Laboratorium Laserowej Spektroskopii Molekularnej PŁ

Mikroskop (gr. μικρός mikros - "mały" i σκοπέω skopeo - "patrzę, obserwuję") – jest urządzeniem służącym do obserwacji małych obiektów, zwykle niewidocznych gołym okiem.

Pierwsze mikroskopy były mikroskopami optycznymi, w których do oświetlania obserwowanych obiektów wykorzystywano światło dzienne. Za twórców tego rodzaju mikroskopów uważa się Holendrów: Zachariasza Janssena i jego ojca Hansa Janssena . Pierwsze konstrukcje wykonali oni około roku 1590. Ze względu na słabe powiększenie (10 razy) mikroskopy nie zdobyły wtedy uznania jako narzędzie badawcze.

mikroskop Carl Zeiss 1879

Przełomu dokonał wynalazca i przedsiębiorca Antonie van Leeuwenhoek, który udoskonalił konstrukcję mikroskopu, a następnie rozwinął produkcję tych urządzeń w XVII wieku. Leeuwenhoek jako pierwszy obserwował żywe komórki –pierwotniaki, erytrocyty itp. Wykorzystanie mikroskopu przyczyniło się do ogromnego postępu w biologii. Naukowcy mogli badać, co dzieje się we wnętrzu żywych organizmów. Powstały nowe dziedziny nauki, cytologia oraz mikrobiologia. Dzięki wykorzystaniu mikroskopu możliwy był ogromny postęp w leczeniu chorób zakaźnych. W roku 1882 Robert Koch odkrył z pomocą mikroskopu bakterie gruźlicy. Mikroskop wykorzystano do obserwacji podziału chromosomów w jądrze komórkowym. W roku 1910 Thomas Hunt Morgan udowodnił, że chromosomy są nośnikami genów dając początek genetyce. W technologii materiałowej mikroskopy wykorzystywano do obserwacji struktur metali albo innych materiałów. W ten sposób możliwe stało się opracowanie doskonalszych stopów metali wykorzystywanych w przemyśle. Kolejnym przełomem stało się wykorzystanie w mikroskopie elektronów. W roku 1931 pierwszy mikroskop elektronowy skonstruowali Ernst Ruska i Maks Knoll w Berlinie. Możliwa stała się obserwacja najmniejszych struktur organelli komórkowych. W technologii wykorzystanie mikroskopów elektronowych stało się podstawą rewolucji krzemowej. Bez technik sprawdzania jakości wykonywanych w półprzewodnikach struktur nie udałoby się dokonać tak ogromnego postępu w tej dziedzinie.

W roku 1982 mikroskopia uczyniła pierwszy krok w kierunku świata atomów. Pracujący w Zurychu naukowcy Gerd Binnig oraz Heinrich Rohrer skonstruowali mikroskop STM- skaningowy mikroskop tunelowy. Pozwolił on na obserwację struktur złożonych z pojedynczych atomów. Późniejsze prace doprowadziły do budowy szeregu odmian tego mikroskopu pozwalających na badanie różnych właściwości materii w skali nanometra. Niezwykłą cechą mikroskopu STM była jego zdolność nie tylko do obserwacji atomów, ale również manipulacji nimi. Obecnie badacze przewidują, że postęp w mikroskopii przyczyni się znacznie do rozwoju nanotechnologii, która może znaleźć zastosowanie w prawie każdej dziedzinie życia.

Mikroskop jest zbudowany z: okularu, który służy do powiększenia obrazu tworzonego przez obiektyw mikroskopu, tubusa, który służy do formowania powiększonego obrazu pośredniego, śruby makrometrycznej, która służy do wstępnej regulacji odległości, śruby mikrometrycznej, która służy do ustalenia ostrości, rewolweru, który umożliwia prostą zmianę obiektywu, obiektywów, które zbierają światło wychodzące z przedmiotu i tworzą jego powiększony obraz pośredni, kondensora, który koncentruje światło formując z niego stożek, lusterka, które służy do naświetlania badanego obiektu;

Mikroskopia konfokalna jest odmianą mikroskopii świetlnej charakteryzująca się zwiększonym kontrastem, a zatem i rozdzielczością.

W zwykłej mikroskopii (szerokiego pola, w tym mikroskopie fluorescencyjnym) próbka jest oświetlana przez źródło światła w całości. W odpowiedzi na to, albo odbija światło, albo fluoryzuje, przy czym sygnały te są zbierane przez obiektyw. Obiektyw zbiera sygnał nie tylko z miejsca ogniskowania, ale z całego przekroju próbki. Powoduje to, że tło wobec sygnału z miejsca ogniskowania jest dość wysokie, co zmniejsza kontrast. Zastosowanie przesłony z małym otworem przed detektorem (na przykład kamerą CCD), odcina sygnał dochodzący spoza płaszczyzny ogniskowania, co znacznie powiększa kontrast i jakość uzyskanego obrazu.

Podstawy obrazowania konfokalnego zostały opatentowane przez Marvina Minsky'ego w 1961.

• Promień lasera pada na lustro dichroiczne o selektywnym odbiciu fal świetlnych

• Wiązka przechodzi przez lustra skanujące, które dzięki minimalnym ruchom obrotowym

mogą nią kierować • Obiektyw skupia wiązkę w jednym punkcie,

która wzbudza wyznakowany barwnikiem preparat co powoduje emisję dłuższej fali

świetlnej • Wiązka powraca tą samą drogą przez lustra

skanujące i dichroiczne, po czym natrafia na przesłonę z niewielkim otworem

• Wreszcie wiązka dociera do detektora. Taki sygnał zostaje zamieniony przez

przetworniki analogowo-cyfrowe na postać cyfrową i przeanalizowany przez komputer.

Zasada działania mikroskopu konfokalnego

http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintrobasics.html

Mikroskopia konfokalna ma wiele zalet w porównaniu z konwencjonalną

mikroskopią optyczną. Cechują ją wysoki kontrast i rozdzielczość. Światło, które

jest wzbudzane w punktach leżących poza ogniskiem jest eliminowane przez

system pinholi i nie bierze udziału w tworzeniu obrazu. Wynikiem tego jest

obraz niezawierający składowych pochodzących z płaszczyzn innych niż ogniskowa. Dzięki temu rozdzielczość

i kontrast w tym mikroskopie są lepsze niż w zwykłym mikroskopie

fluorescencyjnym.

http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintrobasics.html

Porównanie skanowania szerokopasmowego i punktowego w mikroskopii konwencjonalnej i konfokalnej

porównanie obrazów nabłonka skrzydła motyla barwionego jodkiem propidyny

Probe Ex (nm) Em (nm) MW Notes

Hydroxycoumarin 325 386 331 Succinimidyl ester

Aminocoumarin 350 445 330 Succinimidyl ester

Methoxycoumarin 360 410 317 Succinimidyl ester

Cascade Blue (375);401 423 596 Hydrazide

Pacific Blue 403 455 406 Maleimide

Pacific Orange 403 551

Lucifer yellow 425 528

NBD 466 539 294 NBD-X

R-Phycoerythrin (PE) 480;565 578 240 k

PE-Cy5 conjugates 480;565;650 670 aka Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red

Znaczniki

http://www.mitr.p.lodz.pl/raman

http://www.witec.de

Zamiast wykrywać sumaryczną intensywność światła z danego

punktu próbki, sygnał rozkłada się na widmo za pomocą

spektrometru

Można uzyskiwać różne widma: absorpcji, transmisji,

odbiciowe, fluorescencji, fotoluminescencji, Ramana, itp.

Technika Ramana znakomicie współgra z mikroskopią

konfokalną ze względu na wysoką specyficzność wykrycia

struktur chemicznych, brak konieczności skomplikowanego

przygotowana próbek, w odpowiednich warunkach – dobrą

jakość sygnału

ZALETY MIKROSKOPII KONFOKALNEJ: Zastosowanie pinhola przed detektorem (na przykład kamerą CCD), odcina sygnał dochodzący spoza płaszczyzny ogniskowania, co znacznie powiększa kontrast i jakość uzyskanego obrazu – ostrość i barwność.

Możliwość rekonstrukcji obrazu 3D i 4D.

Pozwala na rejestrowanie obrazów cienkich warstw preparatu, czyli przekrojów optycznych badanych obiektów. Z tego powodu jest on często stosowany do rejestracji serii przekrojów optycznych na różnych głębokościach preparatu.

Eliminuje problem poświaty wynikającej z warstw preparatu leżących poza płaszczyzną ostrości.

Oferuje lepszą rozdzielczość niż tradycyjna mikroskopia optyczna.

Możliwość wizualizacji żywych preparatów.

WADY MIKROSKOPII KONFOKALNEJ : Wpływ czynników otoczenia.

Blaknięcie.

Fototoksyczność.

Nadal gorsza rozdzielczość niż w mikroskopie elektronowym.

Wysoka cena.

http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintrobasics.html

Przykłady zastosowań:

1. Analiza tkanek

gruczołu

piersiowego

ex-vivo

http://www.mitr.p.lodz.pl/raman

http://www.witec.de

2. Analiza komórek skóry in-vivo

skóra sucha skóra nawilżona

http://www.horiba.com

3. Widma komórek bakterii

widok kolonii bakterii

widmo Ramana pojedynczej komórki bakterii

http://www.horiba.com

4. Analizy farmaceutyczne

kofeina

kwas acetylosalicylowy

paracetamol- N-(4-

hydroksyfenylo)acetamid

widma Ramana

składników tabletki

http://www.horiba.com

5. Analiza polimerów

http://www.witec.de

Laboratorium Laserowej Spektroskopii Molekularnej PŁ

Lasery impulsowe znalazły szerokie zastosowanie w spektroskopii rozdzielczej w czasie. Ze względu na rozdzielczość czasową metody, zależną od długości trwania impulsu, spektroskopię dzielimy na: nanosekundową (10-9s)

pikosekundową (10-12s)

femtosekundową (10-15s)

Do najczęściej stosowanych metod spektroskopowych rozdzielczych w czasie należą: Techniki badające zanik fluorescencji

Techniki typu wiązka pompująca-wiązka sondująca (pump-probe) Metody nieliniowej wymuszonej spektroskopii Ramana

Echo fotonowe

Dudnienia kwantowe (quantum beats)

Techniki spektroskopii laserowej rozdzielczej w czasie dostarczają informacji o dynamice różnych procesów takich jak: Relaksacja reorientacyjna

Solwatacja nadmiarowego elektronu

Dynamika różnych reakcji np. izomeryzacja cis- trans; przeniesienie protonu w stanie wzbudzonym, przeniesienie elektronu, zmiany konfirmacyjne Rozfazowanie wibracyjne T2 w podstawowym stanie elektronowym

Relaksacja wibracyjna T1 w podstawowym i wzbudzonym stanie elektronowym Wibracyjna predysocjacja

Schemat ilustrujący metodę wiązki pompującej -sondującej

próbka wiązka sondująca laser detektor

wiązka pompująca

c

xt

t- opóźnienie wiązki sondującej względem pompującej x- różnica dróg optycznych c-prędkość światła

sygnał uzyskiwany w spektroskopii absorpcyjnej

metodą wiązki pompującej-sondującej

Częstość wiązki pompującej lub sondującej można zmieniać w szerokich granicach za pomocą przestrajalnych źródeł światła, takich jak: Generatory parametryczne (OPG)

Oscylatory parametryczne (OPO)

Wzmacniacze parametryczne (OPA)

Źródła białego kontinuum (WC- emitujące niemonochromatyczne promieniowanie w szerokim zakresie)

laser próbka detektor wiązka sondująca

wiązka pompująca

OPO

Metody generowania krótkich impulsów:

Q - switching

synchronizacja modów

aktywna: modulowanie długości rezonatora L przez wprowadzenie w drgania jednego ze zwierciadeł, zastosowanie przetwornika optoakustycznego pasywne: nasycające się absorbenty, autosynchronizacja, modulowanie współczynnika wzmocnienia ośrodka aktywnego

periodyczne zmiany współczynnika załamania ośrodka przez zmianę gęstości wywołane fala dźwiękową

przetwornik optoakustyczny

metoda nasycających się absorbentów

WZMOCNIENIE

Kryształ Ti+3:Al2O3

527 nm YLF pompowanie powodujące inwersję obsadzeń

Tsunami 800 nm

Jeżeli impuls przechodzi przez ośrodek nieliniowy, w którym utrzymywana jest inwersja obsadzeń (przez pompowanie z innego źródła) to impuls przechodząc przez ośrodek wywołuje emisję wymuszoną. W rezultacie wychodzący impuls zostaje wzmocniony.

wzmacniacz regeneratywny (wielokrotne przejście światła po tej samej drodze w rezonatorze).

M1 M2

/4 PC2 PC1

ośrodek aktywny (Ti+3:Al2O3)

Merlin (YLF) 250 ns, Q-switch

P thin layer polarizer

Tsunami-stretcher

Input

Output

Analiza fotouczulaczy

MgPcS4-H2O, c=1x10-5M ZnPcS4-H2O, c=1x10-5M

MITR

Analiza wodnych roztworów elektrolitów

LOA MITR

Dynamika femtosekundowa DPPC

MBI - Berlin MITR

porównania próbek DPPC „wet” i „dry”

LABORATORIUM LASEROWEJ SPEKTROSKOPII MOLEKULARNEJ

Politechnika Łódzka Międzyresortowy Instytut Techniki Radiacyjnej

93-590 Łódź Wróblewskiego 15

tel:(48-42) 6313175, 6313162, 6313188 fax:(48-42) 6840043

http://www.mitr.p.lodz.pl/raman

Dr Beata Brożek-Płuska

Politechnika Łódzka Międzyresortowy Instytut Techniki Radiacyjnej

93-590 Łódź Wróblewskiego 15

tel:(48-42) 6313162, 6313188 fax:(48-42) 6840043

e-mail: brozek@mitr.p.lodz.pl

Lasery światłowodowe.

Zasada działania światłowodu.

Zasada działania mikroskopu konfokalnego.

Sposoby pomiaru impulsu femtosekundowego.