IV. AMPLIFIKASI DNA DENGAN MENGGUNAKAN PCRA. Pendahuluan1. Latar BelakangReaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.PCR merupakan sebuah inovasi besar dalam perkembangan biologi molekuler. PCR telah menjadi suatu metode yang telah merevolusionerisasi berbagai cabang ilmu biologi dan terapannya dalam penelitian biologi molekuler. PCR ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983. Prinsip PCR merupakan amplifikasi (perbanyakan) segmen tertentu dari DNA yang dibatasi oleh sepasang primer oleh enzim DNA polymerase yang mengkatalisis reaksi polimerisasi deoxynucleotida trifosfat (dNTP) dari arah 5-3.PCR menggunakan prinsip dari replikasi DNA, namun berbeda dengan replikasi DNA bahwa PCR hanya mengamplifikasi daerah tertentu (sekuens) dari gen spesifik atau gen spesifik tertentu yang dikenali dan dibatasi oleh sepasang primer, yaitu primer forward dan primer reverse. Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan biologi molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus, Genetic profiling in forensic, legal and bio-diversity applications, biologi evolusi, Site-directed mutagenesis of genes dan mRNA Quantitation di sel ataupun jaringan.2. Tujuan PraktikumTujuan dari praktikum acara amplifikasi DNA dengan menggunakan PCR yaitu untuk:a. Mengetahui apa yang dimaksud dengan Polymerase Chain Reaction (PCR). b. Mengetahui apa saja tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR). c. Mengetahui alat dan bahan apa saja yang dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR). d. Mengetahui apakah komponen-komponen yang dibutuhkan dalam proses Polymerase Chain Reaction (PCR). e. Mengetahui apa saja variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR).3. Waktu dan Tempat PraktikumPraktikum bioteknologi acara amplifikasi DNA dengan menggunakan PCR dilaksanakan pada Senin, 20 April 2015 bertempat di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta.B. Tinjauan PustakaReaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis. PCR memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA. Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi. Hal ini didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya. Spesifitas PCR terletak pada kemampuannya mengamplifikasi sehingga menghasilkan produk melalui sejumlah siklus. Keakuratan yang tinggi karena DNA polymerase mampu menghindari kesalahan pada amplifikasi produk. Masalah yang berkenaan dengan PCR yaitu biaya PCR yang masih tergolong tinggi (Zuhriana 2010).Terdapat tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat. Dasar siklus PCR meliputi denaturation (95C) selama 30 detik, annealing (5560C) selama 30 detik, extension (72C) waktu tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan sebagai produk amplifikasi. Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, enzim DNA polimerase yang thermostabil, buffer PCR, ion Mg 2+, dan thermalcycler (Fatchiyah 2013). Proses PCR berjalan pada temperature tinggi dan menggunakan mesin thermal cycler yang dapat diprogram untuk mengatur siklus annealing, elongasi, dan denaturasi. Proses kerja PCR melalui beberapa tahapan perubahan suhu yang bersiklus, antara lain denaturasi DNA templat pada suhu 92-95oC, penempelan primer pada DNA templat (annealing) pada suhu 50-60oC, pemanjangan primer pada temperature 72oC (extension/elongation) (Ridzky 2012).Keuntungan metode RAPD-PCR adalah diperoleh informasi yang lebih akurat (Nur 2008). Prosedur amplifikasi dengan RAPD-PCR yaitu pemanasan pendahuluan pada 95C selama 5 menit sebanyak satu siklus diikuti 45 siklus yang terdiri atas pemanasan untuk denaturasi pada 95C selama 1 menit, anealing padasuhu 36C selama 1 menit, pemanjangan pada suhu 72C selama 2 menit, dan pada siklus terakhir ditambah waktu pemanjangan pada suhu 72 C selama 10 menit. PCR sering gagal karena proses denaturasi yang tidak sempurna. Suhu yang diprogramkan biasanya 95C selama 30 detik atau 97C selama 15 detik. Namun untuk DNA yang mengandung G+C tinggi, suhu perlu dinaikkan atau waktu denaturasi diperpanjang tetapi tidak terlalu lama dan suhunya tidak terlalu tinggi karena akan merusak enzim Taq D-pol yang umumnya mempunyai waktu paruh 40 menit pada 95C (Dwi 2009).Jumlah siklus dapat mengubah pola-pola DNA produk RAPD. Denaturasi awal pada suhu 95oC berfungsi memisahkan utas ganda DNA serta membuat protease menjadi tidak aktif. Suhu penempelan primer 35oC sampai 36oC direkomendasikan oleh Operon Technologies, sedangkan suhu pemanjangan 72oC selama 2 menit cukup untuk mengamplifikasi produk yang berukuran besar (sampai 4 kb) (Made 2009). Penanda molekuler yang banyak digunakan dalam analisis keragaman genetik tumbuhan, salah satunya adalah RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Marka molekuler ini dapat berbasis PCR (Polymerase Chain Reaction) yang banyak digunakan dalam mengidentifikasi keragaman pada tingkat intraspesies maupun antarspesies. Teknik RAPD lebih murah, mudah dilakukan, cepat memberikan hasil, menghasilkan polimorfisme pita DNA dalam jumlah banyak dan mudah memperoleh primer acak yang diperlukan untuk menganalisis genom semua jenis organisme. Teknik RAPD tidak membutuhkan informasi awal tentang urutan basa suatu spesies, yang diperlukan adalah DNA yang relatif murni dan dalam jumlah yang relatif kecil. Oleh karenanya RAPD dapat diterapkaan pada hampir semua jenis tanaman (Indah 2012). Penggunaan RAPD selalu memperlihatkan keragaman lebih tinggi daripada alozim dan RFLP, sehingga sangat mendukung upaya analisis keragaman genetik terutama jika latar belakang genomnya belum diketahui. (Agus 2012).C. Metode Praktikum1. Alata. Polymerase Chain Reaction (PCR)2. Bahana. PCR mix (Taq-DNA polimerase, MgCl2, buffer, dNTPs)b. Aquabidesc. Primer mixd. DNA template3. Cara Kerjaa. Mencampurkan komponen bahan kedalam mikrotube.b. Menambahkan 50 l lisat sel dan campurkan sampai homogen, kemudian menambahkan 50 l minyak parafin keatas campuran PCR.c. Melakukan amplifikasi secara manual atau dengan menggunakan thermalcycler otomatis yaitu dengan menginkubasi pada suhu:1) 950 C selama 1 menit2) 550 C selama 1 menit3) 720 C selama 1 menitd. Mengulangi langkah inkubasi pada thermalcycler sampai 35 siklus.e. Menginkubasi tabung pada suhu 720 C selama 5 menit.f. Mengambil 2 l sampel DNA hasil amplifikasi kemudian melakukan elektroforesis pada gel agarose untuk mengetahui hasilnya.D. Hasil dan Pembahasan1. Hasil PengamatanPCR Mix

Primer mix

DNA template

Aquadest

PCR Mix

1. Menyiapkan 4 bahan utama yang disebut PCR primer yang terdiri dari taq DNA polymerase, Mgcl2, DNTPS dan buffer ekstruksi sebanyak 10 l yang dimasukkan ke dalam microtube

10 l

7 l Aquadest

2. Menambahakan aquades 7 l Cold H2O CH clumer

Primer

DNA template

3. Menambahkan primer sesuai yang diinginkan sebesar 1 l

4. Memasukkan microtube ke dalam PCR di dalam PCR akan terjadi 3 proses yaitu denaturasi annealing dan extension.

5. Hasil Amplifikasi DNA diperoleh

Gambar 4.1 Bagan cara kerja amplifikasi DNA menggunakan PCRExtension pada suhu 720 C selama 1 menitTerjadi:Penempatan primer pada masing masing utas tunggal DNAProses terus berulang sampai 35 siklusDenaturasi pada suhu 950 C selama 1 menitTerjadi:Rantai DNA ganda memisah menjadi untaian DNA tunggal

Annealing pada suhu 550 C selama 1 menitTerjadi:Penempatan primer pada masing masing utas tunggal DNA

Gambar 4.4 Bagan Siklus Polymerase Chain Reactions (PCR)

2. PembahasanPolymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Dengan diketemukannya teknik PCR di samping juga teknik-teknik lain seperti sekuensing DNA, telah merevolusi bidang sains dan teknologi khususnya di bidang diagnosa penyakit genetik, kedokteran forensik dan evolusi molekular.Komponen-komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah templat DNA, sepasang primer yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates), buffer PCR, magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA. Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju. Penyiapan DNA templat untuk proses PCR dapat dilakukan dengan menggunakan metode lisis sel ataupun dengan cara melakukan isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid dengan menggunakan metode standar yang ada.Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3 yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Pada proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus OH pada ujung 3 dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA templat. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara).Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Menurut Zuhriana (2010) enzim ini diperoleh dari Eubacterium yang disebut Thermus aquaticus, spesies ini diisolasi dari taman Yellowstone pada tahun 1969. Enzim polimerase taq tahan terhadap pemanasan berulang-ulang yang akan membantu melepaskan ikatan primer yang tidak tepat dan meluruskan wilayah yang mempunyai struktur sekunder. Aktivitas polimerase DNA bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi. Menurut Fatchiyah (2013) Denaturasi untai ganda DNA merupakan langkah yang kritis selama proses PCR. Temperatur yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan untai ganda DNA. Temperatur pada tahap denaturasi pada kisaran 92-950 C, suhu 940 C merupakan pilihan standar. Denaturasi DNA yang memiliki kandungan GC cukup sulit. Guanin-Cytosine memiliki ikatan yang lebih kuat dibanding ikatan Adenin-Thymine sehingga untuk memisahkannya membutuhkan temperatur denaturasi yang tinggi, akan tetapi kemampuan bertahan Taq DNA Polymerase menurun secara tajam pada temperatur sekitar 95 0C. Annealing merupaka proses pengenalan (annealing) suatu primer terhadap DNA target tergantung pada panjang untai, banyaknya kandungan GC, dan konsentrasi primer itu sendiri. Optimalisasi temperatur annealing dimulai dengan menghitung Melting Temperature (Tm) dari ikatan primer dan DNA template, namun pada umumnya suhu antara 50-60 0C. Pada tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan bergerak dari ujung 5 menuju ujung 3 dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan. Pada setiap satu kilobase (1000bp) yang akan diamplifikasi memerlukan waktu 1 menit.

Teknik PCR dapat dimodifikasi ke dalam beberapa jenis diantaranya: a) Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), metode ini digunakan untukmembedakan organisme berdasarkan analisis model derifat dari perbedaan DNA. b) Inverse-PCR, metode ini digunakan ketika hanya satu sekuen internal yang diketahui.c) Nested-PCR, proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi pada produk selama amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak diperlukan.d) Quantitative-PCR, digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil produk PCR. Metode ini secara tidak langsung digunakan untuk mengukur kuantitas, dimulai dari jumlah DNA, cDNA, atau RNA.e) Reverse Transcriptase (RT-PCR), metode ini digunakan untuk amplifikasi, isolasi atau identifikasi sekuen dari sel atau jaringan RNA.f) Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) bertujuan untuk mendeteksi polimorfisme pada tingkat DNA (Zuhriana 2010).Menurut Indah (2012) teknik RAPD memiliki beberapa kelebihan antara lain lebih murah, mudah dilakukan, cepat memberikan hasil, menghasilkan polimorfisme pita DNA dalam jumlah banyak dan mudah memperoleh primer acak yang diperlukan untuk menganalisis genom semua jenis organisme. Teknik RAPD tidak membutuhkan informasi awal tentang urutan basa suatu spesies, yang diperlukan adalah DNA yang relatif murni dan dalam jumlah yang relatif kecil. Oleh karenanya RAPD dapat diterapkaan pada hampir semua jenis tanaman.Menurut penelitian yang dilakukan oleh Agus (2012) Teknik PCR-RAPD memiliki kelemahan yaitu dapat terjadi positif semu jika reaksi yang dipergunakan mengandung kontaminan yang menyebabkan belum jelasnya gambar hasil PCR-RAPD DNA pada suatu tanaman. Sehingga masih diperlukannya suatu prosedur isolasi DNA untuk meminimalkan senyawa-senyawa kontaminan yang dapat mengganggu reaksi PCR seperti polisacharida dan metabolit sekunder. Keberadaan polisakarida dan metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam isolasi asam nukleat. Struktur polisakarida yang mirip dengan asam nukleat akan menyebabkan polisakarida tersebut akan mengendap bersama dengan asam nukleat.E. Kesimpulan dan Saran1. Kesimpulana. Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro.b. Tahapan PCR meliputi denaturasi pada suhu 950C selama 1 menit, annealing pada suhu 550C selama 1 menit dan ekstension pada suhu 720C selama 1 menit serta berlangsung hingga 35 siklus.c. Alat yang digunakan pada proses PCR yaitu Thermalcyler dan terdapat 4 komponen/bahan utama pada proses PCR yaitu PCR mix Taq-DNA polimerase, MgCl2, buffer, dNTPs.d. Variasi PCR meliputi Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Inverse-PCR, Nested-PCR, Quantitative-PCR, Reverse Transcriptase (RT-PCR), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD).2. SaranPraktikum amplifikasi DNA menggunakan PCR akan lebih baik bila praktikan melaksanakan metode tersebut secara langsung. Penjelasan melalui video hanya digunakan sebagai visualisasi proses yang terjadi saat amplifikasi PCR berlangsung. Buku petunjuk praktikum pada acara ini perlu diperbaiki formatnya supaya praktikan dapat memahami proses praktikum yang akan dilaksanakan.DAFTAR PUSTAKAAgus Z 2012. Optimasi Proses PCR-RAPD Anggrek Phalaenopsis Sp. yang Telah Diperlakukan dengan Colchicine. GAMMA Vol. 1(2): 155-161.Dwi WA 2009. Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya dan Jeruk dengan Menggunakan Modifikasi Bufer CTAB. Buletin Teknik Pertanian Vol. 14(1): 12-16.Fatchiyah 2013. Polymerase Chain Reaction: Dasar Teknik Amplifikasi DNA. http://fatchiyah.lecture.ub.ac.id/. Diakses pada tanggal 5 Mei 2015.Indah FL, M Restu, Tutik K 2012. Optimalisasi Suhu dan Lama Inkubasi dalam Ekstraksi DNA Tanaman Bitti (Vitex cofassus Reinw)Serta Analisis Keragaman Genetik dengan Teknik RAPD-PCR. J. Sains & Teknologi Vol.12(3): 265-276.Made P 2009. Optimalisasi Ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada Grevillea Spp. (Proteaceae). J. Biologi Vol.8(1): 12-16.Nur IJ, Liliek S, Arifin NS. Analisis Kekerabatan Mentimun (Cucumis sativus L.) Menggunakan Metode RAPD-PCR dan Isozim. Biodiversitas Vol. 9(2): 99-102Ridzky A 2012. Polymerase Chain Reaction. http://ridzky_thermusaquaticus-fst09.web.unair.ac.id/. Diakses pada tanggal 5 Mei 2015Zuhriana KY 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek Vol. 5(6).