PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEATMENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER

Oleh :

Nama : KhasanahNIM : B1J011101Kelompok : 4Rombongan : VAsisten : Yona Vebrila

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO

2013

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Pembelajaran tentang genetika molekuler memegang peranan dalam

mengidentifikasi faktor genetik yang mempengaruhi kerentanan penyakit manusia

dan hasilnya. Kemajuan teknik dalam genotip dan analisis sekuen, bersamaan dengan

ketersediaan sekuen dan informasi variasi sekuen yang terbatas telah meningkatkan

substansial lingkup manusia terhadap penelitian genetik. Salah satu pengembangan

teknologi yang penting untuk mendapatkan genotip dengan hasil yang baik adalah

kuantifikasi DNA. Keakuratan dan kuantifikasi DNA yang tepat sangat diperlukan

untuk mendapatkan hasil genotip yang efisien. Sampai saat ini, spektrofotometri

telah menjadi metode tradisional untuk kuantifikasi DNA dalam biologi molekuler

(Haque, 2003).

Seiring makin bertambahnya pengetahuan kita tentang biologi molekuler,

semakin menjadi jelas bahwa perkembangan dan pemanfaatan dalam bidang ini

menimbulkan revolusi yang besar dalam diagnosis, pencegahan dan pengobatan

penyakit. Pemeriksaan untuk variasi urutan DNA lebih sensitif dibandingkan dengan

banyak teknik lain (seperti pemeriksaan enzim) dan memungkinkan kita mengenal

penyakit lebih dini. Oleh karena itu, kemungkinan besar mengenal stadium yang

lebih dapat diterapi. Pemeriksaan DNA juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi

pembawa penyakit yang diwariskan sehingga pembawa dapat menerima penyuluhan

yang sesuai. Karena variasi genetik sedemikian khusus, “sidik jari” DNA (analisis

perbedaan urutan DNA) dapat digunakan untuk menentukan hubungan keluarga atau

untuk membantu mengidentifikasi pelaku kejahatan (Dawn, 2000).

Perhitungan asam nukleat sangat penting sebagai prosedur dalam banyak

penelitian biologi molekuler. Namun, penentuan konsentrasi DNA atau RNA yang

akurat bisa menjadi sulit, terutama ketika kemurnian sampel tidak pasti. Di banyak

kasus, pendekatan yang paling cepat dan akurat untuk menentukan konsentrasi asam

nukleat yang relatif murni dan protein adalah dengan membaca absorbansi pada

spektrofotometri. Jumlah cahaya yang diserap oleh sampel berbanding lurus dengan

konsentrasi protein atau asam nukleat dalam sampel. Konversi absorbansi dalam

pembacaan konsentrasi didasarkan pada hukum Lambert-Beer (Teare, 1997).

Menurut Day (2001), spektrofotometri adalah suatu metode analisis untuk

mengukur konsentrasi senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut

mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan

fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang

gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang

ditransmisikan atau diabsorbsi. Spektrofotometer dilengkapi sumber cahaya atau

gelombang elektromagnetik, baik cahaya UV (ultra violet) maupun cahaya nampak

(visible). Komponen utama dari alat ini adalah sumber cahaya, pengatur intensitas,

monokromator, kuvet, detektor, penguat arus dan indikator atau layar (Riyadi, 2009).

B. Tujuan

Tujuan dari praktikum penentuan kualitas dan kuantitas asam nukleat

menggunakan spektrofotometer kali ini adalah untuk melakukan pengukuran kualitas

dan kuantitas DNA hasil isolasi.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah spektrofotometer UV-

VIS, kuvet, mikropipet beserta tip dan tabung reaksi.

Bahan-bahan yang digunakan adalah DNA bakteri E-coli dan DNA buah,

akuades steril, larutan blanko, dan tissue.

B. Metode

Metode yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah :

1. Mesin spektrofotometer dinyalakan dan ditunggu 15 menit supaya stabil.

2. Akuades dimasukkan ke dalam kuvet, kemudian diukur absorbansinya sebagai

nilai absorbansi blanko. Pengukuran nilai absorbansi blanko ini dilakukan setiap

sebelum pengukuran nilai absorbansi sampel, kecuali pada panjang gelombang

230 nm.

3. Sebanyak 3 µL DNA hasil isolasi dilarutkan dalam akuades hingga 3000 µL,

kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 230 nm, 260 nm, 280 nm dan 320 nm.

4. Konsentrasi DNA dan kemurnian DNA dari protein atau RNA dan karbohidrat

atau kemikalia dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut :

Konsentrasi DNA = λ 260 x 50 x faktor pengenceran

Kemurnian DNA : Protein atau RNA = λ 260λ 230

Karbohidrat atau kemikalia = λ 260 λ 230

5. Hasil perhitungan dimasukkan ke dalam tabel.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Tabel 1. Perhitungan Konsentrasi DNA

No Sampelλ230

A[S]-A[B]

λ260

A[S]-A[B]

λ280

A[S]-A[B]

λ320

A[S]-A[B]

1 Mangga 0,009 0,009 0,015 0,009

2 Pepaya 0,031 -0,002 0,007 -0,004

3 Naga 0,020 0,001 0,016 0,002

4 Strawberry 0,339 0,008 -0,005 -0,008

5 Alpukat 0,147 0,112 -0,108 0,083

6. E.coli -0,046 -0,014 -0,006 -0,013

Keterangan: A[S] = Absorbansi sampel DNA

A[B] = Absorbansi blanko

Tabel 2. Perhitungan Konsentrasi DNA terhadap Konsentrasi Protein dan

Karbohidrat/Kemikalia

NoPanjang Gelombang (λ) (nm)

260 nm 260/280 nm 260/230 nm

1 450 0,6 1

2 1550 -0,285 -0,064

3 1000 0,0625 0,05

4 400 -1,6 0,023

5 7350 -1,037 0,761

6 -700 2,33 0,3

Interpretasi :

λ 230 = 2-2,2 : DNA murni

< 2 : kemikalia/karbohidrat

>2,2 : blanko tidak sesuai

λ 280 = 1,8 : DNA murni

< 1,8 : protein

> 1,8 : RNA

Perhitungan :

1. DNA hasil isolasi dari buah strawberry

Konsentrasi DNA :

DNA ng/μL = A260 x 50 ng/μL x F (faktor pengenceran)

= 0,008 x 50 x 1.000

= 400 ng/μL

Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein atau RNA:

260/280 nm = 0,008 = -1,6 ng/μL

-0,005

Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi karbohidrat atau kemikalia :

260/230 nm = 0,008 = 0,023 ng/μL

0,339

2. DNA hasil isolasi dari bakteri E. coli

Konsentrasi DNA :

DNA ng/μL = A260 x 50 ng/μL x F (faktor pengenceran)

= -0,014 x 50 x 1.000

= -700 ng/μL

Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein atau RNA:

260/280 nm = -0,014 = 2,33 ng/μL

-0,006

Konsentrasi DNA terhadap kontaminasi karbohidrat atau kemikalia :

260/230 nm = -0,014 = 0,3 ng/μL

-0,046

Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara,

yaitu secara kualitatif dengan metode elektroforesis gel agarosa dan secara kuantitatif

dengan metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk

menentukan kandungan atau jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau

komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam

larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati, 2011). Spektrofotometri

merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa

berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya.

Spektrofotometri terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer yaitu

suatu alat yang digunakan untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif

maupun kualitatif dengan mengukur transmitan ataupun absorban dari suatu cuplikan

sebagai fungsi dari konsentrasi. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum

dengan panjang gelombang tertentu. Suatu spektrofotometer terusun dari sumber

spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorbsi untuk larutan

sampel atau blanko dan sutu alat untuk mengukur perbedaan absorbsi antara sampel

dan blanko ataupun pembanding. Fotometer yaitu alat pengukur intensitas cahaya

yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Khopkar, 2003).

Kekurangan dari spektrofotometri ini yaitu hanya terjadi bila terjadi

perpindahan elektron dari tingkat energi yang rendah ke tingkat energi yang lebih

tinggi. Perpindahan elektron ini tidak diikuti oleh perubahan arah spin, hal ini dikenal

dengan sebutan tereksitasi singlet. Jika tidak terjadi perpindahan elektron, maka alat

ini tidak akan berfungsi. Adakalanya beberapa zat harus diubah dulu menjadi

senyawa berwarna sebelum dianalisa, kurang teliti dalam analisis kualitatif. Hal

tersebut disebabkan karena pita-pita absorbsi yang diperoleh melebar, dengan

demikian kurang khusus atau terbatas pemakaiannya. Kelebihan dari

spektrofotometri ini yaitu dapat digunakan secara luas untuk banyak zat organik dan

anorganik, memiliki kepekaan yang tinggi, keselektifannya sangat baik pada

pemilihan kondisi yang tepat dapat dicari panjang gelombang untuk zat yang dicari,

memiliki tingkat ketelitian yang tinggi dengan kesalahan relatif sebesar 1 % - 3 %,

tetapi kesalahan ini dapat diperkecil lagi dan dapat dilakukan dengan cepat dan tepat

(Triyati, 1985).

Berdasarkan sumber cahaya dan panjang gelombangnya, spektrofotometri

dibedakan menjadi 4 macam, yaitu :

1. Spektrofotometri Vis (Visible)

Spektrofotometri visible menggunakan cahaya tampak (visible) sebagai

sumber sinar atau energi. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu tungsten

halogen. Lampu tersebut terbuat dari tabung kuarsa yang berisi filamen tungsten

dan sejumlah kecil iodin. Lampu ini mirip dengan lampu yang terdapat dalam

perumahan dan perkantoran. Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik

yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah

380 nm sampai 780 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh mata oleh

mata baik itu putih, merah, biru, hijau, ataupun lainnya maka sinar tersebut

termasuk ke dalam sinar tampak (visible). Syarat pengukuran dengan

spektrofotometri visible yaitu sampel dalam larutan menyerap sinar tampak (380-

780 nm), larutan sampel harus bening dan berwarna, pelarut tidak menyerap sinar

tampak (Riyadi dan Wahyu, 2009).

2. Spektrofotometri UV (Ultra Violet)

Spektrofotometri UV menggunakan cahaya UV sebagai sumber sinar atau

energi. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar

dapat digunakan lampu deuterium. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh

mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan

senyawa yang tidak memiliki warna, bening dan transparan. Oleh karena itu,

sampel tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagen

tertentu. Bahkan sampel dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi.

Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau

sentrifugasi (Riyadi dan Wahyu, 2009).

3. Spektrofotometri UV-Vis (Ultra Violet-Visible)

Spektrofotometri UV-Vis menggunakan kombinasi antara cahaya UV dan

cahaya tampak sebagai sumber sinar atau energi. Untuk sistem spektrofotometri,

UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode

ini adalah dapat digunakan baik untuk sampel berwarna juga untuk sampel tak

berwarna (Riyadi dan Wahyu, 2009). DNA yang mengandung basa-basa purin dan

pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya

UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol dapat menyerap cahaya

pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini, kemurnian

DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan

nilai absorbansi 280 (A260/A280) (Fatchiyah, 2011).

Spektroskopi ultraviolet-tampak (UV-1601 pc shimadzu

spektrofotometer) atau spektrofotometri Ultraviolet-Visible (UV-Vis) mengacu

pada spektroskopi serapan di wilayah spektral UV-Visible. Spektrofotometri ini

menggunakan cahaya dalam yang terlihat dan dengan rentang yang berdekatan

(dekat-UV dan dekat inframerah atau NIR). Kisaran penyerapan dapat terlihat

secara langsung dari warna yang ditimbulkan bahan kimia yang terlibat. Di daerah

spektrum elektromagnetik ini molekul mengalami transisi elektronik (Saxena et

al., 2010).

4. Spektrofotometri Infra Red

Spektrofotometri Infra Red atau infra merah merupakan suatu metode yang

mengamati interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada pada

daerah panjang gelombang 0,75-1.000 µm atau pada Bilangan Gelombang

13.000-10 cm-1. Radiasi infra merah dihasilkan dari pemanasan suatu sumber

radiasi dengan listrik sampai suhu antara 1500 dan 2000 k. Sumber radiasi yang

biasa digunakan berupa Nemst Glower, Globar, dan kawat nikhrom. Pengukuran

energi terserap direkam sebagai transmitan sebagai fungsi panjang gelombang.

Komponen spektrofotometer infra merah terdiri dari lima bagian pokok, yaitu

sumber radiasi, wadah sampel, monokromator, detektor dan rekoder

(Sastrohamidjojo, 1992).

Kualitas DNA hasil isolasi dapat dilihat dari tingkat kemurniannya. Jika

DNA hasil isolasi memilki tingkat kemurnian yang tinggi, bebas dari segala bentuk

kontaminan seperti protein, RNA, karbohidrat atau bahan kemikalia, menandakan

bahwa DNA hasil isolasi tersebut memiliki kuailtas yang baik. Kuantitas DNA hasil

isolasi dapat dilihat dari konsentrasinya. Jika DNA hasil isolasi memiliki konsentrasi

yang tinggi, maka DNA hasil isolasi tersebut memilki kuantitas yang tinggi pula.

Kualitas dan kuantitas DNA tersebut ditentukan oleh beberapa faktor, yaitu

kemurnian DNA, panjang DNA, kemampuan dipotong oleh sembarang enzim, tidak

mengalami modifikasi selama proses isolasi berlangsung. Oleh sebab itu, terdapat

sejumlah teknik isolasi DNA, yang disesuaikan untuk berbagai maksud penggunaan

dan kualitas serta kuantitas minimum yang ingin dicapai (Ardiansyah, 2012).