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La microscopie optique auXXIème siècle :
de la physique au service de la biologie.
Jacques DEROUARD
Professeur émérite
Laboratoire Interdisciplinaire de Physique (LIPhy)
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Microscopie et biologie
Pasteur dans son laboratoire, Alfred EDEFELT, 1885, Musée d’Orsay
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La microscopie optique auXXIème siècle
• Des origines à nos jours
• De l’imagerie morphologique à l’« imageriefonctionnelle moléculaire »: la microscopie defluorescence
• Quelques développements récents:– Imagerie « non linéaire »
– Optique adaptative
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La microscopie optique auXXIème siècle
• NB Conférence D. Bourgeois Ateliers del’Information 16 juin 2015:
–« Microscopie de fluorescence, superrésolution, sujet du prix Nobel deChimie 2014 »
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La préhistoire
Van Leeuwenhoek (1632-1723)
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La préhistoire
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La préhistoire
Microscopecomposé18ème siècle(cf aussi Hookecontemporain devan Leewenhoek)
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L’Histoire
Microscope Zeiss(1885)
NB Collaboration Abbe -Schott - Zeiss
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Microscope optique début du 21ème siècle
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• Imagerie morphologique d’objets biologiquestransparents observés en transmission– contraste de phase
– contraste interférentiel
– coloration (membrane, noyaux…) de cellules« fixées », c’est-à-dire mortes!
Microscopie optique et biologie
Milieu inhomogénéité d’indice δδδδnépaisseur e: déphasage en.
2 δλπ
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Microscope optique
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Microscopie optiquemorphologique
• Contraste de phase (Zernike, 1935, Prix Nobelde Physique 1953)
Contraste de phaseImage transmissionnormale (cellules de l’épitheliumde la bouche)
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Microscopie optiquemorphologique
• Contraste interférentiel (Nomarski, 1955)
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Microscopie optiquemorphologique
• Colorants en introduits en quantité suffisante(-> cellules « fixées » = mortes!) pourabsorber la lumière et colorer la lumièretransmise
Sang de rat infecté par« trypanosoma - evansi ».Marquage par colorationbleu de méthylène-éosine
(crédit wikimedia, A.R. Walker)
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Microscopie optique et biologie
• Imagerie morphologique d’objets transparents
• Imagerie « fonctionnelle »– détection, localisation et comportement de
molécules impliquées dans le fonctionnementcellulaire
– cf protéines, ADN, Ca++...
Imagerie « moléculaire »
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Microscopie et biologie:Imagerie moléculaire fonctionnelle
• Marquage par des molécules fluorescentes:émettent de la lumière de couleur différente decelle de l’éclairage. Filtre coloré observation sur « fond noir »– Très grande sensibilité: une molécule individuelle
est déjà détectable (plus facile de voir les étoiles lanuit qu’en plein jour!)
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Microscope optique de fluorescence
« Cube »séparateur
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Spectres d’absorption et defluorescence d’un colorantfluorescent
Détection de lumière de fluorescence:
« Cube » séparateur avec filtres
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Microscopie et biologie:Imagerie moléculaire de fluorescence
• Marquage par des molécules fluorescentesémettant de la lumière de couleur différente decelle de l’éclairage– cf « DAPI », se lie spécifiquement à ADN
– cf greffage de molécules fluorescentes sur unanticorps qui s’attache spécifiquement sur uneprotéine donnée: permet d’obtenir une imagemontrant la localisation de la protéine en question
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http://rsb.info.nih.gov/ij/images/
Cellulles endothéliales d’artère pulmonaire bovine vues au microscope après fixation et marquage par 3 types de molécules fluorescentes dedifférentes couleurs. En bleu, noyaux marqués au DAPI. En vert, microtubules marqués par un anticorps. En rouge, actine marquée à la phalloïdine liée à colorant « TRITC ».
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• Marquage par des molécules fluorescentesémettant de la lumière de couleur différente decelle de l’éclairage– protéines fluorescentes synthétisées directement
par des organismes génétiquement modifiés pourcela (cf R. Tsien, M. Chalfie, O. Shimomura, prixNobel de chimie 2008)
– permet l’imagerie moléculaire au sein decellules vivantes
Microscopie et biologie:Imagerie moléculaire de fluorescence
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Le prix Nobel de chimie 2008(R. Tsien, M. Chalfie, O. Shimomura)
• Molécule « Green Fluorescent Protein »présente naturellement chez certaines méduses
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Protéines fluorescentes et géniegénétique
• Organismes peuvent êtregénétiquement modifiéspour fabriquer desprotéines « fusionnées »avec cette protéinefluorescente
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• Organismes peuvent être génétiquementmodifiés pour fabriquer des protéines« fusionnées » avec cette protéine GFP
Protéines fluorescentes et géniegénétique
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Rouge: actine(« cytosquelette »)- redFP
Vert : Paxilline (protéine adhésion)- GFP
Bleu: ADN, marqueur DAPI
M. Balland (LIPhy) et al, 2015
Microscopie et biologie:Imagerie moléculaire de fluorescence
Cellule OGM / Protéinesfluorescentes
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Protéines fluorescentes et géniegénétique
• De très nombreuses protéines peuvent être, et ontété, clonées in vivo dans de très nombreuseslignées cellulaires
• Leur fluorescence permet ainsi d’observer leurlocalisation, mesurer leur nombre, suivre leurmouvement et leur réactivité
• On peut aussi les photo-détruire et en étudier lesconséquences
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Protéines fluorescentes et géniegénétique
• Il s’agit d’une révolution considérablepour la recherche en biologie cellulaire,datant d’à peine plus de 20 ans
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Protéines fluorescentes et géniegénétique
• cf conférence passée D. Bourgeois 16-06-2015« Microscopie de fluorescence, super résolution,sujet du prix Nobel de Chimie 2014 »
• cf conférence à venir D. Falconet 2-02-2016« Utilisation de la lumière pour déchiffrer lesarchitectures du vivant »
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Imageries microscopiques parbalayage laser de l’objet
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Microscopie de fluorescence parbalayage laser
• Très souvent lampe d’excitation estremplacée par un laser– imagerie plein champ si faisceau défocalisé
– ou au contraire image point par point obtenueen balayant le faisceau focalisé sur l’objetétudié.
• -> simple photodétecteur plutôt que caméra
• -> montage confocal pour limiter profondeur dechamp
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Fluorescenceexcitée parabsorptiond’1 photon
Objectif
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Microscopie confocale:trou de filtrage placé devant photodétecteur
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Microscopie confocale:trou de filtrage placé devant photodétecteur+ miroir mobile pour balayer le faisceau
Conchello et Lichtman 2005
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Plein champ Confocal
Résolution longitudinale de l’image:meilleure qu’avec une image éclairée plein champ
Application à l’imagerie 3Dpar « section optique »
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Reconstitution 3D
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Microscopie de fluorescence« bi-photonique »
et autres techniques « non linéaires »
• cf conférence passée B. Boulanger 17-11-2015« Comment la lumière joue avec la matière ? Avecl’optique non linéaire ! »
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Microscopie bi-photonique
Fluorescenceexcitée parabsorptiond’1 photon
Objectif
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Microscopie bi-photonique
Fluorescenceexcitée parabsorptionsimultanéede 2 photons
Objectif Objectif
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Microscopie bi-photonique
Fluorescenceexcitée parabsorptionsimultanéede 2 photons
Objectif
-Profondeur de champautomatiquementlimitée
-Evite les phénomènesde photo-blanchiment
-Meilleure pénétrationdu rayonnementd’excitation dans lemilieu
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• J.C. Vial, P.Vérant LIPhy, UJF-CNRS
• J. Coles et al. GIN, UJF-INSERM
Microscopie bi-photoniqueExemple d’application: imagerie de la
microvascularisation du cerveau d’une souris
Jaune: fluorescence d’un colorant injecté dans le sang
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Microscopies optiques non linéaires
Générationd’harmonique 2
Générationd’harmonique 3
Processus non résonnants sensibles à la structurede la matière au voisinage du point focal
Imagerie morphologique sans marquage!
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Microscopie optique non linéaire
Images d’une section de fémur de bovinR. Genthial, D. Débarre, A. Gourrier (LIPhy),E. Beaurepaire et al (Polytechnique) 2015
Générationd’harmonique 2
Générationd’harmonique 3
50µm
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Optique « adaptative » enmicroscopie
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Optique « adaptative » enmicroscopie
Image floue d’un objet vu à traversun milieu transparent inhomogène
Image crédit J. Kubby,W.M. Keck Center forAdaptive OpticalMicroscopy, Univ.California Santa Cruz
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Optique « adaptative »
Faisceau lumineux directif
Echantillon:milieu transparentinhomogène
Faisceau lumineuxdistordu après traverséede l’échantillon
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Optique « adaptative »
Echantillon:milieu transparentinhomogène
Réflexion surmiroir plan
Faisceaulumineux restedistordu aprèsréflexion
Faisceau lumineux directif
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Optique « adaptative »
Réflexion surmiroir courbe
Faisceau lumineux estredressé après réflexionsur miroir courbe deforme adaptée
Echantillon:milieu transparentinhomogène
Faisceau lumineux directif
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Miroirs déformables: cf Société ALPAO (Montbonnot)
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Optique adaptative enmicroscopie
• Utile pour observation en profondeurd’échantillons « épais »
• méthodes pour « adapter » la forme dumiroir déformable– méthode 1: analyse de la lumière émise par un
point source inséré dans l’échantillon
– méthode 2: algorithme d’optimisation d’uncritère de qualité de l’image observée
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Optique adaptative enmicroscopie
• Exemple: Imagerie 3D par microscopie defluorescence biphotonique + optique adaptativedu cerveau d’un embryon vivant de poisson-zèbre génétiquement modifié/protéine fluo jaune
Wang, Milkie, Saxena, Engerer, Misgeld,Bronner, Mumm, Betzig; Nature Methods,11, 625-628 (2014)
Prix Nobel de chimie 2014
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Conclusion
• Microscopie optique outil puissant pourétude d’objets biologiques– morphologie
– imagerie moléculaire, sonde dufonctionnement des cellules
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Conclusion
• Nombreux développements instrumentauxet méthodologiques en cours– détecteurs, sources de lumière, optiques,
systèmes d’acquisition
– correction d’aberrations optiques par « optiqueadaptative »
– interaction lumière-matière, photophysiquemoléculaire
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Conclusion
• Importance fondamentale des marqueursmoléculaires– chimie
– biochimie
– génie génétique