laporan akhir penelitian fundamentalrepository.unesa.ac.id/sysop/files/2020-05-27_lap... · 2020....
TRANSCRIPT
i
LAPORAN AKHIR PENELITIAN FUNDAMENTAL
MEMPELAJARI KARAKTERISTIK SENYAWA N-ASETIL GLUKOSAMIN PADA PROSES HIDROLISIS KITIN MENGGUNAKAN
ENZIM KITINASE DARI Pseudomonas sp TNH 54
Tahun ke 1 dari rencana 2 tahun
Oleh :
Ketua : Dr. Nuniek Herdyastuti, M.Si (NIDN 0010117004) Anggota : Dr. Sari Edi Cahyaningrum, M.Si (NIDN : 0029127002)
UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA Nopember, 2015
BIDANG ILMU : MIPA
ii
iii
MEMPELAJARI KARAKTERISTIK SENYAWA N-ASETIL GLUKOSAMIN PADA PROSES HIDROLISIS KITIN MENGGUNAKAN ENZIM KITINASE DARI
Pseudomonas Sp TNH 54
Abstrak
Oleh :
Nuniek Herdyastuti dan Sari Edi Cahyaningrum
N-Asetil glukosamin merupakan senyawa turunan kitin yang dapat diperoleh secara enzimatis dari substratnya kitin jenis amorf. Kitin jenis amorf merupakan kitin yang telah dimodifikasi dengan penambahan Sodium dodecyl sulphate (SDS) diketahui mempunyai aktifitas tinggi terhadap enzim kitinase. Seanyawa N-Asetil glukosamin sangat potensial untuk digunakan dalam industri karena mempunyai banyak aplikasi yang signifikan dan mempunyai efisiensi tinggi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi substrat, enzim dan waktu inkubasi terhadap pola kinetika pebentukan N-asetilglukosamin serta pengaruh pelarut terhadap kemurnian N-Asetil glukosamin. Metode yang digunakan untuk menentukan N-Asetil glukosamin dengan menggunakan HPLC, dan pemurnian dilakukan dengan variasi pelarut. Hasil optimasi menunjukkan bahwa konsentrasi substrat 1,2% dapat menghasilkan 94,8% N-Asetil glukosamin, dengan konsentrasi enzim 0,1 U/mL dan waktu inkubasi selama 8 jam. Berdasarkan pola pemetaan berganda menunjukkan bahwa kinetika reaksi enzimatis mengikuti orde dua dengan nilai KM sebesar 8,33 mg/mL dan Vmaks 52,6 mg/mL jam. Hasil pemurnian dengan variasi pelarut asetonitril dengan aseton, metanol dan etanol dapat menunjukkan pemisahan yang cukup bagus sehingga diperoleh puncak N-Asetil glukosamin sesuai dengan standar pada waktu retensi sekitar 3,1 – 3,3 menit Kata kunci : Kitin, kitinase, N-Asetil glukosamin
iv
STUDYING TO THE CARACTERISTIF OF N-ACETYL GLUCOSAMINE IN CHITIN HYDROLYSIS PROCESS WITH CHITYNASE ENZYME FROM
Pseudomonas Sp TNH54
Abstract
By : Nuniek Herdyastuti and Sari Edi Cahyaningrum
N-Acetyl Glucosamine is a compound chitin derivative which can be obtained
enzymatis from substrate amorphous chitin types. Amorphous chitin is a kind of that has been modified by the addition of sodium dodecyl sulphate (SDS) are known to have high activity of the enzyme chitinase. N-Acetyl glucosamine potential for use in industry because it has many significant applications and has high efficiency. This study aims to determine the effect of substrate concentration, enzyme and incubation time for kinetic patterns to forming of N-acetylglucosamine and solvent effect on the purity of the N-Acetyl glucosamine. The method used to determine the N-acetyl glucosamine by using HPLC, and purification is done by varying the solvent. Optimization results show that 1.2% concentration of the substrate can produce 94.8% of N-acetyl glucosamine on the enzyme concentration of 0.1 U/mL and the incubation time for 8 hours. Based on the pattern of double-reciprocal plot showed that the kinetics of enzymatic reaction followed a second order with the KM value of 8.33 mg / mL and a Vmax of 52.6 mg / mL h. The results of purification with acetonitrile with solvent variations of the acetone, methanol and ethanol can show a good separation to obtain the peak of N-Acetyl glucosamine in accordance with the standards at a retention time of about 3.1 to 3.3 minutes Keywords : chitin, chitinase, N-Acetyl glucosamine
v
PRAKATA
Dengan mengucap syukur kehadlirat Allah s.w.t, atas segala Rahmad dan
Kemurahan-Nya penulis dapat menyeleaikan penelitian dengan laporan akhir yang berjudul
“Mempelajari karakteristik senyawa N-asetil glukosamin pada proses hidrolisis kitin
menggunakan enzim kitinase dari Pseudomonas Sp TNH 54”. Penelitian ini dibagi dalam
dua tahapan, yaitu pada tahap pertama (Tahun – 1) melakukan isolasi, optimasi, dan
pemurnian N-Asetil glukosamin yang selanjutnya dilanjutkan pada tahap kedua (Tahun – 2)
untuk penentuan rendemen serta penentuan pemurnian terbaik dan karakterisasi N-Asetil
glukosamin.
Penelitian ini memperoleh dana dari Proyek Peningkatan Kualitas Sumber Daya
Manusia Direktorat Pembinaan Penelitian Dan Pengabdian Kepada Masyarakat Dirjen Dikti
Kemendikbud Tahun Anggaran 2015 melalui program penelitian Fundamental. Untuk itu
kami mengucapkan terima kasih kepada : Ketua DP2M, Rektor UNESA, Ketua Lembaga
Penelitian dan Pengabdian UNESA, Ketua Jurusan Kimia UNESA, Mahasiswa Kimia yang
telah membantu penelitian ini. Harapan kami semoga penelitian ini dapat membawa manfaat
bagi peneliti sendiri khususnya dan dapat memberikan informasi bagi rekan-rekan peneliti
lainnya.
Surabaya, Nopember 2015
Peneliti
vi
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL i LEMBAR PENGESAHAN .................................................... ii ABSTRAK .................................................... iii ABSTRACT .................................................... iv PRAKATA .................................................... v DAFTAR ISI .................................................... vi DAFTAR TABEL .................................................... vii DAFTAR GAMBAR .................................................... viii DAFTAR LAMPIRAN .................................................... x RINGKASAN .................................................... xi BAB I PENDAHULUAN .................................................... 1 1.1 Latar Belakang .................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah .................................................... 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA .................................................... 5 2.1 Kitin .................................................... 5 2.2 Struktur Kitin .................................................... 6 2.3 Senyawa turunan kitin .................................................... 7 2.4 Manfaat Kitin .................................................... 9 2.5 Penelitian terkait kitinase .................................................... 11 2.6 Ekstraksi mengunakan pelarut .................................................... 12 BAB III TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
....................................................
15
BAB IV METODE PENELITIAN BAB V HASIL PENELITIAN 5.1 Pembuatan kitin jenis amorf 5.2 Optimasi produksi N-Asetil glukosamin 5.3 Pemurnian N-Asetil glukosamin BAB VI SIMPULAN DAN SARAN
....................................................
....................................................
....................................................
....................................................
....................................................
..............................................
16 22 22 23 35 43
DAFTAR PUSTAKA .................................................... 44 LAMPIRAN .................................................... 47
vii
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
2.1 Sifat-sifat pelarut umum ............................................ 13
5.1 Penentuan Jumlah N-asetil glukosamin berdasarkan variasi konsentrasi substrat
............................................
27
5.2 Penentuan Jumlah N-asetil glukosamin berdasarkan variasi waktu inkubasi
............................................
32
viii
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
2.1 Senyawa kitin yang terdiri dari N-Asetil-glukosamin dihubungkan oleh ikatan β, 1-4 glikosida
............................................ 6
2.2 Jalur degradasi kitin oleh kitinase ............................................ 8
4.1 Kerangka Operasional Penelitian ............................................ 17 5.1 Kitin jenis amorf ............................................ 22 5.2 Hasil analisis penentuan kurva standar N-
asetil glukosamin pada konsentrasi 0,8 mg/mL dengan HPLC
............................................
23 5.3 Kurva standar N-Asetil glukosamin ............................................ 24 5.4 Hasil analisis HPLC pada penentuan
konsentrasi optimum untuk konsentrasi kitin1,6 – 2,4%
............................................
25 5.5
5.6
5.7
Hasil analisis HPLC pada penentuan konsentrasi optimum untuk konsentrasi kitin 0,4 – 1,2% Persentase N-Asetil glukosamin pada masing-masing substrat Penentuan KM dan Vmaks dengan Persamaan Lineweaver – Burk
............................................ ............................................ ............................................
26
27
28 5.8 Hasil analisis HPLC pada penentuan waktu
inkubasi optimum untuk waktu 0 – 2 jam ............................................
30
5.9 Hasil analisis HPLC pada penentuan waktu inkubasi optimum untuk waktu 4 – 24 jam
............................................
31
5.10
Persentase N-Asetil glukosamin pada variasi waktu inkubasi
............................................
33
5.11
Persentase N-Asetil glukosamin pada variasi konsentrasi enzim
............................................
34
5.12
Hasil analisis bagian filtrat pada tahap pemurnian
............................................
35
5.13
Hasil analisis bagian endapan pada tahap pemurnian untuk aseton, etanol, dan asetonitril
............................................
36 5.14
Hasil analisis bagian endapan pada tahap pemurnian untuk metanol
............................................
37
5.15
Hasil N-Asetil glukosamin pada pemurnian bertahap untuk NAG standar, filtrat pada tahap akhir, endapan pada tahap akhir dan filtrat pada asetonitril
............................................
38 5.16
Hasil analisis bagian endapan pada bagian filtrat pertama
............................................
39
5.17 Hasil pemurnian N-Asetil glukosamin tahap kedua dengan variasi pelarut menggunakan
ix
aseton, etanol, dan asetonitril ............................................ 40
5.18 Hasil pemurnian N-Asetil glukosamin tahap ketiga dengan variasi pelarut menggunakan aseton, etanol, dan asetonitril
............................................
41
x
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1 Penentuan kurva standar N-Asetil glukosamin (HPLC)
.................................................. 47
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12
Perhitungan persentase N-asetil glukosamin pada optimasi konsentrasi substrat Hasil penentuan optimasi konsentrasi substrat dengan HPLC Penentuan KM dan Vmaks dari transformasi persamaan Michaelis-Menten ke Lineweaver-Burk Perhitungan persentase N-asetil glukosamin pada optimasi waktu inkubasi Hasil penentuan optimasi waktu inkubasi dengan HPLC Kurva standar N-asetil glukosamin (Spektrofotometer uv-vis) Perhitungan N-asetil glukosamin pada optimasi konsentrasi enzim Bagan tahapan pemurnian N-asetil glukosamin Hasil analisis pemurnian dengan variasi pelarut Biodata peneliti Publikasi di Seminar Nasional Kimia
.................................................. .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. ..................................................
48
50
56
57
59
66
67
69
70 73 92
xi
RINGKASAN Kitin banyak tersebar di alam seperti pada jamur, alga, nematoda, arthropoda,
mollusca, hewan dan tumbuhan,arakhnida, dinding sel jamur, exoskeletons serangga,
cangkang krustasea dan bagian dari invertebrata, juga ditemukan sebagai polimer
ekstraseluler dari beberapa mikroba. (Guo, 2004). Bentuk kitin yang rapat dan kompak
karena bentuk - yang mempunyai rantai antipararel dan menstabilkan bentuk polimorfiknya
secara alami sehingga menyebabkan kitin tidak larut dalam pelarutnya (Majtán, 2007).
Berdasarkan hasil yang diperoleh pada penelitian penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa
kitin yang telah dimodifikasi dengan penambahan sodium dodecyl sulphate (SDS)
menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi terhadap kitinase dibandingkan kitin serbuk. Hal ini
dikarenakan perbedaan kristalinitas kitin amorf dengan kitin serbuk, dimana kitin jenis amorf
lebih terbuka dibanding kitin serbuk (Herdyastuti, 2015).
Kitin dapat didegradasi secara enzimatis dengan kitinase menghasilkan monomernya
N-Asetil glukosamin atau 2-asetamido-2-deoksi-D-glukosa (GlcNAc) adalah gula amino
sederhana yang berpolimerisasi membentuk ikatan β-1,4. Monosakarida amino tersebut
mempunyai rumus molekul C8H15NO6, dan berat molekulnya adalah 221,2. Secara umum
GlcNAc merupakan serbuk berwarna putih dan sedikit manis, mempunyai titik leleh pada
221° C mempunyai kelarutan 25 % dalam air , serta 1 % larutan air tidak berwarna dan jelas
(Chen and Liu, 2010). N-Asetil glukosamin merupakan suatu nutrien, metabolit senyawa
antara dan diperlukan pada fungsi sel. Senyawa monomernya yaitu N-asetil D-glukosamin
dan D-glukosamin merupakan kandidat food supplement, serta pengobatan pada penderita
osteoarthritis (Illankovan et al., 2005). suplemen makanan dan untuk pengembangan terapi
karena karakteristik yang unik. Hasil uji toksisitas mengungkapkan bahwa GlcNAc tidak
beracun, aman bagi tubuh dan lebih lanjut menunjukkan bahwa 54% dari glukosamin yang
diberikan akan diekskresikan ke dalam urin dalam satu hari.
Berdasarkan hal tersebut menunjukkan bahwa GlcNAc sangat potensial untuk
digunakan dalam industri karena mempunyai banyak aplikasi yang signifikan dan
mempunyai efisiensi tinggi. Untuk mendapatkan GlcNAc maka perlu dilakukan isolasi dari
kitin secara enzimatis, pemurnian dan karakterisasi. Penelitian pada Tahun – 1 ini bertujuan
untuk melakukan optimasi terhadap variasi konsentrasi enzim, substrat dan waktu inkubasi
sehingga dapat diketahui pola kinetikanya. Serta melakukan pemurnian terhadap variasi
beberapa pelarut berdasarkan sifat kepolarannya yaitu aseton, etanol, metanol dan asetonitril.
xii
Tahap isolasi N-Asetil glukosamin dilakukan secara enzimatis dengan menggunakan
kitin jenis amorf sebagai substrat. Metode yang digunakan untuk menganalisis N-Asetil
glukosamin adalah dengan menggunakan HPLC dan penentuan konsentrasinya dengan
berdasarkan kurva standar N-Asetil glukosamin. Adapun penentuan aktivitas kitinase
menggunakan metode Monreal and Reese yang didasarkan pada pelepasan N-Asetil
glukosamin dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 540
nm. Optimasi pembentukan N-Asetil glukosamin dilakukan terhadap variasi konsentrasi
substrat, konsentrasi enzim dan waktu inkubasi. Pada tahap pemurnian dilakukan dengan cara
ekstraksi menggunakan variasi pelarut aseton, etanol, metanol dan asetonitril.
Hasil yang diperoleh dari tahap optimasi variasi konsentrasi substrat 0,4 – 2,4 mg/mL
menunjukkan bahwa konsentrasi substrat 1,2 mg/mL dapat menghasilkan N-Asetil
glukosamin tertinggi yaitu 22,8 mg/mL atau 94,8 %. Berdasarkan pemetaan kebalikan-ganda
diperoleh harga KM sebesar 8,33 mg/mL dan Vmaks 52,6 mg/mL jam atau 0,88 mg/mL Menit,
reaksi enzimatis tersebut mengikuti pola kinetika reaksi orde dua. Penentuan waktu inkubasi
optimum selama 0 – 24 jam menunjukkan bahwa, jumlah N-Asetil glukosamin yang tertinggi
yaitu sebesar 10,95 mg/mL atau 45,6 % dihasilkan saat enzim kitinase dan kitin jenis amorf
diinteraksikan selama 8 jam. Menurut Widyastuti (2007), senyawa kitooligosakarida dan N-
asetilglukosamin hasil hidrolisis kitin oleh kitinase pada konsentrasi yang tinggi akan dapat
menyebabkan inhibisi umpan balik karena kelebihan N-asetilglukosamin sebagai produk
akhirnya. Penelitian lain menyebutkan bahwa kitinase dapat dihambat secara kompetitif oleh
beberapa senyawa seperti alosamidin dan beberapa senyawa selain gula yang terdapat di
dalamnya (Peter, 2005). Jumlah N-Asetil glukosamin menunjukkan kenaikan dengan
semakin tingginya konsentrasi enzim kitinase, dimana konsentrasi enzim 0,1 U/mL dapat
menghasilkan sekitar 0,454 mg/mL atau 1,89 % N-Asetil glukosamin dengan konsentrasi
kitin 1,2 % diikubasi selama 8 jam. Pemurnian yang dilakukan dengan menggunakan pelarut
aseton, metanol, etanol, dan asetonitril yang divariasi dengan pelarut asetonitril memberikan
hasil yang bagus dengan pola yang hampir sama dengan diperolehnya puncak yang sesuai
dengan N-Asetil glukosamin standar dengan waktu retensi sekitar 3,1 – 3,3 menit. Belum
dilakukan perhitungan rendemen dari masing-masing pemurnian untuk menentukan pelarut
manakah yang dapat menghasilkan rendemen tertinggi.
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kitin merupakan polimer yang sangat melimpah di alam dan menempati urutan
kedua setelah selulosa. Kitin banyak tersebar di alam seperti pada jamur, alga, nematoda,
arthropoda, mollusca, hewan dan tumbuhan,arakhnida, dinding sel jamur, exoskeletons
serangga, cangkang krustasea dan bagian dari invertebrata, juga ditemukan sebagai
polimer ekstraseluler dari beberapa mikroba. (Guo, 2004). Jumlah kitin yang dapat
dihasilkan per tahunnya dalam biosfer sangat banyak sekali. Pada tahun 1993
diperkirakan dunia dapat memperoleh kembali kitin dari invertebrata laut sebanyak
37.000 ton dan meningkat menjadi 80.000 ton pada tahun 2000 (Ogawa, 2002). Kitin
ditemukan sebagai dua allomorphs, yaitu α - kitin dan β - kitin. α - kitin mempunyai
jumlah yang paling berlimpah dan banyak terdapat dalam udang dan kepiting kerang. β -
kitin ditemukan dalam tinta cumi-cumi dan secara komersial lebih mahal. Sampai saat
ini, tidak mungkin untuk mendapatkan β - kitin baik dari hasil isolasi atau biosintesis
sevara in vitro.
Berdasarkan hasil yang diperoleh pada penelitian penelitian sebelumnya
menunjukkan bahwa kitin yang telah dimodifikasi dengan penambahan beberapa pereaksi
menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan kitin serbuk. Bentuk kitin yang
rapat dan kompak karena bentuk - yang mempunyai rantai antipararel dan menstabilkan
bentuk polimorfiknya secara alami sehingga menyebabkan kitin tidak larut dalam
pelarutnya (Majtán, 2007). Substrat kitin jenis amorf menunjukkan aktivitas paling tinggi
setelah kitin jenis koloidal. Modifikasi kitin dengan menggunakan detergen SDS
menyebabkan penggembungan pada struktur kitin sehingga menyebabkan perubahan
2
pada sifat fisik kitin serbuk. Hal ini dikarenakan perbedaan kristalinitas kitin amorf
dengan kitin serbuk, dimana kitin jenis amorf lebih terbuka dan lebih amorf dibanding
kitin serbuk (Herdyastuti, 2013).
Kitin merupakan bentuk linier polisakarida yang dibentuk dari ikatan -1,4
residu N-asetil-glukosamin. Dengan demikian kitin secara kimiawi adalah suatu polimer
golongan polisakarida yang tersusun atas 2-asetamido-2-deoksi-D-glukosa membentuk
ikatan -1,4. Monomer senyawa ini merupakan disakarida dari N-asetil-D-glukosamin
yang disebut kitobiosa. Ikatan pada molekul tersebut membentuk fibra yang linier
(Majtán, 2007). N-Asetil glukosamin atau 2-asetamido-2-deoksi-D-glukosa (GlcNAc)
adalah gula amino sederhana yaitu suatu monosakarida yang mempunyai gugus amino
pada bagian strukturnya. GlcNAc merupakan turunan monosakarida glukosa dan
didistribusikan secara luas di seluruh dunia. GlcNAc berpolimerisasi linear dengan ( 1,4)
-β yang merupakan unit monomer dari polimer kitin. Monosakarida amino tersebut
mempunyai rumus molekul C8H15NO6, dan berat molekulnya adalah 221,2. Secara umum
GlcNAc merupakan serbuk berwarna putih dan sedikit manis, mempunyai titik leleh pada
221° C mempunyai kelarutan 25 % dalam air , serta 1 % larutan air tidak berwarna dan
jelas (Chen and Liu, 2010).
N-Asetil glukosamin merupakan suatu nutrien, metabolit senyawa antara dan
diperlukan pada fungsi sel. Senyawa monomernya yaitu N-asetil D-glukosamin dan D-
glukosamin merupakan kandidat food supplement, serta pengobatan pada penderita
osteoarthritis (Illankovan et al., 2005). Penelitian medis yang melibatkan N-
asetilglukosamin menunjukkan potensi pada berbagai pengobatan penyakit autoimun
dengan menggunakan turunan glukosa. Turunan glukosa berpartisipasi dalam berbagai
fungsi tubuh, dan banyak yang percaya glukosamin bahwa dengan atau tanpa kondroitin,
dapat meredakan rasa tidak nyaman dan peradangan pada orang yang menderita arthritis.
3
Kehadiran N-asetilglukosamin di kelenjar timus tampaknya juga dapat mencegah
pembentukan dan pertumbuhan sel-sel abnormal timus (T-sel), yang berkontribusi
terhadap gangguan autoimun (Chang and Fu, 2000). Pusat penelitian Irvine, Universitas
California menyebutkan bahwa adanya supplement N-asetil glukosamin (GlcNAc) dalam
makanan, lebih efektif daripada glukosamin yang dapat mengurangi kelainan dalam
glikosilasi protein dalam sel dan menghambat inflammatory demyelination pada mencit.
Hal ini membuka kemungkinan untuk melakukan terapi metabolic dengan N-asetil
glukosamin untuk mencegah penyakit pada system pusat syaraf, Multiple sclerosis (MS)
yang dalam waktu dekat dapat menyebabkan inflamasi dan dalam jangka panjang
menyebabkan neurodegeneration (Demetriou, 2005). Baru-baru ini juga telah dilakukan
penelitian bahwa GlcNAc dan derivatnya telah digunakan dalam suplemen makanan dan
untuk pengembangan terapi karena karakteristik yang unik. Hasil uji toksisitas
mengungkapkan bahwa GlcNAc tidak beracun, aman bagi tubuh dan lebih lanjut
menunjukkan bahwa 54% dari glukosamin yang diberikan akan diekskresikan ke dalam
urin dalam satu hari.
Berdasarkan hal tersebut menunjukkan bahwa GlcNAc sangat potensial untuk
digunakan dalam industri karena mempunyai banyak aplikasi yang signifikan dan
mempunyai efisiensi tinggi. Setiap tahun, sekitar 100 miliar ton kitin diproduksi di alam
membuat kitin sumber daya biomassa yang cocok untuk produksi GlcNAc melalui proses
yang didasarkan pada hidrolisis kitin (Chen et al, 2010). GlcNAc dapat diperoleh dengan
cara hidrolisis secara kimia atau degradasi secara enzimatis dari senyawa kitin
menggunakan enzim kitinase. Degradasi kitin secara enzimatis telah banyak dilakukan
karena merupakan metode yang sederhana, cepat dan reproducible untuk menghasilkan
senyawa turunan kitin atau kitin oligosakarida (Krokeide, 2007). Untuk mendapatkan
GlcNAc maka perlu dilakukan isolasi dari kitin secara enzimatis, pemurnian dan
4
karakterisasi. Penelitian yang direncanakan dilakukan selama dua tahun ini dibagi dalam
tahapan isolasi, optimasi, dan pemurnian N-Asetil glukosamin pada tahun pertama serta
perhitungan rendemen terbanyak dari masing-masing pemurnian dan karakterisasi N-
Asetil glukosamin pada tahun kedua. Isolasi N-Asetil glukosamin dihasilkan dari proses
degradasi enzimatis dengan enzim kitinase dari Pseudomonas sp TNH54. Optimasi N-
Asetil glukosamin dilakukan terhadap variasi konsentrasi enzim, substrat dan waktu
inkubasi sehingga dapat diketahui pola kinetikanya. Pemurnian N-Asetil glukosamin yang
telah dioptimasi dilakukan terhadap variasi beberapa pelarut berdasarkan sifat
kepolarannya, sehingga dapat diperoleh N-Asetil glukosamin yang murni dan akan
dibandingkan dengan N-Asetil glukosamin standar yang dijual secara komersial.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan pernyataan diatas maka dapat dirumuskan permasalahan, yaitu :
a. Berapakah konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, dan waktu inkubasi optimum yang
diperlukan terhadap pembentukan N-asetil glukosamin serta bagaimana pola kinetika
pembentukan N-asetil glukosamin ?
b. Bagaimanakah hasil pemurnian N-Asetil glukosamin dengan menggunakan jenis pelarut
yang divariasi yaitu aseton, etanol, metanol dan asetonitril ?
c. Berapakah rendemen N-Asetil glukosamin yang dihasilkan dari pemurnian pada kondisi
optimum?
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Kitin
Kitin merupakan salah satu polimer alami yang cukup melimpah dan merupakan
biopolimer terbanyak kedua di alam setelah selulosa. Kitin terdistribusi luas di lingkungan
biosfer seperti pada kulit crustaceae (kepiting, udang dan lobster), ubur-ubur dan juga
ditemukan dalam nematode.. Polimer ini ditemukan sebagai komponen komponen struktural
exosceleton insekta, penyusun dinding sel jamur, yeast dan alga sekitar 3 – 60 % (tergantung
pada tipe jamur), binatang ataupun tumbuhan. Kitin juga dapat ditemukan dalam lapisan
usus, trakea, sayap penutup dan bagian-bagian lain dari tubuh hewan tingkat rendah.
Kandungan kitin tertinggi mencapai 85 % ditemukan pada Arthropoda (Folders et al., 2001).
Dalam Firdaus (2009), Focher menyatakan bahwa, kulit udang mengandung protein (25 – 40
%), kalsium karbonat (45 – 50 %), dan kitin (15 – 20 %), tetapi besarnya kandungan
komponen tersebut tergantung pada jenis udangnya. Adapun kulit kepiting mengandung
protein (15,60 – 23,90 %), kalsium karbonat (53,70 – 78,40 %), dan kitin (18,70 – 32,20 %),
hal ini juga tergantung pada jenis kepiting dan tempat hidupnya. Kandungan kitin dalam kulit
udang lebih sedikit dibandingkan kandungan kulit kepiting, tetapi kulit udang lebih mudah
diperoleh dan tersedia dalam jumlah yang cukup banyak sebagai limbah.
Pada binatang, kitin merupakan struktur yang rigid pada eksoskeleton. Hal ini
dikarenakan pada rantai polimer N-asetil-glukosamin terdapat ikatan hidrogen antar molekul
membentuk mikrofibril menghasilkan struktur yang stabil dan rigid, tidak larut dalam air
sehingga dapat mengkristal (Frandberg, 1997). Seperti halnya pada jamur, kitin yang
ditemukan dalam tanaman juga mendukung dinding selnya. Kitin dapat terbentuk dari proses
6
re-kristalisasi larutan, biosintesis in-vitro atau reaksi polimerisasi secara enzimatis (Rinaudo,
2006)
2.2 Struktur kitin
Kitin merupakan bentuk linier polisakarida yang dibentuk dari ikatan -1,4 residu N-
asetil-glukosamin (Nathalie, 2006). Dengan demikian kitin secara kimiawi adalah suatu
polimer golongan polisakarida yang tersusun atas 2-asetamido-2-deoksi-D-glukosa
membentuk ikatan -1,4. Monomer senyawa ini merupakan disakarida dari N-setil-D-
glukosamin yang disebut kitobiosa dengan struktur seperti pada Gambar 2.1. Ikatan pada
molekul tersebut membentuk fibra yang linier. Rantainya dapat membentuk kristal karena
adanya ikatan hidrogen intramolekul dan membentuk mikrofibril yang panjang menghasilkan
struktur yang rigid dan stabil (Gooday, 1990). Dalam Yurnaliza (2002), Richard menyatakan
kitin berbentuk padat, amorf, tidak berwarna, tidak larut dalam air, asam encer, alkohol dan
semua pelarut organik tetapi kitin dapat larut dalam fluoroalkohol dan asam mineral pekat.
Gambar 2.1. Senyawa kitin yang terdiri dari N-Asetil-glukosamin dihubungkan oleh ikatan β, 1-4 glikosida
7
Kitin, kitosan dan selulosa mengalami biodegradasi dengan mekanisme hampir serupa
yaitu dengan melibatkan kompleks enzim seperti tampak pada Gambar 2.2. Kitin dapat
didegradasi melalui dua jalur utama, pertama degradasi oleh induksi kitinase pada ikatan -
1,4-glikosidik prosesnya ditentukan oleh mekanisme kitinolitik. Kedua polimer mengalami
deasetilasi pertama dan selanjutnya dihidrolisis oleh kitosanase (Gooday,1990).
Kitin mempunyai dua bentuk allomorph, tergantung dari sumbernya, yaitu bentuk α
dan β yang dapat dibedakan berdasarkan spektroskopi inframerah dan NMR serta difraksi
sinar – X. Bentuk allomorph ketiga adalah kitin – γ, tetapi berdasarkan analisis strukturnya
merupakan bagian dari kedua allomorph di atas. Kitin – α lebih banyak ditemukan di alam
karena bentuk polimorfik yang paling stabil dengan struktur yang rapat padat, mempunyai
rantai anti paralel dan mempunyai ikatan hidrogen yang kuat. Kitin-α banyak ditemukan pada
golongan crustaceae seperti kepiting, lobster dan sebagainya. Bentuk kitin – β jarang
ditemukan, terdapat pada golongan moluska, mempunyai struktur paralel tertutup dengan
interaksi intramolekul yang lebih lemah tetapi sedikit lebih stabil dibandingkan kitin – α, dan
mempunyai kelarutan tertinggi dibandingkan dua bentuk lainnya. Bentuk ketiga adalah kitin
– γ merupakan gabungan dari struktur kitin α dan β. Struktur kitin – α yang menyebabkan
kitin tidak larut dalam pelarut, sedangkan kitin-β dapat membentuk swollen di dalam air
sehingga dapat larut seperti dalam asam format (Coutiño et al., 2006 ; Majt´an et al., 2007).
2.3 Senyawa Turunan Kitin
Turunan kitin terpenting adalah kitosan (Gambar 2) yang diperoleh dari deasetilasi
parsial kitin pada kondisi basa (NaOH) atau hidrolisis enzimatis dengan adanya kitin
deasetilase. Transformasi kitin menjadi kitosan dilakukan dengan tahap deasetilasi dengan
basa berkonsentrasi tinggi. Gugus asetil yang masih berikatan dengan kitin menyebabkan
kitin bersifat inert terhadap berbagai pelarut sehingga sulit dilarutkan. Hal ini berbeda dengan
8
kitosan yang merupakan senyawa turunan dari kitin yang telah melepaskan gugus asetilnya
(Firdaus, 2009). Kitosan mempunyai bentuk polimer yang sama dengan kitin. Kedua polimer
tersebut dibedakan berdasarkan kandungan nitrogennya, polimer tersebut disebut kitin bila
kandungan nitrogennya kurang dari 7% dan bila kandungan nitrogennya lebih dari 7%
disebut kitosan. Kedua senyawa tersebut dapat ditemukan di alam dan istilah kitosan
sekarang lebih sering digunakan untuk menunjuk kitin yang dihilangkan gugus asetilnya
secara artifisial (Suhardi,1992).
Gambar 2.2. Jalur degradasi enzimatis dari kitin dan kitosan membentuk monomer-
monomernya
Morfologi semi-kristal kitin, kitosan diperoleh dengan reaksi bentuk padatan yang
mempunyai distribusi gugus asetil heterogen sepanjang rantainya. Ditambahkan bahwa kitin
– β reaktifitas deasetilasinya lebih tinggi daripada kitin – α. Pada proses re-asetilasi sampai
51%, pada kitin dengan deasetilasi tinggi dengan penambahan asetat anhidrida dapat
menghasilkan senyawa turunan yang larut di air, sedangkan produk heterogen yang
diperoleh dari deasetilasi parsial kitin hanya dapat larut atau sedikit larut pada kondisi asam.
Kitosan Kitin Oligomer
Kitin deastilase
Kitosan Oligomer N-Asetil Glukosamin
Glukosamin
Kitinase
Kitosanase
Deasetilase Β-D-glukosaminidase
Kitin
9
Hasil pengukuran NMR menunjukkan bahwa distribusi gugus asetil adalah random untuk
mencapai kelarutan tertinggi di air sekitar 50 % asetilasi. Toffey et al. (1999) juga telah
melakukan proses re-asetilasi yang merubah kitosan dari larutan asam asetat menjadi kitin
dengan pemansan. Selain kitosan, senyawa lain turunan kitin adalah carboxymethylchitin
(CM-chitin), merupakan polimer anion yang larut di air. CM-chitin dikerjakan sama seperti
selulosa ; kitin diperlakukan dengan asam monokloroasetat dengan adanya NaOH pekat.
Tipe yang sama pada modifikasi kimia (esterifikasi dan eterifikasi) untuk selulosa yang
dilakukan untuk mendapatkan C-6 dan C-3 pada gugus –OH dari kitin (Rinaudo, et al.,
2000). Kitin dapat digunakan untuk campuran polimer alam atau sintetik ; dapat digunakan
sebagai senyawa selulosa crosslinked (seperti epikloridin, glutaraldehid, dll.). Kitin secara
parsial dapat didegradasi dengan asam untuk mendapatkan senyawa oligokitin. Senyawa-
senyawa oligomer, seperti halnya turunan dari kitosan dikenal karena bioaktivitasnya sebagai
anti-tumor, bakterisida dan anti jamur, menumbuhkan kitinase dan mengendalikan
pertumbuhan tanaman. Senyawa-senyawa tersebut digunakan untuk menguji aktivitas
lisozim, dapat digunakan sebagai active starting blocks pada protein dan lemak untuk
memperoleh senyawa analog glikoprotein dan glikolipid. Metode turunan selulosa juga
digunakan untuk menyiapkan hidroksipropilkitin (untuk tetes air mata), fluorinasi kitin,
Nand O-sulfated chitin, (dietilamino) etilkitin, fosforil kitin, merkapto-kitin dan kitin
karbamat.
2.4 Manfaat kitin
Kitin dan kitosan mempunyai sifat yang khas dan dapat dimanfaatkan dalam berbagai
bidang dan industri. Kitin dan senyawa-senyawa turunannya mendapat perhatian besar para
ahli karena sifat-sifat fungsionalnya yang khas. Sifat potensial yang dimiliki kitin
memungkinkan pemanfaatannya dalam berbagai bidang seperti biokimia, obat-obatan,
10
farmakologi, enzimologi, mikrobiologi, pertanian, pangan dan gizi serta industri-industri
yang menjadikan biopolimer ini sangat berharga.
Kitin mempunyai toksisitas rendah dan bersifat inert dalam gastrointestinal mamalia ;
biodegradable, dengan adanya kitinase yang terdistribusi luas di alam dan ditemukan dalam
bakteri, jamur dan tanaman, serta sistem pencernaan beberapa binatang. Kitinase dilibatkan
dalam sistem pertahanan bakteri. Lisozim dari putih telur, pohon kurma dan pohon papaya,
dapat memecah kitin dan dinding sel bakteri. Sashiva et al., (1990) menunjukkan bahwa
derajat deasetilasi sangat penting pada proses hidrolisis kitin. Kitin juga digunakan untuk
menyiapkan kolom kromatografi afinitas untuk mengisolasi senyawa lektin dan menentukan
strukturnya (Datta, et al., 1984). Kitin dan 6-O-karboksimetil-kitin mengaktivasi peritoneal
in vivo makrofaga, menekan pertumbuhan sel tumor dalam mencit, dan menstimulasi non-
spesifik host resisten yang menginfeksi Escherichia Coli. Kitin juga mempercepat
penyembuhan luka (Hudson and Jenkin, 2003). Kitin secara luas digunakan untuk imobilisasi
enzim dan sel ; imobilisasi enzim diaplikasikan pada industri makanan seperti minuman sari
buah, dan proses pembuatan susu saat ditambahkan enzim amylase – α dan β yang digabung
dengan kitin (Krajewska, et al., 2004). Kitin banyak diaplikasikan sebagai biosensor dalam
makanan karena kitin bersifat biodegradable, tidak toksik, secara fisiologis tidak mudah
bereaksi, bersifat anti-bakteri, hydrophilicity, mudah membentuk gel dan mempunyai afinitas
terhadap protein. Material kitin juga dapat digunakan untuk treatment pada pollutant industri
yang dapat menyerap kompleks perak tiosulfat dan aktinida (Songkroah, et al., 2004). Kitin
dapat dibuat bentuk film dan serat dengan penambahan larutan NaOH 14 %, bersifat non-
allergic, menghilangkan bau, anti-bakteri dan dapat menjaga kelembaban (Yoshino, et
al.,1992). Regerasi turunan serat kitin digunakan sebagai pengikat dalam proses pembuatan
kertas dengan penambahan 10% n-isobutil-kitin sehingga dapat memecah kekuatan kertas
(Kobayashi, et al., 1982). Selain itu kitin dalam bentuk film dan serat juga digunakan dalam
11
bidang kesehatan dan farmasi untuk pembalut luka dan pembuatan obat (Yusof, et al., 2003).
Aplikasi lainnya dalam hidroksiapatit – kitin – kitosan material komposit pengisi – tulang,
yaitu bentuk yang dapat mengeraskan sediri pasta untuk regenarasi jaringan dalam treatment
cacat tulang (Ito, et al., 1998). CM-kitin secara selektif dimodifikasi sebagai obat anti tumor
(Ouchi, et al., 1992). Sebagai contoh, 5-fluorourasil ditengarai mempunyai aktivitas anti
tumor dan senyawa analog D-glukosa yaitu muramil-L-alanil-isoglutamin, yang bertanggung
jawab untuk aktivitas immuno- adjuvant dapat digabung dengan CM-chitin menggunakan
pembatas spesifik dan membentuk ikatan ester. Oligomer kitin telah dinyatakan sebagai obat
anti-kanker dan oligomer dengan DP ¼ 5 aktif dalam mengontrol proses fotosintesis pada
jagung dan kedelai (Khan, et al., 1992)
2.5 Penelitian Terkait Kitinase
Penelitian ini merupakan kelanjutan dari penelitian sebelumnya terkait dengan enzim
kitinase. Penelitian diawali dengan eksplorasi bakteri kitinolitik dari tanah sawah untuk
memperoleh bakteri penghasil kitinase dengan aktivitas tertinggi yang sebagaian telah
didanai oleh DP2M melalui Hibah bersaing tahun 2008 – 2009. Enzim kitinase telah
dikarakterisasi berdasarkan suhu, pH, pengaruh ion logam, konsentrasi substrat dan
zimogram (Herdyastuti, 2011). Bakteri kitinolitik dengan aktivitas tertinggi telah ditentukan
spesiesnya berdasarkan gen 16S-rRNA sebagai Pseudomonas sp TNH 54 dengan kemiripan
98% terhadap Pseudomonas sp (Herdyastuti, 2012). Penelitian kemudian dilanjutkan dengan
mempelajari pengaruh bentuk substrat kitin yang telah divariasi yaitu kitin serbuk, jenis
koloidal, bead, SF dan amorf yang telah didanai oleh Ditlitabmas DIKTI melalui Hibah
Fundamental tahun 2012 dan 2013. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kitin jenis amorf
dan koloidal menunjukkan sebagai substrat yang tepat pada kitinase.
Proses hidrolisis kitin dengan kitinase dapat menghasilkan senyawa turunan kitin
(oligosakarida) bahkan sampai dengan monomer pembentuknya yaitu N-Asetil glukosamin.
12
Pada penelitian ini akan dikaji bagaimanakah karakteristik N-Asetil glukosamin yang
dihasilkan dari hidrolisis kitinase terhadap kitin yang telah dimurnikan melalui tahap
pemurnian dengan menggunakan beberapa pelarut yang selanjutnya akan dibandingkan
dengan N-Asetil glukosamin komersial. Pada penelitian ini juga akan dikaji jumlah N-Asetil
glukosamin yang dapat diperoleh melalui tahap optimasi.
2.6 Ekstraksi menggunakan pelarut
Sebagian besar reaksi kimia secara luas dilakukan di dalam larutan. Larutan terdiri
dari pelarut (solvent) dan zat terlarut (solute). Pelarut (solvent) pada umumnya adalah zat
yang berada pada larutan dalam jumlah yang besar, sedangkan zat lainnya dianggap sebagai
zat terlarut (solute). Pelarut memenuhi beberapa fungsi dalam reaksi kimia, dimana pelarut
melarutkan reaktan dan reagen agar keduanya bercampur, sehingga hal ini akan memudahkan
penggabungan antara reaktan dan reagen yang seharusnya terjadi agar dapat merubah reaktan
menjadi produk. Pelarut juga bertindak sebagai kontrol suhu, salah satunya untuk
meningkatkan energi dari tubrukan partikel sehingga partikel-partikel tersebut dapat bereaksi
lebih cepat, atau untuk menyerap panas yang dihasilkan selama reaksi eksotermik.
Pada umumnya pelarut yang baik mempunyai kriteria sebagai berikut : (1) pelarut
harus tidak reaktif (inert) terhadap kondisi reaksi, (2) pelarut harus dapat melarutkan reaktan
dan reagen, (3) p//elarut harus memiliki titik didih yang tepat dan (4) Pelarut harus mudah
dihilangkan pada saat akhir dari reaksi. Kriteria kedua adalah dengan menggunakan prinsip
like dissolves like, dimana reaktan yang nonpolar akan larut dalam pelarut nonpolar
sedangkan reaktan yang polar akan larut pada pelarut polar. Selain itu terdapat tiga ukuran
yang dapat menunjukkan kepolaran dari suatu pelarut yaitu : (a) momen dipole, (b) konstanta
dielektrik, (c) kelarutannya dengan air. Molekul dari pelarut dengan momen dipol yang besar
dan konsanta dielektrik yang tinggi termasuk polar. Sedangkan molekul dari pelarut yang
13
memilki momen dipol yang kecil dan konstanta dielektrik rendah diklasifikasikan sebagai
nonpolar. Sedangkan secara operasional, pelarut yang larut dengan air termasuk polar,
sedangkan pelarut yang tidak larut dalam air termasuk nonpolar.
Berdasarkan kepolaran pelarut, maka para ahli kimia mengklasifikasikan pelarut ke
dalam tiga kategori yaitu : (a) Pelarut Protik Polar, Protik menunjukkan atom hidrogen
yang menyerang atom elektronegatif yang dalam hal ini adalah oksigen. Dengan kata lain
pelarut protik polar adalah senyawa yang memiliki rumus umum ROH. Contoh dari pelarut
protik polar ini adalah air H2O, metanol CH3OH, dan asam asetat (CH3COOH). (b) Pelarut
Aprotik Dipolar, Aprotik menunjukkan molekul yang tidak mengandung ikatan O-H.
Pelarut dalam kategori ini, semuanya memiliki ikatan yang memilki ikata dipol besar.
Biasanya ikatannya merupakan ikatan ganda antara karbon dengan oksigen atau nitorgen.
Contoh dari pelarut yang termasuk kategori ini adalah aseton [(CH3)2C=O] dan etil asetat
(CH3CO2CH2CH3). (c) Pelarut Nonpolar, merupakan senyawa yang memilki konstanta
dielektrik yang rendah dan tidak larut dalam air. Contoh pelarut dari kategori ini adalah
benzena (C6H6), karbon tetraklorida (CCl4) dan dietil eter (CH3CH2OCH2CH3). Beberapa
pelarut berdasarkan sifat kepolarannya seperti pada Tabel 2.1
Tabel 2.1 Sifat-sifat pelarut umum
Pelarut Rumus kimia Titik didih
Konstanta Dielektrik
Massa jenis
Pelarut Non-Polar
Heksana
CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 69 °C 2.0 0.655 g/ml
Benzena C6H6 80 °C 2.3 0.879 g/ml
Toluena C6H5-CH3 111 °C 2.4 0.867 g/ml
Dietil eter CH3CH2-O-CH2-CH3 35 °C 4.3 0.713 g/ml
Kloroform CHCl3 61 °C 4.8 1.498 g/ml
Etil asetat CH3-C(=O)-O-CH2- 77 °C 6.0 0.894 g/ml
14
CH3
Pelarut Polar Aprotic
1,4-Dioksana
-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O- 101 °C 2.3 1.033 g/ml
Tetrahidrofuran (THF)
-CH2-CH2-O-CH2-CH2-
66 °C 7.5 0.886 g/ml
Diklorometana (DCM) CH2Cl2 40 °C 9.1 1.326 g/ml
Asetona CH3-C(=O)-CH3 56 °C 21 0.786 g/ml
Asetonitril (MeCN) CH3-C≡N 82 °C 37 0.786 g/ml
Dimetilformamida (DMF) H-C(=O)N(CH3)2 153 °C 38 0.944 g/ml
Dimetil sulfoksida (DMSO) CH3-S(=O)-CH3 189 °C 47 1.092 g/ml
Pelarut Polar Protic
Asam asetat CH3-C(=O)OH 118 °C 6.2 1.049 g/ml
n-Butanol
CH3-CH2-CH2-CH2-OH 118 °C 18 0.810 g/ml
Isopropanol (IPA) CH3-CH(-OH)-CH3 82 °C 18 0.785 g/ml
n-Propanol CH3-CH2-CH2-OH 97 °C 20 0.803 g/ml
Etanol CH3-CH2-OH 79 °C 30 0.789 g/ml
Metanol CH3-OH 65 °C 33 0.791 g/ml
Asam format H-C(=O)OH 100 °C 58 1.21 g/ml
Air H-O-H 100 °C 80 1.000 g/ml
15
BAB III
TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
3.1 Tujuan
Penelitian pada Tahun – 1 ini bertujuan untuk :
a. Melakukan optimasi konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, dan waktu inkubasi untuk
menghasilkan senyawa turunan kitin (N-Asetil glukosamin) sebagai hasil degradasi
enzimatis dari kitin jenis amorf
b. Melakukan pemurnian N-Asetil glukosamin sebagai hasil degradasi enzimatis dari kitin
jenis amorf berdasarkan sifat kepolaran dengan menggunakan variasi pelarut
c. Menentukan persentase hasil N-Asetil glukosamin hasil pemurnian pada kondisi optimum
d. Publikasi hasil-hasil penelitian dalam suatu konferensi dan jurnal baik pada skala
Nasional maupun Internasional
3.2 Manfaat Penelitian
Beberapa manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah :
a. Memberikan informasi tentang mekanisme hidrolisis kitin secara enzimatis dengan
menggunakan kitinase menghasilkan seyawa turunan kitin (N-Asetil glukosamin)
b. Mempelajari karakteristik sifat fisik dan kimia senyawa N-Asetil glukosamin hasil
hidrolisis kitin secara enzimatis yang telah dimurnikan debandingkan dengan (N-Asetil
glukosamin) komersial
c. Menganalisis jumlah N-Asetil glukosamin yang dihasilkan berdasarkan kondisi optimasi
konsentrasi substrat dan enzim serta waktu inkubasi pada sejumlah kitin tertentu
d. Memperoleh senyawa turunan kitin (GlcNAc) dari hasil degradasi kitin untuk
dikembangkan di industri khusunya industri Farmasi sebagai obat anti inflamasi
16
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian eksperimen
4.2 Sasaran Penelitian
Sasaran dalam penelitian ini adalah kitin, adapun sampel penelitian ini adalah sebagian
dari populasi yang diambil secara acak
4.3 Waktu Penelitian
Penelitian ini direncanakan selama 8 bulan, yang dilaksanakan dimulai bulan Maret
sampai bulan Oktober 2015.
4.4 Tempat Penelitian
Kegiatan penelitian ini dilakukan di laboratorium Biokimia dan Instrumen Jurusan Kimia
serta laboratorium IPA Terpadu FMIPA UNESA.
4.5 Kerangka Operasional Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian Tahun – 1 dari dua tahun yang direncanakan, dan
secara garis besar kerangka operasional dapat dilihat pada Gambar 4.1. Tahap pertama
yang dilakukan adalah membuat kitin jenis amorf sebagai substrat dan induser untuk
produksi enzim kitinase. Tahap kedua adalah optimasi konsentrasi substrat, konsentrasi
enzim dan waktu inkubasi terhadap pembentukan N-Asetil glukosamin. Tahap ketiga
melakukan pemurnian dengan menggunakan variasi pelarut berdasarkan sifat
kepolarannya yang akan dianalisis dengan HPLC. Tahap keempat adalah menentukan
rendemen atau persentase hasil N-Asetil glukosamin yang telah dimurnikan pada kondisi
optimum.
17
Gambar 4.1. Kerangka operasional Penelitian
Pseudomonas sp TNH54
Ekstrak Enzim Kitinase
KITIN Kitin jenis amorf
N-Asetil glukosamin
Konsentrasi enzim, waktu inkubasi, dan konsentrasi
substrat
Analisis gugus fungsi dengan IR
PEMURNIAN
OPTIMASI
Sifat fisik : warna, kelarutan, titik leleh
Penentuan BM dengan GC – MS
N-Asetil glukosamin murni
TAHUN KE-I
TAHUN KE-II
Variasi konsentrasi substrat
Rendemen N-Asetil glukosamin
Ekstraksi dg pelarut polar
Analisis dengan KLT, HPLC
Variasi konsentrasi enzim
Variasi waktu inkubasi
18
4.6 Variabel Penelitian
Variabel pada penelitian ini adalah :
A. Pengaruh konsentrasi substrat
Variabel bebas : konsentrasi substrat
Variabel kontrol : konsentrasi enzim, waktu inkubasi, pH, suhu
Variabel terikat : konsentrasi N-Asetil glukosamin
B. Pengaruh konsentrasi enzim
Variabel bebas : konsentrasi enzim
Variabel kontrol : konsentrasi substrat, waktu inkubasi, pH, suhu
Variabel terikat : konsentrasi N-Asetil glukosamin
C. Pengaruh waktu inkubasi
Variabel bebas : waktu inkubasi
Variabel kontrol : konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, pH, suhu
Variabel terikat : konsentrasi N-Asetil glukosamin
4.7 Bahan dan Alat
Bahan
Bahan-bahan yang dipergunakan pada penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Kitin dari cangkang udang (Rongsheng, Cina)
2. Pseudomonas sp TNH54 hasil isolasi dari tanah pertanian yang telah dikarakterisasi
3. Bahan-bahan kimia yang diperoleh di pasaran komersial dengan kemurnian p.a antara lain
: HCl, NaOH, NaCl, 3,5-dinitro salisiclyc acid (SIGMA), Na3C6H5O7.2H2O, N-Asetil
glukosamin (SIGMA), pepton, yeast extract, agar (Oxoid), Etanol 95%, Metanol, Aseton,
Asetonitril (untuk HPLC).
Alat
Peralatan yang dipergunakan pada penelitian ini disamping peralatan gelas standar,
digunakan pula peralatan khusus seperti : shaker, sentrifugasi dingin, autoclave,
Spektrofotometer UV-vis (Shimadzu 1800), HPLC (Hewlet Packard, Series 1050)
19
4.8 Prosedur Penelitian
Prosedur Penelitian
Pembuatan kitin jenis amorf
10 g kitin (dari cangkang udang) dilarutkan dalam campuran larutan NaOH 40% dan
0,2% SDS (yang sudah didinginkan pada suhu 4C). Larutan di-swell selama 1 jam pada suhu
4C. Matriks slurry kitin disimpan selama 1 malam pada suhu -20C, kemudian dinetralkan
dengan HCl 6 N. Selanjutnya difiltrasi, dan dicuci dengan urutan pelarut etanol, air, etanol,
dan aseton. Hasilnya Dikeringkan dengan oven, diperoleh kitin bentuk amorf.
Produksi enzim kitinase
Enzim diproduksi dari koloni tunggal dari bakteri Pseudomonas sp TNH54
ditumbuhkan pada 100 mL media screening cair yang mengandung 0,4% kitin jenis amorf
pada suhu kamar dengan pengocokan 120 rpm selama 20 jam. Kultur cair kemudian
disentrifugasi pada 8000xg selama 15 menit suhu 4C. Supernatan yang diperoleh merupakan
ekstrak kasar kitinase.
Aktivitas Enzim
Aktivitas enzim kitinase ditentukan berdasarkan pelepasan N-Asetilglukosamin
dengan menggunakan metode yang dijelaskan oleh Monreal dan Reese (1969). Satu unit
aktivitas didefinisikan sebagai jumlah mikromol N-Asetil glukosamin yang dilepaskan dalam
1 jam. Aktivitas enzim ditentukan dengan menggunakan persamaan :
Unit/mL enzim = (jumlah NAG yg dilepaskan)(2,5)
(2)(1)(0,5)
Keterangan : 2,5 = volume reaksi mula-mula dari uji 2 = faktor konversi untuk mengkonversi 2 jam ke 1 jam sebagai definisi per unit 1 = volume (dalam mL) supernatan (dalam penentuan kolorimetri) 0,5 = volume (dalam mL) enzim yang digunakan NAG = N-Asetil glukosamin
20
Pengaruh Pelarut pada Pemurnian N-Asetil glukosamin
N-asetil glukosamin yang diperoleh dari hidrolisis kitin ditambahakan pelarut (aseton
atau metanol atau etanol atau asetonitril). Campuran tersebut dipisahkan dan endapan yang
diperoleh kemudian di keringkan dalam oven suhu 50C dan diuji dengan HPLC. Untuk
menentukan berat keringnya dihitung dengan menggunakan persamaan :
Berat kering (%) =
Uji N-Asetil glukosamin
Sebanyak 2 mL larutan kitin 1,25 % (b/v) dilarutkan dalam 200 mM buffer kalium
fosfat diaduk dengan pengaduk magnet dan ditambahkan 0,5 mL larutan enzim. Inkubasi
selama 2 jam pada suhu kamar. Setelah 2 jam tempatkan tabung ke dalam air mendidih
selama 5 menit dan didinginkan pada suhu kamar. Suspensi disentrifugasi selama 10 menit
pada kecepatan 4000 rpm dan supernatan yang diperoleh ditentukan dengan HPLC (HP 1050)
pada kolom Waters; menggunakan detector UV 210 nm ; kecepatan 1 mL/mnt ; injeksi 0,1
mL
4.9 Analisis Data
N-Asetil glukosamin (GlcNAc) yang diperoleh dari degradasi enzimatis kitin dengan
menggunakan enzim kitinase diuji dengan HPLC dan dianalisis secara deskriptif berdasarkan
Rf dan dibandingkan dengan Rf GlcNAc standar. Optimasi terhadap konsentrasi substrat,
konsentrasi enzim dan waktu inkubasi juga dianalisis secara deskriptif berdasarkan jumlah N-
Asetil glukosamin tertinggi. Penentuan konsentrasi substrat, konsentrasi enzim dan waktu
inkubasi optimum ditentukan berdasarkan perhitungan yang selanjutnya dibuat grafik antara
Berat kering N-Asetil glukosamin
Berat kering kitin X 100%
21
variabel tersebut dengan kandungan GlcNAc. Kadar GlcNAc tertinggi menunjukkan kondisi
optimum dari masing-masing variabel.
Pada tahap pemurnian dengan menggunakan beberapa pelarut dengan tingkat
kepolaran yang berbeda seperti etanol, metanol, aseton dan asetonitril. Hasil pemurnian diuji
menggunakan HPLC dengan membandingkan puncak yang muncul terhadap GlcNAc
standar.
22
BAB V
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari karakteristik senyawa N-asetil glukosamin
yang diperoleh dari hasil degaradsi enzimatis dengan kitinase. Produksi N-asetil glukosamin
dilakukan melalui tahapan optimasi terhadap konsentrasi substrat, konsentrasi enzim dan
waktu inkubasi. Hasil yang diperoleh selanjutnya dimurnikan dengan menggunakan beberapa
pelarut polar : asetonitril, etanol, metanol dan aseton. Hasil pemurnian tersebut akan
menentukan jumlah rendemen N-Asetil glukosamin yang dihasilkan dari hidrolisis kitin jenis
amorf.
5.1 Pembuatan kitin jenis amorf
Kitin yang diperoleh dari cangkang udang digunakan sebagai substrat untuk
menghasilkan senyawa N-asetil glukosamin. Kitin dibuat dalam bentuk amorf dengan
penambahan sodium dodecyl sulphate (SDS). Warna kitin amorf tidak berbeda dari kitin awal
tetapi teksturnya lebih halus dan ringan seperti pada Gambar 5.1, dan diperoleh rendemen
sekitar 50 % dari total kitin yang digunakan.
Gambar 5.1 Kitin jenis amorf
23
Kitin jenis amorf dipilih sebagai substrat dikarenakan menunjukkan aktivitas yang lebih baik
terhadap kitinase dibandingkan kitin serbuk maupun kitin koloidal. Proses penggembungan
pada kitin menyebabkan ukuran pori menjadi lebih besar dan mudah mengembang pada
medium air, sehingga menyebabkan interaksi enzim dengan substrat semakin mudah
dibandingkan pada bentuk kitin serbuk yang lebih kompak (Herdyastuti et al, 2015).
5.2 Optimasi produksi N-Asetil glukosamin
Optimasi dilakukan untuk menentukan kondisi terbaik pada pembentukan senyawa N-asetil
glukosamin dari kitin jemis amorf secara enzimatis. Hasil produksi N-asetil glukosamin
ditentukan dengan menggunakan HPLC dengan menggunakan N-asetil glukosamin sebagai
standar. Penentuan kurva standar N-asetil glukosamin dengan HPLC ditentukan berdasarkan
waktu retensi seperti terlihat pada Gambar 5.2. Puncak N-Asetil glukosamin standar pada
waktu retensi sekitar 2,6 menit, dan terlihat masih ada puncak yang lain meskipun sangat
kecil. Hal ini dimungkinkan bahwa masih ada pengotor pada senyawa tersebut atau terjadi
hidrolisis. Puncak tersebut muncul apabila konsentrasi N-Asetil glukosamin kecil, tetapi
apabila konsentrasi N-Asetil glukosamin tinggi maka puncak tersebut hilang.
Gambar 5.2 Hasil analisis penentuan kurva standar N-asetil glukosamin pada
konsentrasi 0,8 mg/mL dengan HPLC
24
Hasil penentuan N-Asetil glukosamin selanjutnya dibuat grafik antara konsentrasi N-asetil
glukosamin dan luas area seperti pada Gambar 5.3 (hasil selengkapnya pada Lampiran 1).
Berdasarkan kurva standar tersebut diperoleh persamaan garis Y= 670,5X – 97,03 dengan
regresi linier 99,6%. Persamaan tersebut selanjutnya akan dipergunakan untuk menentukan
konsentrasi N-Asetil glukosamin dari sampel berdasarkan pengukuran luas areanya.
Gambar 5.3 Kurva standar N-Asetil glukosamin
5.2.1 Penentuan konsentrasi substrat optimum
Hasil degradasi kitin jenis amorf secara enzimatis maupun non enzimatis akan
menghasilkan senyawa N-Asetil glukosamin. Pembentukan N-asetil glukosamin secara
enzimatis dengan menggunakan enzim kitinase dari Pseudomonas sp TNH54 memerlukan
optimasi kondisi seperti konsentrasi enzim, konsentrasi substrat dan waktu inkubasi.
Penentuan konsentrasi substrat optimum dilakukan dengan melakukan variasi konsentrasi
kitin jenis amorf yaitu 0,4 ; 0,8 ; 1,2 ; 1,6 ; 2,0 dan 2,4 % dan masing-masing menunjukkan
hasil seperti pada Gambar 5.4 dan 5.5 (hasil selengkapnya di Lampiran 3). Masing-masing
konsentrasi menghasilkan puncak yang cukup banyak, hal ini menunjukkan bahwa di dalam
sampel tersebut banyak sekali terdapat senyawa lain disamping N-Asetil glukosamin. Apabila
050
100150200250300350400450500
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Luas
Are
a (m
AU
)
Konsentrasi NAG (mg/mL)
25
diamati pada masing-masing konsentrasi memberikan puncak yang selalu muncul pada di
sekitar waktu retensi 2 menit. Apabila dibandingkan dengan waktu retensi dari N-Asetil
glukosamin standar maka dapat disimpulkan bahwa puncak yang muncul pada waktu retensi
tersebut merupakan N-Asetil glukosamin. Pergeseran waktu retensi tersebut disebabkan
karena banyaknya sampel selain N-Asetil glukosamin.
Gambar 5.4 Hasil analisis HPLC pada penentuan konsentrasi optimum
untuk konsentrasi kitin 2,4 % (A) ; 2,0 % (B) dan 1,6 % (C)
A
B
C
26
Gambar 5.5 Hasil analisis HPLC pada penentuan konsentrasi optimum untuk konsentrasi kitin 1,2 % (D) ; 0,8 % (E) dan 0,4 % (F)
D
E
F
27
Masing-masing luas area selanjutnya ditentukan jumlah N-asetil glukosamin menggunakan
persamaan Y= 670,5X – 97,03 pada kurva standar dan diperoleh hasil seperti pada Tabel 5.1
(perhitungan selengkapnya di Lampiran 2)
Tabel 5.1 Penentuan Jumlah N-asetil glukosamin berdasarkan variasi konsentrasi substrat
Konsentrasi Substrat (%)
Luas area (mAU)
Jumlah N-Asetil glukosamin (mg/mL)
0,4 1230 1,98 0,8 4190 6,39 1,2 15180 22,78 1,6 10580 15,92 2,0 9820 14,79 2,4 2510 3,89
Hasil yang diperoleh pada Tabel 5.1 tersebut apabila dinyatakan dalam persentase N-Asetil
glukosamin yang dihasilkan dalam masing-masing substrat maka diperoleh grafik seperti
pada Gambar 5.6
Gambar 5.6 Persentase N-Asetil glukosamin pada masing-masing substrat
Jumlah N-Asetil glukosamin pada masing-masing substrat yang tertinggi dihasilkan pada
konsentrasi substrat 1,2 % yaitu sebesar 22,8 mg/mL atau 94,8 %. Kandungan N-Asetil
0102030405060708090
100
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Jum
lah
NA
G (%
)
Konsentrasi Substrat (%)
28
glukosamin semakin menurun setelah melewati konsentrasi 1,2 %. Dikatakan bahwa
konsentrasi substrat dapat mempengaruhi kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh suatu enzim.
Berdasarkan persamaan Michaelis – Menten, semakin bertambahnya konsentrasi substrat
akan menyebabkan kecepatan reaksi semakin bertambah sampai pada kecepatan yang
mendekati kecepatan maksimum (Nelson, 2003).
Berdasarkan grafik pada Gambar 5.6 terlihat bahwa enzim mengikuti pola dari
persamaan Michaelis – Menten. Untuk menentukan pola kinetika dari reaksi tersebut maka
dapat digunakan metode “pemetaan kebalikan berganda” sehingga dapat menentukan secara
tepat harga KM dan Vmaks. Metode tersebut dapat dilakukan dengan menggunakan
transformasi aljabar dari persamaan Michaelis-Menten, sehingga diperoleh persamaan
Lineweaver-Burk (Gambar 5.7) yang menghubungkan parameter 1/V terhadap 1/[S] (Hasil
lengkapnya di Lampiran 4).
Gambar 5.7 Penentuan KM dan Vmaks dengan Persamaan Lineweaver – Burk
Harga KM merupakan unsur kunci dalam persamaan Michaelis-Menten yang bersifat
khas bagi enzim tertentu, dengan substrat spesifik pada kondisi pH dan suhu tertentu. KM
sangat penting dan bersifat karakteristik yang bermanfaat tidak hanya sebagai dasar untuk
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
1/V
[1/S]
29
menjelaskan penjabaran secara matematika tentang kinetika enzim tetapi juga untuk menguji
secara kuantitatif aktivitas enzim dalam jaringan dan pemurnian enzim. Selain itu harga KM
juga berguna untuk menganalisis beberapa mekanisme pengendalian enzim. Berdasarkan
pemetaan kebalikan-ganda diperoleh harga KM sebesar 8,33 mg/mL dan Vmaks 52,6 mg/mL
jam atau 0,88 mg/mL Menit.
Beberapa penelitian yang terkait dengan penentuan konsentrasi substrat diantaranya
Jamialahmadi et al (2011) menyebutkan bahwa reaksi enzimatis dengan menggunakan
substrat kitin koloidal 100 mg/mL dapat menghasilkan N-Asetil glukosamin 21,5 %.
Penelitian lain menunjukkan bahwa kitinase dari Trichoderma harzianum dapat
mendegradasi kitin dengan konsentrasi 17,5 mg/mL yang menghasilkan 77% N-Asetil
glukosamin (Das et al., 2012). Rameshaiah et al (2014) memperoleh 0,32 g/L N-Asetil
glukosamin dengan konsentrasi kitin 15 g/L. Farag et al (2014) menyebutkan bahwa kitinase
yang diperoleh dari Aspergillus terrus dapat menghasilkan produk meksimum dengan
menggunakan konsentrasi substrat kitin powder 2 % , pH 5, suhu 30C dan pengocokan
selama 5 hari. Bervariasinya nilai N-Asetil glukosamin yang dihasilkan sangat dipengaruhi
oleh aktivitas kitinase yang digunakan yang diperoleh dari berbagai sumber yang berbeda.
Semakin tinggi aktivitasnya maka jumlah produk yang dihasilkan juga semakin tinggi.
5.2.2 Penentuan waktu inkubasi optimum
Setelah diperoleh konsentrasi optimum selanjutnya dilakukan penentuan waktu
inkubasi optimum dengan menggunakan konsentrasi kitin 1,2 %. Variasi waktu inkubasi
yang digunakan adalah 0, 1, 2, 4, 6, 8 dan 24 jam hasilnya seperti terlihat pada Gambar 5.7
(hasil selengkapnya di Lampiran 6). Waktu inkubasi sangat menentukan jumlah produk yang
dihasilkan, hal ini memberikan waktu terbaik untuk interaksi enzim dengan substrat. Seperti
halnya pada optimasi konsentrasi substrat, penentuan waktu inkubasi dilakukan berdasarkan
30
munculnya puncak pada waktu retensi di sekitar 2 – 3 menit yang akan dibandingkan dengan
N-Asetil glukosamin standar.
Gambar 5.8 Hasil analisis HPLC pada penentuan waktu inkubasi optimum untuk waktu 0 jam (A) ; 1 jam (B) dan 2 jam (C)
B
C
A
31
Gambar 5.9 Hasil analisis HPLC pada penentuan waktu inkubasi optimum
untuk waktu 4 jam (D) ; 6 jam (E) ; 8 jam (F) ; dan 24 jam (G)
D
E
F
G
32
Dengan menggunakan kurva standar, maka diperoleh kadar N-asetil glukosamin seperti pada
Tabel 5.2 (perhitungan selengkapnya di Lampiran 5).
Tabel 5.2 Penentuan Jumlah N-asetil glukosamin berdasarkan variasi waktu inkubasi
Hasil yang diperoleh pada Tabel 5.2 tersebut apabila dinyatakan dalam persentase N-Asetil
glukosamin yang dihasilkan dengan konsentrasi substrat 1,2 % pada berbagai waktu inkubasi
maka diperoleh grafik seperti pada Gambar 5.9
Jumlah N-Asetil glukosamin yang tertinggi pada variasi waktu inkubasi dihasilkan
saat enzim kitinase dan kitin jenis amorf dengan waktu 8 jam yaitu sebesar 10,95 mg/mL atau
45,6 %. Kitin dan kitosan adalah senyawa-senyawa yang tidak larut dalam air sehingga hal
ini juga merupakan kendala bagi enzim sehingga memerlukan waktu lama untuk
mendegradasinya (Coutiño et al, 2006). Jumlah N-Asetil glukosamin ternyata semakin
menurun setelah setelah dilakukan inkubasi sampai 24 jam. Penurunan jumlah N-
asetilglukosamin kemungkinan dikarenakan enzim mengalami denaturasi selama reaksi
berlangsung atau terjadi penghambatan saat proses pembentukan N-asetilglukosamin
(Jamialahmadi et al, 2011). Menurut Widyastuti (2007), senyawa kitooligosakarida dan N-
asetilglukosamin hasil hidrolisis kitin oleh kitinase pada konsentrasi yang tinggi akan dapat
menyebabkan inhibisi umpan balik karena kelebihan N-asetilglukosamin sebagai produk
akhirnya. Penelitian lain menyebutkan bahwa kitinase dapat dihambat secara kompetitif oleh
Waktu Inkubasi (Jam)
Luas area (mAU)
Jumlah NAG (mg/mL)
0 214,7 0,46 1 681 1,16 2 813 1,36 4 3203 4,92 6 7087 10,71 8 7244 10,95
24 5472 8,31
33
beberapa senyawa seperti alosamidin dan beberapa senyawa selain gula yang terdapat di
dalamnya (Peter, 2005).
Gambar 5.10 Persentase N-Asetil glukosamin pada variasi waktu inkubasi dengan konsentrasi kitin jenis amorf 1,2%
Beberapa penelitian yang mempelajari tentang pengaruh waktu inkubasi terhadap
pembentukan N-Asetil glukosamin diantaranya adalah : pembentukan N-Asetil glukosamin
sebanyak 1,3 g/L diperoleh dari substrat kitin setelah diinkubasi dengan kitinase dari
Trichoderma harzianum selama 113,17 jam (Rameshaiah et al, 2014). Penelitian lain
menyebutkan bahwa produksi N-Asetil glukosamin dari kitin koloidal dengan enzim kitinase
dari Aeromonas sp PTCC 1691 menghasilkan sekitar 40% setelah diinkubasi selama 24 jam
(Jamialahmadi, 2011). Produksi N-Asetil glukosamin sebanyak 2,375 mg/mL secara
enzimatis dari kitin koloidal dengan menggunakan kitinase dari Aspergillus sp 501 yang
diinkubasi selama 4 hari (Widhyastuti, 2010).
5.2.3 Penentuan konsentrasi enzim optimum
Konsentrasi enzim merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim,
dimana semakin tinggi konsentrasi enzim maka aktivitasnya juga semakin meningkat.
05
101520253035404550
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Jum
lah
NA
G (%
)
Waktu Inkubasi (Jam)
34
Kenaikan aktivitas enzim berbanding lurus dengan produk yang dihasilkan, hal ini berarti
bahwa kenaikan N-Asetil glukosamin ditunjukkan dengan kenaikan aktivitas kitinase.
Berdasarkan variasi konsentrasi enzim ditentukan konsentrasi N-Asetil glukosamin seperti
Gambar 5.10 (perhitungan selengkapnya di Lampiran 7 dan 8).
Gambar 5.11 Persentase N-Asetil glukosamin pada variasi konsentrasi enzim yang diinkubasi selama 8 jam dengan konsentrasi kitin jenis amorf 1,2%
Jumlah N-Asetil glukosamin menunjukkan kenaikan dengan semakin tingginya konsentrasi
enzim kitinase, dimana konsentrasi enzim 0,1 U/mL dapat menghasilkan sekitar 0,454
mg/mL atau 1,89 % N-Asetil glukosamin dengan konsentrasi kitin 1,2 % diikubasi selama 8
jam.
Beberapa penelitian lain yang terkait dengan pengaruh konsentrasi enzim kitinase
telah banyak dilakukan diantaranya adalah : El-Sayed et al (2000) menyebutkan bahwa
kitinase dari daun tanaman tingkat tinggi Beta Bulgaris pada konsentrasi 40 g protein dapat
menghasilkan sekitar 55 ng N-Asetil glukosamin. Penelitian lain menyebutkan bahwa
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
Jum
lah
NA
G (%
)
Konsentrasi Enzim (U/mL)
35
kitinase yang diperoleh dari sejenis insekta Balanus Amphitrite dengan konsentrasi 4U/mL
dapat menghasilkan sekitar 0,4 g/mL N-Asetil glukosamin ((Khandeparker et al, 2013).
5.3 Pemurnian N-Asetil glukosamin
Hasil degradasi secara enzimatis kitin jenis amorf untuk membentuk N-Asetil glukosamin
masih menunjukkan adanya senyawa yang lain pada kromatogram HPLC. Untuk memperoleh N-
Asetil glukosamin dengan tingkat kemurnian yang tinggi, maka perlu dilakukan pemurnian. Pada
penelitian ini akan dilakukan pemurnian dengan menggunakan beberapa pelarut dengan tingkat
kepolaran yang berbeda. Pelarut yang digunakan untuk pemurnian N-Asetil glukosamin
berdasarkan urutan kepolaran adalah : aseton, etanol, metanol dan asetonitril.
Produksi N-Asetil gllukosamin dilakukan pada kondisi optimum, yaitu pada konsentrasi
substrat 1,2 % , konsentrasi enzim sekitar 1 U/mL dan waktu inkubasi 8 jam. Hasil yang
diperoleh pada filtrat selanjutnyaa masing-masing dimurnikan dengan menambahkan pelarut
metanol, etanol, aseton, dan asetonitril. Setelah ditambahkan pelarut tersebut masing-masing
filtrat membentuk endapan, dan diduga pada endapan tersebut diduga salah satunya merupakan
N-Asetil glukosamin. Hal ini telah dibuktikan setelah dilakukan pengujian terhadap filtrat tidak
menunjukkan adanya puncak dari N-Asetil glukosamin (Gambar 5.11).
Gambar 5.12 Hasil analisis bagian filtrat pada tahap pemurnian
36
Adapun endapan yang diperoleh tersebut selanjutnya dilarutkan dengan aquades untuk dianalisis
kandungan N-Asetil glukosamin seperti pada Gambar 5.12 – 5.14. Hasil yang diperoleh
menunjukkan bahwa masih terdapat banyak sekali senyawa-senyawa yang lain, sehingga perlu
dilakukan pemurnian lebih lanjut dengan melakukan variasi pelarut.
Gambar 5.13 Hasil analisis bagian endapan pada tahap pemurnian untuk aseton (A), etanol (B), dan asetonitril (C)
C
B
A
37
Gambar 5.14 Hasil analisis bagian endapan pada tahap pemurnian untuk metanol
Selanjutnya dilakukan pemurnian dengan variasi pelarut dengan asetonitril sebagai pelarut
utamanya, hal ini dikarenakan asetonitril mempunyai kepolaran yang lebih tinggi dan dapat
menunjukkan puncak N-Asetil glukosamin lebih baik dibandingkan pelarut yang lain. Hasil
pemurnian dengan menggunakan metanol yang dilanjutkan dengan asetonitril pada masing-
masing tahapan seperti pada Gambar 5.15 (Tahapan pemurnian bertingkat selengkapnya
seperti pada Lampiran 9). Filtrat yang ditambahkan dengan metanol membentuk endapan dan
filtrat. Endapan yang diperoleh diduga mengandung N-Asetil glukosamin selanjutnya di
larutkan dengan aquades dan semua endapan larut sempurna kemudian ditambahkan kembali
asetonitril. Hal ini bertujuan untuk memisahkan kembali N-Asetil glukosamin dengan pelarut
yang lebih polar. Setelah ditambahkan asetonitril ternyata diperoleh kembali endapan dan
filtrat yang terdiri dari dua lapisan, dimana lapisan bawah diperkirakan merupakan asetonitril
yang hanya sedikit atau bahkan tidak mengandung N-Asetil glukosamin (Gambar 5.15 D).
Lapisan atas merupakan air selanjutnya ditambahkan kembali asetonitril dan membentuk
endapan dan filtrat yang masih mengandung N-Asetil glukosamin dalam air (Gambar 5.15B).
Endapan yang terbentuk selanjutnya dilarutkan aquades dan ditambahkan asetonitril tetapi
sudah tidak membentuk endapan. Diperkirakan pada larutan tersebut diperoleh N-Asetil
glukosamin yang tinggi seperti ditunjukkan pada Gambar 5.15C (hasil selengkapnya di
Lampiran 10).
38
Gambar 5.15 Hasil N-Asetil glukosamin pada pemurnian bertahap untuk NAG standar (A),
filtrat pada tahap akhir (B), endapan pada tahap akhir (C) dan filtrat pada asetonitril (D)
A
D
C
B
39
Pemurnian dengan metanol yang dilanjutkan dengan asetonitril memberikan hasil yang lebih
baik dibandingkan dengan pemurnian sebelumnya yang ditunjukkan dengan adanya puncak
dengan waktu retensi yang sama dengan waktu retensi N-Asetil glukosamin standar (Gambar
5.15 A,B dan C). N-Asetil glukosamin standar menunjukkan dua puncak, dimungkinkan
adanya senyawa lain dikarenakan N-Asetil glukosamin yang terhidrolisis dalam selang waktu
tertentu. Pada bagian B dan C muncul puncak lain pada waktu retensi sekitar 2,7 menit
diperkirakan puncak tersebut merupakan oligomer dari N-Asetil glukosamin yang
terdegradasi dari kitin. Hal yang sama juga dikemukakan oleh Sashiwa et al (2002) yang
menyebutkan bahwa degradasi polimer kitin secara enzimatis dengan endokitinase secara
perlahan akan dihasilkan oligosakarida dan selanjutnya dengan eksokitinase akan dihasilkan
N-Asetil glukosamin. Penelitian yang lain juga menunjukkan bahwa pola degradasi hidrolisis
kitin memberikan kromatogram dari oligomer N-Asetil glukosamin selain monomernya
(Chang et al, 2000).
Pemurnian terhadap N-Asetil glukosamin juga telah dilakukan dengan pelarut aseton,
asetonitril dan etanol yang kemudian dilanjutkan dengan asetonitril. Dilakukan tahapan yang
sama seperti halnya pada pemurnian di atas, filtrat pertama setelah ditambahkan pertama kali
dengan pelarut diperoleh puncak-puncak yang masih sangat banyak seperti pada Gambar
5.16.
Gambar 5.16 Hasil analisis bagian endapan pada bagian filtrat pertama
40
Salah satu dari puncak yang mempunyai luas area tertinggi tersebut dimungkinkan
bukan merupakan N-Asetil glukosamin dikarenakan waktu retensinya lebih jauh dari N-
Asetil glukosamin standar. Filtrat pada tahap kedua dari masing-masing pelarut memberikan
pola yang hampir sama seperti pada Gambar 5.17 tetapi masih terdapat puncak-puncak yang
lainnya.
Gambar 5.17 Hasil pemurnian N-Asetil glukosamin tahap kedua dengan variasi pelarut
menggunakan aseton (A), etanol (B), dan asetonitril (C)
C
B
A
41
Puncak yang muncul sangat banyak di pemurnian tahap kedua (Gambar 5.16) sudah banyak
yang hilang setelah dilakukan pemurnian kembali dengan variasi pelarut menggunakan
asetonitril (Gambar 5.18).
Gambar 5.18 Hasil pemurnian N-Asetil glukosamin tahap ketiga dengan variasi pelarut
menggunakan aseton (A), etanol (B), dan asetonitril (C)
42
Pemisahan dua atau lebih substansi tersebut didasarkan pada perbedaan koefisien
distribusinya. Apabila satu zat terlarut mempunyai nilai K lebih besar dari 1 dan yang lainnya
lebih kecil dari 1, maka dengan ekstraksi tunggal dapat dipisahkan. Akan tetapi apabila dua
substansi mempunyai kesamaan tetapi tidak identik koefisien distribusinya, maka pemisahan
hanya akan memisahkan secara parsial, sehingga perlu ditambahkan pelarut yang lain dengan
menggunakan metode Lyman Craig seperti yang telah dilakukan di atas (Pecsok et al, 1976).
Apabila diamati pada keempat jenis pelarut tersebut menunjukkan pola yang hampir sama,
dimana puncak yang diduga merupakan N-Asetil glukosamin telah terpisah dengan baik
meskipun masih terdapat 1 puncak lainnya yang belum terpisah dan diduga sebagai oligomer
N-Asetil glukosamin. Belum dilakukan perhitungan pada pelarut mana yang mempunyai
rendemen tinggi dari N-Asetil glukosamin sehingga selanjutnya dapat ditentukan pelarut
mana yang terbaik untuk mendapatkan N-Asetil glukosamin. Hal ini berarti masih perlu
dilakukan penelitian lanjutan untuk menentukan jenis pemurnian terbaik untuk mendapatkan
N-Asetil glukosamin berdasarkan puncak yang teridentifikasi dan jumlah rendemen tertinggi.
Jumlah rendemen N-Asetil glukosamin pada masing-masing pelarut yang belum terselesaikan
pada Tahun – 1 dan karakterisasi dari N-Asetil glukosamin yang diperoleh akan dilakukan
pada Tahun – 2.
43
BAB VI
SIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan di atas dapat diambil kesimpulan untuk
tahap pertama sebelum dilakukan karakterisasi adalah sebagai berikut :
1. Hasil optimasi menunjukkan bahwa konsentrasi substrat 1,2 % dapat menghasilkan N-
asetilglukosamin tertinggi sebesar 22,8 mg/mL atau 94,8 %. Waktu inkubasi terbaik yang
diperlukan untuk interaksi kitin jenis amorf dan kitinase adalah 8 jam dengan jumlah N-
asetilglukosamin sebesar 10,95 mg/mL atau 45,6 %. Konsentrasi enzim yang semakin
tinggi menunjukkan jumlah N-Asetil glukosamin yang semakin meningkat, konsentrasi
enzim 0,1 U/mL dapat menghasilkan sekitar 0,454 mg/mL atau 1,89 % N-Asetil
glukosamin
2. Berdasarkan pemetaan pada persamaan Lineweaver-Burk menunjukkan bahwa kinetika
reaksi enzimatis mengikuti orde dua dengan nilai KM sebesar 8,33 mg/mL dan Vmaks 52,6
mg/mL jam atau 0,88 mg/mL Menit.
3. Pemurnian yang dilakukan dengan menggunakan pelarut aseton, metanol, etanol, dan
asetonitril yang divariasi dengan pelarut asetonitril memberikan hasil yang bagus dengan
pola yang hampir sama dengan diperolehnya puncak yang sesuai dengan N-Asetil
glukosamin standar dengan waktu retensi sekitar 3,1 – 3,3 menit
4. Belum dilakukan penentuan rendemen N-Asetil glukosamin tertinggi pada masing-
masing pelarut, direncanakan akan dilakukan pada Tahun – 2.
44
DAFTAR PUSTAKA
Acosta N., Jimenez C, Borau V, and Heras A., 1993, Extraction and characterization of chitin from crustaceans, Biomass. Bioenerg., 5, 2, 53
Boller, T. and Mauch, F., 1988, Colorimetric assay for chitinase, In Methods in Enzimology, W.A. Wood and S.T. Kellog (eds.) Academic Press, San Diego, pp 430-435
Chang K.L.B and FU, W.R., 2000, HPLC analysis of n-acetyl-chito-oligosaccharides during the acid hydrolysis of chitin, Journal of Food and Drug Analysis, 2000. 8(2) : 75-83
Chen, J.K, Shen,C.R.,Liu, C.L., 2010, N-Acetylglucosamine: Production and applications, Mar. Drugs, 8, 2493-2516
Coutin˜o, L.R., Marı´a del Carmen, M.C., Huerta, S., Revah, S., Shirai, K., 2006, Enzymatic hydrolysis of chitin in the production of oligosaccharides using Lecanicillium fungicola chitinases, Process Biochemistry, Vol. 41 : 1106–1110.
Datta P.K., Basu P.S., Datta T.K., 1984, Isolation and characterization of Vicia faba lectin affinity purified on chitin column. Prep Biochem. 14:373–87.
de la Cruz, J., Pintor-Toro,J.A., Benitez,T. and Llobell,A., 1995, Purification and Characterization of an endo--1,6-glucanase from Trichoderma harzianum that is related to its mycoparasitism, J.Bacteriology, 1777 : 1864-1871
Demetriou, M., 2005, The Journal of Immunology, Vol.175, part 11 : 7202-7208. Domard, A. and Vasseur,V., 1991, Nonspecificity of a colorimetric method for the estimation
of N-asetil-glukosamin, Int.J.Biol.Macromol., 13 : 366-368. El-Sayed S.T., Salem A.M., Shehata A.N., and Jwanny E.W., 2000. Chitinase from leaves of
Beta vulgaris and other higher plants. Pakistan Journal of Biological Scince. 3(2) : 250-256
Farag, Aida M., Al-Nusarie, and Taghred S., 2014. Production, Optimization, Characterization and antifungal activity of chitinase produced by Aspergillus terrus, African Journal of Biotechnology, 13(14) : 1567-1578
Firdaus F., Darmawan E., Mulyaningsih S., 2009, Karakteristik spektra infrared (IR) kulit udang, kitin dan kitosan yang dipengaruhi oleh proses demineralisasi, deproteinasi, deasetilasi I dan deasetilasi II, DPPM UII, Yogyakarta.
Folders Jindra, Algra Jon, Roelofs Marc S. and Bitter Wilbert, 2001, Characterization of Pseudomonas aeroginosa Chitinase a Gradually Secreted Protein, Journal of Bacteriology, Vo. 183, No.24.
Frandberg Emma, 1997, Antifungal Compounds of Chitinolytic Bacteria from Grain Ecosystem, Doctor’s dissertation, ISSN 1401-6249
Gooday, G.W., 1990, Physiology of Microbial Degradation of Chitin and Chitosan, Biodegradation, 1 : 177-190
Guo, S.H., Chen J.K. and Lee,W.C., 2004, Purification and Characterization of Extracellular Chitinase From Aeromonas schubertii, Enzyme and Microbial Technology, 35 : 550-556
Herdaystuti, N. dan Cahyaningrum, S.E., 2013, Mempelajari pengaruh variasi bentuk substrat kitin hasil isolasi limbah cangkang udang pada proses degradasi enzimatis kitinase dari bakteri Pseudomonas sp TNH 54, Laporan Penelitian Fundamental Tahun ke -2 Ditlitabmas DIKTI
Ilankovan P., Hein S., Chuen-How Ng, Trung T.S., Stevens W.F., 2005, Production of N-acetyl chitobiose from various chitin substrates using commercial enzymes, J.Carb.Poly. available online at www.sciencedirect.com
45
Ito M., Matahira Y., Sakai K., 1998, The application of chitin-chitosan to bone filling materials, vol. 4. Kichin, Kitosan Kenkyu: Publ. Nippon Kichin, Kitosan Gakkai (p. 142–143).
Khan W., Prithiviraj B., Smith D.L., 2002, Effect of foliar application of chitin and chitosan oligosaccharides on photosynthesis of maize and soybean. Photosynthetica, 40:621–4.
Khandeparker L., Gaonkar C.C, Desai D.V., 2013. Degradation of barnacle nauplii: implications to chitin regulation in the marine environment. Biologia, vol.68(4) : 696-706
Kobayashi Y., Nishiyama M., Matsuo R., Tokura S., Nishi N., 1982, Application of chitin and its derivatives to paper industry. In: Hirano S, Tokura S, editors. Chitin chitosan. In: Proceeding of the International Conference, 2d. Jpn Soc Chitin Chitosan, Tattori, Japan.. p. 244–7.
Krajewska B., 2004, Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review., Enzyme Microbiol. Technol., 35:126–39.
Krokeide, I.M., Eijsink, V.G.H., and Sørlie, M., 2007, Enzyme assay for chitinase catalyzed hydrolysis of tetra-N-acetylchitotetraose by isothermal titration calorimetry, Thermochimica Acta, Vol. 454 : 144–146
Majt´an J., B´ılikov´a, K., Markoviˇc O., J´an Gr´of, Kogan G., and Sim´uth J., 2007, Isolation and characterization of chitin from bumblebee (Bombus terrestris), Intern. J. Biol. Macromol., 40, 237–241
Monreal J. and Reese, E.T., 1969, The Chitinase of Serratia marcescens, Canadian Journal of Microbiology, 15 : 689-696.
Nathalie C., Fleury A., Fukamiza T., and Ryszard B., 2006, Two-exo--D-glukosaminidase from Actinomycetes define anew subfamily 2 of glikoside hydrolases, Biochem. J., 394, 675-686.
Ogawa Kihachiro, Yoshida, Kariya, Ohnishi and Ikeda Ryuichiro, 2002, Purification and Characterization of a Novel Chitinase from Burkholderia cepacia strain KH2 isolated from the Bed Log of Lentinus edodes, Shiitake mushroom, J.Gen. Appl. Microbiol., 48 : 25-33
Ouchi T, Inosaka K, Murata J, Nishimoto T, Ohya Y. Design of water-soluble CM-chitin/antitumor drug conjugate. Polym Prep, Am Chem Soc, Div Polym Chem 1992;33(2):537–8.
Pecsok R.L., Shields L.D., Cairns T., and McWilliams I.G., 1976. Modern methods of chemical analysis. 2nd edition. John Willey and sons, New York
Rinaudo M., 2006, Chitin and Chitosan : Properties and applications, Prog.Polym.Sci., 31 : 603-632
Sashiva H., Saimoto H,, Sgigemasa Y,, Ogawa R, 1990, Tokura S., Lysozyme susceptibility of partially deacetylated chitin, Int. J. Biol. Macromol., 12:295–6.
Sashiwa T., Fujishima T.,Yamano N., Kawasaki N., Nakayama A., Muraki E., Hiraga K., Oda K., Aiba S., 2002. Production of N-acetyl-D-glucosamine from -chitin by crude enzymes from Aeromonas hydrophila H-2330. Carbohydrate Research. 331 : 761-763
Songkroah C., Nakbanpote W., Thiravetyan P., 2004, Recovery of silver–thiosulfate complexes with chitin, Process Biochem., 39:1553–9
Suraini, A.A., Sin T.L., Alitheen N., Shahab N. and Kamaruddin K., 2008, Microbial Degradation of Chitin Materials by Trichoderma virens UKM1, Journal of Biological Science, Vol.8 (1) : 52-59
Toffey A., Glasser W.G., 1999, Chitin derivatives. II. Time–temperature-transformation cure diagrams of the chitosan amidization process, J. Appl. Polym. Sci., 73: 1879–89.
46
Tronsmo,A., and Harman,G.E., 1993, Detection and Quantification of N-Asetil--D-glukosaminidase, Chitobiosidase and endochitinase in Solution and on gels, Anal.Biochem, 208 : 74-79
Watanabe, T., Oyanagi,W., Suzuki,K., and Tanaka,H., 1990, Chitinase system of Bacillus circulans WL-12 and Importance of Chitinase A1 in Chitin Degradation, Journal Bacteriology 172 : 4017-4022
Widhyastuti N., 2010. Purifikasi N-asetil-D-glukosamina hasil sintesa secara enzimatis untuk bahan obat dan pangan fungsional. Laporan Riset Dasar. Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia
Yoshino H., Ishii S., Nishimura S., Kurita K., 1992, Preparation and characterization of mercapto-chitin derivatives. In: Brine CJ, Sandford PA, Zikakis JP, editors. Advances in chitin and chitosan. London and New York: Elsevier, p. 565–70.
Yurnaliza, 2002, Senyawa Kitin dan Kajian Aktivitas enzim Mikrobial Pendegradasinya, FMIPA-USU.
Yusof N.L., Wee A., Lim L.Y., Khor E., 2003, Flexible chitin films as potential wound-dressing materials: wound model studies, J.Biomed. Mater. Res ., A 66A:224–32.
47
LAMPIRAN 1
PERHITUNGAN KURVA STANDAR N-ASETIL GLUKOSAMIN (HPLC)
No. Konsentrasi N-Asetil
glukosamin (mg/mL)
Luas Area (mAU)
1, 0,2 48,6
2. 0,3 97,9
3. 0,4 160
4. 0,5 245
5. 0,6 300
6. 0,7 369
7. 0,8 447
y = 670.5x - 97.03
050
100150200250300350400450500
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Luas
Are
a (m
AU
)
Konsentrasi NAG (mg/mL)
48
LAMPIRAN 2
PERHITUNGAN PERSENTASE N-ASETIL GLUKOSAMIN PADA OPTIMASI KONSENTRASI SUBSTRAT
1. Konsentrasi substrat 0,4 %
0,4 % = 0,4 gram dalam 100 mL aquades = 400 mg/100 mL
= 4 mg/mL dalam 2 mL = 8 mg
Maka jumlah NAG = 1,98/8 x 100% = 24,8 %
2. Konsentrasi substrat 0,8 %
0,8 % = 0,8 gram dalam 100 mL aquades = 800 mg/100 mL
= 8 mg/mL dalam 2 mL = 16 mg
Maka jumlah NAG = 6,39/16 x 100% = 39,9 %
3. Konsentrasi substrat 1,2 %
1,2 % = 1,2 gram dalam 100 mL aquades = 1200 mg/100 mL
= 12 mg/mL dalam 2 mL = 24 mg
Maka jumlah NAG = 22,78/24 x 100% = 94,9 %
4. Konsentrasi substrat 1,6 %
1,6 % = 1,6 gram dalam 100 mL aquades = 1600 mg/100 mL
= 16 mg/mL dalam 2 mL = 32 mg
Maka jumlah NAG = 15,92/32 x 100% = 49,8 %
5. Konsentrasi substrat 2,0 %
2 % = 2 gram dalam 100 mL aquades = 2000 mg/100 mL
= 20 mg/mL dalam 2 mL = 40 mg
Maka jumlah NAG = 14,79/40 x 100% = 37,0 %
6. Konsentrasi substrat 2,4 %
49
2,4 % = 2,4 gram dalam 100 mL aquades = 2400 mg/100 mL
= 24 mg/mL dalam 2 mL =4 8 mg
Maka jumlah NAG = 3,89/48 x 100% = 8,1 %
50
LAMPIRAN 3 HASIL PENENTUAN OPTIMASI KONSENTRASI SUBSTRAT DENGAN HPLC
1. Kitin amorf 2,4 % (Pengenceran 100 x)
51
2. Kitin amorf 2,0 % (Pengenceran 100 x)
52
3. Kitin amorf 1,6 % (Pengenceran 100 x)
53
4. Kitin amorf 1,2 % (Pengenceran 100 x)
54
5. Kitin amorf 0,8 % (Pengenceran 100 x)
6. Kitin amorf 0,4 % (Pengenceran 100 x)
55
56
LAMPIRAN 4
PENENTUAN KM DAN VMAKS DARI TRANSFORMASI PERSAMAAN MICHAELIS-MENTEN KE LINEWEAVER-BURK
[S] 1/[S] V 1/V
0,4 2,5 1,98 0,51
0,8 1,25 6,39 0,16
1,2 0,83 22,78 0,04
1,6 0,63 15,92 0,06
2,0 0,5 14,79 0,07
2,4 0,42 3,89 0,27
Garis yang memotong di sumbu X adalah – 1/ KM Saat Y = 0 maka X = - 0,019/0,164 = - 0,12 – 1/ KM Maka KM = 8,33 mg/mL Garis yang memotong di sumbu Y adalah 1/ Vmaks Saat X = 0 maka Y = 0,019 = 1/ Vmaks Maka Vmaks = 52,6 mg/mL jam
y = 0.164x + 0.019R² = 0.984
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
1/V
[1/S]
57
LAMPIRAN 5
PERHITUNGAN PERSENTASE N-ASETIL GLUKOSAMIN PADA OPTIMASI WAKTU INKUBASI
1. Waktu inkubasi 0 jam
1,2 % = 1,2 gram dalam 100 mL aquades = 1200 mg/100 mL
= 12 mg/mL dalam 2 mL = 24 mg
Maka jumlah NAG = 0,46/24 x 100% = 1,9 %
2. Waktu inkubasi 1 jam
1,2 % = 1,2 gram dalam 100 mL aquades = 1200 mg/100 mL
= 12 mg/mL dalam 2 mL = 24 mg
Maka jumlah NAG = 1,16/24 x 100% = 4,8 %
3. Waktu inkubasi 2 jam
1,2 % = 1,2 gram dalam 100 mL aquades = 1200 mg/100 mL
= 12 mg/mL dalam 2 mL = 24 mg
Maka jumlah NAG = 1,36/24 x 100% = 5,7 %
4. Waktu inkubasi 4 jam
1,2 % = 1,2 gram dalam 100 mL aquades = 1200 mg/100 mL
= 12 mg/mL dalam 2 mL = 24 mg
Maka jumlah NAG = 4,92/24 x 100% = 20,5 %
5. Waktu inkubasi 6 jam
1,2 % = 1,2 gram dalam 100 mL aquades = 1200 mg/100 mL
= 12 mg/mL dalam 2 mL = 24 mg
Maka jumlah NAG = 0,46/24 x 100% = 44,6 %
58
6. Waktu inkubasi 8 jam
1,2 % = 1,2 gram dalam 100 mL aquades = 1200 mg/100 mL
= 12 mg/mL dalam 2 mL = 24 mg
Maka jumlah NAG = 10,95/24 x 100% = 45,6 %
7. Waktu inkubasi 24 jam
1,2 % = 1,2 gram dalam 100 mL aquades = 1200 mg/100 mL
= 12 mg/mL dalam 2 mL = 24 mg
Maka jumlah NAG = 8,31/24 x 100% = 34,6 %
59
LAMPIRAN 6 HASIL PENENTUAN OPTIMASI WAKTU INKUBASI DENGAN HPLC
1. Waktu inkubasi 0 jam (Pengenceran 10 x)
60
2. Waktu inkubasi 1 jam (Pengenceran 10 x)
61
3. Waktu inkubasi 2 jam (Pengenceran 10 x)
62
4. Waktu inkubasi 4 jam (Pengenceran 10x)
63
5. Waktu inkubasi 6 jam (Pengenceran 10x)
64
6. Waktu inkubasi 8 jam (Pengenceran 100x)
65
7. Waktu inkubasi 24 jam (Pengenceran 10x)
66
LAMPIRAN 7
KURVA STANDAR N-ASETIL GLUKOSAMIN (SPEKTROFOTOMETER UV-VIS)
No. Konsentrasi N-Asetil glukosamin (mg/mL)
Absorbansi
1. 0,1 0,096 0,095 0,095
2. 0,2 0,194 0,192 0,195
3. 0,3 0,255 0,257 0,256
4. 0,4 0,324 0,326 0,327
5. 0,5 0,409 0,411 0,411
y = 0.762x + 0.027R² = 0.994
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Abso
rban
si (
=494
nm
)
Konsentrasi NAG (mg/mL
67
LAMPIRAN 8
PERHITUNGAN N-ASETIL GLUKOSAMIN PADA OPTIMASI KONSENTRASI ENZIM
1. Aktivitas kitinase
2. Persentase N-Asetil glukosamin
a. Konsentrasi 0,025 U/mL
Dalam 1,2 % substrat = 1,2 gram dalam 100 mL aquades = 1200 mg/100 mL
= 12 mg/mL dalam 2 mL = 24 mg
Maka jumlah NAG = 0,247/24 x 100% = 1,03 %
b. Konsentrasi 0,05 U/mL
Dalam 1,2 % substrat = 1,2 gram dalam 100 mL aquades = 1200 mg/100 mL
= 12 mg/mL dalam 2 mL = 24 mg
Maka jumlah NAG = 0,349/24 x 100% = 1,45 %
No. Konsentrasi Enzim (U/mL)
Absorbansi Rerata absorbansi
N-Asetil glukosamin
(mg/mL)
Aktivitas kitinase (U/mL)
1 0,025 0,211
0,216 0,247
0,618 0,217
0,219
2 0,05 0,293
0,29 0,345
0,862 0,288
0,289
3 0,075 0,324
0,329 0,396
0,990
0,32 0,343
4 0,097 0,37
0,373 0,454
1,135
0,375 0,374
68
c. Konsentrasi 0,075 U/mL
Dalam 1,2 % substrat = 1,2 gram dalam 100 mL aquades = 1200 mg/100 mL
= 12 mg/mL dalam 2 mL = 24 mg
Maka jumlah NAG = 0,396/24 x 100% = 1,65 %
d. Konsentrasi 0,025 U/mL
Dalam 1,2 % substrat = 1,2 gram dalam 100 mL aquades = 1200 mg/100 mL
= 12 mg/mL dalam 2 mL = 24 mg
Maka jumlah NAG = 0,454/24 x 100% = 1,89 %
69
LAMPIRAN 9
BAGAN TAHAPAN PEMURNIAN N-ASETIL GLUKOSAMIN
Metanol + Filtrat N-Asetil
glukosamin Aquades + Endapan
Larutan
Asetonitril +
Endapan 2 lapisan
Lapisan bawah (Asetonitril) B
Lapisan atas
Filtrat (A)
+ Aquades + asetonitril
2 lapisan
+ Asetonitril
Filtrat (C) Endapan
+ Aquades + asetonitril
Larutan (D)
Lapisan atas (F)
Lapisan atas (E)
70
LAMPIRAN 10 HASIL ANALISIS PEMURNIAN DENGAN VARIASI PELARUT
1. Metanol G
71
2. Metanol C
72
3. Metanol D
73
4. N-Asetil glukosamin standar
74
5. Aseton 1
75
6. Aseton 2
76
7. Aseton 3
77
8. Asetonitril 1
78
9. Asetonitril 2
79
10. Etanol 1
80
11. Etanol 2
81
12. Etanol 3
82
13. Filtrat
83
LAMPIRAN 11 BIODATA PENELITI
IDENTITAS DIRI (Ketua Peneliti) 1.1 Nama Lengkap Dr. Nuniek Herdyastuti, M.Si P 1.2 Jabatan Fungsional Lektor Kepala 1.3 NIP 197011101998022001 1.4 Tempat dan tanggal lahir Surabaya, 10 Nopember 1970 1.5 Alamat Rumah Jl. Karah 5 / 50 Jambangan Surabaya 1.6 Nomor Telp./ Fax (031) 8285623 1.7 Nomor HP 08175112310 1.8 Alamat Kantor Jl. Ketintang Surabaya 1.9 Nomor Telp./ Fax (031) 8298761 1.10 Alamat email nherdyastuti@ yahoo.com / [email protected] 1.11 Mata Kuliah yang
diampu 1. Kimia Dasar I dan II 2. Biokimia I dan II 3. Bioteknologi 4. Teknik Penelitian Biokimia 5. Mikrobiologi
B. RIWAYAT PENDIDIKAN 2.1 Program S1 S2 S3 2.2 Nama PT ITS ITB UGM 2.3 Bidang Ilmu Kimia Biokimia Biokimia 2.4 Tahun masuk 1990 1999 2007 2.5 Tahun Lulus 1994 2001 2010 2.6 Judul Skripsi / Thesis / Disertasi
Pengaruh Produk Reaksi Maillard terhadap Kualitas Nira
Deteksi Tingkat Ekspresi in Vitro dan In vivo Protein Car A Salmonella Typhimurium
Karakterisasi Kitinase yang Diproduksi oleh Isolat Bakteri dari Lumpur sawah
2.7 Nama Pembimbing/Promotor
Dr. Nurul Lailana M.S
Achmad Syaifudin Noer, P.hD
Prof.Sabirin Matsjeh, Ph.D
C.PENGALAMAN PENELITIAN
No. Tahun Judul Penelitian Pendanaan Sumber* Jml (Juta Rp)
1. 2014 Pemanfaatan kitosan-alginat mikrosperis sebagai pengenkapsulasi obat TBC sistem Control release (Anggota)
Hibah Bersaing (Tahun ke II)
65.000.000
2. 2013 Pemanfaatan kitosan-alginat mikrosperis sebagai pengenkapsulasi obat TBC sistem Control release (Anggota)
Hibah Bersaing (Tahun ke I)
50.000.000
3. 2013 Mempelajari pengaruh variasi bentuk substrat kitin hasil isolasi
Penelitian Fundamental
35.000.000
84
limbah cangkang udang pada proses degradasi enzimatis kitinase dari bakteri Pseudomonas sp TNH54 (Ketua)
Tahun I, Dikti Ditlitabmas
4. 2012 Mempelajari pengaruh variasi bentuk substrat kitin hasil isolasi limbah cangkang udang pada proses degradasi enzimatis kitinase dari bakteri Pseudomonas sp TNH54 (Ketua)
Penelitian Fundamental Tahun I, Dikti Ditlitabmas
30.000.000
5. 2010 Pembuatan siruf Fruktosa (HFCS) menggunakan enzim glukosa isomerase yang terimobilisasi pada matriks kitosan bead (Anggota)
Hibah Kompetitif sesuai Prioritas Nasional Batch II, DP2M, Dikti.
87.500.000
D.PENGALAMAN PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT
Tahun Judul Pendanaan Sumber Jumlah
(Juta Rp) 2011 Sosialisasi penjernihan minyak goreng jelantah
dengan lempung bentonit sebagai upaya pencegahan timbulnya karsinogenik di Desa Laju Lor Kecamatan Singgahan Kabupaten Tuban
PKMM 2
2011 Pelatihan peningkatan mutu tahu dengan menggunakan kitosan sebagai pengawet alami yang aman bagi kesehatan di industri tahu Desa Tambak Sumur Sidoarjo
DIPA 5
2012 Pelatihan dampak penggunaan plastic di PKK RT 5 RW III Kelurahan Kebraon Surabaya
Swadana 2
2012 Sosialisasi bahaya penggunaan zat pewarna makanan sintetis di PKK RT 16 RW 04 Kelurahan Wonokromo Surabaya
PKMM 2
2013 Pelatihan pemanfaatan kitosan sebagai bahan pengawet ikan yang sehat dan aman bagi kesehatan
DIPA 5
2014 IbM Rukun nelayan di Desa Tambak Wedi Kecamatan Kenjeran Surabaya
DIKTI melalui DIPA-Offline
50
2014 Pelatihan pembuatan sabun kecantikan sebagai rintisan usaha skala rumah tangga
BOPTN, dana kebijakan Fakultas
5
F.PUBLIKASI ARTIKEL ILMIAH DALAM JURNAL Tahun Judul Jurnal
2002 Deteksi Protein Car A melalui pendekatan imunologi
Jurnal Penelitian Matematika dan Sains
85
2003 Deteksi Tingkat Ekspresi Invitro Protein Car A Menggunakan Teknik Elisa dan Western Imunoblotting
Jurnal Hayati, Vol.2 No.2, 99-103, 2003, Terakreditasi (ISSN 0852-6834)
2006 Isolasi dan Karakterisasi Ekstrak Kasar Bromelin dari Batang Nenas (Ananas comusus L.merr)
Jurnal Hayati,Vol.12 No.1, 75-77, 2006, Terakreditasi (ISSN 0852-6834)
2009 Kitinase dan mikroorganisme kitinolitik : Isolasi, karakterisasi dan manfaatnya (Review)
Indonesian Journal of Chemistry, vol.9. no.1, 37-47, 2009, Terakreditasi (ISSN 1411-9420)
2009 Kitin dari limbah cangkang udang sebagai media untuk bakteri kitinolitik yang diisolasi dari lumpur sawah
Jurnal Manusia dan Lingkungan , vol.16, No.2, 115-121, 2009, terakreditasi (ISSN 0854-5510
2011 Characterization of chitinase from Pseudomonas sp TNH54 isolated from Mud fields
Asian Journal of Chemistry, Vol. 23, No. 8, 3549-3552, 2011, terakreditasi (ISSN 0970-7077)
2011 Soption of Mg (II) and Ca (II) metal ions on chitosan-alginate membrane
Journal of Materials science and Engineering, Vol.1, No.1, 87-93, 2011, terakreditasi (ISSN 2161-6213)
2012 Potential antifungal of Chitinolytic Bacteria Pseudomonas sp TNH54 from Mud Field
Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, Vol.3 issue 3, 1117-1124, 2012 (ISSN: 0975-8585)
2014 Immobilization of glucose isomerase in surface-modified chitosan gel beads.
Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, Vol.5 issue 2, 1117-1124, 2014 (ISSN: 0975-8585)
F. Pemakalah Seminar Ilmiah (Oral Presentation)
Nama Pertemuan Seminar Judul Artikel Waktu dan Tempat Seminar Nasional Green Technology
Potensi anti jamur bakteri kitinolitik yang diisolasi dari lumpur sawah
2010, UIN – Malang
Seminar Internasional Conference of The Indonesian Chemical Society
Colloidal Chitin as a Substrate for Chitinase of Producing Enzyme From Pseudomonas sp TNH54
2012, University of Brawijaya Malang
Seminar Nasional Kimia dan Terapan Indonesia
Karakterisasi Variasi Kitin dari kulit cangkang udang Sebagai Substrat Enzim Kitinase Yang Diisolasi Dari Pseudomonas sp TNH54
2013, LIPI Solo
Seminar Nasional Kimia Kitin jenis amorf sebagai alternative substrat untuk produksi
2013, UNY Yogyakarta
86
kitinase dari Pseudomonas sp TNH54
Seminar Nasional Kimia Bakteri kitinolitik yang diisolasi dari tambak udang Lamongan Jawa Timur
2014, Kimia Unesa
Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia
Kondisi optimum untuk memproduksi N-asetil glukosamin dari kitin jenis amorf dengan enzim kitinase dari Pseudomonas sp TNH54
2015, Kimia Unnes
G. KARYA BUKU
No. Tahun Judul Buku Jumlah Halaman
Penerbit
H. PEROLEHAN HKI
No. Tahun Judul/Tema HKI Jenis Nomor P/ID
I. PENGALAMAN MERUMUSKAN KEBIJAKAN PUBLIK/REKAYASA SOSIAL LAINNYA
No. Tahun Judul/Tema/Jenis Rekayasa Sosial
Lainnya yang Telah Diterapkan Tempat
Penerapan Respons
Masyarakat
J. PENGHARGAAN DALAM 10 TAHUN TERAKHIR
No. Jenis Penghargaan Institusi Pemberi Penghargaan
Tahun
1. Satyalancana Karya Satya X tahun Kepresidenan RI 2104 2. Peneliti Berprestasi kategori Non
Kependidikan Sain dan Teknologi LPPM – UNESA 2014
87
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidak-sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima risikonya.
Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan Hibah Fundamental
Surabaya, 20 Oktober 2015 Peneliti,
Dr. Nuniek Herdyastuti, M.Si NIP.197011101998022001
88
ANGGOTA PENELITI
A. IDENTITAS DIRI
1.1 Nama Lengkap (dengan gelar) Dr. Sari Edi Cahyaningrum, M.Si P 1.2 Jabatan Fungsional Lektor kepala/IV a 1.3 NIP/NIK/No. identitas lainnya 197012291997022001 1.4 Tempat dan Tanggal Lahir Kediri, 29 Desember 1970 1.5 Alamat Rumah Pondok Ridho III, Sidodadi Taman , Sidoarjo 1.6 Nomor Telepon/Faks 0317870861 1.7 Nomor HP 08123290484 1.8 Alamat Kantor Jurusan Kimia FMIPA Unesa, Jl. Ketintang
Surabaya 1.9 Nomor Telepon/Faks 0318298761
1.10 Alamat e-mail [email protected] 1.11 Mata Kuliah yg diampu
1. Bioanorganik 2. Material Anorganik 3. Senyawa Organologam 4. Kimia Anorganik I 5. Kimia Anorganik IV
B. RIWAYAT PENDIDIKAN
2.1 Program: S-1 S-2 S-3 2.2 Nama PT ITS UGM UGM 2.3 Bidang Ilmu Kimia Kimia Anorganik Bioanorganik 2.4 Tahun Masuk 1989 1999 2005 2.5. Tahun Lulus 1994 2001 2009 2.6 Judul Skripsi/
Tesis/Disertasi Analisa Patulin Produksi Stapilococus aureus Pada Juice Anggur
Karakteristik Adsorpsi Ni(II) dan Cd(II) pada Kitosan Limbah Udang Windu
Peranan Jembatan Kation Logam Pada Imobilisasi Papain pada Matriks Kitosan beads
2.7. Nama Pembim- bing/ Promotor
Dr. Nurul Lailana M.S
Dr. Narsito Prof. Dr. Narsito
C. PENGALAMAN PENELITIAN
No. Tahun Judul Penelitian Pendanaan Sumber* Jumlah (Rp)
1. 2014 Pemanfaatan kitosan-alginat mikrosperis sebagai pengenkapsulasi obat TBC sistem Control release
Hibah Bersaing (Tahun ke II)
65.000.000
2. 2013 Pemanfaatan kitosan-alginat mikrosperis sebagai pengenkapsulasi obat TBC sistem Control release
Hibah Bersaing (Tahun ke I)
50.000.000
3. 2010 Sintesis dan karakterisasi membran Hibah 100.000.000
89
nanofibrous kitosan-alginat dan aplikasinya sebagai matriks pendukung imobilisasi enzim pepsin
kompetensi
4. 2009 Pembuatan siruf Fruktosa (HFCS) menggunakan enzim glukosa isomerase yang terimobilisasi pada matriks kitosan bead.
Hibah Kompetitif sesuai Prioritas Nasional Batch II, DP2M, Dikti.
87.500.000
5. 2007 Pemanfaatan kitosan limbah udang windu sebagai matriks pendukung imobilisasi papain melalui metode carier crossling
Hibah Bersaing (Tahun II)
42.500.000
6. 2006 Pemanfaatan kitosan limbah udang windu sebagai matriks pendukung imobilisasi papain melalui metode carier crossling kation logam Mg(II)
Hibah Bersaing (Tahun I)
50.000.000
7. 2005 Pemanfaatan kitosan sebagai adsorben Cd(II) dalam Medium Air
PDM 7.000.000
D. PENGALAMAN PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT
No. Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan Sumber* Jumlah (Rp)
1. 2013 Pelatihan pemanfaatan kitosan sebagai pengawet ikan yang aman bagi kesehatan di Desa Tambak Wedi, Kenjeran Surabaya
BOPTN 5.000.000
2. 2011 Pelatihan pembuatan sampo mobil dan sabun pencuci piring di Desa Bungurasih, Waru, Sidoarjo
Mandiri
3. 2011 Pelatihan Pemanfaatan kitosan untuk bahan aditiv pembuatan tahu di Desa Tambak Sumur Sidoarjo
DIPA 5.000.000
4. 2010 Pelatihan pembuatan jamu tradisional untuk wanita di perumahan Pondok Indah Surabaya
Mandiri
5. 2009 Pelatihan Pembuatan sabun pelembut pakaian, dan sabun colek di Pondok Pesantran Darul Falah Sidoarjo
Dipa Unesa 3.000.000
6. 2007 Pelatihan pembuatan jamu tradisional untuk wanita di perumahan Pondok Indah Surabaya
Penerapan Ipteks
7.500.000
7. 2007 Pelatihan pembuatan sabun wajah di SMA Budi Utomo Perak Jombang
Dipa Unesa 3.000.000
A. PENGALAMAN PENULISAN ARTIKEL ILMIAH DALAM JURNAL
90
No. Tahun Judul Artikel Ilmiah Volume/ Nomor Nama Jurnal
1. 2013 Preparation and Properties of Papain Immobilized onto Metal Ions Cross-linked Chitosan Beads
Vol 4.no.4
Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences
2. 2011 Adsorpsi Zn (II) dan Cu(II) pada Kitosan Nanobeads
Vol 18, No.3
Jurnal Manusia dan Lingkungan
3. 2011 Sorption Ca(II) and Mg(II) on Chitosan-alginate membrane.
Vol 1, No.1
Journal of Material Science and Engineering. USA
4. 2010 Soption Cu(II) on Nano Chitosan beads (, Aug
Vol.3 No.2
American Institut of Phisic, USA.
5. 2010 Adsorption Mg(II) on Chitosan in Aqueous Medium
Vol. 2. No. 3
Journal of Coastal Development
6. 2009 Immobilization of papain on chitosan beads with Mg (II) as carrier croslink agent
vol.10. no.2
Indonesian Journal of Chemistry,
7. 2008 Pemanfaatan Kitosan serbuk Sebagai adsorben Ca(II) dalam medium air
vol.10. No.2
Jurnal Kimia Lingkungan
8. 2008 Adsorpsi Zn(II) pada kitosan yang termodifikasi secara swelling
vol.10, No.1
Jurnal Manusia dan Lingkungan
9. 2007 Adsorpsi Cu(II) pada kitosan bead dalam medium air
Vol.9 No.1
Jurnal Kimia Lingkungan
10. 2005 Pemanfaatan kitosan limbah udang sebagai adsorben Cd(II) dari limbah industri
Vol.5. No. 2
Indonesian Journal Of Chemistry
11. 2007 Pengaruh proses penggembungan pada kitosan terhadap adsorpsi Mg(II) dalam medium air
Vol.14. No.2
Jurnal Penelitian Matematika dan Sains
F. PENGALAMAN PENULISAN BUKU
No. Tahun Judul Buku Jumlah Halaman
Penerbit
G. PENGALAMAN PEROLEHAN HKI
No. Tahun Judul/Tema HKI Jenis Nomor P/ID
H. PENGALAMAN MERUMUSKAN KEBIJAKAN PUBLIK/REKAYASA SOSIAL
LAINNYA
91
No. Tahun Judul/Tema/Jenis Rekayasa Sosial Lainnya yang Telah Diterapkan
Tempat Penerapan
Respons Masyarakat
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidak-sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima risikonya. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan Hibah Penelitian Fundamental.
Surabaya, 20 Oktober 2015 Pengusul,
Dr. Sari Edi Cahyaningrum, M.Si NIP.197012291997022001
92
LAMPIRAN 12 PUBLIKASI DI SEMINAR NASIONAL KIMIA (10 Oktober 2015, UNNES)