lapoptose dominique kerboeuf et yves le vern inra, iasp, 37380 nouzilly
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L’apoptose
Dominique Kerboeuf et Yves le VernINRA, IASP, 37380 Nouzilly
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I. Définitions et processus
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La mort cellulaire
• 2 types de mort cellulaire :–apoptose–Nécrose
• Apoptose = Mort cellulaire « programmée » ou « Programmed Cell Death » (PCD)
• PCD = phénomène essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques
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Rôles de la mort cellulaire
• Elimination des « surplus » de cellules saines :– Embryologie (cavités, morphogénèse,
structures vestigiales, cellules « en trop »)– homéostasie = constance de la masse
cellulaire– processus physiologiques (cellules
mammaires, endomètre, cellules épithéliales…)
• Suppression des cellules endommagées (défauts génétiques, vieillissement, maladies, agents toxiques…)
• Régulation des populations cellulaires (ex. élimination régulée de certaines populations cellulaires immunitaires)
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Apoptose et Nécrose
• Leurs mécanismes et modalités de déclenchement
• la morphologie des cellules• les conséquences tissulaires• leurs significations biologiques
Se différencient par :
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Apoptose vs Nécrose
• Atrophie
• Intégrité organelles et membrane
• Condensation du noyau
• Bourgeonnement de la membrane
• Fragmentation (« corps apoptotiques »)
• Phagocytose / C voisines
• Pas d ’inflammation
• Turgescence
• Lyse des organelles et des membranes
• Pas de condensation
• Rupture des membranes
• Libération du contenu cellulaire
• Lyse de la chromatine
• Phagocytose tardive
• Inflammation
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Nécrose
Apoptose
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Photo Molecular Probes
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1. Nécrose : membrane et organellesAltérées, noyau + conservéx 10 000 (TEM)
2. Apoptose (A) réarrangement de la chromatine (vs normal N), membrane ++ x 8000 (TEM)
3. Nécrose (SEM)x 5000
4. Apoptose (SEM) bourgeonnementsx 5000
5. Cellule normale : pores nucléairesx 30 000 (FF)
6. Apoptose : confluence des pores nucléairesx 35 000 (FF)
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Remarques
• Etats intermédiaires : – facteurs déclenchants communs– importance des ressources énergétiques
(ATP)– succession apoptose puis nécrose
• Etat apoptotique « fugitif » inaperçu (phagocytose très rapide)
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Un schéma simple : Caenorhabditis elegans
3 étapes :1) apparition de signaux (externes ou internes)2) activation de protéases cellulaires3) formation des « corps apoptotiques » et phagocytose
EGL-1 ----> CED-9 ----> CED-4 ----> CED-3 ----> Apoptose+ CED-3 activé
Membrane C Etape intra cellulaire
Inactivation Inactivation
Signal
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Schéma général de l ’apoptose
Mitochondrie
AIFCytochrome C
Caspase 9
Caspases effectricesCaspase 3 (Caspases 6 et 7)
Bcl2-pro
Bcl2-anti
Conditions physico-chimiquesCa ++
ADN, noyau
P53
Cyclines
TNFFas
Caspase 8
NKPerforinGranzyme B
T cellCD8
Dégranulation
Récepteurs de mort
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Les signaux déclencheurs
• Déclencheurs extra-cellulaires :– Souvent communications entre cellules– insuffisance de signaux suppresseurs de
« PCD »– augmentation de signaux inducteurs
• Déclencheurs intra-cellulaires– réponse à des stimuli ou à des perturbations
métaboliques
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!
Combinaison des 2 types de signaux
Les récepteurs ont des rôles multiples(ex prolifération, différenciation, survie)
Rôle différent du récepteur selon type cellulaireex. récepteurs des stéroïdes
Différents mécanismes d ’inductionsouvent associés
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Insuffisance de signaux suppresseurs
• Cultures cellulaires : concentration, sérum, diverses molécules solubles ou liées à la membrane (variations selon le type cellulaire)
• Liaison cellules cibles – ex. neurones = adaptation au nombre de cibles
Augmentation de signaux inducteurs
Ex = perte queue des têtards = rôle de l ’hormone thyroïdienne
Signaux extra-cellulaires
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Signaux intra-cellulaires
= lésions de la cellule produites par :drogues, toxines, chaleur, radiations, hypoxie, virus…qui ne sont pas des « inducteurs » spécifiques
= « seuil de lésions » déclenchement de la PCD
= activation des caspases, de protéines proapoptotiques (voie p53 dépendante) ou protéines kinases
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Induction in vitro
Fas ou Ac anti Fas (CD95)TNF ou ligands du TCR
Pas de sérum ou de facteur de croissanceUVH2O2
GlucocorticoidesIonophore calciumCamptothecine
Contact lymphocytes T cytotoxiques ou NK activés
+ concentration cellulaire, équilibre de populations
Temps nécessaire = 2 à 6 h
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Voie Fas-L (CD 95) Fas
Membrane cellulaire
Fas-Ligand
Fas (trimérisation)
FADD Fas Associated protein with Death Domain
Pro Cas 8
Cas 8Pro Cas 3 Autres Cas
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Apoptosome
(AIF)
m
Cytochrome C
dATP
Apaf-1Apaf-1
Pro Cas 9
Pro Cas 9
Cyt C
Cyt CCaspase 9
AIF = Apoptosis Inducing FactorApaf-1 = Apoptosis protease activating factor 1
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Les caspases
= C aspases
14 caspases et pro-caspases
Cystéines protéases, résidus acide aspartique
3 groupes, selon affinité de substrat I = 1, 4, 5 ---> inflammationII= 2, 3, 7 + CED-3 ---> apoptoseIII = 6, 8, 9 ---> «
Activation des caspases « entre elles » = « cascade » irréversible
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Rôle très important de la caspase 3exécuteur-clé (qq soit le stimulus)
Régulation de la cascade par des protéines activatrices inhibitrices
APAF1 Bcl2 FADDRIPFLASHBcl2
Activation en présence de : ATP + cytochrome C(rôle de la mitochondrie)
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La famille des Bcl2
Action sur les membranes mitochondriales = libération ou non du cytochrome C (proApo ou antiApo)
Bax Bak Bok Bik Bin Bad Bid…Mbrane mitochondrie(Bad Bid = cytosol)
Bcl2* Bclxl* Bclw Mcl1 Nr13 Al/Bfl1(*= inhibe Cas9)
+ formation homodimères ou hétérodimères= régulation
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II. Méthodes d’analyse de l’apoptose
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* Membranes cellulaires= Translocation des phosphatidylsérines (Annexin V)
* Mitochondries= Potentiel de membranes (sondes fluorescentes)= Libération du cytochrome C (Ac ELISA)= Libération de AIF « Apoptosis inducing factor » (Ac ELISA)
* Noyau= Clivage de l ’ADN
- Ac anti-histones- fragments (180 pb) : gel d ’agarose (« DNA ladder »)- TUNEL ou TdT : extrêmités 3’OH- nucléosomes (ELISA)
= Libération des « Nuclear Matrix Proteins » (NMPs) Ac
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* Dosages de molécules= Récepteurs des signaux Ac FAS-L (ou Apo-1 ou CD95) TNF
= CaspasesAc ou activités enzymatiques (substrats spécifiques) ==> fluorescence)
= Protéines régulatrices (pro ou anti) Ac
= Glutathion
= calcium
* Gènes impliqués
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Cytométrie en flux et étude de l’apoptose
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Principe de la cytométrie en flux
• Plusieurs paramètres simultanément pour chaque cellule (jusqu'à 11 paramètres dont 8 fluorescences)
• Sélection de populations (analyse et tri)
• Analyse de cellules vivantes, grand nombre en peu de temps
• Cellule par cellule, quantification de la fluorescence
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2 types de signaux
• Signaux de diffusion de lumière
diffusion frontale de la lumière = FSC = Forward Scatter
diffusion latérale de la lumière = SSC = Side Scatter
• Signaux de fluorescence
couleur d’émission de fluorescence : violet, bleu, vert, jaune, orange, rouge
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Spectres d’excitation et d’émission de la fluorescéine
Spectre d’excitation
Spectre d’émission
Invitrogen Molecular Probes
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Analyse monoparamétrique : exemple la fluorescence
Intensité de fluorescence verte => échelle exprimée en unités arbitraires ou canaux
Nom
bre
de c
ellu
les
par
class
e d
’inte
nsi
té
(« c
anal »)
Témoin : autofluorescence des cellules
Après marquage spécifique
Population pure => une gausssienne
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Analyse biparamétrique : exemple de deux fluorescences
• double marquage : amélioration de la discrimination entre les populations
• cellules positionnées en fonction coordonnées sur les 2 axes
Intensité de fluorescence verte
Inte
nsi
té d
e fl
uore
scence
ro
uge
Population doublement marquée
Populations simplement marquées
Population non marquée
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Analyse multiparamétrique
Sélection des cellules sur les paramètres de diffusion de lumière
![Page 33: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/33.jpg)
Analyse multiparamétrique
Marquage avec un anticorps un anti-lymphocytes T
Cellules vivantes
Cellules vivantes
Cellules en apoptose
Cellules en apoptose
Cellules mortes
Cellules mortes
Intensité de fluorescence orange
Nom
bre
de c
ellu
les
par
class
e d
’inte
nsi
té (
« c
anal »)
région 1
région 2
![Page 34: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/34.jpg)
• Pourquoi trier ? Vérification des analyses Autres analyses (cytométrie ou autre méthodologie) Mise en culture (tri « stérile »)
• Comment trier ? Une à quatre populations différentes Vitesse de tri maximum 50000 Cellules/s Support : lames, tubes, plaques à microtitration Milieu : « coussin », PBS, RPMI… (+ SVF) La pureté, la viabilité, la stérilité
Le tri et ses options
![Page 35: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/35.jpg)
Principe du tri par cytométrie
Buse
Drop delay
Rayon laser
Gouttelettes détachées
Plaques de déflection
+ 2500 V- 2500 V
AnalyseF
A
« Break off »
![Page 36: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/36.jpg)
Exemple de tri par cytométrie
Analyse avant tri Réanalyse après tri
Drouet-Viard (2001)
99.6 % de pureté
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Etapes principales de l’apoptose analysées en cytométrie
Récepteurs de mort
caspaseidentification activité
noyauFragmentation
« Nuclear Matrix Protein (NMP)
mitochondriemembrane
récepteursaltérations
Potentiel de membrane
calcium
Pro Bcl2AntiBcl2
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Mise en évidence des récepteurs de mort
Anticorps dirigés contre lesrécepteurs de mort
fonctionnels :
• anti Fas (anti CD95)
• anti TRAIL (anti DR3,DR4,DR5…)
• anti DCR2, DCR3…
=> réaction immunofluorescence directe ou indirecte
Kyung-Mi Kim et al (2000). Experimental and molecular medicine 32, 246-254.
Fixation ligand spécifique => formation complexe multiprotéique
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Mise en évidence des protéines agissant au niveau mitochondrial
Anticorps dirigés contre
• les protéines proapoptotiques: Bax
• les protéines antiapoptotiques : Bcl2
• la forme tronquée de Bid (obtenu après action caspase 8)
Perianayagam et al (2003). European Journal of Clinical Investigation 33, 905-911.
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Variation du calcium intracellulaire
• mesure du flux de Ca++ => Fluo3
• mesure quantitative du Ca++ :
- Fura-2 modification spectre d’excitation
- Indo-1 modification spectre d’émission fluorochrome libre : émission 475nm (B)fluorochrome lié : émission 400nm (A)
mesure ratiométrique sonde liée/sonde libre
Etape précoce de l’apoptose => augmentation du calcium
intra-cellulaire
Spectre d ’émission de l ’indo-1
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Variation de calcium intracellulaire utilisation du fluo-3
Cao QZ et al (2005). World J Gastroenterol Apr 21;11(15):2255-9.
Cellules témoins
Cellules traitéesVérapamil
WangXJ, Xu JX (2005). Neuroscience Letter Mar 11, 376(2) : 127-32.
Induction apoptose par la roténone sur des cellules neuronales
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Modifications membranaires
• Modification graduelle de la perméabilité membranairepénétration plus facile : Hoechst 33342 ou Yo-Pro1
• Perte de l’assymétrie membranaire : externalisation des phospholipidesAnnexineV reconnaît les phosphatidylsérines
• Etude du désordre lipidique membranaireexternalisation des phosphatidylsérines => modification organisation membranaire => augmentation fixation merocyanine 540
discrimination cellules mortes-cellules vivantes
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Externalisation des phosphatidylsérines
Intensité de fluorescence verte (annexine V FITC)
Inte
nsi
té d
e
fluore
scence
rouge (
7A
AD
)
Résultats A-M Chaussé (1996)
Cellules vivantes
Cellules mortes
Cellules en apoptose
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Externalisation des phosphatidylsérines
Lignée de cellules T humaines, coloration annexineV Alexa 488 et Iodure de propidiumPhoto : Molecular Probes
Cellule en nécrose
Cellule en apoptose
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Modifications dans la mitochondrie
Action protéines proapoptotiques (Bax…)
Ouverture des pores de transition
• modification équilibre ionique : dépolarisation de la membrane mitochondriale
• libération cytoplasmique du cytochrome c
• libération cytoplasmique des protéines SMAC/Diablo
• libération cytoplasmique des AIF
![Page 46: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/46.jpg)
Mise en évidence de la dépolarisation de la membrane
• mitochondries fonctionnelles = multimères => fluorescence rouge
•mitochondries non fonctionnelles = monomères => fluorescence verte
Intensité de fluorescence verte
Inte
nsi
té d
e
fluore
scence
rouge
D’après Salvioli S. et al. (2000) Cytometry 40:189_197
Cellules normales
Cellules en apoptose
Cellules mortes
fluorochromes cationiques et lipophiles incorporation potentielle dépendante=> variation du potentiel mitochondrial
exemple : DiOC6, Rhodamine 123, MitoTracker, JC-1…
JC-1
![Page 47: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/47.jpg)
Incorporation d ’un fluorochrome cationique : le JC-1
Coloration d ’une lignée de fibroblastes au JC-1, différents temps de stimulation de l ’apoptose
Photo : Ildo Nicoletti, Perugia University Medical School.
![Page 48: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/48.jpg)
Mise en évidence de la libération cytoplasmique du Cytochrome C
+ Act D
-Act D
Coloration d’une lignée de cellules T humainesPhoto et Histogramme : Merck Novagen
•Anticorps dirigés contre le Cytochrome C
![Page 49: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/49.jpg)
Activité enzymatique des caspases
===>
• forme active : anticorps
• site actif de l’enzyme : Peptide spécifique (FLICA)
• quantification de l’activité enzymatique
Procaspases précurseurs inactifs
Caspases actives
Substrat non fluorescent produit fluorescent
Caspase active
![Page 50: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/50.jpg)
Exemple de mesure de l’activité enzymatique
Activité caspase (FITC)
Quanti
t é d
’A
DN
(I
odure
de
Pro
pid
ium
)
F. Guérif, V. Cadoret et D. Royère (2001)
• monoparamétrique activité caspase
Cellules en apoptose
• biparamétrique : activité caspase et ploïdie
![Page 51: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/51.jpg)
Fragmentation de l ’ADN
En fin de cascade apoptotique il y a activation de nucléases qui coupent l ’ADN entre les nucléosomes
• méthode TUNEL :Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling
• méthode du pic hypodiploïde :
![Page 52: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/52.jpg)
Méthode TUNEL
Enzyme Tdt fixe des désoxynucléotides non fluorescents ou fluorescents sur l’extrémité 3’OH libre.
Photo Molecular probes
Cellule en nécrose
Cellule en apoptose
![Page 53: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/53.jpg)
Méthode TUNEL
Utilisation de la ChromaTide BODIPY FL-14-dUTP • apoptose en cours => fluorescence verte
• apoptose terminale : fragmentation nucléaire intense => fluorescence jaune
Photo : Zbigniew Darzynkiewicz, Cancer Research Institute, New York Medical College.
![Page 54: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/54.jpg)
Méthode du pic hypodiploïde
Intensité de fluorescence rouge (Iodure de Propidium)
Résultats M. Afanasieff (1993)
Nom
br e
de c
ellu
l es
par
c las s
e d
’in
tens i
t é
( « c
anal »)
Cellules normales
Cellules en apoptose
Pic G0/G1
Pic G2/M
coupure entre les nucléosomes => quantité ADN < 2Cquantification ADN avec un fluorochrome intercalant spécifique (Iodure de propidium, Bromure d’éthidium…)
![Page 55: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/55.jpg)
III. Apoptose et Infectiologie
![Page 56: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/56.jpg)
Pathologies associées à l ’apoptose
Apoptose excessiveAlzheimerParkinsonSIDAHépatitesCertains diabètesMalformationsRejet de greffevirus, bactériesToxines
Apoptose insuffisanteMaladies autoimmunesLeucémiesSyndromes lymphoprolifératifsTumeursOstéoporoseMalformationsRejet de greffeMaladies virales (poxvirus, adenovirus)Maladies parasitaires (Toxoplasmose, Leishmaniose)
![Page 57: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/57.jpg)
Trois exemples d’apoptose en pathologie infectieuse
• Mort du macrophage infecté par des salmonelles
• Rôle de l’apoptose dans les relations Plasmodium-vecteur
• Virus et régulation mitochondriale de l’apoptose
![Page 58: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/58.jpg)
A) SalmonelloseK. HUEFFER and JE Galan,
Cell.Microbiol., 2004, 6, 1019-1025
• Co-évolution pathogène-hôte = modulation des relations (ex. fonctions/mort macrophage)
![Page 59: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/59.jpg)
• SPI-1 : stimulée par faible O2 et forte osmolarité = phase d’invasion intestinale
• SPI-2 : stimulée par faible Mg++ et pH acide (intra-cellulaire) = infection systémique
• Les 2 protéines induisent la mort du macrophage mais différents mécanismes et temps : 45 min (SPI-1 ?) ou 24 h (SPI-2 ?)
Les TTSS de Salmonella• Salmonelles 2 « Type III protein secretion system » ou TTSS
![Page 60: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/60.jpg)
Les questions
• S’agit-il d’une PCD ou d’une nécrose ?
• Mécanisme typique de PCD ?
• Mort identique pour tous les macrophages ?
• Conséquences pour le pathogène et pour l’hôte ?
![Page 61: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/61.jpg)
PCD ou nécrose ?
- fragmentation chromatine- activation caspase 3- nucléosomes dans cytoplasme
- perte intégrité membrane- pas d’activation caspase 3- altération des organites
témoins
apoptose nécrose
![Page 62: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/62.jpg)
Mécanisme typique de PCD ?
• Rôle clé de la Caspase 1
• Inhibiteurs de caspases inactifs
• Cytotoxicité courte ou longue
• Pas d’activation de la caspase 3
• Différences selon les macrophages
• Existe sans Caspase 1
• Action de protéines effectrices délivrées par TTSS ?
• Régulation pro ou anti-apoptotique ?
• Action indirecte (ex dégradation de l’actine
Conclusions = apoptose par différents mécanismes
![Page 63: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/63.jpg)
Conséquences
• Stimulation du PCD / salmonelles pour limiter la réaction de l’hôte ?
• Réponse de l’hôte pour limiter l’invasion bactérienne ?
• Souris caspase-1- sont plus résistantes = moins pénétration des salmonelles dans la muqueuse ?
![Page 64: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/64.jpg)
B) le Plasmodium et son vecteurH. Hurd and V. Carter, 2004, Int J Parasitol., 34, 1459-1472
![Page 65: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/65.jpg)
PCD chez le parasite, le vecteur et l’hôte
- Chez le parasite et chez le vecteur :
* images caractéristiques de PCD * blocage par les inhibiteurs de caspases des métazoaires
- Chez l’hôte : * liaison présence du parasite et mort CD4+ et CD8+ ( du Fas)
Les observations
![Page 66: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/66.jpg)
PCD chez le parasite
• Pas d’homologues de caspases dans le génome autres cystéine protéases ?
= «méta » et « para » caspases dont calpaine, cathepsine
• Différences pour l’étape mitochondriale (pas de p53, AIF, Apaf1 et Bcl2)
• Ressemblances pour les signaux inducteurs Heat shock, médicaments, lectines (con A),
sérum, ROS, NO (moustique et hôte producteurs +++)
![Page 67: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/67.jpg)
PCD dans le tube digestif du moustique (1)
– Pas un type cellulaire précis
– Ensemble de caractéristiques communes post-invasion parasitaire (très lié à la chronologie du cycle et du stade parasitaire)
– Présence de caspase-3 like
– Déclenchement par simple contact parasitaire
– = élimination des cellules endommagées et/ou libération du parasite ?
– Le parasite s’échappe intact alors que sensible aux inducteurs et présence de NO (= seuils ?)
![Page 68: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/68.jpg)
PCD chez le moustique (2)
• Réduction de fécondité du moustique / le parasite ( mRNA de vitellogénine) et PCD cellules folliculaires (reversible avec inhibiteur de caspase)
• = Réponse adaptative du vecteur vs stress de son parasitisme ? Un stress physiologique à la fois ?
• = Optimisation par le parasite de la survie de son hôte pour sa propre maturation ? Intérêt à « ménager » l’hôte
![Page 69: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/69.jpg)
C) Virus et modulation de PCD dans la mitochondrie
P. Boya et al., 2004, Biochem. Biophys. Acta, 1659, 178-189
• Virus peuvent 1) augmenter PCD
(dissémination, immunosuppression); 2) réduire (réplication)
Variation selon les familles de virus
• Différentes voies d’action sur PCD (TNF, PKR, P53, caspases, mitochondries)
![Page 70: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/70.jpg)
• Mitochondries => action « MMP », (Mitochondrial Membrane Permeabilisation)
= point central clé
• Virus avec : 1) induction; 2) inhibition de MMP (début du cycle) (fin du cycle infectieux)
• MMP déclenchée par :=> Voie externe : « death receptors
», caspases, MMP)=> Voie interne : action directe
mitochondriale« mitochondrial targeting sequence = MTS)
![Page 71: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/71.jpg)
Mécanismes anti-apoptotiques
Exemple du KSHV (herpes virus : sarcome de Kaposi’ et maladies lymphoprolifératives)
• Différentes protéines virales anti-PCD dont 2 localisées dans mitochondries (K7 et K15)
• K7 contient un MTS
• K7 bloque MMP induit par TNF-α, CD45 death receptor ligand, Bax…
• K7 a un domaine formant un pont Bcl-2 et caspase 3 activée
• K7 régule aussi la voie du calcium
![Page 72: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/72.jpg)
Virus Protein Intracellular Localization
Partners Cellular homologs
Protects cells from
CMV vMIA M Bax, ANT
Oxidants, anti-Fas, Bax, tBid, TN, TG, STS, BFA, NFX, CPX, HCQ
Myxoma M11L M PBR STS, anti-Fas, PPIX
Vaccinia F1L M STS, anti-Fas
KSHV K7 or vIAP M, ER, PM CAML, Bcl-2, activated caspase 3
Survivin delta-Ex3
TG, TNF-α, anti Fas
K15 M, ER HAX-1
EBV BHRF1 M Bcl-2 TRAIL, t-BHP, DNA damage, virus infection
HCV NS2 ER (M with CIDE-B)
CIDE-B CIDE-B
Antiapoptotic viral proteins acting at the mitochondria
Abbreviations: ANT, adenine nucleotide translocase; BFA, brefeldin A; CIDE-B, cell death-inducing; CMV, cytomegalovirus; CPX, ciprofloxacin; DFF45-like effector-B; EBV, Epstein–Barr virus; ER, endoplasmic reticulum; HCQ, hydroxychloroquine; HCV, hepatitis C virus; KSHV; Kaposi's sarcoma-related herpes virus; M, mitochondria; N, nucleus; NFX, norfloxacin; PBR, peripheral benzodiazepin receptor; PM, plasma membrane; PPIX, protoporphyrin IX, TG, thapsigargin; TN, tunicamycin; STS, staurosporine; t-BHP, tert-butyt-hydroperoxide
![Page 73: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/73.jpg)
Mécanismes pro-apoptotiques
Exemple du HBV (hépatite B) : Protéine X (HBx)
• Essentielle pour réplication virale, oncogène
• Sensibilisation des hépatocytes au PCD induit par # stimuli (TNF-α, TRAIL)
• Localisation mitochondriale, perte du ΔΨm, mort
• MTS identifiée et fonctions précisées
• HBx interagit avec 2 protéines mitochondriales (HSP60 et VDAC3)
• Protéines anti-PCD (Bcl2 et Bcl-Xl) protègent
• VDAC3 = rôle pathogène (hépatite chronique et carcinogénèse) ???
![Page 74: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/74.jpg)
Virus Protein Intracellular localization
Partners Effect on mitochondrial morphology
HBV X M, N VDAC3, Hsp60, cFLIP, p53, survivin
Yes
HIV Vpr M, N ANT, cyclophilin A, 14-3-3 proteins, Gag, SP1, GR, TFIIB, p300/CREB-binding protein
Yes
IAV PB1-F2 M, N Yes
HTLV-1
P13 II M, N FPPS, C44, C254
Yes
BLV G4 M, N FPPS
AEV VP3 M Yes
2C M, N Yes
WDSV Orf C M, C Yes
HPV E1E4 M cytokeratin Yes
type 16
Proapoptotic viral proteins acting at the mitochondria
Abbreviations: AEV, avian encephalitis virus; ANT, adenine nucleotide translocase;BLV, bovine leukemia virus; C, cytosolic; ER, endoplasmic reticulum; FPPS, farnesylpyrophosphate synthetase; HBV, hepatitis B virus; HIV-1, human immundeficiency virus-1; HPV, human papillomavirus; HSP, heat shock protein; HTLV-1, human T leukemia virus-1; IAV, influenza A virus; M, mitochondria; N, nucleus; VDAC, voltage-dependent anion channel; WDSV, Walleye dermal sarcoma virus
![Page 75: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/75.jpg)
Séquences en relation avec l’apoptose
![Page 76: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/76.jpg)
1) Généralités sur l ’apoptose :http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/TOC.html voir « apoptosis »
2) Fournisseurs :Molecular Probes : sondes fluorescenteshttp://probes.invitrogen.com/handbook/
Roche www.roche-applied-science.com voir « cell biology » puis « apoptosis »
Genentech : www.researchApoptosis.com
Merck : http://www.merckbiosciences.co.uk/html/emd/ip_apoptosiskits.html
Quelques sites web intéressants
![Page 77: Lapoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022081518/551d9d91497959293b8c7a29/html5/thumbnails/77.jpg)
Laboratoire de Cytométrie Unité Infectiologie Animale Santé Publique (IASP-213)Centre de Tourstél 02-47-42-77-59
Dominique Kerboeuf, Yves Le Vern
E-mail :[email protected] [email protected]
Site web :http://www.tours.inra.fr/plates_formes/plate_forme_d_analyses_cellulaires_et_moleculaires
Notre adresse