La resistenza delle cellule umane alla trasformazione tumorale

• Le nostre cellule hanno una serie di meccanismi/checkpoints formidabile per arrestare il processo di trasformazione tumorale

• Nelle nostre cellule si accumulano moltissime mutazioni, ma la trasformazione tumorale rimane un evento raro

• Singole mutazioni sono quindi insufficienti per la trasformazione tumorale: – modello “multi-step” della trasformazione tumorale

I checkpoint sono una barriera fisiologica al processo di trasformazione

tumorale

La senescenza cellulare è un evento comune di risposta anti-tumorale

• Nei: – Mutazione della chinasi BRAF:

• Attivazione di segnali di crescita incontrollati – Replication stress

– Attivazione di DnaDamageResponse (DDR) – Senescenza cellulare (documentata in vivo nella

cute umana) • Quanti altri casi???

La progressione tumorale

• Il tumore rappresenta un’entitá dinamica nelle sue stesse fondamenta genetiche

• La semplice descrizione delle anomalie genetiche perció é insufficiente per farci capire come “funziona”

• Occorre una visione “integrata” della storia naturale del tumore, nei vari stadi della sua progressione

Teoria della selezione clonale • In base a questo modello, la tumorigenesi si puó

considerare come l’espansione seriale di cloni successivi di cellule, caratterizzati dall’acquisizione di mutazioni che conferiscono un vantaggio selettivo di crescita nei confronti delle popolazioni cellulari circostanti

• Per arrivare ad un fenotipo tumorale maligno, é necessaria una serie di alterazioni. Una sola alterazione genetica di per sé puó essere controllata da meccanismi di risposta cellulari

• Le alterazioni sono prevalentemente genetiche, ma alterazioni “epigenetiche” e quindi stabilmente ereditabili di pattern di espressione genica sono anch’esse importanti

Emergenza sequenziale di subcloni. Un processo di selezione competitiva fra I subcloni coesistenti porta all’emergenza del subclone maligno “vincente”, che peró puó acquisire nel tempo nuove alterazioni genetiche dando origine ad eterogeneitá genetica

Progressione lineare o “caotica”?

• Nella visione classica, mutazioni emergono che portano via via all’emergenza di cloni con maggiore malignità

• Nella visione che tiene conto di alcuni risultati più recenti, più cloni (derivati da una unica cellula di origine del tumore, ma caratterizzati da eterogeneità genetica) possono coesistere contemporaneamente nella massa tumorale

Modello monoclonale

Modello policlonale

Modelli di progressione tumorale

I vantaggi dell’eterogeneità clonale

• La presenza di più cloni fornisce la capacità di esplorare il “paesaggio di fitness” (fitness landscape) con maggiore efficienza – Uno dei subcloni può trovarsi in vicinanza di

uno dei picchi di fitness, e quindi avvicinarsi ad esso mediante un numero di eventi mutazionali basso

– Dopo terapia, uno dei subcloni –ancora- può trovarsi vicino ad uno dei nuovi picchi di fitness imposti dai farmaci

A: condizioni di base B: dopo terapia

Un esempio: recidiva di leucemia

• Sequenziamento completo del genoma di cellule leucemiche all’esordio, e dopo la prima recidiva: uno dei subcloni diventa il clone dominante, acquisendo nuove mutazioni

Selezione clonale e cellule staminali tumorali

Quanti sono i geni mutati in un tumore ?

Next Generation Sequencing • Progresso delle tecnologie di sequenziamento del

DNA e riduzione dei costi – sequenziamento del genoma umano (3,000,000,000 di

basi) negli anni ’90-inizio 2000: >5 anni, $300,000,000 – L’ALTRO IERI (2010): sequenziamento del genoma

umano di J. Watson in 1-3 mesi, $350,000!!! – IERI (2011): sequenziamento di 1 genoma in 1

settimana, 50,000$ – OGGI: 1-10,000 genomi/anno – DOMANI: 1 genoma in 4..... MINUTI per < $1,000!!!

How was this achieved?

• Integration (Think about sequencing pipeline)

• Parallelization

• Miniaturization

Same concepts that revolutionarized integrated circuits

Massively parallel sequencing • Sequenziamento tradizionale: regioni di DNA

vengono isolate, clonate in plasmidi (o simili), amplificate mediante crescita in batteri e quindi cloni individuali vengono sequenziati

• Sequenziamento parallelo: il DNA da analizzare viene frammentato e (senza essere clonato) viene immobilizzato su una superficie solida (un vetrino, p.es.), quindi viene amplificato via PCR e poi ogni singolo frammento viene sequenziato contemporaneamente

Sequenziamento sistematico del DNA dei tumori

• Prima analisi completata nel 2007: circa 20 tumori (colon e mammari) – Sequenziamento degli esoni trascritti (non

dell’intero genoma) per circa 20,000 geni dal tessuto normale e dal tumore

• Geni mutati nel tumore rianalizzati in altri 25 pazienti per avere una idea della frequenza di mutazioni riscontrate per quel gene nei tumori

– I più interessanti sono sequenziati in altri 100 pazienti

Alcuni conti

• Identificate in media ≈ 80 mutazioni/tumore • Le mutazioni interessano geni diversi in

tumori di tipo diverso (colon vs mammari)

Il paesaggio “mutazionale” dei tumori

Considerazioni

• Pochissimi sono i geni mutati frequentemente in molti tumori (5): – “MONTAGNE”

• La maggior parte dei geni identificati sono mutati raramente in alcuni tumori: – “COLLINE”

Due tumori del colon: praticamente due diverse malattie

Chi conta di più?

• Le ricerche si sono concentrate in passato sulle “montagne”, che sono state scoperte prima con le tecnologie disponibili

• In realtà le “colline” rappresentano la situazione più frequente – Le “colline” sono molto numerose, ma il

numero di “pathways” colpito è minore (più colline appartengono allo stesso pathway)

Il primo tumore umano interamente sequenziato

AML con cariotipo normale (100,000,000,000bp sequenziate!!!)

Variazioni o mutazioni?

Mutazioni “driver” (che portano a variazioni funzionali importanti per il fenotipo tumorale) vs mutazioni “passenger” (neutrali, dovute all’instabilità del genoma delle cellule tumorali)

La progressione tumorale “da vicino”

Sequenziamento di tumori primari/mestastasi dallo stesso

paziente

Mutazioni in tumori pancreatici metastatici

• Due tipi di mutazioni – Founder (presenti sia

nel tumore primario che in tutte le metastasi)

– Progressor (presenti solo in una o più metastasi)

La geografia della progressione tumorale

• Le cellule che danno inizio a metastasi hanno già accumulato le mutazioni “progressor” nel tumore primario

• Diverse cellule (con diverso spettro di mutazioni progressor) danno origine a diverse metastasi

Il sequenziamento di diverse regioni del tumore/metastasi rivela uno spettro di mutazioni: comuni a tutte le lesioni tumorali, comuni solo al tumore primario, comuni solo alle metastasi, “uniche” per ciascuna regione sequenziata.

Patogenesi molecolare dei tumori

Mutazioni ed instabilitá genomica

• Alcuni numeri “agghiaccianti”: – 1014 cellule/uomo; – 1016 divisioni cellulari/durata della vita media; – 10-6/10-7 frequenza di mutazioni/gene/divisione

cellulare Ogni gene umano é mutato 10 miliardi di volte

durante la nostra vita!!! • La maggior parte di queste mutazioni non sono trasmissibili

perché non avvengono nelle cellule germinali

Geni associati alla trasformazione neoplastica

• Oncogeni: l’”acceleratore” bloccato • Oncosoppressori: I “freni” malfunzionanti • Instabilitá genomica: guida in stato di

ubriachezza

Modelli teorici di soppressione tumorale

• L’inattivazione di un gene il cui prodotto funge da mediatore in un pathway lineare dá come risultato l’inattivazione dell’intero pathway.

• In questo caso, l’inattivazione successiva di un altro componente dello stesso pathway non conferirebbe ulteriori vantaggi selettivi alla cellula che presenta la prima mutazione, e quindi la mutazione successiva non sarebbe osservabile nel tumore emergente.

Visione integrata di oncogeni ed oncosoppressori

• Aldilá del singolo gene, quello che occorre considerare é la necessitá per la cellula tumorale di raggiungere l’inattivazione di un determinato pathway

• Tale inattivazione si puó raggiungere per attivazione di un oncogene, o per inattivazione di un oncosoppressore

• Questa visione ci consente di classificare I geni in base al pathway cui appartengono: geni appartenenti a pathway diversi (p.es. Rb e p53) sono spesso mutati nella stessa cellula tumorale

Analisi di geni in tumori

In ognuno dei tre maggiori pathway oncosoppressori, l’inattivazione di Un componente preclude l’inattivazione degli altri componenti.