“DETERMINACIÓN DE BIOMASA”LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA DE LOS PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES

YURICO

TRUJILLO-PERÚ 2012

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLOINGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

PROFESOR: ING. SÁNCHEZ GONZALES, JESÚS ALEXANDER ALUMNA: MARTÍNEZ SALDAÑA, YURICO ELIZABETH CICLO: IX HORARIO: JUEVES 11-1PM

LABORATORIO N° 03.

DETERMINACIÓN DE BIOMASA

“PESO HÚMEDO, PESO SECO, TURBIDIMETRÍA”

I. OBJETIVOS

Determinar la concentración en Peso húmedo (g mH/mL) y Peso Seco (g mS/mL) de una solución

celular y ver que método es más efectivo.

Calcular el coeficiente de variabilidad de las tres repeticiones en Peso Húmedo y Peso Seco de la

levadura de pan.

Determinar la biomasa de una solución celular desconocida mediante el método de turbidimetría

Determinar la cantidad de microorganismos en una muestra mediante la aplicación de diferentes

métodos.

Hallar el factor de conversión para cada caso, mediante la Curva de Calibración.

Determinar el Porcentaje de Error de los factores de Conversión, relacionando los datos.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Biomasa es un término general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. A la vez

también se puede referir como la cantidad de células, de personas o masa de seres vivos. El objetivo de la

biomasa es la reproducción de células.

La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes de un bioproceso ya que su

determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clave para

establecer las tasas de producción, de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances de masa de

cualquier proceso biológico. Los métodos clásicos de determinación de biomasa son métodos directos que

se basan en el número de células o en el peso celular. Para determinar la biomasa es necesario calcular el

número de células en una determinada muestra. Esto es importante en ciertas circunstancias; por ejemplo,

para determinar la inocuidad de muchos alimentos o drogas se requiere cuantificar los microorganismos en

esos productos. Los métodos para estimar el número de microorganismos pueden medir la cantidad de

células, la masa celular o la actividad celular. Los métodos que cuantifican la cantidad de células son útiles

principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o

actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en

los que es difícil cuantificar las células individuales.

A. Medida de biomasa

La medida de la masa de los constituyentes de la célula bacteriana es utilizada frecuentemente como base

para la medida de una actividad metabólica, o de un constituyente metabólico o químico. Algunos de los

métodos para cuantificar la biomas son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se

busca exactitud.

1. Peso húmedo

Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por

filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra. La principal desventaja

es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La

cantidad de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy

empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la

forma y deformación celular.

Para corregir el peso húmedo se determina la cantidad de líquido que queda retenida en el espacio

intercelular luego de una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el

Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.

2. Peso secoLa cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos de peso seco por

unidad de volumen, ya sea como sólidos en suspensión totales (SST) o sólidos en suspensión volátiles

(SSV). Las células se separan del líquido bien por centrifugación bien por filtración. Se expresan en

g.m.s/mL.

La principal desventaja de estas técnicas es que su determinación incluye no sólo microorganismos activos

sino microorganismos muertos, material inerte, polímeros extracelulares y materia orgánica adsorbida.

Además, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles. Los métodos gravimétricos

son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles. A la vez este método este método

los componentes volátiles de las células pueden perderse en el secado y puede existir alguna degradación.

También la muestra seca pude recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene

humedad relativa alta.

3. Absorción

Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada,

parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometría mide la luz dispersada por

una solución de partículas. La turbidimetría mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz

transmitida a través de la solución. Con relación a la longitud de onda y al tamaño de la partícula pueden

existir tres tipos de dispersión.

Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento de los

cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos pero pueden llevar a resultados erróneos. Principalmente,

dan información sobre el peso seco (contenido macromolecular).

Turbidimetría

La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y

cuantifica la luz residual transmitida. Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones

diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen casi la misma

absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la

absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del

microorganismo.

Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de

Colonia) cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el

número de microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una suspensión

bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma

es posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de microorganismos totales o con

UFC.

Figura 1. Absorbancia en función del Peso Seco

K: constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del

microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0).

Peso seco: Concentración celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (µg/ml-mg/ml).

La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de

bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores

producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas

puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorción.

III. MATERIALES Y MÉTODOS

A. Materiales e instrumentos

Materiales

Levadura de panificación “Fleishmann” Agua destilada Tubos de ensayo Láminas cubreobjetos Vaso de precipitación Pipeta Jeringa

Equipos

Centrifugadora Microscopio Estufa (105°ºC por 3 horas) Balanza electrónica Cámara de Neubauer Espectrofotómetro

B. Metodología

Figura 2. Absorbancia en función del Peso Seco Figura 3. Absorbancia en función del Número de Microorganismos Totales

a) Para determinación de Peso Húmedo

Se tomaron muestras de 5 mL de la solución inicial y se colocaron en tres tubos de ensayos previamente pesados.

Luego los tubos son llevados a la centrifuga donde se hacen girar a 4 000 RPM, por un tiempo de 10 minutos.

Luego pasamos a pesar cada tubo de ensayo en la balanza analítica, anotamos los pesos y luego promediamos.

b) Para determinación de Peso Seco

Se tomaron muestras de 5 mL de la solución inicial y se colocaron en tres tubos de ensayos previamente pesados.

Los tubos de ensayo son llevados a la centrifuga donde se hacen girar a 4 000 RPM, por un tiempo de 10 minutos.

Luego pasamos a pesar cada tubo de ensayo en la balanza analítica y anotamos los pesos.

Posteriormente, se llevan los tubos a estufa, a una temperatura de 105 ºC por un tiempo promedio de 3 horas.

Pasado el tiempo anotaremos, los pesos y luego pasamos a sacaremos un promedio.

Figura 4. Metodología de Peso Húmedo y Peso Seco.

Las ecuaciones que se determinarán son:

En Seco la solución no tiene que estar muy diluida, con este método se mide la levadura “Fleischmann”

Peso Húmedo(g mHmL )= (PesoTubo+MuestraHúmeda )−(Peso Inicial Tubo )VolumendeMuestra (¿5mL)

Peso Seco(g mSmL )= (PesoTubo+MuestraSeca )−(Peso Inicial Tubo )Volumende Muestra(¿5mL)

Hallaremos el coeficiente de Variabilidad de las 3 repeticiones.

c) Para determinación de turbidimetría

Se preparó una solución acuosa con levadura, a partir de la cual se procedió a preparar diluciones ( 4/5, 3/5, 2/5, 1/10, 1/30, 1/50, 1/100)

De la muestra original se tomó 5 ml en dos tubos para determinar la concentración en peso seco y peso húmedo.

Para determinar la concentración por conteo celular se tomó una muestra de la dilución 1/100.

Con todas las diluciones y muestra original se procedió a colocarlas uno por uno en celdas para leer la absorbancia en el espectrofotómetro.

Con estos datos se pasó a realizar las siguientes graficas absorbancia vs peso seco, absorbancia vs peso húmedo y absorbancia vs conteo celular.

Se preparó una solución desconocida con la finalidad de determinar el porcentaje de error (%Error), en la realización de la práctica, utilizando los diferentes métodos empleados.

Método Indirecto

Figura 5. Metodología de Turbidimetría.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

A. Para Peso Seco y Peso Húmedo

Tabla1. Peso Seco y Peso Húmedo de las muestras conocidas de 5ml

Muestra Original

W Tubo vacío(g)

W tubo + muestra húmeda (g)

W tubo + muestra seca (g)

Peso en húmedo (g/mL)

Peso en seco (g/mL)

A 7,4625 7,9003 7,5198 0,0876 0,01146

B 6,4196 6,8065 6,4859 0,0774 0,01326

C 9,7336 10,1598 9,80321 0,0852 0,0139

PROMEDIO - - - 0,0834 0,0129

S - - - 0,0053 0,00128

CV - - - 0,0730 0,0357

Tabla 2. Peso húmedo y peso seco de las muestras desconocida de 5 ml

B. Para Turbidimetría En la Cámara Neubauer se escogió 5 celdas al azar para tener una muestra representativa de la cual se obtuvo una muestra original de 1210000000 cel. /ml.

W Tubo vacío(g)

W tubo + muestra húmeda (g)

W tubo + muestra seca (g)

Peso en húmedo (g/mL)

Peso en seco (g/mL)

6,5821 6,7484 6,5989 0,03326 0,00336

Tabla 3. Peso Húmedo, peso Seco, Absorbancia y Conteo Celular de la muestra original y de cada dilución.

Diluciones Concentración Conteo celular

(cel/ml)Absorbanci

aPeso húmedo

(g/ml)Peso húmedo

(g/ml)

Muestra original - 1210000000 2,499 0,083393333 0,012880667

4/5 0,80 968000000 2,413 0,066714667 0,010304533

3/5 0,60 726000000 2,268 0,050036 0,008243627

2/5 0,40 484000000 2,065 0,033357333 0,006594901

1/10 0,10 121000000 1,265 0,008339333 0,005275921

1/30 0,03 40333333,33 0,603 0,002779778 0,004220737

1/50 0,02 24200000 0,428 0,001667867 0,003376589

1/100 0,01 12100000 0,482 0,000833933 0,002701272

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.090

0.51

1.52

2.53

f(x) = 25.9342164450259 x + 0.701759778024647R² = 0.868199726354182

ABSORBANCIA vs. PESO HÚMEDO

Peso húmedo (g/ml)

Abso

rban

cia

Figura 6. Relación absorbancia vs peso húmedo.

Tabla 4. Porcentaje de error Ecuación y de la muestra en peso húmedo.

De la Muestra problema se obtuvo una absorbancia de 1.671 y 179000000 cel. /ml. Esto se obtuvo igual

que para muestra original, escogiendo 5 cuadrados al azar en la cámara de Neubauer.

0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.0140

0.5

1

1.5

2

2.5

3f(x) = 234.057110804077 x − 0.0652563542952396R² = 0.840756576759658

ABSORBANCIA vs. PESO SECO

Peso seco (g/ml)

Abso

rban

cia

Figura 7. Relación absorbancia vs peso seco

Tabla 5. Ecuación y porcentaje de error de la muestra en peso seco

ECUACIÓN 25,93x + 0,701

ABSORBANCIA 1,671

PESO HÚMEDO REAL 0,03326

PESO HÚMEDO TEÓRICO 0,037408407

ERROR (%) -12,47266161

ECUACIÓN 234,0x - 0,065

ABSORBANCIA 1,671

PESO SECO REAL 0,00336

PESO SECO TEÓRICO 0,007418803

ERROR (%) -120,7977208

0

200000000

400000000

600000000

800000000

1000000000

1200000000

14000000000

0.51

1.52

2.53

f(x) = 1.78738905515608E-09 x + 0.701759778024647R² = 0.868199726354182

ABSORBANCIA vs. CONTEO DE CÉLULAS

Conteo de células (cel/ml)

Abso

rban

cia

Figura 8. Relación absorbancia vs conteo celular

Tabla 6. Ecuación y porcentaje de error de la muestra en conteo celular

Según Arnáiz, et al (1992), el peso húmedo se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es

pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Demostrando una técnica útil

para grandes volúmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el

espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. Esto se puede contrastar en la Tabla 1, hay una

diferencia entre el peso húmedo y el peso seco debido a que el primero contiene agua del diluyente de la

solución. Este peso húmedo tiene una masa de 0,0834 gramos lo cual representa a 1210000000 células.

De modo que las células estarán hidratadas y gran parte de ellas podrían ser visibles.

Según Gil (2003), el recuento de células por área presentes en una solución, su coeficiente de variación se

encuentra dentro de lo aceptable si no hay mucha diferencia significativa, ya que dentro de la

determinación de biomasa, su variación podía ser significativamente cuando es menor (CV= 12,3 %),

indicando que la exactitud de la determinación varía con los laboratorios y el personal. Esto se comprueba

ECUACIÓN 2E-09x + 0,701

ABSORBANCIA 1,671

CONTEO DE CÉLULAS REAL 179000000

CONTEO DE CÉLULAS TEÓRICO 4,85E-10

ERROR (%) 100

con las muestras de peso seco y húmedo calculadas donde se obtienen valores menores al mencionado:

7.304% en cuanto a peso húmedo y 3.57% en peso seco; de lo que hay un mínimo error significativo esto

se puede atribuir por el pesado y una buena maniobrabilidad con los objetos de laboratorio.

Según Rodríguez, et al ( 2005), nos señala que para que sean visibles las trazas de turbidez es necesario

más de un millón de células por ml., como para ser medida por un espectrofotómetro. Por lo que la

turbidimetría no es un método útil para medir la contaminación de líquidos para un número relativamente

pequeño de bacterias y o levaduras. Se comprobó en la práctica con éxito en el experimento ya que tanto

la muestra original analizada como la muestra problema sobrepasaban dicha cantidad,; además, todas las

muestras de concentraciones diferentes se leyeron 550nm de longitud de onda, cercano a 540 nm,

(longitud de onda comúnmente utilizada para la determinación de crecimiento por el método de

turbidimetría en las investigaciones).

Según Toro (2005), la relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para

suspensiones diluidas de bacterias. Sus absorbancias no deben ser mayores a 0.3, ya que valores

mayores producen desviaciones. Esto se comprobó con el peso Seco de la muestra problema, su peso

real y su peso teórico, presentando estos un % de error mayores y donde su absorbancia resultó 1.671.

V. CONCLUSIONES

Se determinó la biomasa de la levadura Fleischamn mediante el método de peso húmedo, peso seco y

por turbidimetría, encontrando su Absorbancia y su variabilidad.

La determinación de biomasa mediante peso seco y peso húmedo es un método fácil y rápido de

realizar pero que también es un método impreciso debido a diversos factores que se presentan en

laboratorio.

Encontramos el factor de conversión para cada caso, logrando construir la curva de calibración y hallar

el factor de conversión en los tres métodos para determinar sus resultados teóricos comparándolos con

los reales, obtenidos en laboratorio.

Determinamos el porcentaje de error.

VI. RECOMENDACIONES

Para obtener una muestra homogénea se debe agitar la muestra antes de colocarlas en las celdas

y de esta manera evitar errores en las lecturas del espectrofotómetro.

El llenado en las celdas de la cámara de Neubauer se debe hacer correctamente para evitar que

se pierda parte de la muestra.

Calibrar el espectofómetro antes de tomar las medidas, ya que este pudo haber sido utilizado con

otras sustancias en experimentos anteriores. Del mismo modo calibrar la balanza analítica par que

nuestro porcentaje de error sea mínimo.

El llenado correcto de la muestra en la cámara, se debe realizar de modo que no se derrame en la

lámina cubre objeto la solución. De esta manera haremos el conteo.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ARNÁIZ,C., ISAC,L. Y LEBRATO, J. (2000).Determinación de la biomasa en procesos biológicos. Sevilla.

GIL, E. (2003). Elementos clave en la uniformidad de distribución de abonos. Escuela superior de

agricultura de Barcelona.

RODRÍGUEZ, E., GAMBOA, M., HERNÁNDEZ, F Y GARCÍA, J. (2005). Bacteriología General: Principios y

prácticas de laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica.

TORO R. (2005), Manual de Introducción al Laboratorio De Microbiología, editorial universidad de caldas,

2005.

ANEXOS