LAPORAN PEWARNAAN BAKTERI ( PEWARNAAN GRAM )

Laporan pewarnaan gram

A.    Tujuan

Mengetahui bakteri gram positif dan bakteri gram negatif

a.       Mahasiswa mampu membuat sediaan untuk pewarnaan sederhana

b.      Melakukan proses pewarnaan sederhana

c.       Mengamati bentuk bakteri pada preparat di bawah mikroskop

B.     Dasar Teori

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur, dan sifat-

sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak

berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut di suspensikan.

Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk

diidentifikasi adalah dengan metode pengecatan atau pewarnaan, hal tersebut

juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi

dinding sel bakteri melalui serangkain pengecetan. (Jimmo, 2008) Zat warna

dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri

dengan sekelilingnya ditingkatkan. Zat warna yang digunakan bersifat asam

atau basa

Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk,

susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna

khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul atau pun flagella, dan hal-hal

terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion

positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer,

1998).

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana

karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat

warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin

(komponen kromotofiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang

mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat,

intensifikasi, pewarnaan dan penggunaan warna penutup. Suatu preparat yang

sudah menyerap zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka zat warna

terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer.

Bakteri-bakteri ini disebut bakteri tahan asam, dan ini merupakan ciri khas bagi

suatu spesies (dwidjoeseputro, 1994)

Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi DUA, yaitu :

1. Pewarnaan negatif

            Pada pewarnaan ini merupakan pewarnaan tidak langsung  karena yang

di warnai adalah latar belakangnya, sedangkan bakerinya sendiri tidak

mengalami pewarnaan. Zat warna yang di gunakan adalah nigrosin.

2. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak

digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna

untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi

dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat

basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan

sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat

mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa

digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan

karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua

jenis pewarnaan.

a.       pewarnaan asam

Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan

hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam

pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.

b.      Pewarnaan Basa

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai

bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan

ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna

untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat

nigrosin atau tinta cina.

3. Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif

dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode

ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian

Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk

membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri

Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu

pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat

warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram

negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain)

ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif

menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk

mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur

dinding sel mereka.

a.  Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna

metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan

mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara

bakteri gram negative tidak.

b.  Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu

sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu

di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah

muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan

pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu

lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat

diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki

selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan

kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol

sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi

terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu

dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).

4. Pewaranaan spora/ flagel

Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan

diri  terhadap pengaruh buruk dari luar.spora bakteri mempunyai fungsi yang

sama sepertti kristal amoeba, sebab bakteri dalam bentuk spora dan amoeba

dalam bentuk Kristal merupakan suatu fase di mana kedua mikroorganisme itu

berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak

menguntungnkan. Endospora hanya terdapat pada bakteri merupakan tubuh

dinding  yang tebal yang sangat refraktif, dan sangat resisten. Dihasilkan oleh

semua spesies basillus, clostidum, dan sporosarcina. Bakteri yang mampu

membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi

sehingga sel vegetatif. Namun pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhanya,

terjadi sintesis protoplasma baru dalam sitoplasma vegetatifnya yang di

maksudkan untuk menjadi spora (Pelczar, 2007).

Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri sebagai berikut:

1.      Fiksasi

Fiksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan bakteri karena berguna merekatkan

sel bakteri pada gelas objek, membunuh bakteri, melepaskan granula (butiran)

protein menjadi gugusan reaktif (NH3+) membuat sel-sel lebih kuat, mencegah

terjadinya otolisis sel, mengubah avinitas, fiksasi dapat dilakukan secara fisik

atau dengan bahan kimia.

2.      Peluntur zat warna

Peluntur zat warna berguna untuk menghasilkan kontras yang lebih baik pada

bayangan mikroskop. Pada umumnya, sel-sel yang mudah diwarnai akan lebih

mudah pula dilunturkan warnanya. Sedangkan sel-sel yang sukar diwarnai akan

lebih sukar dilunturkan warnanya.

3.      Substrata

Merupakan zat warna asam atau basa dapat bereaksi dengan senyawa-senyawa

tertentu. Oleh karena itu, senyawa-senyawa organik seperti protein, karbohidrat,

lemak dan asam nukleat akan mempengaruhi pewarnaan. Berdasarkan jenis zat

warna yang diserap oleh sel, maka dapat dibedakan tiga macam sel yaitu: sel-sel

asidofil, basodill dan sudanofil.

4.      Intensifikasi warna

Zat warna dapat diintensifikasikan dengan cara menambahkan mordan, yaitu zat

kimia yang dapat menyebabkan sel-sel bakteri dapat diwarnai lebih intensif

karena zat warna terikat lebih kuat daripada jaringan sel. Mordan dibagi atas

dua macam, yaitu mordan asam dan mordan basa. Mordan asam adalah mordan

yang bereaksi dengan zat-zat warna basa. Sedangkan mordan basa adalah

mordan yang bereaksi dengan anion zat warna asam.

5.      Zat warna penutup atau zat warna lawan

Zat warna lawan adalah suatu zat warna basa yang berbeda warnanya dengan

zat warna mula-mula yang digunakan. Gunanya adalah untuk memberikan

warna pada sel-sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula. Zat

warna penutup diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan untuk

memberikan kontras pada sel-sel yang tidak menyerap zat warna utama

(Sutedjo, 1991).

PEMBAHASAN

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara

komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut

kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen

seluler maupun pada pewarna (Manurung, 2010).

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan

paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan

tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan

pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak

sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan

pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif.

Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.

Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di

antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).

Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain:

a.  Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis.

b.  Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia

seperti sabun, formalin, fenol.

c.  Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. Pewarnaan gram pada

praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:

a.  Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

b.  Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

c.  Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

d.  Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.

Keempat tahap tersebut dijelaskan langsung dalam langkah percobaan di bawah

ini.

Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda

tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas

dengan aquades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang

berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan

memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa

sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam.

Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat

berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan

meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme

pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi

dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif

mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.

Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30 detik bertujuan agar cat atau

pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes

sampel yang berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas

gelas benda yang berbeda. Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan

(fiksasi) di atas bunsen burner. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air

sehingga hanya akan didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya

bakteri benar-benar melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa

tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu

diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri

dijaga agar tidak terkena nyala api.

Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut

kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan

aquades hingga warnanya hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu

pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap

mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodine

pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh

bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran

sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari

dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan

hilang dari sel. Iodine yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar

pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut

kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan

aquades hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang

berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna

pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung

pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna,

maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat

menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada

pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu

mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak

berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid

sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 96%

gram + : lipid << + alkohol 96%  pori dinding sel yang terbentuk kecil,

protein dinding sel terdehidrasi, pori tertutup (kompleks kristal violet-iodine

tidak tercuci)

gram - : lipid >> + alkohol 96%        pori dinding sel yang terbentuk besar,

protein dinding sel terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks kristal violet-

iodine tercuci)

Alkohol 96% yang diteteskan di atas gelas benda didiamkan selama 30

detik kemudia dibilas dengan aquades dengan tujuan agar warna dapat luntur

secara sempurna dan tidak ada yang tersisa di dalam gelas benda.

Setelah pembilasan reagen alkohol 96% pada gelas benda sebelumnya,

selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas gelas benda tersebut kemudian

didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades

hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna

sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah

kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain,

safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta

menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam

sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif

sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan

perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan

membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel

berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke

pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat

warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam

waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke

yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat

(efisiensi waktu).

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan

terhadap gelas benda dengan menggunakan aquades. pembilasan ini bertujuan

untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap

akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air

bilasan dari aquades dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak

tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah

pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop.

Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan

jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri

gram negatif.

Gambar skematik langkah kerja yang dilakukan oleh praktikan

Tabel prosedur pewarnaan gram

(Pradhika, 2008)

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu

ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan

negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri

karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan

inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat

dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada

muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat

pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah

methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada

umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya

mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel

sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel (Rudi,

2010).

Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi, peluntur

warna, substrat, intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup.

Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram

negatif berwarna merah. Dalam praktikum ini digunakan salah satu pewarnanya

yaitu safranin yang sesuai teori bersifat basa sehingga lebih mudah bersenyawa

atau bereaksi dengan bagian-bagian inti sel bakteri.

Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat

warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan

mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,

sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna

penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua

bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini

berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan

struktur dinding sel mereka (Rudi, 2010).

Hasil pengamatan di bawah mikroskop menunjukkan bahwa bakteri

sampel A memiliki warna merah muda (gram negative), dan Bakteri sampel B

memilki warna ungu (gram positif).

1.  Escherichia coli

    

Gambar  E. coli dengan perbesaran 1000 x

Klasifikasi ilmiah

   Kingdom : Bakteria

Filum   : Proteobacteria

Kelas   : Gamma Proteobacteria

Order   : Enterobacteriales

Famili  : Enterobacteriaceae

Genus   : Escherichia

Spesies : E.  coli

Berdasarkan hasil pengamatan, terdapat bakteri Eschericia coli pada air

WC. Berbentuk E. coli adalah basil (batang) yang pendek. Bakteri tersebut pada

saat diwarnai menunjukkan warna merah muda yang berarti bahwa bakteri ini

bersifat gram negatif.

Menurut literatur, E. coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang

termasuk bakteri gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli

hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem

pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada

strain baru dari E. coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan

penyakit diare, sindrom diare lanjutan, muntaber, hemolitik uremic (hus),

infeksi usus, infeksi saluran urin, dan neonatal meningitis. Peranan yang

mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada

level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang

disebabkan oleh Salmonella typhi. Disamping itu, E. coli banyak digunakan

dalam teknologi rekayasa genetika dan biasa digunakan sebagai vektor untuk

menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan karena

bakteri ini memiliki pertumbuhan yang sangat cepat dan mudah dalam

penanganannya (Fajriana, 2008).

Infeksi E.coli O157:H7 yang patogen pada manusia yaitu yang bersifat

verotoksigenik yang telah menyebabkan 16.000 kasus penyakit melalui

makanan (Food Born Diseases) dan 900 orang meninggal per tahun di AS,

dengan perkiraan annual cost $ 200,000 hingga $ 600,000. Kejadian wabah

tunggal pada tahun 1993 di Western AS telah menyebabkan 700 orang

menderita sakit dan 4 orang meninggal (Sartika, 2005).

Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang paling umum digunakan.

Berbagai macan tipe morfologi bakteri (coccus,       bacillus, spirilum, dan

sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu

mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja.

Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana

karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat

warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin

(komponen kromotofiknya bermuatan positif).

Pada pewarnaan sederhana, bakteri diwarnai oleh reagen tunggal. Pewarnaan

dasar dengan kromogen (zat warna) muatan positif disarankan selama asam

nukleat bakteri dan komponen dinding sel membawa muatan negatif yang

menyerap dengan kuat dan mengikat kation kromogen perlu diperhatikan

lamanya waktu pewarnaan tergantung pada jenis pewarnaan yang digunakan.

Misalnya metilen blue terserap selama 2-3 menit, dengan demikian bakteri yang

terdapat pada sampel akan menyerap zat warna yang diberikan. Pengecetan

sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel

dan latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel mikroba

itu sendiri, dengan cara mewarnai sel-sel mikroba dengan zat warna khususnya

warna Kristal Violet.

Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang

berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan

memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa

sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam.

Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat

berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan

meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme

pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi

dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif

mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.

Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau

pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Penambahan lugol pada bakteri. Lugol  merupakan pewarna Mordan, yaitu

pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap

mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama.

Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat

pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding

sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran

zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol

memungkinkan hilang dari sel. Lugol  yang diteteskan didiamkan selama 1

menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas objek glass tersebut

kemudian didiamkan selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas

dengan air hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik

yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat

warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar

tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat

mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen

dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci.

Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua

kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau

bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan

terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian

didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga

warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna

sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah

kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain,

safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta

menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam

sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif

sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan

perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan

membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel

berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna

lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna

tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu

singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang

lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan

terhadap kaca objekdengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk

mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir

pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan

dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan

reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir,

gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna

ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna

merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh –

Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna

tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan

penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan

permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung

pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri

menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun

oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol

95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan

dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur

pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat

warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang

dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang

mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya

dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh

terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut

tampak biru (Hadioetomo, 1993)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1         Hasil pengamatan

Tabel hasil pengamatan pewarnaan dan cara-cara pewarnaan

No

Pewarnaan

Keterangan

1.

Pewarnaan sederhana

-          Perbesaran 40 x 10

-          Bentuk sel seperti batang yang biasa disebut basil

-          Berwarna ungu

2.

Pewarnaan negative

 

-          Perbesaran 40 x 10

-          Bentuk sel seperti batang atau sering disebut basil.

-          Berwarna ungu kemerah-merahan.

3.

Pewarnaan gram

-          Perbesaran 40 x 10

-          Bentuknya batang yang sering du sebut dengan basil.

-          Berwarna merah dan sekitarnya berwarna orange.

4.

Pewarnaan spora

 

-          Perbesaran 40 x 10

-          Bentuk bakteri basil

-          Sporanya berwarna hijau

-          Mikrobannya berwarna orange

4.2         Pembahasan

            Macam-macam pewarnaan yang di lakukan dalam praktikum tentang

cara-cara pewarnaan antara lain :

a.              Pewarnaan sederhana

Tujuan dari pewarnaan sederhana adalah mengidentifikasi morfologi sel bakteri

dengan menggunakan zat warna tunggal. Prinsipnya yaitu  pewarnaan ini hanya

menggunakan satu macam zat warna saja. Sebelum zat warna difiksasi terlebih

dahulu pewarnaan ini dipakai untuk melihat bentuk-bentuk bakteri. Zat warna

yang di gunakan adalah Methylen blue, Crystal violet, basic fuchin atau

safranin. Fungsi zat warna: Crystal violet merupakan pewarna primer (utama)

yang akan memberi warna mikrioorganisme target. Crystal violet bersifat basa

sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam

(Sutedjo, 1991).

b.             Pewarnaan Negatif

Tujuan dari pewarnaan negatif adalah untuk mengetahui bentuk mikroba

dengan pewarnaan-pewarnaan tidak langsung. Prinsip pewarnaan negatif adalah

cara pengamatan mikrobiologi yang dapat di lakukan untuk membedakan

spesies kecil dan cairan optiknya. Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang di

gunakan untuk melihat secara tidak langsung, karena yang diwarnai adalah latar

belakangnya, sedangkan bakterinya sendiri tidak mengalami pewarnaan. Pada

pewarnaan ini tidak di lakukan fiksasi karena itu dapat digunakan untuk melihat

bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya dan untuk menentukan ukuran bakteri,

karena bakteri praktis tidak mengalami perubahan. Berbeda dengan pewarnaan

lain, pewarnaan negatif memungkinkan bakteri terlihat transparan dan tampak

jelas. Fungsi zat warna: Safranin merupakan pewarnaan tandingan atau pewarna

skunder, zat ini berfungsi untuk mewarnai sel-sel yang telah kehilangan warna

utama dengan kata lain memberikan warna pada bakteri non target (Pelczar,

2007).

c.              Pewarnaan Gram

Tujuan dari pewarnaan gram adalah untuk melakukan pengamatan morfologi

bakteri dengan pewarnaan diferensial. Prinsip pewarnaan gram termasuk

pewarnaan diferensial (untuk membedakan) karna dapat membedakan bakteri-

bakteri yang bersifat gram negatif dan positif. Pewarnaan ini ditemukan pertama

kali pada tahun 1884 oleh Criestian Gram.

Bakteri garam positif  ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet)

dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai

lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak

berwarna ungu.

Bakteri gram negatif  ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna

utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh  peluntur dan dapat diwarnai

oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri

tampak berwarna merah. Fungsi zat warna:

Crystal violet yang berfungsi membentuk ikatan mg-Ribonucleid acid pada

membran/dinding sel bakteri sehingga membentuk kompleks mg-Ribonucleid

acid- crystal violet. Kompleks ini merupakan senyawa yang tidak luntur dengan

alkohol.

Lugol’s ladin yang berfungsi sebagai penguat ikatan pada kompleks mg-

Ribonuclead acid.

Alkohol 95% berfungsi mencuci lemak pada dinding sel bakteri.

Safranin berfungsi sebagai zar warna tandingan (lawan) luruh nya kompleks

mg-Ribonucleid acid- crystal violet dari dinding sel bakteri gram negatif

(Pelczar, 2007).

d.             Pewarnaan Spora

Tujuan dari pewarnaan spora yaitu mengenal dasar-dasar kimiawi pada

pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora bakteri

dan bentuk vegetatif. Prinsip pada pewarnaan ini pemanasan akan

mengembangkan lapisan luar spora sehingga brwarna hijau. Melalui

pendinginan utama akan terperangkap didalam spora dengan pencucian zat

warna utama yang da pada sel vegetatif akan terlepas, sehingga pada pewarnaan

yang kedua(safranin) sel vegetatif akan berwarna merah. Fungsi zat warna

malachite green merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi

kedalam endospora (Dwidjoseputro, 2005).

            Pada praktikum kali ini hasil yang diperoleh yaitu bakteri yang diamati

bulat lonjong memanjang dengan serabut ekor bewarna merah. Bakteri ini

identik dengan bakteri garam positif sebab bakteri yang di lihat dominan violet,

di dalam kolono ini juga terdapat spora yang berwarna hijau. Bakteri garam

positif  ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet) dengan kuat

sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat

warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna ungu.

Contoh bakteri garam positif yaitu: Bacillus subtilis, Stepcoccus sp lactis;

Staphylococcus aureus. Bakteri gram negatif  ialah bakteri yang mempuyai daya

mengikat zat warna utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh  peluntur

dan dapat diwarnai oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop

sel-sel bakteri tampak berwarna merah. Contoh bakteri garam negatif:

Corynebacterium diphteri,Eschercia coli dan Salmanela thypora (Sutedjo,1991).

Perbedaan dan ciri-ciri bakteri garam positif dan bakteri garam negatif:

Bakteri garam negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna

crystal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga akan berwarna merah

jika diamati dengan mikroskop. Disisi lain bakteri garam negatif seperti

Eschercia coli memiliki sistem membran ganda di mana membran plasmanya

diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel

tebal berupa peptidoglikan yang terletak di antara membran dalam dan luarnya,

bakteri ini juga bersifat patogen yang berarti mereka berbahaya bagi organisme

inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada

dinding gram negatif terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan

lapis atau endotoksin). Disisi lain, bakteri gram positif akan berwarna ungu

perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang

berbeda dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan gram. Bakteri gram

negatif seperti Staphylococcus aureus (bakteri pathogen yang umumnya pada

manusia) hanya memiliki membrane plasma tunggal yang dikelilingi membrane

plasma tebal berupa peptidoglika sekitar 90% dari dinding sel tersebut tersusun

atas peptidoglika sedangkan sisanya berupa molekul lain bernama asam teikoat

(Pelczar, 2007).

Fiksasi adalah proses yang dilakukan untuk pewarnaan yang dapat berpenetrasi

kedalam endospora.

Yang membuat praktikum kurang akurat disebabkan oleh faktor kesalahan

adapun faktor kesalahan sebagai berikut: Fiksasi yang kurang tepat dapat

mengakibatkan bakteri mati, Pemberian zat warna yang terlalu berlebihan dapat

memperlambat pengeringan tanpa fiksasi dan memperlambat proses

pengamatan, Sentuhan atau geseran pada preparat yang telah berisi bakteri

dapat menganggu struktur bakteri.

Percobaan praktikum kali ini menggunakan bakteri sebagai objek dalam

pewarnaan gram yaitu E. coli.Prosedur pewarnaan gram untuk bakteriE. coli

secara umum yaitu sampel ditaruh pada preparat dan difiksasi dengan pembakar

spirtus. Pemfiksasian dengan pembakar spirtus ini bertujuan untuk mematikan

tanpa mengubah struktur bakteri tersebut. Sedangkan untuk langkah

selanjutnya, preparat diberi larutan Gram A(kristal violet / ungu) dan didiamkan

selama 60 detik. Pemberian Gram A ini bertujuan untuk menguatkan warna

yang nantinya ditimbulkanbakteri. Selanjutnya, preparat diberi Gram B (Kalium

Iodida) dan didiamkan selama 60 detik. Didiamkan selama kurang lebih 60

detik mempunyai maksud agar  pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih

kuat. Pemberian Gram B ini menyebabkan afinitas pengikatan zat warna oleh

bakteri semikn tinggi. Setelah kering, langkah yang selanjutnya, preparat diberi

larutan alkohol 95% dengan tujuan sebagai peluntur dan membuka pori - pori.

Langkah yang selanjutnya, preparat ditetesi safranin dan dibiarkan selama 45

detik. Pemberian safranin (Gram D) bertujuan untuk memperjelas pewarnaan

jika sel gram negatif maka menjadi warna merah tetapi jika sel gram positif

menjadi warna biru.Dibiarkan selama 45 detik agar bakteri yang catnya telah

luntur dapat terwarnai. Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar cat

dapat hilang secara sempurna dan tidak tersisa, dikeringanginkan bertujuan agar

warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna

sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru.Setelah semuanya selesai,

terakhir preparat diamati dibawah mikroskop(Pelczar, dkk, 1958).

Hasil pengamatan di bawah mikroskop menunjukkan bahwa, Escherischia

colipada pewarnaan gram menghasilkan warna merah. Sehingga bakteri ini

termasuk dalam Gram negatif. Bakteri Escherichia coli berbentuk coccus

(bulat). Koloninya tersusun seperti rantai memanjang (Harley dan

Presscot,2002).

E.coli termasuk dalam famili Enterobacteriaceae yang masuk bakteri Gram

negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. Colimemiliki bentuk yang

bervariasi dari bulat hingga batang pendek. Bakteri ini ada yang soliter, namun

ada juga yang tampak berkumpul atau berpasangan.E. coli hidup dalam jumlah

besar di usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan

melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi, pada saat strain baru dari

E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan

sindrome diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang

mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada

level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang

disebabkan oleh Salmonella typhi. E.coli banyak digunakan dalam teknologi

rekayasa genetika dan biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-

gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan karena bakteri ini memiliki

pertumbuhan yang sangat cepat dan mudah dalam penanganannya (Radji,2012).

Dinding sel bakteri Gram negatif mempunyai kandungan lipid yang tebal dan

ketika ditambahkan pewarnaan kristal violet maka dinding sel bakteri Gram

negatif akan menyerap zat warna tersebut namun ketika diberi alkohol, kristal

violet pada Gram negatif menjadi luntur disebabkan struktur dinding selnya

yang sebagian besar tersususun oleh lipid, sehingga ketika diberi zat warna,

kedua dinding sel bakteri Gram negatif akan menyerapnya kembali sehingga

hasil pewarnaan bakteri Gram negatif berwarna merah (Radji,2012).

Karakteristik

Gram positif

Gram negative

Dinding sel

Homogen dan tebal (20-80 nm serta sebagian besar tersusun dari peptidoglikan.

Polisakarida lain dan asam teikoat dapat ikut menyusun dinding sel.

Peptidoglikan (2-7 nm) di antara membran dam dan luar, serta adanya membran

luar (7-8 nm tebalnya) yang terdii dari lipid, protein, dan lipopolisakarida

Bentuk sel

Bulat, batang atau filament

Bulat, oval, batang lurus atau melingkar seprti tand koma, heliks atau filamen;

beberapa mempunyai selubung atau kapsul

Reproduksi

Pembelahan biner

Pembelahan biner, kadang-kadang pertunasan

Metabolisme

Kemoorganoheterotrof

Fototrof, kemolitoautotrof, atau kemoorganoheterotrof

Motilitas

Kebanyakan nonmotil, bila motil tipe flagelanya adalah petritrikus

(petritrichous)

Motil atau nonmotil. Bentuk flagela dapat bervariasi-polar,lopotrikus

(lophtrichous), petritrikus (petritrichous).

Anggota tubuh (apendase)

Biasanya tidak memiliki apendase

Dapat memiliki pili, fimbriae, tangkai

Endospora

Beberapa grup dapat membentuk endspora

Tidak dapat membentuk endospore

Perbedaan dua kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan

(mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh

alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap

mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak

terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol

dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin. Bakteri

gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu

lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat

diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki

selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan

kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol

sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram positif

mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan

bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu

pendek(Isro, 2008).

Hasil pewarnaan pada koloni bakteri yaitu berwarna merah karena merupakan

koloni gram negatif.Dan bakteri yang terbukti berwarna ungu karena tergolong

ke dalam koloni gram positif (Isro, 2008).

KESIMPULAN1.  Pewarnaan yang digunakan dalam praktikum ini adalah pewarnaan Gram.

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan yang didasarkan pada tebal atau tipisnya

lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak

pada membran sel bakteri. Pewarnaan ini berguna untuk membedakan spesies

bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni bakteri gram positif dan gram

negatif. Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan bakteri antara lain:

a.  Pembuatan olesan bakteri

b.  Fiksasi

c.  Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna.

2.  Teknik pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:

a.  Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

b.  Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

c.  Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

d.  Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.

3.  Dari hasil pengamatan warna bakteri, pada sampel A dapat dikelompokkan

dalam bakteri gram negatif karena menunjukkan warna merah muda ketika

diamati di bawah mikroskop.

4.  Dari hasil pengamatan warna bakteri, pada sampel B dapat dikelompokkan

dalam bakteri gram positif karena menunjukkan warna ungu ketika diamati di

bawah mikroskop.

B.     Kesimpulan

Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, bakteri e.coli yang berwarna

merah merupakan gram negatif dan bacillus yang berwarna ungu merupakan

gram positif.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D,1989. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan

Irawan, 2008. Teknik pewarnaan. Mikroba.http://wordbiology.wordpress.com.

Daftar Pustaka

Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.

http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 11

November 2010

Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram

Negatif).http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-

positif-dan-gram-negatif. 11 November 2010.

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta :

Gramedia.

Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I.

Parwati, Wia Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok,

Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam

untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.

Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.

http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri.html.

11 November 2010.

Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium

Mikrobiologi UNS.

Diposkan 25th October 2013 oleh Alex Kimia

Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.

Sutedjo, M.1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rhineka Cipta.

Dwijosapoetra, D. 1984. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta

Harley dan Presscot.2002.Laboratory Exercise in Microbiology.McGraw-Hill

Publisher.USA

Isroi. 2008. Aspergillus. http://gambar.mirasites.com/aspergillus.html. diakses

tanggal 4 april 2013

Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di laboratorium.PT Raja Grafindo Persada.

Jakarta

Novak, A et al. 2002. Characterization Candida albicans colony morfology

mutans and their hybrids vol 48. Departemen of microbiology university of

pecs. Hungary

Pelczar, M.J, and E.C.S, Chan. 1958. Microbiolgy. Mc Graw Hill Book

Company. New York

Radji, Maksum. 2012. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi. Fakultas

Farmasi Universitas Indonesia. Depok 

Rahayu, Winiati Pudji. 2000. Aktivitas Antimikroba Bumbu Masakan

Tradisional Hasil Olahan    Industri terhadap Bakteri Patogen dan

Perusak.Buletin Teknologi dan Industri Pangan, Vol. XI, No. 2.IPB

Sumarsih, Sri. 2003.Diktat Kuliah Mikrobiologi Dasar. Faperta UPN “Veteran”

Yogyakarta

Suryawina, A. 1986. Microbiology Air. Penerbit Alumni. Bandung

Syamsuri., I.  2000.  Biologi 2000.  Erlangga.  Jakarta