fluorimetrico con la sonda
DCHQ5 e la determinazione mediante AAS
Campione DCHQ5
Mg (nmol/106 cells)
AAS
Mg (nmol/106 cells)
HL60 121p 19,75 ± 0,76 22,78 ± 0,38
HL60 124p 22,93 ± 1,30 20,70 ± 0,61
HL60 128p 23,77 ± 1,14 24,70 ± 0,89
HT29 67p 24,31 ± 1,13 23,94 ± 0,89
HT29 69p 23,96 ± 0,37 21,17 ± 0,71
Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e
Biotecnologie, Via S. Donato 19/2, 40127 Bologna, tel. 051 2095625, e-mail
Tab.I. Canale medio della distribuzione di fluorescenza di cellule
marcate con DCHQ5 5 µM
Eccitazione 360 nm Eccitazione 488 nm
HL60 proliferanti 94 83
HL60 differenziate 45 43
P O S T E R P a g . | 123
La carenza di magnesio inibisce la progressione del ciclo cellulare in
cellule di osteosarcoma umano
1Cappadone Concettina,
1,2Farruggia Giovanna,
1Merolle Lucia,
3Marraccini
Chiara , 1Sargenti Azzurra,
1,2Malucelli Emil,
1,2Iotti Stefano
1Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie, Università di Bologna;
2 Istituto Nazionale di Biostrutture e Biosistemi;
3 Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio;
Vi sono molte evidenze che suggeriscono una correlazione tra la disponibilità di
magnesio e la proliferazione cellulare e, in particolare, è stato ampiamente
dimostrato che la carenza di questo ione inibisce la proliferazione in molte linee
cellulari di diversa origine, normali e trasformate [1]. Tuttavia, i meccanismi
molecolari che sottendono a questo fenomeno non sono ancora stati ben chiariti. In
questo lavoro abbiamo quindi studiato l’effetto della carenza di magnesio sulla
proliferazione e sull’espressione di alcune proteine coinvolte nella progressione del
ciclo cellulare in cellule di osteosarcoma umano SaOs-2 e U2OS.
Le cellule sono coltivate per 24 ore in terreno privo di magnesio e contenente lo
0,5% di siero fetale bovino (FBS) deprivato dello ione. Questo trattamento ha
sincronizzato le cellule nella fase G0/G1 e ha ridotto il contenuto di magnesio
intracellulare. Le cellule sono state quindi coltivate in terreno contenente il 5% di
FBS e in presenza o in assenza di MgCl2 1 mM per 24 ore. Sebbene sia riportato che
le cellule tumorali sono meno sensibili alla deprivazione di magnesio [2], la presenza
dello ione nel terreno di coltura ha incrementato notevolmente la proliferazione delle
cellule di osteosarcoma rispetto alle cellule deprivate. L’analisi del ciclo cellulare
mediante citofluorimetria a flusso, indica che le cellule deprivate sono bloccate in
G0/G1 anche dopo l’aggiunta di FCS, mentre nelle cellule coltivate in terreno
completo di magnesio si osserva un netto aumento delle cellule in fase S e in fase
G2/M.
A livello della transizione G1/S le attività delle chinasi ciclino-dipendenti sono
regolate positivamente dal legame con le loro cicline e negativamente dagli inibitori
CKI. Abbiamo quindi investigato l'espressione della proteina p21 e del suo attivatore
trascrizionale p53.
Dopo l'aggiunta di siero, le cellule coltivate in assenza di magnesio presentano un
netto calo del contenuto di questo ione, mentre non presentano variazioni
significative di p21 e p53 rispetto alle cellule in terreno contenente MgCl2. Alla luce
dei risultati ottenuti, si può concludere che l'arresto proliferativo dipende dalla
riduzione del contenuto di magnesio, ma è p53 indipendente. Studi futuri saranno
indirizzati a chiarire i meccanismi e i bersagli molecolari responsabili di questo
blocco.
124 | P O S T E R
Bibiliografia
1. Ikari A, Sawada H, Sanada A, Tonegawa C, Yamazaki Y, Sugatani J. Magnesium deficiency
suppresses cell cycle progression mediated by increase in transcriptional activity of p21(Cip1)
and p27(Kip1) in renal epithelial NRK-52E cells. J. Cell. Biochem. 2011 :112(12):3563-72
2. Wolf F., Trapani V. Cell (patho)physiology of magnesium. Clin. Sci. 2008: 114(1):27-35
Corresponding author: Giovanna Farruggia, Dipartimento di Farmacia e
Biotecnologie, Via S. Donato 19/2, tel 051 2095626, e mail
P O S T E R P a g . | 125
Cadmium contamination and sense of smell in Danio rerio
Motta C.M., Miccoli G., Simoniello P.*, Panzuto R.
Department of Biological Sciences, University of Naples Federico II, Naples, Italy
* GSI Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung, Darmstadt, Germany
Olfactory lamellae, due to their position, are an easy target for several
environmental toxicants including heavy metals. Injury at this level may constitute a
serious threaten to the animal survival since may impair the search for food and the
escape from predators.
In this study, we evaluated the impact of an acute cadmium treatment on the
olfactory response in adult Danio rerio. Animals were contaminated whit 50μM
CdCl2 for 72 hours or, alternatively, contaminated for 72 hours and allowed to
recover for 7 days in uncontaminated water. At the end of treatments the effects on
behavioral responses were studied by exposing the animals to an odor discrimination
tests, in a labyrinth thank. Morphological analyses of the lamellae were also carried
out by conventional light microscopy techniques.
Behavioral tests demonstrated that Cd treatment causes a partial anosmia,
accompanied by an apparent loss in learning and memory abilities. In the olfactory
lamellae marked alterations are induced together with apoptosis. These effects,
however, are temporary: a short period in non-contaminated water is sufficient to
restore almost completely all the olfactory abilities and lamellar morphology.
I N D I C E A N A L I T I C O | 127
A
Abbruzzetti Stefania ............................... 65; 69
Aiello Stefania ............................ 55; 75; 77; 82
Alinovi Rossella ................................. 104; 107
Anagnostou Paolo ........................................ 51
Andreani Giulia .......................................... 121
Antolini R. .................................................... 85
Asaro Anna .................................................. 82
Atzeri Angela ......................................... 70; 86
B
Banda Iris ................................................... 101
Baraldi Andrea ............................................. 43
Baroni Fabio ................................................. 60
Baruffi Silvana ....................................... 35; 38
Bergamonti L. .............................................. 93
Bianchini Paolo ............................................ 65
Bisceglie Franco ......................................... 104
Boano Rosa ............................................ 43; 96
Boattini Alessio ............................................ 49
Bocchi Leonardo .......................................... 90
Bonafé Francesca ......................................... 90
Bridelli Maria Grazia ................................... 43
Bruni L. ...................................................... 113
Buschini Annamaria ................................... 104
C
Cabboi Barbara............................................. 86
Cacciani Francesca ................................. 29; 32
Caldarera Claudio Marcello ......................... 90
Callegari Sergio ...................................... 35; 38
Capocasa Marco ........................................... 51
Cappadone Concettina115; 117; 119; 121; 123
Caramell Davidi ........................................... 50
Carbognani Paolo ....................................... 101
Carletti E. ..................................................... 85
Carnevali Luca ....................................... 35; 38
Carnevali Oliana................................. 109; 111
Casalini Angelo .......................................... 101
Cataldo Angelo............................................. 77
Cavalli Stefano ............................................. 90
Cavazzini Davide ......................................... 60
Cedola Alessia ............................................ 115
Cella Zanacchi Francesca ............................ 65
Cerasola Dario ............................................. 77
Cocchi Massimo .......................................... 19
Colanari Alessia......................................... 117
Congiu Alessandra....................................... 51
Corradi Domenico ................................. 35; 38
Corradi Massimo ....................................... 101
Croci S. ...................................................... 113
D
Dallatana Davide ....................................... 107
De Donatis Mauro ....................................... 67
De Iasio Sergio ............................................ 96
Deiana Monica............................................. 86
Dessì M. Assunta ................................... 70; 86
Destro Bisol Giovanni ................................. 51
Di Majo Danila ................................ 77; 80; 82
Diaspro Alberto ........................................... 65
F
Fagiano Marcello ......................................... 96
Faillace Giudo ............................................. 82
Farruggia Giovanna ... 115; 117; 119; 121; 123
Fiumana Emanuela ...................................... 90
Fogassi Leonardo......................................... 13
Foss C. ......................................................... 85
Franzoni Lorella .......................................... 60
Frati Caterina ............................................... 90
Fratini Michela .......................................... 115
G
Gabrielli Fabio ............................................. 19
Gallone Salvatore ........................................ 22
Gambetta Eugenia ..................................... 109
Gärtner Wolfgang ...................... 57; 65; 69; 99
Giacco Elisabetta ......................................... 62
Giammanco Giulia ....................................... 80
Giammanco Marco .............. 55; 75; 77; 80; 82
Gianoncelli Alessandra .............................. 115
Gioacchini Giorgia .................................... 111
Girotti Marilena ........................................... 96
Goldoni Matteo .................................. 101; 107
Gorelik Julia ................................................ 58
Graffi Giuseppe ........................................... 22
128 | I N D I C E A N A L I T I C O
Graziano G ................................................... 25
Gualerzi Massimo ........................................ 23
Guarnieri Carlo ............................................ 90
H
Haase A. ....................................................... 85
Harauz George ............................................. 67
I
Incani Alessandra ......................................... 86
Iotti Stefano ................ 115; 117; 119; 121; 123
K
Karam Jean-Pierre ........................................ 90
L
La Guardia Maurizio .............................. 80; 82
Lab Max J. ................................................... 58
Lagomarsino Stefano ................................. 115
Levati Giulia ................................................ 96
Lombardo Marco................................ 115; 121
Loru Debora ................................................. 86
Losi Aba ..................................... 57; 65; 69; 99
Lottici P.P. ................................................... 93
Lücke Christian ............................................ 60
Luiselli Donata ............................................. 49
M
Macchi Emilio ........................................ 35; 38
Maida Carmelo Massimo ............................. 55
Malucelli Emil ........................... 115; 121; 123
Mandalari Carmen............................ 65; 69; 99
Mandich Alberta ................................ 109; 111
Maradonna Francesca ................................ 109
Mariottini Gian Luigi ................................... 62
Marraccini Chiara ...... 115; 117; 119; 121; 123
Melis M. Paola ............................................. 86
Melis Massimiliano ...................................... 86
Merolle Lucia ............. 115; 117; 119; 121; 123
Miccoli G. .................................................. 125
Migliaresi C. ................................................ 85
Milani Chantal ............................................. 46
Milani Rolando ............................................. 46
Milia Nicola.................................................. 51
Milici M........................................................ 55
Mineo Valerio .............................................. 75
Minerva F ..................................................... 25
Miragoli Michele ............................. 35; 38; 58
Montero-Menei Claudia ............................... 90
Montinaro Francesco .................................... 51
Morselli Paolo Giovanni .............................. 90
Moschetta A ................................................. 25
Motta A. ....................................................... 85
Motta Chiara ............................................... 125
Mozzoni Paola ....................................101; 107
Muscari Claudio ........................................... 90
Mussi Francesca ......................................... 104
Musso Ezio ...................................... 35; 38; 90
Mutti Antonio .....................................101; 107
N
Notargiacomo Andrea ................................ 115
Nozzi Valentina .......................................... 109
P
Palasciano G ................................................. 25
Palmieri VO.................................................. 25
Panattoni Gian Luigi .................................... 46
Pane Luigi .................................................... 62
Panzuto R. .................................................. 125
Parakhonskiy B. ........................................... 85
Pedrini B. ...................................................... 95
Pedrini L. ...................................................... 95
Pelosi Giorgio ............................................. 104
Perotti Alessio ............................................ 107
Pettener Davide ............................................ 49
Pinelli Silvana ....................................104; 107
Piras Alessandra ........................................... 70
Planeta Diego ........................................ 55; 75
Polverini Eugenia ......................................... 67
Pontrelli D .................................................... 25
Porcedda Silvia ............................................. 70
Predieri G. .................................................... 93
Q
Quaini Federico ............................................ 90
I N D I C E A N A L I T I C O | 129
R
Rabino Massa Emma .............................. 22; 95
Raffelberg Sarah..................................... 65; 69
Randazzo Walter .......................................... 75
Rescigno Antonio ......................................... 70
Rinaldi Marianna .......................................... 22
Roncoli Gabriele ........................................ 111
Rosa Antonella ....................................... 70; 86
Rosangela Cinquetti ..................................... 43
Rossi Gian Luigi .......................................... 60
Rossi Stefano .................................... 35; 38; 58
Rusca Michele ............................................ 101
Russo Giuseppe ............................................ 77
S
Sacco C ........................................................ 25
Sanna Emanuele ........................................... 51
Santovito D .................................................. 25
Sargenti Azzurra......... 115; 117; 119; 121; 123
Sarno Stefania .............................................. 49
Savi Monia ................................................... 90
Scano Paola .................................................. 70
Scorolli Annalisa ........................................ 111
Sgoifo Andrea ........................................ 35; 38
Simoniello P. ............................................. 125
Spinnato Gianpaolo ..................................... 82
Stani Mariachiara......................................... 43
Stilli Donatella ............................................. 90
T
Tarasconi Pieralberto ................................. 104
Traina Marcello ........................................... 77
Traversi Ilaria .................................... 109; 111
Trombini Claudio .............................. 115; 121
Trombini Mimosa ........................................ 38
V
Venturella Fabio .................................... 55; 82
Viappiani Cristiano ................................ 65; 69
Z
Zaniboni Massimiliano .......................... 29; 32
Zucca Paolo ................................................. 70