laporan hplc sampel capsaicin

PENGGUNAAN HIGH PEFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

(HPLC) DALAM ANALISA KADAR CAPSAICIN DARI SAMPEL

BONCABE (BPOM RI MD:255631002021)

Tami Diyah Nurani

Laboratorium Analisis Fisikokimia, Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran

1. PENDAHULUAN

Kromatografi cair kinerja tinggi

(KCKT) merupakan sistem pemisahan

dengan kecepatan dan efisiensi yang

tinggi. Hal ini karena didukung oleh

kemajuan dalam teknologi kolom,

sistem pompa tekanan tinggi, dan

detektor yang sangat sensitif dan

beragam. KCKT mampu menganalisa

berbagai cuplikan secara kualitatif

maupun kuantitatif, baik dalam

komponen tunggal maupun

campuran. KCKT merupakan teknik

pemisahan yang diterima secara luas

untuk analisis dan pemurnian

senyawa tertentu dalam suatu sampel

pada sejumlah bidang antara lain;

farmasi, lingkungan dan industri-

industri makanan (Putra, 2004:8).

KCKT paling sering digunakan

untuk: menetapkan kadar senyawa-

senyawa tertentu seperti asam-asam

amino, asam-asam nukleat dan

protein-protein dalam cairan

fisiologis, menentukan kadar

senyawa-senyawa aktif obat dan lain-

lain. Beberapa senyawa organik yang

mudah terurai (labil)

pada pemanasan dapat dianalisis

dengan cara kromatografi cairan

kinerja tinggi atau HPLC karena HPLC

dilakukan pada suhu kamar. Selain

senyawa organic teknik HPLC juga

dapat menganalisis senyawa

anorganik, cuplikan yang

mempunyai berat molekul tinggi atau

titik didihnya tinggi seperti polimer

(Clark, 2007).

Prinsip kerja HPLC adalah

sebagai berikut dengan bantuan

pompa, fasa gerak cair dialirkan

melalui kolom ke detektor, cuplikan

dimasukkan ke dalam fasa gerak

dengan penyuntikan. Didalam kolom

terjadi pemisahan kompenen-

komponen campuran karena

perbedaan kekuatan interaksi antara

solut-solut terhadap fasa diam. Solut-

solut yang kurang kuat interaksinya

dengan fasa diam akan keluar dari

kolom terlebih dahulu, sebaliknya

solut-solut yang kuat interaksinya

dengan fasa diam akan keluar dari

kolom lebih lama. Setiap komponen

campuran yang keluar dideteksi oleh

detector kemudian direkam dalam

bentuk kromatogram. Kromatogram

HPLC serupa dengan kromatogram

gas (Hendayana, 2006:69).

Capsaicin (8 metil N vanilil

- 6 nonenamida) merupakan

komponen aktif cabai yang

menghasilkan panas dalam cabai.

Capsaicin bersifat iritan terhadap

mamalia termasuk manusia, dan

menimbulkan rasa terbakar dan

panas pada jaringan manapun yang

tersentuh (Barbero et al, 2010).

Capsaicin mempunyai nilai ekonomis

yang tinggi pada bidang farmasi.

Semakin tinggi kadar capsaicin maka

semakin baik kualitasnya sebagai

sediaan farmasi. Dalam bidang

farmasi selain untuk meredakan rasa

sakit atau nyeri, capsaicin juga dikenal

memiliki aktivitas antikanker (Surh,

2002).

Capsaicin merupakan turunan

senyawa fenilpropanoid yang

memiliki aktifitas biologis yang tinggi,

memberikan efek fisiologi dan

farmakologis yang lebih dikenal

sebagai senyawakimia aktif, juga

sebagai antioksidan (Mori, 2006).

BonCabe adalah sebuah produk

dari Kobe berupa serbuk cabai kering.

BonCabe mengklaim bahwa

produknya menggunakan 100% cabai

alami dengan bahan tambahan

seperti penguat rasa sodium inosinate

dan guanilat (www.boncabe.com,

2012).

2. METODE PENELITIAN

Alat

Alat-alat yang digunakan dalam

penelitian ini adalah botol vial, kertas

saring, mikropipet, mortir, stamper,

penangas air, tabung reaksi, tabung

sentrifuga, vortex,mikrosentrifugator,

ultrasonic vibrator dan instrumen

HPLC.

Bahan

Bahan-bahan yang digunakan

adalah sampel BonCabe, kloroform,

metanol,air, dan larutan standar

capsaicin.

Prosedur

1. Pembuatan kurva kalibrasi

Larutan standar dibuat dengan

variasi konsentrasi, yaitu 1 ppm, 2

ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 40

ppm dengan masing - masing

volumenya 1 ml. Pembuatan larutan

standar dilakukan dengan

pengenceran bertingkat dari stok

standar 2000 ppm. Kemudian larutan

standar tiap variasi konsentrasi

disuntikan ke instrumen HPLC.

Larutan blanko dibuat dari fase gerak

metanol:air (70:30).

2. Penentuan Kadar Capsaicin

Sampel digerus menggunakan

mortir dan stamper hingga halus,

kemudian ditimbang sebanyak 1 gram

dan dimasukkan ke dalam tabung

sentrifuga. 8 ml kloroform

ditambahkan ke dalam tabung, lalu

disentrifugasi pada 3000 g selama 15

menit. Disaring menggunakan kertas

saring lalu dipindahkan ke dalam

tabung reaksi. Kloroform diuapkan

dengan cara memindahkan sampel ke

tabung reaksi dan memasukkan

tabung reaksi ke dalam penangas air.

Sampel bebas kloroform ditambahkan

2 ml metanol dan dimasukkan

kembali dalam vial kemudian

disonikasi dengan ultrasonic vibrator.

Diambil 10 l ke dalam tabung

eppendorf lalu ditambahkan fasa

gerak (metanol : air 70 : 30)

sebanyak 990 l. Tabung eppendorf

lalu divortex selama 20 detik dan

disentrifugasi pada 3000g selama 15

menit. Sampel kemudian disuntikan

ke dalam instrumen HPLC.

3. HASIL

3.1. Tabel data pengukuran larutan standar

Konsentrasi (ppm) Panjang gelombang 227 nm Panjang gelombang 281 nm

Waktu retensi Luas area Waktu retensi Luas area

1 4,242 39588 4,217 21304

2 4,275 43097 4,275 16161

5 4,267 96601 4,267 36443

10 4,275 184000 4,275 71414

20 4,275 372996 4,275 143008

40 4,267 745599 4,267 285289

3.2. Tabel hasil pengukuran sampel

Panjang gelombang Waktu retensi Luas area

227 nm 4,5 34797

281 nm

4,208 1408

4,492 102

4,592 24

y = 18341x + 8551,2 R = 0,9993

y = 6957,6x + 5154,7 R = 0,9978

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0 10 20 30 40 50

Luas

are

a

konsentrasi standar (ppm)

Kurva Konsentrasi Standar terhadap Luas Area

227 nm

281 nm

Linear (227 nm)

Linear (281 nm)

3.3. Perhitungan Pengenceran Larutan

Standar

M1.V1 = M2.V2

Konsentrasi 40 ppm

2000 . x = 40. 1 ml

X = 0,02 ml = 20 l

Jadi diambil 20 l dari larutan standar

2000 ppm, ditambah fase gerak

hingga 1 ml.

Konsentrasi 20 ppm

40 . x = 20 . 1 ml

X = 0,5 ml

Jadi diambil 0,5 ml dari larutan

standar 40 ppm, ditambah fase gerak

hingga 1 ml.

20 . x = 10 . 1 ml

X = 0,5 ml



hingga 1 ml.

10 . x = 5 . 1 ml

X = 0,5 ml



hingga 1 ml.

5 . x = 2 . 1 ml

X = 0,4 ml



hingga 1 ml.

2 . x = 1 . 1 ml

X = 0,5 ml



hingga 1 ml.

3.4. Perhitungan Kadar Capsaicin

Berdasarkan kurva yang

dihasilkan, maka persamaan garis

yang digunakan adalah persamaan

garis pada 227 nm karena

memberikan regresi paling tinggi.

Persamaan garisnya yaitu:

y = 18341x + 8551,2

R2 = 0,9993

Berdasarkan persamaan dari larutan

standar, maka dihasilkan:

y = 18341x + 8551,2

34797 = 18341x + 8551,2

18341 x = 26245,8

X = 1,431 ppm

Jadi, konsentrasi capsaicin dalam

1000 l larutan adalah 1,431 ppm.

Konsentrasi capsaicin dalam 10 ml

(sebelum pengenceran):

V1.M1 = V2.M2

10 . 1,431 = 1 . M2

M2 = 1431 ppm

Jadi konsentrasi capsaicin dalam 10 ml

(sebelum pengenceran) adalah 1431

ppm.

Massa capsaicin dalam sampel:

Ppm = mg/L

Massa (mg) = 1431 ppm x 10-2 L

Massa = 14,31 mg

Jadi, massa capsaicin dalam sampel

adalah 14,31 mg.

Kadar capsaicin dalam sampel:

% capsaicin = (massa capsaicin /

massa sampel) x 100%

% capsaicin = (14,31 mg / 103 mg) x

100%

% capsaicin = 1,431 %

Massa capsaicin dalam sampel

BonCabe

Massa BonCabe sachet = 7 gram

Massa capsaicin = 1,431% x 7 g

Massa capsaicin = 0,1 gr = 100 mg

4. PEMBAHASAN

Analisis sampel dimulai dengan

menyiapkan sampel, yaitu BonCabe dari

Kobe. Sampel digerus dalam mortar

hingga cukup halus, hal ini bertujuan

agar memudahkan saat ekstraksi.

Setelah itu ditimbang dengan timbangan

digital masing-masing 1 gr, lalu

dimasukkan ke dalam tabung sentrifuga.

Sampel diekstraksi dengan metode

ekstraksi cair-cair. Sampel dilarutkan

dengan 8 ml klorofom hingga sampel

terendam, lalu disentrifugasi pada 3000

g selama 20 menit.

Ekstraksi cair-cair adalah suatu

metode dimana solut dipisahkan dari

cairan pembawa (diluen) menggunakan

solven cair. Campuran diluen dan solven

ini adalah heterogen (immiscible / tidak

saling campur), jika dipisahkan terdapat

2 fase, yaitu fase rafinat dan fase ekstrak.

Perbedaan konsentrasi solut di dalam

suatu fasa dengan konsentrasi pada

keadaan setimbang merupakan

pendorong terjadinya pelarutan

(pelepasan) solut dari larutan yang ada.

Sehingga akan terbentuk 2 fase, dimana

fase atas (rafinat) mengandung residu

sedangkan fase bawah (ekstrak)

mengandung solven (kloroform) dan

solute (capsaicin).

Sentrifugasi yaitu metode yang

digunakan dalam untuk mempercepat

proses pengendapan dengan

memberikan gaya sentrifugasi pada

partikel-partikelnya. Pemisahan

sentrifuga menggunakan prinsip dimana

objek diputar secara horizontal pada

jarak tertentu. Apabila objek berotasi di

dalam tabung atau silinder yang berisi

campuran cairan dan partikel, maka

campuran tersebut dapat bergerak

menuju pusat rotasi, namun hal tersebut

tidak terjadi karena adanya gaya yang

berlawanan yang menuju kearah dinding

luar silinder atau tabung, gaya tersebut

adalah gaya sentrifugasi. Gaya inilah

yang menyebabkan partikel-partikel

menuju bagian dasar tabung dan

terakumulasi membentuk endapan.

Kemudian disaring menggunakan kertas

saring dan corong gelas. Hasil saringan

(supernatant) dimasukkan dalam tabung

reaksi. Setelah itu tabung reaksi disimpan di

atas penangas air untuk mempercepat

proses penguapan kloroform. Hasilnya

terdapat ekstrak sampel yang

mengandung capsaicin. Lalu

ditambahkan 2 ml metanol sebagai

pembawa capsaicin dalam larutan.

Larutan tersebut kemudian dipindahkan

ke dalam vial dan dilakukan sonikasi

menggunakan ultrasonic vibrator untuk

menghomogenkan, lalu dipipet sebanyak

10 l ke dalam tabung eppendorf dan

ditambahkan 90 l fase geraknya, yaitu

metanol:air 70:30.

Fase gerak ini sebelumnya harus

dilakukan digessing (penghilang gas)

yang ada untuk menghindari kekacauan

analisis. Selain itu adanya pengotor

dalam solven juga menyebabkan

gangguan pada sistem. Oleh karena itu,

pada fase gerak ini harus disaring

terlebih dahulu untuk menghindari

partikel-partikel kecil. Kemudian kolom

dipasangkan pada alat instrument yang

akan membawa hasil pemisahan ke

detektor. Kolom yang digunakan adalah

kolom fase balik C18 dimana fused silica

yang bersifat polar dilapisi dengan

Oktadesil Silika (ODS atau C18) yang

bersifat nonpolar. R adalah gugus alkil

rantai lurus dan R biasanya adalah n-

oktadesil (C-18). Hasil reaksi yang

diperoleh disebut dengan silica fase

terikat yang stabil terhadap hidrolisis

serta mempunyai karakteristik

kromatografik dan selektifitas yang

berbeda jika dibandingkan dengan silika

yang tidak dimodifikasi). Setelah semua

sudah disiapkan maka HPLC siap bekerja

yaitu mula-mula solven diambil melalui

pompa. Kemudian solven masuk ke

dalam katup injeksi berputar, yang

dipasang tepat pada sampel loop.

Dengan mikro syringe, sampel

dimasukan ke dalam sampel loop yang

kemudian bersama-sama dengan solven

masuk ke dalam kolom. Setelah itu, hasil

pemisahan dideteksi oleh detektor, yang

penampakannya ditunjukan oleh

perekam berupa grafik. Elusi yang

digunakan adalah elusi isokratik dimana

fase gerak dari awal sampai akhir

memiliki perbandingan komposisi yang

tetap.

Sampel diukur pada 2 panjang

gelombang, yaitu 227 nm dan 281 nm

agar dapat mengetahui pada panjang

gelombang mana yang memberikan

serapan lebih baik. Pada panjang

gelombang 227 nm dihasilkan grafik

dengan 1 puncak area capsaicin dengan

waktu retensi 4,5 dan luas area 34797.

Sedangkan pada panjang gelombang 281

nm dihasilkan 3 puncak area capsaicin,

yaitu puncak tertinggi pada waktu

retensi 4,208; luas area 1408, puncak

kedua pada waktu retensi 4,492; luas

area 102, dan puncak ketiga pada waktu

retensi 4,592; luas area 24. Adanya

jumlah puncak yang lebih dari satu buah

menunjukan bahwa capsaicin yang

berada dalam sampel adalah asli dari

buah cabai, bukan capsaicin hasil

sintesis.

Sampel dibandingkan terhadap

larutan standar dengan variasi

konsentrasi, yaitu 1 ppm, 2 ppm, 5 ppm,

10 ppm, 20 ppm, dan 40 ppm. Larutan-

larutan standar dibuat dengan

pengenceran bertingkat dari stok awal

2000 ppm. Larutan standar digunakan

untuk membuat kurva kalibrasi, diukur

pada panjang gelombang 227 nm dan

281 nm. Pengolahan data hasil

pembacaan menunjukan bahwa panjang

gelombang 227 nm memberikan regresi

yang lebih tinggi, sehingga persamaan

garisnya digunakan sebagai pembanding

terhadap penentuan kadar capsaicin

dalam sampel.

Berdasarkan perhitungan maka

didapatkan bahwa kadar capsaicin dalam

sampel yang dianalisis adalah sebesar

0,1431 %, atau setara dengan 10 mg

dalam sampel BonCabe sachet isi 7 gram.

5. KESIMPULAN

Kadar capsaicin dalam sampel

BonCabe produksi dari Kobe sebesar

1,431%. Pada kemasan sachet 7 gram,

kadar capsaicin setara dengan 100 mg.

DAFTAR PUSTAKA

Barbero, G.F.; Molinillo, J.M.G.; Varela, R.M.;

Palma, M.; Macias, F.A.; Barroso,C.G.

Application of Hanschs model to

capsaicinoids and capsinoids: a

studyusing the quantitative structure-

activity relationship. A novel method for

thesynthesis of capsinoids. J. Agric.

Food Chem. 2010,58, 3342-3349.

Clark, Jim. (2007).Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi (HPLC).*Online+. Tersedia:

http://www.chem-istry.org yang

direkam pada 6-10-2007. [ diakses 20

November 2014].

Hendayana, Sumar. (2006). KIMIA

PEMISAHAN Metode Kromatografi dan

Elektroforensis Modern. Bandung : PT.

Remaja Rosdakarya.

Mori, A; Lehmann S, O'Kelly J et al. (2006)

"Capsaicin, a component of red

peppers,inhibits the growth of

androgen-independent, p53 mutant

prostate cancer cells". Cancer Research

66, 6: 3222 3229.

Putra, Effendy De Lux. (2004). Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang

Farmasi. Sumatera Utara : Jurusan

Farmasi FMIPA USU.

Surh, Y.J., (2002). More than spice: capsaicin

in hot chili peppers makes tumor

cellscommit suicide, J. Natl. Cancer Inst.

94: 1263 1265.

http://www.boncabe.com/ [diakses 20

november 2014]

laporan hplc sampel capsaicin

Documents