Latar Belakang : Menentukan fenotip seluler dan molekuler peradangan pada asma dapat mengidentifikasi pasien populasi yang mungkin manfaat terbaik dari terapi bertarget . Meskipun peningkatan IL - 6 dan polimorfisme di IL 6 signaling berhubungan dengan disfungsi paru-paru pada asma , masih belum diketahui apakah peningkatan IL - 6 tingkat terkait dengan fenotip inflamasi spesifik selular , dan bagaimana IL - 6 blokade mungkin berdampak respon inflamasi tersebut.

Metode : Pasien yang mengalami eksaserbasi asma yang phenotypednya berdasarkan karakteristik inflamasi saluran napas mereka ( jumlah sel yang normal, eosinophilic , neutrophilic , campuran granulocytic ) , profil sitokin sputum , dan fungsi paru-paru. Tikus yang terkena alertu biasa , rumah debu tungau ( HDM ) , di tidaknya endogen IL - 6 . Intensitas dan sifat inflamasi paru-paru , dan tingkat sitokin pro - granulocytic dan kemokin bawah kondisi ini dianalisis .

Hasil : Peningkatan IL - 6 dikaitkan dengan FEV1 lebih rendah pada pasien dengan campuran eosinophilic - neutrophilic bronkitis .Pada tikus , paparan alergen meningkat IL - 6 paru-paru dan IL - 6 diproduksi oleh sel dendritik dan makrofag alveolar . Rugi -of - fungsi IL - 6 signaling ( KO atau netralisasi antibodi -mediated ) dibatalkan ketinggian eosinofildan neutrofil merekrut sitokin / kemokin dan peradangan saluran napas alergen yang diinduksi pada tikus

Kesimpulan : Kami menunjukkan asosiasi peradangan saluran napas seluler pleiotropic dengan IL - 6 menggunakan manusia dan data hewan . Data ini menunjukkan bahwa eksaserbasi asma , terutama yang dengan eosinophilic gabungan dan bronkitis neutrophilic , mungkin menanggapi terapi menargetkan IL - 6 jalur dan oleh karena itu memberikan rasional dasar untuk memulai uji klinis untuk mengevaluasi ini .

Kata kunci : peradangan Airway , Asma , Alergi , Bronchitis , Eosinofil , Neutrofil , granulosit , IL - 6 , IL - 6R , Housedebu tungau ( HDM )

Latar belakang

Asma adalah penyakit kronis saluran udara yang ditandai oleh obstruksi aliran udara reversibel, napas hyperresponsiveness, dan peradangan saluran napas. Sementara ini penyakit mendefinisikan fitur, asma telah lebih baru-baru ini diakui sebagai penyakit secara luas yang heterogen dengan beberapa varian klinis, subtipe tergantung pada faktor-faktor seperti keparahan, responsif terhadap kortikosteroid, atau alam peradangan saluran napas. Dalam hal yang terakhir, saluran napas inflammometry telah muncul sebagai pertimbangan penting dalam pengendalian asma dan desain novel, ditargetkan terapi disesuaikan dengan komposisi tertentu dari saluran napas seluler infiltrasi inflamasi [1-3]. Sebagai contoh, kami telah menunjukkan bahwa pemilihan pasien dengan eosinophilic fenotipe asma sangat penting untuk khasiat anti-IL-5 terapi dalam mengontrol eksaserbasi asma [4]. Dengan demikian, penentuan seluler dan molekuler fenotipe peradangan pada asma dapat mengidentifikasi populasi pasien yang mungkin manfaat terbaik dari terapi bertarget.

IL - 6 adalah sitokin pleiotropik yang dapat diproduksi oleh banyak jenis sel dalam menanggapi beragam inflamasi rangsangan dan sitokin [ 5 ] . IL - 6 mengikat larut atau membran - terikat reseptor ( sIL - 6R atau MIL - 6R , masing-masing) , sebelum bergaul dengan dan sinyal melalui gp130 , sebuah ubiquitously dinyatakan trans membran protein [ 5 ]

Seperti baru-baru Ulasan [6], IL-6 dan sIL-6R memiliki konsisten diamati untuk meningkat pada saluran udara anak dan orang dewasa dengan asma, dengan tingkat ini protein yang berkorelasi langsung dengan tingkat keparahan penyakit, dan berbanding terbalik dengan volume ekspirasi paksa dalam 1 detik (FEV1) [7-9]. Imunohistokimia (IHC)biopsi endobronkial dari pasien dengan asma menunjukkan bahwa IL-6R terutama diungkapkan oleh airway epitel,otot polos, dan endotelium pembuluh darah. IHC dari lavage bronchoalveolar (BAL) dari mata pelajaran yang sama menunjukkan bahwa IL-6 diungkapkan oleh makrofag dangranulosit [10]. IL-6 dan sIL-6R juga telah dilaporkanmeningkat pada serum pasien dengan asma [11]. Selanjutnya, studi asosiasi genome baru-baru ini telah mengidentifikasi polimorfisme di IL-6R asma baru lokus risiko yang berhubungan dengan persen lebih rendah diprediksi FEV1, kapasitas vital paksa (FVC) dan rasio FEV1 / FVC [10,12]. Polimorfisme tersebut telah diprediksi untuk meningkatkan pembelahan proteolitik dari IL-6R dari permukaan sel, sehingga meningkatkan tingkat sIL-6R dan sinyal berikutnya melalui IL-6- kompleks sIL-6R-gp130.

Meskipun fenotipe seluler dan molekuler inflamasi pada asma dapat mengidentifikasi populasi pasien bahwa manfaat mungkin terbaik dari terapi bertarget , mepolizumab untuk eosinophilic - asma misalnya [ 4 ] , sebuah asosiasi antara IL - 6 dan peradangan saluran napas tertentu fenotipe asma tidak diketahui . Di sini , kami menunjukkan bahwa IL - 6 dikaitkan dengan campuran eosinophilic neutrophilic bronkitis selama eksaserbasi asma dan buruk fungsi paru pada manusia . Menggunakan mapan hewan model asma , kami menguji hipotesis bahwa IL - 6 mendorong peradangan granulocytic di paru-paru . memang, dengan tidak adanya IL - 6 alergen yang disebabkan alergi peradangan saluran napas yang dibatalkan . Dengan demikian , eksaserbasi asma , terutama yang dengan eosinophilic gabungan dan bronkitis neutrophilic , mungkin menanggapi terapi menargetkan IL - 6 jalur dan oleh karena itu, data ini memberikan dasar yang rasional untuk memulai uji klinis untuk mengevaluasi ini .

MetodeSubyek penelitian dan pengumpulan spesimen dan analisis Induksi dahak dikumpulkan dari pasien berturut-turut dengan dokter-didiagnosis asma eksaserbasi diri pelaporan(Didefinisikan sebagai peningkatan batuk, mengi atau produksi sputum selama lebih dari 2 hari dan yang Asma Kontrol. Kuesioner [13] Rata telah diubah oleh lebih dari 0,5 unit) menghadiri Firestone Institut Respiratory Klinik rawat jalan kesehatan (Hamilton, Ontario). Diagnosis asma didasarkan pada riwayat klinis yang kompatibel dengan bukti keterbatasan aliran udara reversibel peningkatan (dalam FEV1 dari 15% atau lebih berikut bronkodilator) atau saluran napas hyper-responsiveness (konsentrasi provokatifmetakolin menyebabkan penurunan 20% pada FEV1). Induksi dahak dan pemeriksaan sitokin dan total dan diferensial jumlah sel dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [14]. Sitokin dahak yang kuantitatif menilai menggunakan uji Luminex (Luminex, Austin, TX). Spirometri dilakukan sesuai dengan standar dari American Thoracic Society. Studi ini disetujui oleh Etika Dewan Penelitian dari St Joseph Kesehatan, Hamilton, Ontario. Semua pasien yang tersedia ditulis diinformasikan persetujuan.

Model hewan asmaUsia, jenis kelamin , penjual dan kontrol regangan - cocok digunakan dalam semua percobaan . Wild type ( WT ) dan IL - 6 KO ( B6.129S2 - Il6tm1Kopf / J ) tikus berasal dari JAX laboratorium ( Bar Harbor , Maine ) . Beberapa kelompok tikus WT diterima baik sistem anti - tikus IL - 6 ( MP5-20 F3 , R & D atau BioXCell ) atau kontrol Rat IgG ( Sigma ) . Seperti dijelaskan sebelumnya [ 15,16 ] , tikus menerima 25 mg rumah debu tungau ( HDM , Dermatophagoides pteronyssinus , Greer Laboratories ) di 10 ml garam intranasal ( di ) sekali sehari selama 10 hari berturut-turut . Tikus kontrol menerima garam hanya i.n. 24 jam kemudian , paru-paru yang diekstrak dan sasaran BAL dua kali ( 0,25 ml diikuti dengan 0,2 ml ) dengan PBS yang mengandung LENGKAP PI ( Roche ) , dansekitar 0,25-0,3 ml cairan ditanamkan adalah diambil secara konsisten . Total jumlah sel kemudian ditentukan menggunakan hemositometer. Setiap sampel UUPA adalah kemudian disentrifugasi dan supernatan dikumpulkan dan disimpan pada -20 C . Cytospins disiapkan dan bernoda dengan Protokol Hema 3 set ( Fisher Scientific ) dan , 500 sel dihitung dan diidentifikasi sebagai monosit , limfosit , neutrofil dan eosinofil menggunakan hemocytological standar kriteria . Dalam beberapa percobaan , paru-paru yang dibedah tanpa koleksi BAL dan ditempatkan di PBS dengan COMPLETE PI pada 4 C untuk homogenat jaringan persiapan. Atau , paru-paru yang perfusi dengan PBS dan disimpan dalam es - dingin HBSS sampai pengolahan untuk mengalir analisis cytometric . Semua prosedur telah disetujui oleh Penelitian Etika Dewan McMaster University.

Paru homogenat jaringan dan analisisParu-paru seluruh yang homogen dalam 1,5 ml PBS ditamba dengan LENGKAP PI ( Roche , Laval , QC , Canada ) . Setelah homogenisasi , 150 ml 10 % Triton X -100 ditambahkan dan sampel mengguncang pada suhu 4 C selama 1 jam . Supernatan dikumpulkan menyusul 15 menit berputar di 12.000 rpm pada suhu 4 C dan disimpan pada -70 C . Sitokin diukur dalam homogenat paru menggunakan Luminex 100 Jumlah Sistem dan kit dari dari Upstate ( Charlottesville , VA )

Sel dendritik dan makrofagSeperti dilaporkan sebelumnya [ 17 ] , granulosit macrophagecolony stimulating factor ( GM - CSF ) -derived dendritik Sel-sel yang dihasilkan dan kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan media, HDM , Escherichia coli 0111 : LPS B4 ( Kultur sel diuji ; Sigma ) atau 25 banyaknya replikasi infeksi kekurangan virus stomatitis vesikuler ( VSV ) -M51 , yang transduces sel dendritik tanpa keturunan signifikan Produksi virus atau efek pada kelangsungan hidup . Seperti dilaporkan sebelumnya [ 18 ] , makrofag alveolar yang pulih dari paru-paru tikus naif dengan es dingin PBS ditambah dengan 0,5 mM EDTA dan , kemudian , dicuci dengan lengkap RPMI . 5.22 105 makrofag per sumur yang berlapis dan diizinkan untuk mematuhi pada 37 C selama 1 jam . Sel tidak patuh dihilangkan dengan lembut mencuci tiga kali dengan hangat PBS . Makrofag dirangsang selama 24 jam dengan media, HDM , atau LPS . Supernatan bebas sel dianalisis untuk IL - 6 dengan ELISA ( R & D )

Isolasi sel paru-paru dan analisis cytometric aliran Seperti dijelaskan sebelumnya [15], jumlah sel paru-paru yang terisolasi oleh kolagenase pencernaan (tipe Kolagenase saya; Hidup Teknologi, Burlington, ON, Canada), dicuci dua kali dalam PBS dengan 0,5% bovine serum albumin, dan kemudian disaring melalui saringan sel 40-m. Dalam semua tes, sel diinkubasi dengan anti-FcRII / IIIb sebelum inkubasi dengan fluorochrome-terkonjugasi antibodi, sel-sel mati dikeluarkan oleh propidium iodida (Sigma) penyerapan dan terjaga keamanannya di singlet. Antibodi yang digunakan berasal dari eBioscience, BD Biosciences, Invitrogen, atau Biolegend dan pra-dititrasi untuk menentukan konsentrasi optimal: CD45-allophyocyannin (APC) -Cyanine (Cy) 7, CD3-Pacific Blue, CD11c-fluorescein isothiocyanate (FITC), B220-phycoerythrin (PE) -Cy5, major histocompatibility kompleks II-Alexa Fluor 700, Siglec-F-PE, Ly6C-Peridinin Klorofil Protein Complex (PerCP) - Cy5.5, DX5-PE-Cy7, CD4-APC, Gr-1-Pacific Jeruk. Fluoresensi minus satu kontrol yang digunakan untuk gating. Data dikumpulkan menggunakan LSRII (BD Biosciences) dan dianalisis menggunakan software FlowJo (Pohon bintang). Lebih dari 300.000 peristiwa dikumpulkan untuk setiap sampel klinik , dahak dikumpulkan pada saat eksaserbasi di pengelolaan klinis rutin pasien dengan moderat untuk asma berat untuk menilai bronkitis ke mengoptimalkan pengobatan anti - inflamasi . sampel dilaporkan dalam penelitian ini berasal dari pasien berturut-turut yang memiliki eksaserbasi dilaporkan sendiri ( didefinisikan sebagai peningkatanbatuk , mengi atau dahak produksi selama lebih dari 2 hari dan yang nilai Asma Kontrol Angket telah diubah oleh lebih dari 0,5 unit ) yang menghadiri klinik selama periode penelitian

Menggunakan Luminex manik berbasis immunoassay multipleks dari dithiothreitol ( DTT ) -treated supernatan sputum , kamimenemukan tingkat signifikan lebih tinggi dari IL - 6 pada pasien denganasma dengan eosinophilic campuran dan bronkitis neutrophilic dibandingkan dengan pasien dengan asma dengan terisolasi eosinofilik ( jumlah total sel < 10 106 / g , eosinofil > 3 % ) atau intens bronkitis neutrophilic ( jumlah total sel > 15 106 / g , neutrofil > 65 % ) atau jumlah sel normal ( Gambar 1 ) .Sebaliknya , pasien dengan bronchitis terisolasi neutrophilic memiliki peningkatan kadar IL- 1 sputum , yang memiliki dikaitkan dengan eksaserbasi bakteri obstruktif penyakit saluran napas [ 19,20 ] . TNF - bawah batas deteksi di sebagian besar pasien ( tidak ditampilkan ) , dan uji klinis telah dihasilkan hasil yang bertentangan dengan terapi anti - TNF - berbasis untuk asma [ 2 ] .. dalam hal fungsi paru-paru , pasien dengan campuran eosinophilic / neutrophilic bronkitis memiliki tingkat terbesar aliran udara obstruksi dibandingkan dengan tiga kelompok lainnya (Gambar 1). Analisis varians seluruh kelompok mengungkapkan tidak ada perbedaan statistik dalam dosis kortikosteroid yang digunakan pada saat pengumpulan sampel ( dosis rata-rata ICS 1500 mg dalam kelompok eosinophilic , 1000 mg dalam 2 kelompok lain ) . Dengan demikian , dahak IL - 6 berhubungan dengan campuran eosinophilic / neutrophilic peradangan saluran napas asma dan gangguan fungsi paru-paru . IL-6 diproduksi oleh alergen-dirangsang mononuklear fagosit dan menengahi granulocytic saluran napas alergi inflamasi melalui elisitasi dari eosinofil dan kemokin neutrofil dan sitokin pada tikus Untuk menyelidiki peran kausatif untuk IL-6 pada asma kami menggunakan model tikus mapan HDM-diinduksi peradangan saluran napas alergi, di mana sensitisasi dan inflamasi dicapai dengan i.n. yang administrasi alergen tanpa adjuvant eksogen [16,21]. Tikus terkena HDM dengan cara ini dipamerkan ditinggikan tingkat IL-6 di paru-paru (Gambar 2A), menunjukkan bahwa IL-6 mendorong respon inflamasi untuk HDM. Sebagai mononuklear fagosit telah diusulkan untuk menjadi besar sumber IL-6 [10], kita mempertanyakan jika HDM menimbulkan IL-6 dari sel-sel tersebut dalam vitro. Memang, dibandingkan dengan mediaexposed sel dendritik, HDM diinduksi IL-6 produksi dalam dosis cara yang tergantung (Gambar 2A). Demikian juga, dan seperti yang ditunjukkan sebelumnya [18], makrofag alveolar terkena HDM ex vivo dihasilkan IL-6 (Gambar 2A). VSV dan LPS digunakan sebagai kontrol positif untuk memunculkan IL-6 produksi [17,18]. Peradangan saluran napas sehingga, HDM-diinduksi dikaitkan dengan IL-6 produksi, setidaknya dari fagosit mononuklear

KesimpulanData klinis menunjukkan bahwa IL-6 / IL-6R adalah berbeda-beda dinyatakan dalam penderita asma dibandingkan kontrol sehat, dan bahwa ini terkait dengan disfungsi saluran napas [6]. IL-6R polimorfisme dapat berkontribusi keparahan asma [6]. Di sini, kami mengamati tingkat tinggi IL-6 di dahak pasien dengan campuran eosinophilic / neutrophilic saluran udara peradangan dan bahwa ini terkait dengan fungsi paru yang lebih buruk. Data praklinis kami menunjukkan bahwa IL-6 meningkat pada paru-paru selama nafas peradangan, dan bahwa penghambatan IL-6 signaling menurun respon inflamasi asma terlepas apakah peradangan yang neutrophilic, eosinophilic, atau dicampur, melalui downregulation dari granulosit aktivasi dan merekrut sitokin dan kemokin. Sebelumnya Studi menggunakan sistem alergen pengganti dengan intraperitoneal, bukan sensitisasi mukosa, memiliki menyebabkan hasil yang tidak konsisten, sebagian karena eksklusif pemeriksaan baik IL-6 tikus KO atau tikus WT diobati dengan anti-IL-6 antibodi [5,22].

Di sini, kami menggunakan alergen lingkungan umum, HDM, dalam modelhanya melibatkan paparan mukosa. Selanjutnya, kami dimanfaatkan baik KO serta strategi netralisasi antibodi untuk menghasilkan hasil yang konsisten menunjukkan bahwa IL-6 drive HDM-diinduksi radang saluran napas. Dengan demikian, klinis kami dan data praklinis menunjukkan bahwa pasien dengan asma, seperti yang dengan campuran eosinophilic / neutrophilic bronkitis dipilih melalui inflammometry, dapat mengambil manfaat dari terapi menargetkan IL-6 jalur.