lab 9 protein estimation biuret method

7
Biochemistry Lab : ปปปปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปป 26 ปปป 28 ปปปปปปป 2552 ปปปป 13:00 – 15:50 ป. ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปป 4 กกกกกกกกกกกกกกกกก (Protein Estimation): Biuret method กกกกกกก ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปปปปปปปป ปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปปปปปปปปป ปปปปปป(Sensitivity) ปปปปปปปปปป ปปปปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปปปปป ปปปปปปปปปป ปปปปปปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปปปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปปปปปปปปปปปปปป ปป 5 ปปปป 1. Kjeldahl Method ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปปปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป Nitrogen ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป 16 % ปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป Organic-N ปปปปปปปปปปป ammonia ปปปปปปปป ปปปปป ปปป nitrogen (NH 3 -N) ปปปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปปปปป 2. Biuret Method ปปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปปปป ปปปปปปปปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปปปป peptide bond ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป Peptide Bond ปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป ปปปปปปปปปปปปปปป ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป 1-10 mg/ml ปปปปปปปปปป ปปป ปปปปปปปป Biuret (1) ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป(ปปปปปปปปปปปปปปปปปปปปป 1

Upload: kawaiilover

Post on 19-Jun-2015

4.972 views

Category:

Documents


6 download

TRANSCRIPT

Page 1: Lab 9 protein estimation   biuret method

Biochemistry Lab : ประจำ�� วันพุ�ธและศุ�กร�ที่�� 26 และ 28 สิ�งห�คม 2552 เวัล� 13:00 – 15:50

น.

ห�องปฏิ�บัติ�ก�รอ�ค�รวั�จำย ชั้$น 4

การหาปร�มาณโปรตี�น (Protein Estimation): Biuret method

หลั�กการก�รห�ปร�ม�ณโปรติ�นจำ�กสิ�รติวัอย'�ง ม�หล�ยวั�ธ� ผู้)�วั�เคร�ะห�จำะติ�องเล*อก

ให�เหม�ะสิม พุ�จำ�รณ�จำ�กสิถ�นะของสิ�รติวัอย'�ง ควั�มไวั(Sensitivity) ของวั�ธ�ก�ร ป/จำจำยแที่รกซ้�อนที่��ลดควั�มแม'นย��ของวั�ธ�ก�รที่��จำะเล*อกใชั้� และข�อจำ��กดติ'�งๆ เชั้'น อ�ปกรณ�เคร*�องม*อ สิ�รเคม�ที่��ติ�องใชั้� งบัประม�ณ เวัล�ที่��ติ�องใชั้�วั�เคร�ะห� และจำ��นวันสิ�รติวัอย'�ง เป3นติ�น ก�รวั�เคร�ะห�ห�ปร�ม�ณโปรติ�นที่��น�ยมกน ม� 5 วั�ธ�

1. Kjeldahl Method เที่�ยบัจำ�กก�รห�ปร�ม�ณไนโติรเจำนที่$งหมด วั�ธ�น�$ม�จำ�กหลกก�รวั'�โปรติ�นน$นม� Nitrogen เป3นองค�ประกอบัอย)'ประม�ณ 16 % ดงน$นเร�จำะน��สิ�รติวัอย'�งม�ย'อยและเปล��ยน Organic-N ให�กล�ยเป3น ammonia และวัดห� ในร)ปของ nitrogen (NH3-N) วั�ธ�น�$น�ยมใชั้�ในก�รวั�เคร�ะห�อ�ห�รสิติวั� ก�รวั�เคร�ะห�น�$�เสิ�ย เป3นติ�น

2. Biuret Method อ�ศุยหลกก�รที่��วั'� โปรติ�นประกอบัด�วัย กรดอะม�โนติ'อกนด�วัย peptide bond ดงน$นก�รวัดจำ��นวันของ Peptide Bond จำ4งสิะที่�อนปร�ม�ณของโปรติ�นโดยติรง วั�ธ�น�$จำะม�ควั�มไวัเหม�ะสิมกบัโปรติ�นที่��ม�ควั�มเข�มข�นอย)'ในชั้'วัง 1-10 mg/ml

วั�ธ�ก�รค*อ ใชั้� สิ�รละล�ย Biuret(1) ผู้สิมกบัสิ�รละล�ยติวัอย'�ง(ที่��ติ�องก�รวัดห�ปร�ม�ณโปรติ�น) ติ$งที่�$งไวั�ที่��อ�ณหภู)ม�ห�องประม�ณ 30

น�ที่� แล�วัน��ไปวัดห�ค'� absorbance ที่�� wavelength 540 nm

จำ�กน$นน��ม�เที่�ยบักบั Calibration curve(2) ก6จำะที่ร�บัค'�ควั�มเข�มข�นของโปรติ�นในสิ�รละล�ยได� สิ�ที่��ได�ม�จำ�กก�รจำบักนของ Cu2+ ใน

1

Page 2: Lab 9 protein estimation   biuret method

Biuret solution กบั Peptide bond ป/จำจำยแที่รกซ้�อนอ�จำเก�ดได�หล�ยสิ�เหติ�เชั้'น ห�กม� lipid หร*อ detergents อย)'ในสิ�รละล�ยด�วัยจำะเก�ดควั�มข�'นที่��ให�ได�ค'�สิ)งกวั'�ควั�มเป3นจำร�ง นอกจำ�กน�$ยงม�สิ�รบั�งชั้น�ดที่��ไม'ใชั้'โปรติ�นสิ�ม�รถเก�ดสิ�ได�ในสิ�รละล�ย Biuret เชั้'น peptides, sucrose, tris, bile pigment เป3นติ�น

3. Lowry-Folin Method วั�ธ�น�$ Lowry ได�พุฒน�ปรบัปร�งจำ�กวั�ธ� Biuret ที่��ให�ได�ควั�มไวัม�กข4$น สิ�ม�รถวัดได�ที่��ระดบัควั�มเข�มข�นของโปรติ�นติ���ๆ ลงไปถ4ง 5 g/ml สิ�ที่��เก�ดข4$นอ�ศุยปฏิ�ก�ร�ย�สิองชั้น�ด ค*อ Biuret และ Reduction ของ Tyr & Trp ด�วัย Folin-Ciocalteu

reagent(3) ซ้4�งม�สิ'วันผู้สิมของ Phosphomolypdate -

phosphotungstate ติ$งที่�$งไวั� 40-60 น�ที่� จำะเก�ดสิ�น�$�เง�นเข�ม น��ไปวัดค'� absorbance ได�ที่�� 500 nm อย'�งไรก6ติ�มห�กม�ปร�ม�ณโปรติ�นม�กกวั'� 250 g/ml สิ�ที่��ได�จำะเข�มม�กเก�น จำ��เป3นติ�องเจำ*อจำ�งสิ�รละล�ยติวัอย'�งก'อน เชั้'นกนกบั Biuret Method เม*�อน��ค'�ที่��ได�เที่�ยบักบั Calibration curve(2) ก6จำะที่ร�บัค'�ควั�มเข�มข�นของโปรติ�นในสิ�รละล�ยได� วั�ธ�น�$ม� interfering substances หล�ยชั้น�ด ได�แก' สิ�รพุวัก phenolic compounds รวัมที่$ง Phe, Tyr, Trp

อ�สิระ น�$�ติ�ลติ'�งๆ เชั้'น sucrose, glucose รวัมที่$ง Glycerol

Thiol cpds, reducing agents เป3นติ�น4. Spectrophotometric Method (Warburg-

Christian) กล'�วัได�วั'�วั�ธ�น�$สิ�ม�รถที่��ได�เร6วัที่��สิ�ด ม�ข�ดควั�มสิ�ม�รถของวั�ธ�น�$ อย)'ที่��ควั�มเข�มข�นของโปรติ�นที่�� 50-100 g/ml ที่��ได�ง'�ย ด�วัยก�รน��สิ�รละล�ยไปวัด absorbance ที่�� 280 nm ที่$งน�$อ�ศุยหลกก�รวัดที่�� max of Tyr, Trp ที่��ม�อย)'ในโปรติ�น อย'�งไรก6ติ�ม ห�กเป3นสิ�รละล�ยที่��สิะกดจำ�กเซ้ลล� จำะม�สิ�รหล�ยชั้น�ดปะปนม�ด�วัย หน4�งในบัรรด�ที่��มกจำะอย)'กบัโปรติ�นก6ค*อ Nucleic acid ซ้4�งม� max อย)'ที่�� 260 nm มนจำ4งด)ดแสิงที่�� 280 nm ได�ด�เชั้'นกน ผู้)�พุฒน�ได�ที่ดสิอบัด�วัยก�รน��เอ�สิ�รละล�ยที่��ผู้สิมระหวั'�งโปรติ�นบัร�สิ�ที่ธ�8และ Nucleic

2

Page 3: Lab 9 protein estimation   biuret method

acid บัร�สิ�ที่ธ�8แล�วัวัดเที่�ยบัห�อติร�สิ'วัน A280/A260 ที่��ไวั�เป3นติ�ร�งเปร�ยบัเที่�ยบั น��ค'�ที่��ได�ม�ค��นวัณห�ควั�มเข�มข�นของโปรติ�น ติ�มสิ)ติร

[Prot] in mgml-1 = A280 x Factor ห�กไม'ม�ติ�ร�งให�ใชั้� อ�กสิ)ติร ค*อ

[Prot] in mgml-1 = 1.55A280 - 0.76 A260

ข�อจำ��กดของวั�ธ�น�$ ก6ค*อ จำะติ�องม� UV-

spectrophotometer และ Quartz Cuvette ซ้4�งม�ร�ค�ค'อนข��งแพุง(ค)'ละประม�ณ 8,000 บั�ที่)

5. Dye-binding Method (Bradford) ในป9 ค.ศุ.1976

Bradford ได�พุฒน�วั�ธ�น�$ข4$น เพุ*�อหล�กเล��ยงข�อจำ��กดของวั�ธ� Biuret

และ Lowry โดยใชั้�สิ�รละล�ย Comassie Brilliant Blue G-25

dye in acidic solution ซ้4�งปกติ�จำะม� max อย)'ที่�� 465 nm แติ'เม*�อมนจำบักบัโปรติ�น จำะเปล��ยน max เป3น 595 nm สิ�จำะเก�ดข4$นหลงก�รผู้สิมเพุ�ยง 2 น�ที่�เที่'�น$น นบัวั'�สิดวักม�ก อ�กที่$งเก*อบัไม'ม�ติวัแที่รกซ้�อนเลย ม�เพุ�ยง detergent เชั้'น Triton X และ sodium

dodesyl sulphate เที่'�น$น ควั�มไวัของวั�ธ�น�$ก6ด�พุอๆกบัวั�ธ�ของ Lowry อ�กด�วัย

(1) Biuret Solution เติร�ยมโดย ชั้�ง CuSO4.5H2O 1.5 g และ NaKC4H4O6.4H2O (Sodium

potassium tartrate หร*อ Rochelle salt) 6 g ละล�ยในน�$�กล�น 500 ml

แล�วัน�� 10%(w/v) NaOH (carbonate free) 300 ml ม�ผู้สิม แล�วัเติ�ม KI 1 g เพุ*�อป:องกนไม'ให�เก�ดก�รติกติะกอนของ Cuprous oxide จำ�กน$นเติ�มน�$�กล�นปรบัให�ได�ปร�ม�ติรรวัมเป3น 1 ล�ติร เก6บัไวั�ใน ขวดพลัาสตี�ก

(2) Calibration Curve

3

Page 4: Lab 9 protein estimation   biuret method

ค*อ กร�ฟม�ติรฐ�น ในที่��น�$ plot ระหวั'�ง แกนนอน ค*อ ควั�มเข�มข�นของสิ�รละล�ยโปรติ�นม�ติรฐ�น โดยที่�วัไปจำะใชั้� Bovine serum albumin บัร�สิ�ที่ธ�8 (Standard BSA) และแกนติ$งค*อ ค'�ก�รด)ดซ้4มแสิงของสิ�รละล�ยโปรติ�นน$นๆ เอ�ไวั�เที่�ยบัห�ควั�มเข�มข�นของ Unknown solution

ปฏิ�บั�ตี�การนกศุ4กษ�จำะได�รบั 1. สิ�รละล�ยโปรติ�นที่��ไม'ที่ร�บัควั�มเข�มข�น(Unknown) คนละ 1 หลอด2. สิ�รละล�ยโปรติ�นม�ติรฐ�นควั�มเข�มข�น 10 mg/ml กล�'มละ 5 ml

ให�ห�ควั�มเข�มข�นโดยใชั้�วั�ธ� Biuret 1. เติร�ยม Test Tubes ที่��สิะอ�ดและแห�ง กล�'มละ 7-10 หลอด 2. pipette Standard protein solution และ น�$�กล�น ติ�ม

ปร�ม�ติรที่��ระบั�ไวั�ในติ�ร�งอย'�งแม'นย��ที่��สิ�ด(ม�ฉะน$นกร�ฟที่��ได�อ�จำผู้�ดพุล�ด) เขย'�ให�ผู้สิมเข��กนด�

3. เติ�ม Biuret solution หลอดละ 4 ml เขย'�ให�ผู้สิมเข��กนด� ที่�$งไวั� 30 น�ที่�ให�ปฏิ�ก�ร�ย�เก�ดสิมบั)รณ�

4. น��ไปวัดค'�ก�รด)ดกล*นแสิง ที่�� ควั�มย�วัคล*�น 540 nm

5. สิ��หรบั Unknown ให�เติร�ยมเป3น 2 หลอด โดยหลอดแรกไม'ติ�องเจำ*อจำ�ง ให�ใชั้�ปร�ม�ติรของ unknown 1.0 ml สิ'วัน หลอดที่�� 2 ให�เจำ*อจำ�งด�วัยน�$�กล�น เที่'�ติวั

6. เติ�ม Biuret solution หลอดละ 4 ml เขย'�ให�ผู้สิมเข��กนด� ที่�$งไวั� 30 น�ที่�ให�ปฏิ�ก�ร�ย�เก�ดสิมบั)รณ�

7. น��ไปวัดค'�ก�รด)ดกล*นแสิง ที่�� ควั�มย�วัคล*�น 540 nm เชั้'นกน8. อย'�งไรก6ติ�มห�กพุบัวั'�สิ�ที่��เก�ดข4$นเข�มเก�นกวั'�ที่��เคร*�องจำะอ'�นค'�ได� ให�

เจำ*อจำ�งให�เหม�ะสิม 9. อย'�ล*มก�รวัดให�วัดหลอดที่��เจำ*อจำ�งกวั'�ก'อนติ�มล��ดบั10. บันที่4กค'� A540 และน��ไปวั�ดกร�ฟม�ติรฐ�น ให�ค'� A540 เป3นแกน

ติ$ง และ ค'� ควั�มเข�มข�นของโปรติ�นม�ติรฐ�น (mg/ml) เป3นแกนนอน

4

Page 5: Lab 9 protein estimation   biuret method

11. น��ค'� A540 ของ unknown เที่�ยบัห�ค'�ควั�มเข�มข�นจำ�กกร�ฟ และ สิ��หรบัหลอดที่�� 2 จำะติ�องค��นวัณห�ค'�ควั�มเข�มข�นเร��มติ�น ก'อนน��ม�เปร�ยบัเที่�ยบักบัค'�ที่��ได�จำ�กหลอดที่�� 1

หลอดที่�� Std. protei

n(ml)

น�$�กล�น(ml)

Unknown

BIURET

(ml)

Blank 0 1.0 - 4.01 0.8 0.2 - 4.02 0.6 0.4 - 4.03 0.4 0.6 - 4.04 0.2 0.8 - 4.05 0.1 0.9 - 4.0

Unknown-1

- - 1.0 4.0

Unknown-2

- 0.5 0.5 4.0

การเตีร�ยมความพร�อมแลัะค�าถาม1. เข�ยนผู้งก�รที่��ง�นเชั้'นเร*�องก'อนๆ ขอให�พุ�จำ�รณ�แติ'ละข�อวั'�ควัรเร�ยง

ล��ดบัก�รที่��ง�นอย'�งไร จำ4งจำะที่��ให�ม�ประสิ�ที่ธ�ภู�พุ รวัดเร6วัที่นเวัล�2. ออกแบับัติ�ร�งบันที่4กผู้ล และ เติร�ยมกระด�ษกร�ฟ ไม�บันที่ด ด�นสิอ

ป�กก�สิ�เข�มที่��เด'นชั้ด ย�งลบัสิ��หรบัวั�ดกร�ฟม�ติรฐ�น (Calibration Curve)

5

Page 6: Lab 9 protein estimation   biuret method

3. แสิดงก�รค��นวัณ concentration of standard protein

( mg/ml) หลอดที่�� 2 -5 บันที่4ก และ น��ผู้ลที่��ได�ใสิ'ไวั�ในติ�ร�งบันที่4กผู้ลไวั�ล'วังหน��

4. ผู้ลที่��ได�จำ�ก unknown หลอดที่�� 1 และ 2 ควัรเที่'�กนหร*อไม' เพุร�ะอะไร

5. เหติ�ใดค'�ควั�มเข�มข�นของโปรติ�นจำ4งไม'น�ยมแสิดงเป3น Molar

6. เหติ�ใดก�รวั�เคร�ะห�ห�ปร�ม�ณโปรติ�นในพุ*ชั้อ�ห�รสิติวั� จำ4งไม'ควัรใชั้�วั�ธ�อ*�นๆ นอกจำ�ก Kjeldahl Method

6