Elvira Maria Mendes do Nascimento Pesquisador Científico

LACEN - SP

DOENÇAS RIQUETSIAIS HUMANAS:

  Febre Maculosa

  Tifo murino

  Febre Q / Endorcardite por Coxiela

  Erliquioses

  Bartoneloses

  Angiomatose Bacilar

  Doença da Arranhadura do Gato

  Endocardite por Bartonela (projeto INCOR)

Pesquisa de anticorpos específicos para o Grupo da Febre Maculosa

- Reação de Imunofluorescência Indireta em amostras de soro pareadas (intervalo ≥ 15 dias)

64 128 256 512 1024 C +

64 128 256 512 1024 C -

Antígeno – Cultura Concentrada de Riquétsias do

Grupo Febre Maculosa

Anti IgG/M Humano Marcado com Fluoresceína

• Cor e Forma

64 128 256 512 C +

C -

1024

Negativo Positivo

A B

C D

Figura 1: Reação de IFI para Grupo Febre Maculosa: A- controle negativo, IgG (10X); B- controle negativo (40X); C- controle positivo,IgG (10X); D- controle positivo (40X)

BHI 1mL

Coágulo 5mL sangue

Pérolas de vidro Agitação no vortex

Incubar com soro IgG positivo para FM

Anti IgG Marcado com Fluoresceína

Positivo focos

Negativo

Centrifugação 2500 rpm 25°C 1 hora Incubação 37°C 5 dias

A B C

D E F

Fig 2 – Isolamento em cultura celular (Vero) identificação por Imunofluorescência indireta para riquétsias do Grupo da Febre Maculosa: A- controle negativo (10x); B- controle negativo (20x); C- controle negativo (40x); D- isolamento positivo (10x); E- isolamento positivo (20x); F- isolamento positivo (40x); Fonte: Santos et al. Fotomicroscópio Zeiss, modelo Axioskop 2 plus Fotografado por Dra Jussara Bianchi Castelli do Laboratório de Patologia do InCor-HCFMUSP.

Immunohistoquímica para Rickettsia spp

Immunohistochemical   assay   showing   granular   an3gen   staining   in   endothelium   (polyclonal   an3-­‐  Ricke:sia  an3body-­‐    X400)  

Fonte: Dra. Roosecelis A. Brasil, Centro de Patologia - IAL

LightCycler® 480 Roche

Applied Biosystems 7500 Real-Time

Life Technologies

 PCR é uma reação baseada na replicação do DNA  Extração do ácido nucléico através kit comercial (coluna de sílica)  O DNA do agente infeccioso é amplificado e o sinal dessa amplificação é captado pelo aparelho (composto fluorescente)

A FMPCR atualmente é constituído por 3 reações de qPCR:

  uma para Rickettsia spp (gene gltA, com detecção por sonda TaqMan®)

  um para riquétsias Grupo Febre Maculosa (gene OmpA, com detecção por SYBR Green)

  um controle interno endógeno (RNAse P humana, com detecção por sonda TaqMan®)

Validação dos ensaios de PCR em tempo real

Curva de concentração decrescente para reação de qPCR para Rickettsia spp analisada no ABI7500

Curva padrão de eficiência para reação de qPCR para Rickettsia spp analisado no ABI7500

Template DNA de Rickettsia rickettsii em co-cultivo de

células Vero [ ] estimada: 10+7 cópias/mL

Curva de concentração decrescente para o protocolo de qPCR para riquétsias GFM, analisada no LC480-ROCHE

LightCycler® 480 Roche

Curva dissociação dos produtos amplificados

Curva padrão de eficiência para o protocolo riquétsia GFM, analisado pelo LC480-Roche

LightCycler® 480 Roche

-mais frequentemente -Fácil processamento

-podem ser utilizados

Bacteremia •  Período (curto)

• Intensidade

vasculite aguda compatível com casos de óbito

soroconversão 1ª amostra IgG<64

40 casos Não fatais

10 positivos

30 negativos

Sensibilidade 25% Em casos não fatais

AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DA PCR EM TEMPO REAL PARA O DIAGNÓSTICO DA FEBRE MACULOSA

BRASILEIRA EM CASOS FATAIS

Nos anos de 2010 e 2012 - casos fatais suspeita clínica e/ou epidemiológica de FMB:

Concordância entre os resultados foi de 100%

Concordância entre os resultados foi baixa (kappa=0,096, p-valor=0,435, intervalo de confiança 95% de

0,336 a –0,144).

RIFI positivo=título de anticorpos tipo IgG e/ou IgM≥128

concordância entre os resultados foi baixa

(kappa=0,186, p-valor=0,005, intervalo de confiança 95% de 0,316 a –0,056).

31,6% casos como positivos para FMB

FMPCR foi um avanço o diagnóstico laboratorial da FMB

156

38

(36 casos)

152

42

(41 casos)

-2011 a partir de maio

-2012 até 26 de outubro

23%

28% Fonte: SIGH

Material de escara de inoculação/sufusão hemorrágica

Elvira Maria Mendes do Nascimento Pesquisador Científico

emmendes55@gmail.com

Fabiana Cristina Pereira dos Santos Pesquisador Científico

Sílvia Colombo

Assistente Técnica de Apoio à Pesquisa Científica e Tecnológica

Nilcéia de Lourdes Ramos Arruda Auxiliar de Laboratório