laporan praktikum biokimia ip.docx
TRANSCRIPT
LaporanPraktikumBiokimia
NamaPercobaan :IP – Isolasi Protein dari Susu
Hari/ TanggalPercobaan : Kamis / 13 September 2012 / 13.00 – 15.00
Kelompok : C
Golongan : S
NamaMahasiswa / NRP : - Raymond Harris Mustafa (2443011185)
- PetronelaStefania Rondo (2443011173)
- IraniusAgung Astra Amijaya (2443011190)
- Gratia Sintia (2443011172)
- AniRombeSarungngu (2443011177)
I. Tujuan Percobaan
Mengisolasi kasein dari susu berdasarkan titik isoelektriknya.
II. Dasar Teori
Kasein merupakan sebuah fosfoprotein. Kasein tidak dapat larut pada titik
isoelektriknya, pH 4.6, namun karena pH susu mendekati 7.0, tidak diragukan lagi
bahwa kasein akan berada sebagai sebuah garam, yakni kalsium kaseinat. Pada
asidifikasi (pengasaman), kasein akan mengendap:
Ca−kasein+2 HCl → Kasein+CaC l2
Pada pengasaman susu, reaksi yang sama akan terjadi. Rennin juga akan
mengendapkan kasein. Bagaimianapun juga, hal ini tidak sepenuhnya benar, karena
pencernaan parsial juga ikut ambil bagian dalam reaksi tersebut, dimana beberapa
fragmen dari protein akan memisah. Hal ini berbeda dengan pengendapan dengan
menggunakan asam yang hasil endapannya mengandung kalsium. Faktanya, pada
ketiadaan kalsium, pengendapan tidak akan terjadi seperti ini:
Ca−kaseinat Rennin→
Ca−parakaseinat+ peptida
namun:
Kasein Rennin→
Parakasein+ peptida
Parakasein akan tetap berada dalam larutan hingga ion Ca2+ ditambahkan:
Parakasein+C a2+¿→ Ca−parakaseinat ¿
Hal ini dapat ditunjukkan dengan menambahkan sejumlah asam oksalat ke
dalam susu, dan akan melalui penyaringan, susu tanpa kalsium. Rennin, jika
ditambahkan ke dalam susu tanpa kalsium itu, tidak akan menggumpalkan kasein
dalam susu tersebut, dibandingkan dengan rennin yang akan menggumpalkan susu
biasa dalam beberapa menit. Penambahan berikutnya, garam kalsium yang dapat
larut, dalam jumlah berlebih, akan membawa gumpalan turun ke dasar wadah. Bila
rennin ditambahkan ke dalam susu yang dididihkan, tidak akan ada gumpalan, sebab
pemanasan telah menyebabkan kalsium menjadi terendapkan sebagai Ca3(PO4)2. Susu
yang digumpalkan atau “junket” sering digunakan dalam makanan Amerika. Pada
kondisi yang sesuai, enzim proteolitik lain akan menyebabkan susu menggumpal
dengan cara ini, namun rennin, enzim yang berada dalam perut keempat pada sapi
muda, sangat efektif dan sangat jelas efeknya terbatas pada pencernaan ini. (Kleiner
and Orten, 1966)
III. Alat dan Bahan
Alat:
Gelas kimia
Termometer
pH meter
Penyaring Buchner
Neraca analitis
Gelas arloji
Bahan:
Susu cair
Buffer Na-Asetat (0.2 mol/L, pH 4.6)
Etanol 95%
Eter
Muslin (kain saring)
Kertas saring
IV. Cara Kerja
Tempatkan 100 mL susu dalam gelas kimia 500 mL, dan buffer Na-Asetat dalam gelas kimia 500 mL.
Panaskan susu dan buffer Na-Asetat sampai 40° C
Tambahkan buffer ke dalam susu secara perlahan dengan pengadukan, sampai pH akhir campuran mencapai sekitar 4.8 (ukur dengan pH meter)
Dinginkan suspensi sampai suhu ruang kemudian dinginkan lagi selama 5 menit sebelum disaring dengan muslin.
Cuci endapan yang diperoleh beberapa kali dengan sejumlah kecil air, kemudian suspensikan dalam sekitar 30 mL etanol.
Saring suspensi dengan penyaring Buchner dan cucilah kembali dengan campuran etanol-eter (1:1) secukupnya.
Cucilah endapan pada kertas saring dengan 50 mL eter dan hisap kering dengan penyaring Buchner.
Pindahkan serbuk kasein yang diperoleh ke gelas arloji, ratakan untuk menguapkan eter.
Timbang serbuk kasein kering yang telah bebas eter.
V. Hasil Pengamatan
VI. Pengolahan Data
Persentase Hasil=(Bobot KaseinVolume Susu ) x100 %
¿( 4.667100 ) x100 %
¿4.667 %
Nilai Teoritis:
Rentang kadar kasein dalam susu: 2.1% - 6.4%
Serbuk Kasein Kering
Massa: 4,667 gr
Susu setelah kaseinnya diendapkan
VII. Pembahasan
PembahasanHasilPercobaanDikaitkandenganTeoridanTujuanPraktikum
Persentase kadar kasein dalam susu yang kami peroleh dari percobaan (4.667
gr) sesuai dengan rentang kadar kasein yang kami peroleh dari literatur, yakni 2.1% -
6.4%. Namun, kadar kasein yang kami peroleh dapat merupakan jumlah yang bukan
kadar yang sebenarnya. Hal ini dapat disebabkan karena beberapa hal, di antaranya:
a. Adanya kasein yang tertinggal di dalam susu, kertas saring, dan kain saring.
b. Serbuk kasein kering yang telah kami timbang masih mengandung air.
Jawaban dari Bahan Diskusi / Pembahasan
1. Apa yang dimaksud dengan titik isoelektrik?
Jawab: titik isoelektrik merupakan pH di mana muatan pada asam amino
saling seimbang satu sama lain (antara muatan positif dan negatifnya), dan
merupakan pH di mana asam amino memiliki kelarutan terkecil.(Kleiner and Orten,
1966)
2. Carilah dan jelaskan beberapa metode isolasi protein yang lain.
Jawab:
a. Metode Salting Out
Prinsip: Solubilitas protein
dalamsebuahlarutandipengaruhiolehkonsentrasigaram yang ada di
dalamlarutantersebut. Efekinimuncul karena adanyainteraksiantara ion-ion
garamdengangugusbermuatanpada
protein.Adisigaramkedalamlarutanbisamenyebabkanduahal yang
berbeda.Padabeberapalarutandengan protein yang
tidakdapatatausulituntuklarutdalamakuades,
adisigaramdalamjumlahkecilbisamenyebabkan protein
tersebutlarut.Fenomenainidisebutsalting in.Apabilaadisigaramdilanjutkan,
akanterdapatsuatutitikdimanaadisilebihlanjutdarigaramtidakakanmenambahsolubilitas
protein, malahakanmenyebabkanpresipitasidari protein. Fenomenainidisebutsalting
out. (Srivastava, 2009)
b. MetodeKromatografi
Prinsip: Kromatografimerupakansalahsatucara yang
seringdigunakanuntukmemisahkan / mengisolasimolekul-molekulbiologiseperti
protein. IstilahinidiciptakanTswett (1906) daribahasaYunanichroma yang
berartiwarna.Iamemisahkanklorofildaripigmen-pigmen lain
dalamtanamandenganmenggunakantabung (kolom) yang
diisipadatdengankalsiumkarbonatsebagaiadsorben.
Ekstraktanamandimasukkankedalamkolomdanbiladialirkanpelarutorganik yang
sesuai, pigmen-pigmendalamekstrakbergerakturundarikolomdengankecepatan yang
berbeda-bedadanmasing-masingterpisahmembentukcincinatau pita
berwarna.Kemudianditemukanbahwacarainijugadapatjugadigunakanuntukmemisahka
nmolekul yang tidakberwarna.
Padapemisahanmolekuldenganteknikkromatografi, molekul-molekul yang
akandipisahkanterdistribusiantaraduafasazat, yaitufasastasioner yang
tidakbergerakdanfasamobil yang bergerak. Fasastasioner data
berupazatpadatataucairan, sedangkanfasamobilmungkinsuatucairanatau
gas.Fasamobildisebutjugaeluendan proses
pergerakansuatumolekulsepanjangfasastasioner yang
disebabkanoleheluendisebutelusi.
Hasilpemisahandenganteknikkromatografidisebutkromatogram.(Murray, 2006)
KromatografiKolom
Kromatografikolommerupakanteknikpemisahanmolekul-
molekuldaricampurannyadenganmelewatkanlarutan yang mengandungmolekul-
molekul yang akandipisahkantersebutmelaluikolom yang
berisimatrikspadatsebagaifasastasioner. Sifatmatriksdapatdibuatsedemikianrupa,
sehinggamemungkinkanpemisahanselektifmolekul-molekultersebut.Sifatiniantara
lain: kelarutan, ukuran, ataumuatanmolekul.
Padakromatografikolom yang klasik,
umumnyadigunakantabunggelasberdiameter 1 cm ataulebih, denganpanjangsekitar 10
– 30 cm. Adsorbenberupapartikel-
partikelmikroskopisdipadatkanpadakolommembentukfasastasioner.
Lajualiraneluendiaturdengankeran (pengaturaliran), biasanyasekitar 1 mL/menit.
Sampel, yang berupalarutan yang mengandungcampuranmolekul-molekul,
dituangkedalamkolomdanmolekul-molekuldipisahdenganmengalirkaneluen yang
sesuai.Elusiberlangsungsampaimolekul-molekulkeluarsatu-persatudarikolom.Fraksi-
fraksiyang terdiridaribeberapa mLeluen yang
keluardarikolomditampungdalamtabung-tabungsecara manual
ataumenggunakankolektorotomatis.Deteksifraksi yang mengandungmolekul-
molekulitudilakukandengancaramembandingkanvolume retensi (VR)
denganwakturetensi (tR) molekul-molekultersebutdenganstandar yang
telahdiketahui. Volume retensi adalah volume eluen yang
diperlukanuntukmengelusisuatumolekulpadakadarmaksimumnya,
sedangkanwakturetensimenyatakanwaktu yang
diperlukanuntukmengelusimolekulpadakadarmaksimumnya.
Selanjutnyapenetapankuantitatifmolekul-molekuldapatdilakukandengnacaratitrasi,
spektofotometriatasmetodaanalisis lain.(Murray, 2006)
Kromatografi Gel Penyaring
Padateknikini, protein/molekul lain
dipisahkandaricampurannyaberdasarkanperbedaanberatatauukuranmolekul. Cara
inidisebutjugamolecular sieve chromatographyatausize exclusion
chromatographykarenabutiransintetisdengandiameterdanukuranpori-poritertentu
yang dipadatkanpadakolombekerjasebagaipenyaringmolekuler.
Bilalarutan yang mengandungcampuran protein dilewatkanpadakolom,
molekul yang lebihkecildapatmasukkepori-
porisehinggarelatiftertahandanlebihlambatkeluardarikolom, sedangkanmolekul yang
lebihbesardaripori-poriteruslewat di
selabutiranpenyaringsehinggalebihcepatkeluardarikolom.Penyaringmolekuler yang
biasadigunakanadalah gel dekstranataupoliakrilamid yang
tersusundaributiranmikroskopis.
Dalampercobaanini, digunakanbutiran-butiranmikroskopisdekstran,
suatubentukpolimerdariglukosa, denganukuranterterntu yang seragam,
sebagaifasastasionerataumatrikspemisah.Dekstran yang
menyusunbutiranmikroskopistersebutteranyamsedemikianrupa,
sehinggamempunyaimataanyamandenganukuranterterntu pula.Partikel yang
larutdalamfasamobildandenganukuranlebihkecildarimataanyamantersebutakanterpera
ngkaplagidalambutiran yang lain, demikianseterusnya. Sebaliknya,
m
olekuldenganukuranlebihbesardarimataanyamantidakterperangkapdanmengalirdalam
cairan di antarapartikel-partikeltersebut.Akibatnya,
molekuldenganukuranlebihbesardarimataanyamantersebutmenempuhjalan yang
lebihpendekdankeluarlebihdahuludarikolompemisah. (Murray, 2006)
c. MetodeElektroforesis
Prinsip: Protein adalah heterobiopolimer yang terdiri dari asam amino melalui
ikatan peptida. Protein-protein ini dibedakan berdasarkan muatan elektronnya yang
berikatan secara ionik atau kovalen. Hal inilah yang menyebabkan suatu larutan
protein memiliki muatan listrik yang berbeda-beda. Selain itu, dapat juga dibedakan
berdasarkan berat molekulnya.
Pada teknik pemisahan protein dengan metode elektroforesis, protein serum
dipisahkan berdasarkan muatan listriknya. Apabila larutan protein diletakkan dalam
suatu medan listrik, tiap protein akan bermigrasi ke kutub yang berlawanan dari
muatan yang dikandung protein tersebut. Protein yang bermuatan negatif akan
bergerak ke anode yang adalah kutub positif. Sementara itu, protein yang tidak
bermuatan tidak akan bergerak. (Wade, 2006)
VIII. Kesimpulan
Pada percobaan praktikum ini, kasein menunjukan kelarutan terkecilnya pada
pH 4.8, yang merupakan titik isoelektriknya. Titik isoelektrik yang dimiliki kasein ini
dapat dipergunakan sebagai prinsip untuk mengisolasi kasein, yakni dengan
menurunkan pH larutan yang mengandung kasein menjadi 4.8, sehingga melalui
penyaringan, endapan kasein akan didapat.
Surabaya, 18 September 2012
Praktikan,
Raymond Harris Mustafa
IX. Daftar Pustaka
BukuPetunjukPraktikumBiokimia. 2012.
FakultasFarmasiUniversitasKatolikWidya Mandala Surabaya.
Ghosal S, Srivastava AK.Fundamentals of Bioanalytical Techniques and
Instrumentation. New Delhi: PHI Learning Private; 2009
Kleiner and Orten: Biochemistry 7th edition. Saint Louis. 1966. The C. V.
Mosby Company.
Murray, Robert K. Granner, Daryl K. Rodwell, Victor W. Biokimia.
Harper.27th ed. Jakarta.PenerbitBukuKedokteran EGC: 2006.
L. G. Wade, Jr. Organic Chemistry, 6th ed. New Jersey : Pearson, 2006