latvijas lauksaimniecĪ Āte latvia university of...
TRANSCRIPT
LATVIJAS LAUKSAIMNIECĪBAS UNIVERSITĀTE LATVIA UNIVERSITY OF AGRICULTURE
PĀRTIKAS TEHNOLOĢIJAS FAKULTĀTE
FACULTY OF FOOD TECHNOLOGY
AĢENTŪRA “BIOTEHNOLOĢIJAS UN VETERINĀRMEDICĪNAS ZINĀTNISKAIS INSTITŪTS “SIGRA””
AGENCY “RESEARCH INSTITUTE OF BIOTECHNOLOGY AND VETERINARY MEDICINE “SIGRA””
Ināra Helēna Konošonoka
GOVS PIENA MIKROBIĀLĀ KONTAMINĀCIJA UN IZOLĒTĀS MIKROORGANISMU ASOCIĀCIJAS
MICROBIAL CONTAMINATION OF COW’S MILK AND
ISOLATED ASSOCIATIONS OF MICROORGANISMS
Promocijas darba kopsavilkums inženierzinātņu doktora zinātniskā grāda iegūšanai
pārtikas zinātnē
Summary of promotion work for acquiring the Doctor’s degree of Engineering Sciences in the Food Sciences
Sigulda 2005
Promocijas darbs izstrādāts Latvijas Lauksaimniecības universitātes aģentūrā “Biotehnoloģijas un veterinārmedicīnas zinātniskais institūts “Sigra”” laika posmā no 2000.- 2004.gadam.
Promocijas darba zinātniskie vadītāji: Dr.habil.agr., Dr.med. vet. Aleksandrs Jemeļjanovs – profesors, LLU aģentūras “Biotehnoloģijas un veterinārmedicīnas zinātniskais institūts “Sigra”” direktors Dr. sc.ing. Inga Ciproviča – LLU Pārtikas tehnoloģijas fakultātes asociētā profesore
Oficiālie recenzenti: Dr.habil.sc.ing. Sigita Angele Urbiene – Lietuvas Lauksaimniecības universitātes profesore Dr.habil.med. Aija Žilevica – Latvijas Universitātes profesore Dr.habil.biol. Edīte Birģele – Latvijas Lauksaimniecības universitātes profesore
Promocijas darba aizstāvēšana notiks LLU Pārtikas zinātnes promocijas padomes atklātā sēdē Jelgavā, Lielā ielā 2, Pārtikas tehnoloģijas fakultātē, 145. auditorijā
Ar promocijas darbu un kopsavilkumu var iepazīties LLU Fundamentālajā bibliotēkā, Jelgavā, Lielā ielā 2.
Atsauksmes sūtīt Promocijas padomes sekretārei LLU Pārtikas tehnoloģijas fakultātes docentei Dr.phys. Lilijai Markevičai Lielā iela 2, Jelgava, LV 3001.
Dissertation was performed in 2000 – 2004 at the Research Institute of Biotechnology and Veterinary Medicine “Sigra” of the Latvia University of Agriculture
Scientific supervisors: Professor, Dr.habil.agr., Dr.med.vet. Aleksandrs Jemeļjanovs – LUA Research Institute of Biotechnology and Veterinary Medicine “Sigra” Associate professor, Dr. sc.ing. Inga Ciproviča – LUA Faculty of Food Technology
Official reviewers Dr.habil.sc.ing. Sigita Angele Urbiene – Professor of Lithuanian University of Agriculture Dr.habil.med. Aija Žilevica – Professor of Latvia University Dr.habil.biol. Edīte Birģele – Professor of Latvia University of Agriculture
The doctoral dissertation and thesis are available at the Fundamental Library of the Latvia University of Agriculture, Lielā Street 2, Jelgava. The Promotion Paper will be defended in the open session of the LUA Food Science Promotion Council , in room 145, Jelgava, 2 Lielā street. Any comments are to be sent to the secretary of the Promotion Council, the docent of the Faculty of Food Technology at the LUA, Dr.phys. Lilija Markeviča – 2 Lielā Street, Jelgava, LV 3001, Latvia.
2
SATURS Pētījuma priekšmets un problēmas aktualitāte…………………………4 Pētījuma mērķis, uzdevumi, novitāte………………………………….. 5 Zinātniskā darba aprobācija…………………………………………….5 Pētījumu materiāls un metodes…………………………………………8 Pētījumu rezultāti un diskusija…………………………………………10 1. Veselu govju piena mikroflora ……………………………………..10 2. Ar subklīnisku un klīnisku mastītu slimojošu govju tesmeņa sekrēta mikroflora…………………………………………12 3. Veselu govju piena un slimu govju tesmeņa sekrēta mikrofloras salīdzinājums…………………………………………..16 4. Staphylococcus aureus un koagulāzes negatīvo stafilokoku skaits pienā un slimu govju tesmeņa sekrētā………………………..18 5. Staphylococcus aureus, koagulāzes negatīvo stafilokoku un to asociāciju saistība ar somatisko šūnu skaitu pienā un slimu govju tesmeņa sekrētā…………………………………….19 6. Mikrofloras sastāvs un somatisko šūnu skaits termiski neapstrādātā pienā………………………………………………….23 7. Staphylococcus ģints mikroorganismu kvalitatīvās un kvantitatīvās izmaiņas pienā govju vakcinācijas ietekmē…………..27 Secinājumi un ieteikumi………………………………………………..28 CONTENT The research subject and topicality of the problem……………………30 The aim, tasks and scientific novelty of the promotion work………….31 Approbation of the research work……………………………………...31 Materials and methods………………………………………………….34 Results and discussion………………………………………………….36 1. Microflora of healthy cows’ milk…………………………………...36 2. Microflora of subclinically and clinically diseased cows’
udder secretion samples…………………………………………….38 3. Comparison of the microflora between healthy cows’ milk and
subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples……42 4. The count of Staphylococcus aureus and coagulase negative
staphylococci in cows’ milk and subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples ……………………………………………44
5. Connection between isolated Staphylococcus aureus and coagulase negative staphylococci and somatic cell counts in cows’ milk and subclinically and clinically diseased cows’ secretion samples……………………………………………………46 6. Spectrum of microflora and somatic cell count in raw milk………...49 7. Qualitative and quantitative changes of microorganisms from the genus Staphylococcus in milk as a result of vaccination of cows’……53 Conclusions and suggestions……………………………………………55
3
APZĪMĒJUMU UN SAĪSINĀJUMU SKAIDROJUMS:
KoNS koagulāzes negatīvie stafilokoki kvv ml-1 koloniju veidojošās vienības 1 ml piena LB * HM govju šķirņu “Latvijas brūnā” un “Holšteinas melnraibā”
krustojums p p-vērtība piens veselu dzīvnieku normālas sekrēcijas produkts sekrēts ar subklīnisku un klīnisku mastītu slimojošu govju tesmeņa
produkts spp. suga (latīniski) SPSS statistiskā datu apstrādes programma SŠS somatisko šūnu skaits subsp. pasuga (latīniski) S. Staphylococcus ģints S. aureus Staphylococcus aureus ZI “Sigra” Latvijas Laukasaimniecības universitātes aģentūra
“Biotehnoloģijas un veterinārmedicīnas zinātniskais institūts “Sigra”
x izlases vidējais aritmētiskais
PĒTĪJUMA PRIEKŠMETS UN PROBLĒMAS AKTUALITĀTE Dzīvnieku valsts izcelsmes produkti, t.sk. piena produkti, ir nozīmīga
veselīga un sabalansēta uztura sastāvdaļa. Lai nodrošinātu patērētāju pieaugošās vajadzības pēc veselīgiem un
drošiem uzturlīdzekļiem, visos pārtikas aprites posmos ir jānodrošina gan pastāvošās likumdošanas ievērošana, gan labas ražošanas prakses nosacījumi, kvalitatīvu pārtikas produktu ieguvē. Pienu un tā produktus, kā diētiski pilnvērtīgu pārtiku, patērē visu vecumu cilvēki, bet sevišķi tie nepieciešami bērniem, kuru augošajiem organismiem vajadzīgas pienā esošās olbaltumvielas, laktoze, minerālvielas un vitamīni. Līdz ar to šiem produktiem jābūt īpaši drošiem, lai nenodarītu ļaunumu jutīgajiem bērnu organismiem.
Vienlaikus piens ir vide, kas nodrošina pat visprasīgāko mikroorganismu augšanu un vairošanos. Līdztekus daudziem apkārtējās vides mikroorganismiem, kas nenodara ļaunumu patērētājam, pienā var nokļūt patogēnie mikroorganismi, visbiežāk no govīm, slimojošām ar subklīniskiem un klīniskiem tesmeņa iekaisumiem. Īpaši bīstami mastītu ierosinātāji ir Staphylococcus aureus, kā arī citas Staphylococcus ģints sugas, tā sauktie koagulāzes negatīvie stafilokoki. Tie spēj ierosināt
4
dažādas infekcijas cilvēkiem un producē enterotoksīnus, kas var izsaukt piena un tā produktu patērētāju intoksikācijas.
Latvijā nav veikti pētījumi par koagulāzes negatīvo stafilokoku sastopamību pienā, to saistību govju tesmeņa iekaisumu ierosināšanā. Visi šie jautājumi darbā īpaši akcentēti.
PĒTĪJUMA MĒRĶIS UN UZDEVUMI
Darba mērķis: izvērtēt govs piena mikrofloras kvantitatīvo un kvalitatīvo sastāvu.
Pētījumu uzdevumi: 1. Noteikt mikroorganismu sugas un to asociācijas veselu govju pienā
un ar klīnisku un subklīnisku mastītu slimojošu govju tesmeņa sekrētā;
2. Izvērtēt Staphylococcus aureus un koagulāzes negatīvo stafilokoku saistību ar somatisko šūnu skaitu govs pienā;
3. Izpētīt tirdzniecībā esošā termiski neapstrādātā piena mikrobiālo piesārņojumu;
4. Izzināt Staphylococcus aureus eksperimentālās vakcīnas ietekmi uz mikrofloras sastāvu vakcinētu govju pienā.
PĒTĪJUMA NOVITĀTE
1. Noskaidrots Staphylococcus ģints mikroorganismu, t.sk., koagulāzes negatīvo stafilokoku sugu spektrs veselu govju pienā, ar subklīnisku un klīnisku mastītu slimojošu govju tesmeņa sekrētā.
2. Apzināta koagulāzes negatīvo stafilokoku un somatisko šūnu skaita sakarība veselu govju pienā un ar subklīnisku un klīnisku mastītu slimojošu govju tesmeņa sekrētā.
3. Noskaidrota Staphylococcus aureus antigēna ietekme uz Staphylococcus sugu spektru vakcinētu govju pienā.
ZINĀTNISKĀ DARBA APROBĀCIJA
Promocijas darba pētījumu rezultāti prezentēti 12 starptautiskās zinātniskās konferencēs:
1. Konošonoka I. H. Mikroorganismus raksturojošo kvalitatīvo un
kvantitatīvo rādītāju un somatisko šūnu skaita izvērtējums govs pienā.
5
Starptautiskā zinātniskā konference “Zinātne lauku attīstībai”, Jelgava, 2001. gada 23. - 25. maijā.
2. Konošonoka I. H. Evaluation of Microflora and Somatic Cell Count Changes in Mastitic Udder Secretions. Starptautiskā zinātniskā konference “Zinātne lauku attīstībai”, Jelgava, 2002. gada 22. - 24. maijā.
3. Konošonoka I. H., Jemeļjanovs A. Piena un gaļas piesārņojums to realizācijas vietās. Starptautiskā konference “Eco-Balt 2002”, Rīga, 2002. gada 7. – 8. jūnijā.
4. Jemeljanovs A., Konosonoka I. H. Staphylococcus aureus Prevalence in a Mastitic Secret of Cows with Udder Inflammation. 27th World Veterinary Congress, Tunis, September 25 – 29, 2002.
5. Jemeļjanovs A., Blūzmanis J., Konošonoka I. H., Duļbinskis J. Imunizācija – tesmeņa iekaisuma profilakses efektīvākais pasākums. Starptautiskā zinātniskā konference “Dzīvnieki. Veselība. Pārtikas higiēna”, Jelgava, 2002. gada 14. novembrī.
6. Konošonoka I. H., Jemeļjanovs A. Pasterizēta piena mikrofloras kvantitatīvās un kvalitatīvās izmaiņas uzglabāšanas temperatūras ietekmē. Starptautiskā konference “Eco-Balt 2003”, Rīga, 2003. gada 15.-16. maijā.
7. Konošonoka I. H. Influence of Different Factors on Somatic Cell Count in Cows, Milk. International scientific conference “Research for Rural Development”, Jelgava, May 21-24, 2003.
8. Jemeljanovs A., Konosonoka I. H., Bluzmanis J. Staphylococcus species prevalence in cows, raw milk from dairy farms in Latvia. The 54th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, Rome, Italy, 31 August – 3 September, 2003.
9. Konošonoka I. H., Ciproviča I. Organic farming – opportunities for dairy farmers in Latvia? Starptautiskā zinātniski-praktiskā konference “Nekaitīgi pārtikas produkti veselīgam uzturam”, Jelgava , 2003. gada 14. maijā.
10. Konošonoka I. H. Estimation of Prevailing Pathogens in Cow,s Milk International scientific conference “Research for Rural Development”, Jelgava, May 19 – 22, 2004.
11. Jemeljanovs A., Konosonoka I. H., Bluzmanis J. Pathogenic microorganisms elevating somatic cell count in cow’s udder secretions. The 55th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, Bled, Slovenia, September 5 - 9, 2004.
12. Konošonoka I. H., Jemeļjanovs A., Blūzmanis J. Staphylococcus ģints baktēriju sastopamība veselu govju pienā un slimu govju tesmeņa sekrētā. Zinātniskā konference “Dzīvnieki. Veselība. Pārtikas kvalitāte”, Jelgava, 2004. gada 15. oktobrī.
6
Kopumā publicēti 11 zinātniskie raksti latviešu un angļu valodā, no tiem 9 publicēti vispāratzītos recenzējamos izdevumos: 1. Konošonoka I. H. (2001) Mikroorganismus raksturojošo
kvalitatīvo un kvantitatīvo rādītāju un somatisko šūnu skaita izvērtējums govs pienā. Zinātne lauku attīstībai: Starptautiskās zinātniskās konferences referāti, 2001. g 23.-25. maijā, Jelgava, Latvija, 127.-130. lpp.
2. Konošonoka I. H. (2002) Evaluation of Microflora and Somatic Cell Count Changes in Mastitic Udder Secretions.Research for Rural Development. International scientific conference proceedings, 22-24 May, 2002, Jelgava, Latvia, pp. 173-176.
3. Konošonoka I. H., Jemeļjanovs A. (2002) Piena un gaļas piesārņojums to realizācijas vietās. Starptautiskā konference Eco-Balt 2002, Rīgā, 2002. gada 7.-8. jūnijā, 78.-79. lpp.
4. Jemeļjanovs A., Blūzmanis J., Konošonoka I. H., Duļbinskis J. (2002) Imunizācija – tesmeņa iekaisuma profilakses efektīvākais pasākums. Starptautiskās zinātniskās konferences “Dzīvnieki. Veselība. Pārtikas higiēna.” Raksti, Jelgava, 2002. gada 14. novembrī, 64.–69. lpp.
5. Konošonoka I. H., Jemeļjanovs A. (2003) Pasterizēta piena mikrofloras kvantitatīvās un kvalitatīvās izmaiņas uzglabāšanas temperatūras ietekmē. Starptautiskā konference Eco-Balt 2003, Rīgā, 2003. gada 15.-16. maijā, II-24.-II-25. lpp.
6. Konošonoka I. H. (2003) Influence of Different Factors on Somatic Cell Count in Cows, Milk. Research for Rural Development. LUA, International scientific conference proceedings, Jelgava, Latvia, 21-24 May, 2003, pp. 160-163.
7. Konošonoka I. H., Ciproviča I. (2003) Organic farming – opportunities for dairy farmers in Latvia? Starptautiskās zinātniski-praktiskās konferences “Nekaitīgi pārtikas produkti veselīgam uzturam” referāti. Jelgava, 61.- 64. lpp.
8. Jemeļjanovs A., Miculis J., Ramane I., Konosonoka I., Kaugers R. (2004) Development of organic livestock production and certification in Latvia. In: Organic livestoc farming: potential and limitations of husbandry practice to secure animal health and welfare and food quality. Proceedings of the 2nd SAFO Workshop 25-27 March 2004, Witzenhausen, Germany, pp. 183 – 191.
9. Konošonoka I. H., Jemeļjanovs A. (2004) Svaiga govs piena kvalitāti ietekmējošie mikrobiālie faktori. LLU Raksti 12 (307), 25. – 30. lpp.
10. Konošonoka I. H. (2004) Estimation of Prevailing Pathogens in Cow,s Milk. Research for Rural Development. LUA, International scientific conference, Jelgava, Latvia, 19-22 May, 2004, pp. 161-166.
7
11. Konošonoka I. H., Jemeļjanovs A., Blūzmanis J. (2004) Staphylococcus ģints baktēriju sastopamība veselu govju pienā un slimu govju tesmeņa sekrētā. Zinātniskā konference “Dzīvnieki. Veselība. Pārtikas kvalitāte” rakstu krājums,Jelgava, Veterinārmedicīnas fakultāte, 150. – 155. lpp.
PĒTĪJUMU MATERIĀLS UN METODES
Pētījumi veikti laikā no 2001. gada janvāra līdz 2004. gada janvārim. Mikrobioloģiskās analīzes veiktas ZI “Sigra” Veterinārmedicīnas nodaļas mikrobioloģijas laboratorijā.
Kopumā analizēti 196 veselu govju piena, 311 ar subklīnisku un 87 ar klīnisku mastītu slimojošu govju sekrēta paraugi, kas iegūti Rīgas, Ogres, Cēsu un Gulbenes rajonu zemnieku saimniecībās.
Termiski neapstrādāta piena paraugi (n = 170) iegādāti Rīgas Centrāltirgū, Āgenskalna, Vidzemes un Purvciema tirgos.
Pētījumā izmantotas 219 dažādu šķirņu, dažādu laktāciju, dažādas produktivitātes govis. 164 jeb 75.0 % bija Latvijas brūnās šķirnes govis, 50 jeb 23.0 % bija Holšteinas melnraibās šķirnes govis. 5 jeb 2.0 % bija LB * HM govis. 82.6 % govju bija no 1. līdz 4. laktācijai. 63.0 % govju produktivitāte bija no 4 000 līdz 6 000 kg piena laktācijas periodā.
LLU ZI “Sigra” Veterinārmedicīnas nodaļas veterinārārstu grupa noteica katras govs klīnisko diagnozi. Pamatojoties uz veterinārārstu atzinumu, govis tika iedalītas trīs grupās:
veselas govis; ar subklīnisku mastītu slimas govis; ar klīnisku mastītu slimas govis. Veselu govju piena un slimu govju tesmeņa sekrēta paraugi tika
aseptiski noņemti vienā laikā - pirms rīta slaukšanas. Paraugi uz laboratoriju nogādāti termosomā, kurā temperatūra nepārsniedz + 100 C. Bakterioloģiskā izmeklēšana uzsākta tūlīt pēc paraugu nogādes laboratorijā.
Mezofīlo aerobo un fakultatīvi anaerobo baktēriju kopskaits 1 ml piena noteikts uz piena agara barotnes Petri platēs, saskaņā ar standarta LVS 179:1999 “Mikroorganismu koloniju veidojošo vienību noteikšana. Koloniju skaitīšanas tehnika 300 C” prasībām. Piena paraugu atšķaidīšana veikta saskaņā ar standarta LVS 178:1999 “Testa paraugu atšķaidījumu sagatavošana mikrobioloģiskai izmeklēšanai” prasībām.
Mikroorganismu identificēšanai izmantotas barotnes: barojošais agars ar 5% liellopu asins piedevu; Bairda - Parkera agars (Difco BBL vai Mast Diagnostic); Endo vai MacConkey agars (Difco BBL); barojošais agars (Difco BBL); koloniju skaitīšanas agars (Difco BBL).
8
Uzsējumi inkubēti 370 C temperatūrā 72 stundas, kontrolējot un analizējot izaugušās kolonijas ik pēc 24 stundām.
Tālākai koloniju identificēšanai lietotas selektīvās barotnes: Mannitola sāļu agars (Difco BBL); KF (Kennera fekālais) streptokoku agars (Difco BBL); dažādas Hisa cukuru barotnes. Izaugušajām kolonijām veikti indola, oksidāzes un katalāzes testi. Lai konstatētu mikroorganismu formu, 18 – 24 stundas gaļas peptona
buljonā audzētas mikroorganismu tīrkultūras krāsotas pēc Grama metodes un mikroskopētas.
Baktērijas līdz sugu līmenim noteiktas ar BBL Becton Dickenson firmas Crystal grampozitīvo un gramnegatīvo baktēriju identifikācijas sistēmu, kurā iekļauti vairāku substrātu fermentācijas, oksidācijas un hidrolīzes testi. Baktērijas identificēja, salīdzinot iegūtos reakciju rezultātus ar datu bāzē esošajiem.
Staphylococcus ģints mikroorganismu izolēšanai un identificēšanai lietotas sekojošas barotnes: Bairda - Parkera agars; Mannitola sāļu agars; barojošais agars ar 5% liellopu asins piedevu. Noslēdzošai S. aureus apstiprināšanai tika lietots Pastorex Staph Plus
tests (Bio Rad, Francija). Citas Staphylococcus ģints sugas tika identificētas, izmantojot BBL
Crystal grampozitīvo mikroorganismu identifikācijas sistēmu. S. aureus un KoNS skaita statistiskai novērtēšanai un salīdzināšanai,
tas iedalīts nosacītās grupās: līdz 500 kvv ml-1; no 501 līdz 2 000 kvv ml-1; no 2 001 līdz 5 000 kvv ml-1; no 5 001 līdz 10 000 kvv ml-1; vairāk kā 10 000 kvv ml-1. Somatisko šūnu skaits piena paraugos noteikts AS “Siguldas ciltslietu
un mākslīgās apsēklošanas stacijas” akreditētā piena kvalitātes laboratorijā, saskaņā ar LVS EN ISO 13366-3:1997 “Piens. Somatisko šūnu skaita noteikšana – 3.daļa. Fluora-opto-elektroniskā metode”, izmantojot iekārtu “Somacount 300”.
Datu apstrāde veikta, izmantojot SPSS programmu paketi SPSS 11.0. un MS EXCEL rīku Regression.
Lai izvērtētu faktoru “produktivitāte”, “veselības stāvoklis”, “no piena paraugiem izolēto mikroorganismu suga” un “izolēto stafilokoku skaits” ietekmi uz somatisko šūnu skaitu paraugos, izmantota daudzfaktoru dispersijas analīze ANOVA.
9
PĒTĪJUMU REZULTĀTI UN DISKUSIJA
1. Veselu govju piena mikroflora
No veselu govju bakterioloģiski pozitīviem piena paraugiem izolētās mikroorganismu dzimtas, ģintis, sugas un to asociācijas apkopotas 1. tabulā.
1. tabula
Izolētie mikroorganismi no veselu govju piena Izolētie mikroorganismi n %
KoNS 104 56.2 Micrococcus spp. un Aerococcus spp. asociācijas
26 14.1
S. aureus 18 9.7 Aerococcus spp. 16 8.7 S. aureus un KoNS asociācijas 14 7.6 Enterobacteriaceae dzimta 6 3.2 Bacillus spp. 1 0.5 Mikroorganismi netika izolēti 11 0 Kopā 196 100
Ja Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus ģintis un Enterobacteriaceae
dzimtas pārstāvji literatūrā (Королева, Семенихина, 1980; Robinson, 1990; Mantere-Alhonen, 1995) minēti kā pienam raksturīgas mikrofloras veidotāji, tad Aerococcus ģints netiek minēta. 16 (8.7 %) gadījumos aerokoki izolēti tīrkultūrā un 26 (14.1 %) gadījumos kopā ar mikrokokiem, kas liecina, ka šo mikroorganismu izolēšanai no piena nav gadījuma raksturs.
No veselu govju piena paraugiem 96.3 % gadījumu izolēti grampozitīvie koki un to asociācijas (Staphylococcus, Micrococcus, Aerococcus ģintis), bet tikai 3.7 % gadījumu citi mikroorganismi, t.sk., 3.2 % gramnegatīvie Enterobacteriaceae dzimtas mikroorganismi. Šie rezultāti apliecina, ka grampozitīvās baktērijas ir izturīgākas kā gramnegatīvās baktērijas pret tesmeņa un pupu apkopšanai lietotajiem dezinfekcijas līdzekļiem (Воротинцева, Мазанкова, 2001) un tām, īpaši stafilokokiem, ir receptori, kas ļauj piestiprināties epitēlija šūnām pupa kanālā (Myllys et.al., 1995). Bez tam piena kontaminācija ar gramnegatīviem mikroorganismiem, galvenokārt Enterobacteriaceae dzimtas pārstāvjiem, notiek pienam saskaroties ar slaukšanas iekārtām, pienam plūstot pa cauruļvadiem, un uzglabāšanas tvertnēs. Zinot piena parauga noņemšanas veidu, šīs mikrofloras klātbūtne tiek izslēgta.
Analizētajos piena paraugos no grampozitīvo koku ģintīm visplašāk pārstāvēta Staphylococcus ģints (76.4 %) (1. att.).
10
9.0 %14.6 % 13.2 %
10.3 %
76.5 %76.4 %Staphylococcus spp. KoNSMicrococcus spp. un Aerococcus spp. asociācija S. aureus
S.aureus un KoNS asociācijaAerococcus spp.
1.att. No veselu govju piena paraugiem izolēto grampozitīvo koku īpatsvars
2.att. S. aureus un KoNS procentuālās attiecības veselu govju piena paraugos
Tik plaša stafilokoku sastopamība pienā noteikti ir jāuzskata par risku piena patērētāju veselībai, jo Staphylococcus ģints sugas, īpaši S. aureus, ir viens no galvenajiem infekciju un intoksikāciju cēloņiem.
Pēdējo 10 – 20 gadu laikā literatūrā minētās atziņas par KoNS kā nosacītiem cilvēku patogēniem (Baird-Parker, 1990; Carter et. al., 1995), rosināja noskaidrot, kādas Staphylococcus ģints sugas pārstāvētas veselu govju pienā. Veicot izolēto stafilokoku tālāku identifikāciju, iegūti rezultāti, kas atspoguļoti 2. attēlā.
Veselu govju pienā prevalē KoNS. S. aureus izolēts 5.8 reizes retāk nekā citas Staphylococcus ģints sugas. S. aureus un KoNS asociācijas izolētas 14 (10.3 %) gadījumos, kas norāda uz dažādu Staphylococcus sugu spēju apvienoties asociācijās un, iespējams, veidot bioplēvi, kas pasargā šos mikroorganismus no apkārtējās vides faktoru iedarbības, tā ļaujot tiem vairoties un kolonizēt tesmeņa audus.
Daļa (n = 83) no veselu govju piena izolētiem KoNS tika identificēti līdz sugai. Sugu spektrs atspoguļots 2. tabulā.
2. tabula Koagulāzes negatīvo stafilokoku sugas veselu govju piena paraugos
Izolētās stafilokoku sugas n % S. haemolyticus 26 31.3 S. simulans 15 18.2 S. xylosus 12 14.5 S. caprae 7 8.4 S. schleiferi subsp. schleiferi 6 7.2 S. kloosii 6 7.2 S. saprophyticus 4 4.8 S. cohnii subsp. urealyticum 4 4.8 S. gallinarum 3 3.6 Kopā 83 100.0
11
Kopumā konstatētas 9 dažādas KoNS sugas. Sešas no izolētajām - S. haemolyticus, S. simulans, S. xylosus, S. caprae, S. cohnii, S. saprophyticus - literatūrā tiek minētas kā svaiga piena kontaminanti (Botha, Brand, 1988; Harvey, Gilmour, 1995). Pētījumā izolētās S. gallinarum (3.2 %), S. schleiferi subsp. schleiferi (7.2 %) un S. kloosii (7.2 %) nav minēti kā svaiga piena kontaminanti, tomēr šo sugu atkārtota izolēšana liecina par to atrašanos govs apkārtējā vidē un iespēju nokļūt piena dziedzeros. Tā S. gallinarum var tikt izolēts no mājputniem, S. kloosii no cūkām, S. schleiferi no suņiem (Balows et.al., 1991). Visi šie dzīvnieki ir saistīti ar kūts vidi, tāpēc nav izslēgta iespēja KoNS nonākšanai govju piena dziedzeros.
Visbiežāk izolētās sugas – S. haemolyticus (31.3 %), S. simulans (18.2 %) un S. xylosus (14.5 %) - ir minētas arī kā subklīnisku un klīnisku govju mastītu ierosinātājas (Jefrey, 1984; Tuteja, Kapur, 1995; Waage et.al., 1999). Tas norāda, ka, lai gan mikroorganismi nav izraisījuši ievērojamu somatisko šūnu skaita pieaugumu pienā [ x ± S x = (130 ± 7) ·103 šūnas ml-1], tomēr, govs organisma imūnsistēmas aizsargspējām samazinoties, iespējams tesmeņa audu iekaisums.
S. haemolyticus ir visbiežāk cilvēkiem infekcijas izraisošā KoNS suga, kas tikusi izolēta septicēmijas, peritonīta, urīntrakta un brūču infekciju gadījumos. Arī S. schleiferi ir cilvēkam nosacīti patogēna suga, kas izolēta brūču infekciju, sepses gadījumos un var inficēt implantus, tādējādi radot pēcoperāciju iekaisumus. S. simulans, S. cohnii un S. xylosus reti, tomēr tiek izolētas infekciju gadījumos (Balows et al., 1991).
Līdz ar to termiski neapstrādāta, koagulāzes negatīvos stafilokokus saturoša govs piena lietošana cilvēku uzturā ir ne tikai nevēlama, bet var būt arī bīstama.
2. Ar subklīnisku un klīnisku mastītu slimojošu govju tesmeņa sekrēta mikroflora
No subklīniski un klīniski slimojošu govju bakterioloģiski pozitīviem
sekrēta paraugiem izolēto mikroorganismu dzimtas, ģintis, sugas un to asociācijas apkopotas 3. tabulā.
Ar subklīnisku mastītu slimu govju tesmeņa sekrēta paraugos visbiežāk sastopami grampozitīvie koki. Arī Somijā, Zviedrijā un Norvēģijā vairāk kā 95 % subklīnisko mastītu ierosina šie mikroorganismi (Pyōrālā; 1995). Cita mikroflora (gramnegatīvās nūjiņas no Citrobacter ģints, grampozitīvās nūjiņas no Bacillus un Corynebacterium ģintīm, mikroskopiskās sēnes ) izolēta 13 (4.3 %) paraugos.
12
3. tabula No subklīniski un klīniski slimojošu govju tesmeņa sekrēta paraugiem
izolētie mikroorganismi Subklīnisks mastīts Klīnisks mastīts Izolētie
mikroorganismi n % n % Staphylococcus spp. 229 74.1 41 48.2 Aerococcus spp. un Micrococcus spp. asociācijas
35 11.3 - -
Streptococcus spp. 25 8.1 29 34.1 Aerococcus spp. 7 2.2 2 2.4 Bacillus spp. 4 1.3 - - Mikroskopiskās sēnes 4 1.3 - - Citrobacter spp. 3 1.0 - - Corynebacterium spp. 2 0.7 - - Enterobacteriaceae dzimta - - 10 11.8 Aeromonas hydrophila - - 3 3.5 Mikroorganismi netika izolēti 2 0 2 0 Kopā 311 100.0 87 100.0
Arī ar klīnisku mastītu slimu govju tesmeņa sekrētā prevalē
grampozitīvie koki no Staphylococcus, Streptococcus un Aerococcus ģintīm. Biežāk kā subklīnisku mastītu gadījumos no sekrēta tika izolēti Enterobacteriaceae dzimtas mikroorganismi (t.sk., Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli) - 10 (11.8 %) gadījumos (3. tabula).
No grampozitīvo koku ģintīm visbiežāk izolēti Staphylococcus ģints mikroorganismi – 229 (74.1 %) subklīnisku un 41 (48.2 %) klīnisku mastītu gadījumos (3. tabula).
Iegūtie dati liecina, ka Staphylococcus ģints mikroorganismi ir prevalējošie kā subklīnisko, tā klīnisko mastītu ierosinātāji. Savukārt Streptococcus ģints sugas, t.sk., Streptococcus agalactiae un Streptococcus uberis, kas pagājušā gadsimta piecdesmitajos un sešdesmitajos gados bija galvenie mastītu patogēni (Myllys et al., 1995; Mozgis, 1997), pētījumā no subklīniski slimojošu govju tesmeņa sekrēta izolēti 9.2, bet no klīniski slimojošu govju tesmeņa sekrēta 1.4 reizes retāk kā Staphylococcus ģints pārstāvji. Tātad arī Latvijā tāpat kā citās zemēs, modernizējot piena ieguvi, ir novērojama prevalējošo tesmeņa iekaisumu ierosinātāju nomaiņa no Streptococcus ģints uz Staphylococcus ģints mikroorganismiem.
Staphylococcus ģints sugu īpatsvars atspoguļots 3. un 4. attēlā.
13
8.3 %
57.6 %34.1 %
4.9 %
39.0 %56.1 %
S. aureus KoNS un S. intermediusKoNS un S. intermedius S. aureus
S. aureus un KoNS asociācijasS. aureus un KoNS asociācijas
3. att. Staphylococcus ģints sugu procentuālās attiecības ar subklīnisku mastītu slimu govju tesmeņa sekrētā
4. att. Staphylococcus ģints sugu procentuālās attiecības ar klīnisku mastītu slimu govju tesmeņa sekrētā
No Staphylococcus ģints mikroorganismiem subklīnisku mastītu gadījumos
prevalē S. aureus (3. att). Iegūtie rezultāti sasaucas ar Burģeles u.c. (1996), Moretti et al. (1998), Javed-Igbal, Siddique (1999), Ameh et al. (1999) atziņām, ka S. aureus ir galvenais visbiežāk izolētais subklīnisko mastītu ierosinātājs.
Augstais izolēto KoNS un S. intermedius īpatsvars (3., 4. att.) liecina par šo mikroorganismu patogenitāti un spēju ierosināt subklīniskus un klīniskus tesmeņa iekaisumus. Cilvēkiem KoNS infekcijas bieži saistītas ar organismā ievietotiem implantiem. Tā kā slaukšanas stobriņi līdzīgi kā implanti sastāv no gumijas un dažādiem organiskiem materiāliem un tos nevar izmazgāt, lietojot centralizēto mazgāšanu, tad KoNS uz šo stobriņu virsmas adaptējas augšanai pienā, kļūstot virulentāki, piemēram, veidojot bioplēvi, kurā veģetatīvās šūnas pārklātas ar polisaharīdu slāni. Kad šādi mikroorganismi nokļūst govs tesmenī, tie spēj vieglāk adaptēties vidē, izvairīties no organisma imūnsistēmas darbības, vairoties un izsaukt piena dziedzeru audu iekaisumu, ko atzīst arī Myllys et al. (1995).
Dažādas stafilokoku sugas (bez S. aureus), kas izolētas no slimojošu govju tesmeņa sekrēta apkopotas 4. tabulā.
Ar subklīnisku mastītu slimu govju tesmeņa sekrētā konstatētas septiņas KoNS sugas. No tām – S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. simulans, S. xylosus - izolētas arī no veselu govju piena paraugiem, kas varētu liecināt par šo mikroorganismu celmu heterogenitāti un atšķirīgo virulenci. Citas sugas – S. capitis, S. epidermidis, S. vitulus - izolētas tikai no subklīniski slimojošu govju tesmeņa sekrēta paraugiem. Visas izolētās stafilokoku sugas, izņemot S. vitulus, minētas kā mastītu ierosinātājas dažādu autoru darbos (Hummel, Lehmann, 1994; Myllys, 1995; Waage et al., 1999). Savukārt ar klīnisku mastītu slimu govju tesmeņa sekrētā konstatētas tikai divas KoNS sugas – S. haemolyticus un S. kloosii (4. tab.).
14
4. tabula Stafilokoku sugas ar subklīnisku un klīnisku mastītu slimojošu govju
tesmeņu sekrēta paraugos Subklīnisks mastīts Klīnisks mastīts Izolētās stafilokoku sugas
n % n % S. haemolyticus 37 47.4 15 65.2 S. simulans 8 10.3 - - S. xylosus 8 10.3 - - S. capitis 8 10.3 - - S. intermedius 6 7.7 6 26.1 S. saprophyticus 5 6.4 - - S. epidermidis 5 6.4 - - S. vitulus 1 1.2 - - S. kloosii - - 2 8.7 Kopā 78 100.0 23 100.0
Koagulāzes pozitīvais S. intermedius, kas šajā pētījumā izolēts 6 (7.7 %)
subklīnisku un 6 (26.1 %) klīnisku mastītu gadījumos, ir nozīmīgs patogēns, kas govīm ierosina ne tikai mastītus, bet dažādas citas infekcijas kā piodermas, abscesus, dzimumsistēmas iekaisumus, brūču infekcijas (Balows et al., 1991).
Visbiežāk no subklīniski un klīniski slimojošu govju tesmeņa sekrēta tika izolēts S. haemolyticus (4. tab.). Citu autoru domas par visbiežāk sastopamajām, govju mastītos iesaistītajām KoNS sugām ir atšķirīgas. Kudinha un Simango (2002) subklīnisku mastītu gadījumos visbiežāk izolējuši S. chromogenes, S. epidermidis, S. hominis. Chaffer et al. (2000) visbiežāk identificējuši S. chromogenes un S. haemolyticus. Savukārt Honkanen-Buzalski (1995) pētījumos visbiežāk tika izolēts S. hyicus, bet Waage (1999) - S. simulans. Līdz šim Latvijā veiktie pētījumi uzrāda S. epidermidis kā biežāk izolēto mastītus ierosinošo KoNS sugu (Burģele, 1996).
Waage et al. (2000), Hummel un Lehmann (1994) domas par biežāk klīnisku mastītu gadījumos izolētiem KoNS dalās. Waage et al. (2000) min S. simulans, S. hyicus un S. chromogenes, savukārt Hummel un Lehmann (1994) no klīniski slimojošu govju tesmeņa sekrēta visbiežāk izolējuši S. xylosus, S. simulans, S. haemolyticus un S. chromogenes.
No klīniski slimojošu govju tesmeņa sekrēta šajā pētījumā izolētais S. kloosii literatūrā nav minēts kā klīnisku mastītu izsaucējs.
Ņemot vērā, ka subklīniskos mastītus govīm ne vienmēr izdodas identificēt un ne visos gadījumos slimība noris ar paaugstinātu SŠS pienā, tad patērētājs, pirmkārt, nav pasargāts no inficēšanās ar patogēniem mikroorganismiem, otrkārt, piena ķīmiskā sastāva izmaiņas traucē patērētājam saņemt pilnvērtīgu produktu un pārstrādātājiem kvalitatīvu izejvielu produktu ražošanai.
15
Pieaugot termiski neapstrādāta piena realizācijai, patērētājs nevar būt drošs par savu veselību.
3. Veselu govju piena un slimu govju tesmeņa sekrēta
mikrofloras salīdzinājums
Salīdzinot aseptiski noņemtu veselu govju piena paraugu un subklīniski un klīniski slimu govju tesmeņa sekrēta paraugu mikrofloru, var secināt, ka procentuāli visos gadījumos dominēja grampozitīvo koku sugas no Aerococcus, Micrococcus, Staphylococcus un Streptococcus ģintīm. Iegūtie rezultāti ļauj secināt, ka minēto ģinšu mikroorganismi ir visbiežāk sastopamie piena kontaminanti, kas tajā nokļūst slaukšanas laikā, pienam plūstot cauri pupa kanālam un pupa atverei. Tajā pat laikā grampozitīvie mikroorganismi ir subklīnisku un klīnisku tesmeņa iekaisumu ierosinātāji. Šie mikroorganismi atrodas govs apkārtējā vidē – gaisā uz putekļu daļiņām, pakaišos, barībā, uz govs apmatojuma un ādas, uz slaukšanas iekārtu virsmām, tad tie viegli var nokļūt pupa kanālā. Kaut arī pupa kanāls ir fizikāla un imunoloģiska barjera tajā iekļuvušajiem mikroorganismiem, jo ap Furstenberga rozeti koncentrējas limfocīti un asins plazmas šūnas, tomēr daļa mikroorganismu adaptējas, spēj pretoties izskalošanas efektam slaukšanas laikā, vairojas un saglabājas pupa kanālā (Sandholm, Korhonen, 1995).
Lai gan kūts vidē, īpaši dzīvnieku fekālijās un pakaišos, atrodas gramnegatīvās Escherichia spp., Enterobacter spp., Klebsiella spp., Salmonella spp., Shigella spp. u.c. baktērijas, tomēr aseptiski ņemtu veselu govju piena paraugos, kā arī ar subklīnisku un klīnisku mastītu slimu govju tesmeņa sekrēta paraugos gramnegatīvās baktērijas konstatētas, attiecīgi, 3.2 %, 1.0 % un 11.7 % gadījumu. Paraugu noņemšanas veids mazināja šo sugu klātbūtni pienā.
Salīdzinoši vairāk gramnegatīvo mikroorganismu (Escherichia coli – 5.8 %, Klebsiella oxytoca un Klebsiella pneumoniae – 4.7 %, citi Enterobacteriaceae dzimtas mikroorganismi – 1.2 %) tika izolēts ar klīnisku mastītu slimojošu govju sekrēta paraugos. Sandholm un Pyōrālā (1995) skaidro, ka minētie mikroorganismi, kurus parasti sauc par koliformām, nespēj kolonizēt pupa kanālu un ilgstoši izdzīvot piena dziedzera audos, kā tas ir ar Staphylococcus ģints pārstāvjiem. Tomēr šo mikroorganismu izdalītie endotoksīni izsauc krasu govs organisma imūnsistēmas atbildes reakciju, kas izpaužas smagās klīniskās pazīmēs. Myllys et al. (1995) uzsver, ka gramnegatīvo mikroorganismu infekcijas ir klīniskas un īslaicīgas.
16
Kā veselu govju pienā, tā ar subklīnisku un klīnisku mastītu slimu govju sekrētā prevalējoši ir Staphylococcus ģints mikroorganismi. Identificējot Staphylococcus ģints sugas, iegūti rezultāti, kas atspoguļoti 5. attēlā.
13.2
76.5
10.3
0
20
40
60
80
%
57.6
34.1
8.3
39.0
56.1
4.9
vesela subklīniskais mastīts klīniskais mastīts
S. aureus KoNS S. aureus un KoNS asociācija
5. att. Staphylococcus ģints sugu procentuālās attiecības piena un slimu govju tesmeņa sekrēta paraugos
Veselu govju pienā dominē KoNS (76.5 %), ar subklīnisku mastītu
slimojošu govju tesmeņa sekrētā S. aureus (57.6 %), bet ar klīnisku mastītu slimojošu govju tesmeņa sekrētā dažādas KoNS sugas (56.1 %).
Iegūtie rezultāti sakrīt ar Myllys et al. (1995) pētījumos iegūtajām atziņām, ka, sākot ar pagājušā gadsimta septiņdesmitajiem gadiem, pakāpeniski pieaug KoNS izolēšanas biežums no veselu govju piena un ar mastītu slimojošu govju tesmeņa sekrēta. Pie tam notikusi tesmeņa ierosinātāju sugu spektra maiņa no Streptococcus agalactiae uz S. aureus un KoNS. Intensificējot lopkopību, tiek veidotas aizvien produktīvākas govju šķirnes, bieži neņemot vērā to rezistenci pret slimībām. Govju slaukšanu ar rokām nomainījusi mehanizēta slaukšana, fermās ir ieviesta pupu dezinfekcija pirms un pēc slaukšanas, govju mastītu profilaksei praktizēta cietstāvēšanas perioda antibiotiku terapija. Šie pasākumi sekmējuši nosacīti patogēnās mikrofloras populācijai kļūt heterogēnai, mainīgai, agresīvākai, par ko liecina iegūtie rezultāti, proti, 34.1 % ar subklīnisku un 56.1 % ar klīnisku mastītu slimojošu govju sekrēta paraugi saturēja nosacīti patogēnos KoNS.
Patogēno S. aureus izolēja no 57.6 % ar subklīnisku un 39.0 % ar klīnisku mastītu slimojošu govju sekrēta paraugiem, kas liecina par vēl aizvien nozīmīgo S. aureus lomu govju piena dziedzeru iekaisumu ierosināšanā.
17
4. S. aureus un KoNS skaits pienā un slimu govju tesmeņa sekrētā
Analizējot S. aureus skaitu piena un sekrēta paraugos,
konstatēja, ka vidējais S. aureus skaits bija būtiski atšķirīgs veselu govju piena paraugos, salīdzinot ar subklīnisku (p < 0.01) un klīnisku (p < 0.01) mastītu slimojošu govju sekrēta paraugiem, bet būtiski neatšķīrās ar klīnisku un subklīnisku mastītu slimojošu govju sekrēta paraugos (p > 0.05).
S. aureus skaita statistiskie rādītāji dažādos paraugos atspoguļoti 6. attēlā.
140 160 9008 800
103 400
21 000
020000400006000080000
100000120000
kvv
ml-1
11 2007 9001 800
min max vidējaisvesela subklīnisks mastīts klīnisks mastīts
6. att. S. aureus skaits piena un sekrēta paraugos
Stafilokoku zemais minimālais skaits arī subklīniski un klīniski slimojošu govju sekrētā (attiecīgi, 160 un 900 kvv ml-1), kā arī augstais (8 800 kvv ml-1) maksimālais stafilokoku skaits veselu govju pienā izskaidrojams ar S. aureus celmu atšķirīgo virulenci un govju organisma imūnsistēmas pretošanās spēju iekļuvušajiem mikroorganismiem. Virulences faktori - piestiprināšanās spēja jutīgo šūnu receptoriem, audu kolonizācijas un fagocitozes nomākšanas spēja, eksofermentu un dažādu veidu toksīnu producēšana - ir atšķirīgi dažādiem S. aureus celmiem (Борисов, 2002), un līdz ar to dažāda ir šo celmu spēja ierosināt infekcijas procesu.
83.3 % gadījumu S. aureus veselu govju pienā bija līdz 2 000 kvv ml-1,
kamēr ar subklīnisku mastītu slimu govju sekrētā 82.4 % un ar klīnisku mastītu slimu govju sekrētā 75.0 % gadījumu S. aureus skaits pārsniedza 2 000 kvv ml-1.
Līdzīgi kā S. aureus izolēšanas gadījumos, KoNS skaits bija būtiski atšķirīgs veselu govju piena un ar klīnisku (p < 0.01) un subklīnisku (p < 0.01) mastītu slimojošu govju sekrēta paraugos, bet būtiski neatšķīrās ar klīnisku un subklīnisku mastītu slimojošu govju sekrēta paraugos (p > 0.05).
18
Minimālais KoNS skaits veselu govju piena un ar subklīnisku un klīnisku mastītu slimojošu govju sekrēta paraugos bija līdzīgs, attiecīgi, 20, 30 un 100 kvv ml-1 (7. att.)
20 30 100
14 500 15 00014 000
700
3 3005 400
0
5000
10000
15000
kvv
ml-1
min max vidējaisvesela subklīnisks mastīts klīnisks mastīts
7. att. KoNS skaits piena un sekrēta paraugos
Iegūtie rezultāti liecina par dažādu KoNS sugu atšķirīgo virulenci. Ja iepriekš šo mikroorganismu grupu dēvēja par “vides stafilokokiem” un neuzskatīja par mastītu ierosinātājiem (Honkanen – Buzalski, Seuna, 1995), tad biežā to izolēšana pētījumā no subklīniski un klīniski slimojošu govju sekrēta liecina par iespējamo dažu stafilokoku sugu augsto patogenitātes pakāpi, kuras rezultātā pat neliels šo mikroorganismu skaits izsauc govs organisma imūnsistēmas atbildes reakciju un infekcijas procesa veidošanos.
Arī maksimālais KoNS skaits bija līdzīgs – 14 500 kvv ml-1 veselu govju pienā, 15 000 kvv ml-1 ar subklīnisku un 14 500 kvv ml-1 ar klīnisku mastītu slimu govju sekrētā (7. attēls). Iespējams, ka S. caprae, S. gallinarum, S. cohnii subsp. urealyticum un S. schleiferi subsp. schleiferi, kuras izolētas tikai no veselu govju piena, nespēj tām ierosināt infekcijas procesu. Savukārt pārējo KoNS sugu (S. haemolyticus, S. simulans, S. xylosus, S. kloosii, S. saprophyticus) celmi, kuri izolēti gan no veselu govju piena, gan ar subklīnisku un klīnisku mastītu slimojošu govju sekrēta, varētu būt ar atšķirīgu patogenitātes pakāpi.
Līdzīgi kā S. aureus izolēšanas gadījumos, arī KoNS veselu govju pienā 96.3 % gadījumu nepārsniedza 2 000 kvv ml-1, bet ar subklīnisku mastītu un klīnisku mastītu slimu govju tesmeņa sekrēta paraugos to skaits, attiecīgi 47.4 % un 69.6 % gadījumu, pārsniedza 2 000 kvv ml-1.
5. S. aureus, KoNS un to asociāciju saistība ar somatisko šūnu skaitu pienā un slimu govju tesmeņa sekrētā
SŠS ir viens no piena kvalitātes rādītājiem. Augsts SŠS izmaina piena
ķīmisko sastāvu, kā arī atspoguļo govs tesmeņa veselības stāvokli, brīdinot par iespējamo ganāmpulka inficēšanos ar mastītu ierosinātājiem. 5. tabulā
19
apkopoti SŠS rādītāji veselu govju pienā, ar subklīnisko un klīnisko mastītu slimojošu govju tesmeņu sekrētā.
5. tabula
Vidējais somatisko šūnu skaits paraugos ar atšķirīgiem izolētiem mikroorganismiem (SŠS · 103 šūnu ml-1)
Vesela govs Subklīniskais mastīts Klīniskais mastīts Izolētais mikroorganisms n n n x x x ± S ± S ± S x x x
S. aureus 18
160 ± 30 132 1 580 ± 130 16 1 990 ± 310
KoNS un S. intermedius
104 130 ± 10 78 980 ± 90 23 1 950 ± 240
S. aureus un KoNS asociācijas
14
70 ± 20 19 1 520 ± 290 2 6 100 ± 50
No veselu govju piena paraugiem izolējot S. aureus (n = 18), KoNS
(n = 104), S. aureus un KoNS sugu asociācijas (n = 14), vidējais somatisko šūnu skaits tajā nebija augstāks par 160 · 103 ml-1 (5. tabula). Tas liecina, ka Staphylococcus ģints mikroorganismi ir govju pienam raksturīgas mikrofloras veidotāji, kas ne vienmēr ierosina infekcijas procesu.
Izolējot S. aureus atsevišķi un asociācijā ar KoNS no subklīniski slimojošu govju tesmeņa sekrēta, SŠS bija līdzīgs, attiecīgi, 1 580 · 103 un 1 520 · 103 šūnu ml-1. Tesmeņa sekrētos, no kuriem izolēja dažādas KoNS sugas, vidējais SŠS bija zemāks un sasniedza 980 · 10-3 šūnu ml-1. Rezultātus apstiprina literatūrā minētās atziņas, ka KoNS ierosina somatisko šūnu skaita paaugstināšanos mazākā pakāpē, kā patogēnie S. aureus un Streptococcus agalactiae (Dohoo, Leslie, 1987; Ariznabarreta et al., 2002).
Klīnisku mastītu gadījumos vislielākais vidējais SŠS pieaugums bijis gadījumos, kad no tesmeņa sekrēta izolētas S. aureus un KoNS sugu asociācijas (6 100 · 103 šūnu ml-1). Vidējais SŠS pieaugums gadījumos, kad izolēti S. aureus asociācijās ar dažādām KoNS sugām un S. intermedius, bijis, attiecīgi, 1 990 · 103 un 1 950 · 103 šūnu ml-1 (5. tabula).
Konstatēts, ka S. aureus un KoNS asociācijas klīnisku mastītu gadījumos izraisījušas 4 reizes, KoNS un S. intermedius – 1.9 reizes, bet S. aureus – 1.2 reizes lielāku SŠS pieaugumu kā subklīnisku mastītu gadījumos. Var secināt, ka klīnisko mastītu gadījumos vienas ģints mikroorganismi izsaukuši krasāku organisma imūnsistēmas atbildes reakciju, salīdzinot ar subklīnisku mastītu gadījumiem, kas izskaidrojams ar mikroorganismu atšķirīgo virulenci.
Izvērtējot SŠS sekrēta paraugos (subklīnisks mastīts) ar dažādu stafilokoku skaitu, jāsecina, ka tas ir būtiski atšķirīgs (p < 0.01).
20
Būtiski atšķīrās SŠS sekrētā, ja S. aureus skaits bija līdz 500 kvv ml-1, salīdzinot ar sekrēta paraugiem, kuros S. aureus skaits pārsniedza 500 kvv ml-1. Noskaidrots, ka S. aureus skaits virs 500 kvv ml-1 ierosina ievērojamu SŠS pieaugumu, turpretīm stafilokoku skaitam pieaugot līdz 10 000 kvv ml-1 un vairāk, SŠS sekrētā vairs būtiski nepalielinājās.
Sakarība starp SŠS un S. aureus skaitu subklīniski slimojošu govju sekrētā parādīta 8. attēlā.
8. att. Sakarība starp SŠS un S.aureus skaitu sekrētā
8. attēlā redzamo sakarību starp SŠS un S. aureus skaitu sekrētā apraksta vienādojums
y = 0.0003x + 1568637; R2 = 0.002 (p > 0.05).
Tas liecina, ka mazāk kā 1 % no somatisko šūnu skaita izmaiņām sekrētā var izskaidrot ar S. aureus skaitu. Redzam, ka, palielinoties S. aureus skaitam sekrētā, SŠS skaits nepaaugstinās. Savukārt augstas SŠS vērtības novērojamas arī pie zema S. aureus skaita.
Šie dati sasaucas ar Shoshani u.c. (2000) pētījumiem, kas norāda, ka S. aureus skaits sekrētā mastīta gadījumā ir svārstīgs un netiek novērotas īpašas sakarības starp stafilokoku skaitu un SŠS sekrētā.
KoNS sugu izolēšanas gadījumā SŠS sekrētā variē šaurākās robežās kā S. aureus izolēšanas gadījumos, proti, no 510 līdz 1 250 · 103 šūnu ml-1. Statistiski būtiski atšķīrās SŠS subklīniski slimojošu govju sekrētā, ja KoNS skaits bija līdz 500 kvv ml-1, salīdzinot ar sekrēta paraugiem, kuros šo mikroorganismu skaits bija no 500 līdz 5 000 kvv ml-1 (p < 0.05). Tālāks KoNS skaita pieaugums sekrētā SŠS būtiski nepaaugstināja (p > 0.05). Var secināt, ka KoNS ierosinātā infekcijas procesā ir svarīgs ne tik daudz stafilokoku skaits sekrētā, cik to virulence. Šī atziņa nav pretrunā ar literatūras datiem, kuros uzsvērts, ka KoNS sugas ir ar atšķirīgu patogenitātes pakāpi, minot S. hyicus kā patogēnāko no tām (Myllys, 1995).
0
1 0 0 0 0
2 0 0 0 0
0 2 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0
S Š S , m l - 1
S.au
reus
, kvv
ml-1
3 0 0 0 0
4 0 0 0 0
5 0 0 0 0
6 0 0 0 0y = 0 . 0 0 0 3 x + 1 5 6 8 6 3 7
R 2 = 0 . 0 0 2
21
Minēto atziņu apstiprina arī 9. attēlā parādītā sakarība starp SŠS un KoNS skaitu subklīniski slimojošu govju sekrētā.
9. att. Sakarība starp SŠS un
KoNS skaitu ar subklīnisku mastītu slimojošu govju tesmeņu sekrētā
10. att. Sakarība starp SŠS un KoNS skaitu ar klīnisku mastītu slimojošu govju tesmeņu sekrētā
9. attēlā redzamo sakarību starp SŠS un KoNS skaitu sekrētā apraksta vienādojums
y = 0.0002x + 3417.3; R2 = 0.001 (p > 0.05).
Līdzīgi kā S. aureus izolēšanas gadījumos, SŠS praktiski nemainās, ievērojami pieaugot KoNS skaitam. Vidējais SŠS ar klīnisku mastītu slimu govju tesmeņa sekrēta paraugos variē no 970 līdz 3 000 · 103 šūnu ml-1, tomēr datu statistiskā analīze parāda, ka nav būtiskas atšķirības starp vidējām SŠS vērtībām, atkarībā no izolēto S. aureus skaita ( p > 0.05). Vērojama tendence somatisko šūnu skaitam sekrētā pieaugt, S. aureus skaitam pārsniedzot 2 000 kvv ml-1. Iegūtie rezultāti varētu liecināt par to, ka klīniskos mastītus ierosina S. aureus celmi ar augstu virulences pakāpi un, to skaitam palielinoties virs 2 000 kvv ml-1, SŠS būtiski nemainās, govs organismā veidojas krasi izteiktas klīniskās pazīmes.
KoNS sugu izolēšanas gadījumā ar klīnisku mastītu slimojošu govju sekrēta paraugos SŠS variē šaurākās robežās. SŠS sekrētā ir 2 520 · 103 ml-1, kas ir 1.3 reizes augstāks kā līdzīga S. aureus skaita (10 000 kvv ml-1) izolēšanas gadījumā. Šī atziņa ir pretrunā ar vairāku autoru (Dohoo, Leslie, 1987; Saloniemi, 1995) uzskatiem, ka KoNS izsauc mērenāku govs imūnsistēmas atbildes reakciju nekā S. aureus.
Vidējais SŠS skaits ir būtiski atšķirīgs sekrēta paraugos ar KoNS skaitu no 501 līdz 2 000 kvv ml-1, salīdzinot ar paraugiem, kuros stafilokoku skaits bijis no 5 001 līdz 10 000 kvv ml-1 un vairāk (p < 0.05).
Iegūtie rezultāti parādīja, ka lielāks KoNS skaits izraisa govs imūnsistēmas krasāku atbildes reakciju, kas rezultējas SŠS pieaugumā.
y = 0,0002x + 3417.3R2 = 0.001
0
5000100001500020000
0 1E+06
2E+06
3E+06
4E+06
5E+06
SŠS, ml-1
KoN
S sk
aits
, kvv
ml-1
y = 0,0021x + 1224R2 = 0,2566
0
5
10000
15000
20000
0 2000000 4000000 6000000SŠS, ml-1
KoN
S sk
aits
, kvv
ml-1
000
22
10. attēlā parādīto sakarību starp SŠS un KoNS skaitu klīniski slimojošu govju sekrētā apraksta vienādojums
y = 0.0021x + 1224; R2 = 0.2566 (p < 0.05).
Tas liecina, ka ar KoNS skaita izmaiņām var izskaidrot 25 % no somatisko šūnu skaita izmaiņām sekrētā. Starp KoNS un SŠS skaitu klīniski slimojošu govju sekrētā pastāv vidēji cieša lineāra sakarība (r = 0.507), t.i., pieaugot KoNS skaitam, ievērojami pieaug arī SŠS sekretā.
6. Mikrofloras sastāvs un somatisko šūnu skaits termiski neapstrādātā pienā
Analizējot dažādās tirdzniecības vietās iegādātā termiski neapstrādātā
piena mikrobiālo piesārņotību, iegūtie rezultāti atspoguļoti 6. tabulā.
6. tabula Termiski neapstrādāta piena mikrobiālā piesārņotība
Piesārņotības rādītājs n Min Max ± S xx Kopējais baktēriju skaits, kvv ml-1
170
6 000 55 500 000 7 598 510 ± 899 350
S. aureus, kvv ml-1 57 30 10 000 1 320 ± 250 KoNS, kvv ml-1 162 30 14 000 2 770 ± 200 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, kvv ml-1
152 10 2 000 400 ± 30
Ministru kabineta 2004. gada 6. aprīļa noteikumi Nr. 251 “Piena un
piena produktu aprites noteikumi” nosaka, ka govs pienā, kuru paredzēts izplatīt, kopējo mezofīlo aerobo un fakultatīvi anaerobo baktēriju skaits nedrīkst pārsniegt 100 000 kvv ml-1. Pētījumā iegūtie rezultāti parāda, ka 94.1 % gadījumu (n = 170) mikrobiālā piesārņojuma līmenis varākkārt pārsniedz to, sasniedzot 55 500 000 kvv ml-1.
Iepriekšminētie noteikumi paredz, ka termiski neapstrādātu pienu drīkst pārdot tieši patērētājam, ja no pieciem pārbaudītiem piena paraugiem tikai divos paraugos S. aureus skaits ir robežās no m = 500 līdz M = 2 000 (m – minimālais S. aureus skaits kvv ml-1, pie kura rezultātu uzskata par apmierinošu; M – maksimālais S. aureus skaits kvv ml-1, pie kura rezultātu uzskata par neapmierinošu) un pārējos (n = 3) tas nedrīkst pārsniegt 500 kvv ml-1.
Vidējais S. aureus skaits bija 1 320 kvv ml-1, maksimālais sasniedza 10 000 kvv ml-1
un 14 jeb 24.6 % paraugu S. aureus skaits bija lielāks kā 2 000 kvv ml-1. Iegūtie rezultāti parāda, ka tirdzniecībā nokļūst ar mastītiem slimojošu govju piens, kā arī neatbilstošās temperatūrās uzglabāts piens, kurā stafilokoki sekmīgi
23
vairojas. Šāds piens nav drošs patērētāju veselībai, jo S. aureus producētie toksīni izsauc pārtikas toksikoinfekcijas.
KoNS konstatēti 95.3 % piena paraugu. Vidējais KoNS skaits bija 2 770 kvv ml-1, maksimālais sasniedza 14 000 kvv ml-1 (6. tab.). Tā kā ir pierādīta koagulāzes negatīvo S. hyicus un S. epidermidis spēja producēt toksīnus (Baird-Parker, 1990; Gilmour, Harvey, 1990) un S. simulans, S. xylosus, S. haemolyticus, S. lugdunensis u.c. nosacītā patoģenēze (BBL Crystal datu bāze), tad iespēja iegādāties tirdzniecības vietās drošu, veselībai nekaitīgu termiski neapstrādātu pienu vairumā gadījumu nav iespējama. Iegūtie rezultāti liek pārtikas apriti kontrolējošām institūcijām pieņemt lēmumu par papildus pasākumiem, noteikumiem tirdzniecībai ar termiski neapstrādātu pienu, kas paredzētu daudz biežāku S. aureus un arī KoNS sugu un to daudzuma kontroli pienā.
Enterococcus ģints mikroorganismu klātbūtne konstatēta 152 jeb 89.4 % paraugu. Vidējais fekālo streptokoku skaits bija 400, maksimālais skaits 2 000 kvv ml-1 (6. tab.). Enterokoki tāpat kā koliformas ir cilvēku un dzīvnieku zarnu trakta dabīgā mikroflora. To atrašanās pienā liecina par tā fekālo piesārņojumu (Королева, Семенихина, 1980). Iegūtie rezultāti parāda, ka piena ieguves, pirmapstrādes, uzglabāšanas un arī tirdzniecības laikā netiek ievēroti sanitāri higiēniskie noteikumi.
No izmeklējamā piena paraugiem izolēto gramnegatīvo mikroorganismu ģinšu procentuālais sastāvs atspoguļots 11. attēlā.
0
10
20
30
40
50
60
%
% 57,1 50,6 34,7 27,6 15,3 11,8 0,6
Enterobacter spp.
Hafnia spp. Citrobacter spp.
Proteus spp. Escherichia spp.
Klebsiella spp.
Salmonella spp.
11. att. No termiski neapstrādāta piena paraugiem izolēto gramnegatīvo mikroorganismu ģinšu procentuālais sastāvs
24
Visbiežāk (57.1 %) piena paraugos tika konstatētas Enterobacter ģints baktērijas, t.sk., Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes. Izolētie mikroorganismi ir nosacīti cilvēku patogēni.
Hafnia alvei (vienīgā Hafnia ģints suga) tika izolēta no 50.6 % paraugu.
Citrobacter ģints baktērijas, t.sk., Citrobacter freundii, tika izolētas no 34.7 % piena paraugu. Daudzos gadījumos Citrobacter ģints sugas izolētas no cilvēku organisma klīniskā materiāla, kas liecina par šo baktēriju patogēno dabu (Хоулт и др, 1997).
Proteus ģints baktērijas, t.sk., Proteus vulgaris un Proteus mirabilis tika izolētas 27.6 % gadījumu.
Escherichia ģints baktērijas, t.sk., Escherichia coli, tika izolētas no 15.3 % piena paraugu.
Klebsiella, t.sk., Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, tika izolētas 11.8 % gadījumu.
Salmonella ģints baktērijas tika izolētas 0.6 % gadījumu. Saskaņā ar normatīvajiem aktiem (Ministru Kabineta 2004. gada 6.
aprīļa noteikumi Nr. 251) termiski neapstrādātā pienā, ko realizē tirdzniecības vietās, Salmonella ģints baktēriju klātbūtne 1 ml produkta nav pieļaujama, ar salmonellām kontaminēts piens nedrīkstētu nonākt pārdošanā.
Iepriekš minēto gramnegatīvo mikroorganismu sugu klātbūtne pienā skaidrojama ar piena ieguves apstākļiem, t.i., sanitāro higiēnu fermās.
Salīdzinot kopējo mezofīlo aerobo un fakultatīvi anaerobo mikroorganismu skaitu tirdzniecībā esošam termiski neapstrādātam pienam, konstatēts, ka piesārņojuma līmenis laika posmā no 2000. – 2004. gadam strauji pieaug (7. tabula).
7. tabula
Kopējais mikroorganismu skaits termiski neapstrādātā piena paraugos, kvv ml-1
Gads n Ģeometriskais vidējais x ± S x 2000. 51 516 700 2 492 730 ± 107 400 2001. 29 746 800 2 929 380 ± 148 960 2003. 44 3 377 180 6 466 980 ± 957 360 2004. 46 17 000 000 22 000 000 ± 2 393 130
2004. gadā kopējais mezofīlo aerobo un fakultatīvi anaerobo
mikroorganismu skaits pienā vairākkārt pieaudzis, salīdzinot ar 2000., 2001. un 2003. gadu. Līdz ar stingrākām piena kvalitātes prasībām, kas izvirzītas, pieņemot to pārstrādes uzņēmumos, zemnieki, kas nespēj piemēroties un izpildīt šīs prasības, savu produkciju realizē tirgū. Tādēļ
25
piena mikrobiālā kvalitāte pazeminās, kas ir piena patērētāju veselību apdraudoša tendence.
Iemesls augstajam mikroorganismu kopskaitam pienā var būt nepareiza piena atdzesēšana pēc izslaukšanas vai arī piemērotu dzesēšanas iekārtu trūkums un neatbilstoša uzglabāšanas temperatūra tirgošanas vietās. Kā liecina I. Ciprovičas pētījumi (1997), līdz 10 0C temperatūrai atdzesētā pienā mikroorganismu daudzums 58 reizes pārsniedz līdz 3.8 0C temperatūrai atdzesēta piena mikroorganismu daudzumu, sasniedzot vairākus miljonus kvv ml-1.
Tirdzniecības vietās termiski neapstrādātā piena tirgošanas laikā kannas netiek turētas aukstumvitrīnās, bet gan tirdzniecības zālē, tad augstais mikroorganismu skaits un tā pieaugums pienā ir likumsakarīgs. Pie tam istabas temperatūra ir pietiekama, lai S. aureus īpaši strauji spētu producēt enterotoksīnus (Bad Bug Book, 1991).
Dažādos gadalaikos noņemtiem piena paraugiem būtiski atšķīrās (p < 0.05) S. aureus. skaits Visvairāk S. aureus izolēts no piena paraugiem 2004. gada ziemas periodā un 2000. gada rudens periodā. Stafilokoku mastīti biežāk sastopami rudens un ziemas periodā (Pyōrālā, 1995), iespējams, šie mikroorganismi no slimiem dzīvniekiem un to piena nokļūst arī pārdošanai paredzētajā pienā.
KoNS skaits būtiski neatšķīrās dažādos gadalaikos noņemtiem piena paraugiem (p > 0.01), bet atšķīrās dažādu tirdzniecības vietu un dažādu saimniecību piena paraugos (p < 0.01).
Apkopojot iegūtos rezultātus, var secināt, ka tirdzniecības vietās iegādājamais termiski neapstrādātais piens vairumā gadījumu pārsniedza maksimāli pieļaujamo mikrobiālā piesārņojuma normu. Tā kā šāda situācija ir ierasta parādība, Rīgas pilsētas tirgos esošajām Pārtikas un veterinārā dienesta laboratorijām būtu stingrāk jāseko piena kvalitātei un jāizstrādā attiecīgas izmaiņas normatīvajos aktos, tādējādi nodrošinot patērētāju veselībai nekaitīga piena un tā produktu realizāciju tirdzniecības vietās.
SŠS tirdzniecībā esošā termiski neapstrādātā pienā atspoguļots 8. tabulā.
8. tabula Somatisko šūnu skaita rādītāji tirdzniecībā esošā termiski
neapstrādātā pienā Somatisko šūnu skaits n % Min Max Vidējais
Līdz 400 000 ml-1 76 44.7 1 000 395 000 195 450
Virs 400 000 ml-1 94 55.3 405 000 3 470 000 447 970 Kopā 170 100.0
Ministru kabineta 2004. gada 6. aprīļa noteikumi Nr. 251 “Piena un
piena produktu aprites noteikumi” paredz, ka pienu izmanto cilvēku patēriņam vai pārtikas produktu ražošanai, ja SŠS tajā nepārsniedz 400 000 šūnu ml-1.
26
Pētījumā noskaidrots, ka pieļaujamo 400 000 ml-1 līmeni pārsniedza 55.3 % piena paraugu.
Paaugstinātais SŠS pienā varētu liecināt, ka koppienam pieliets ar mastītu slimojošu govju piens, tāpēc pastiprināti jākontrolē tirdzniecībai paredzētā termiski neapstrādātā piena SŠS.
8. Staphylococcus ģints mikroorganismu kvalitatīvās un kvantitatīvās izmaiņas pienā govju vakcinācijas ietekmē
Viens no mastītu profilakses veidiem ir govju imunizācija ar
specifiskiem antigēniem. ZI “Sigra” ir izstrādāts un tiek eksperimentāli pārbaudīts S. aureus antigēns. Veicot imunizēto govju piena paraugu bakterioloģisko kontroli, iegūtie rezultāti apkopoti 9. tabulā.
9. tabula S. aureus saturošo un nesaturošo piena paraugu attiecības vakcinētos
ganāmpulkos Pirms
vakcinācijas Pēc
1.vakcinācijas Pēc
1.revakcinācijas Pēc
2.revakcinācijas S. aureus klātbūtne
n % n % n % n % Izolēts 9 39.1 6 26.1 7 30.4 4 17.4 Nav izolēts 14 60.9 17 73.9 16 69.6 19 82.6 Kopā 23 100.0 23 100.0 23 100.0 23 100.0
Rezultāti liecina, ka govju skaits, kuru piens satur S. aureus
veģetatīvās šūnas, pēc 1. vakcinācijas samazinājies 1.5 reizes. Regulāri vakcinējot ganāmpulku ar S. aureus antigēnu, ar S. aureus inficēto govju skaitam ir tendence samazināties, kas apliecina vakcīnas pozitīvo lomu S. aureus izraisītu mastītu profilaksē. Līdz ar to ir iespējams ievērojami uzlabot piena mikrobiālo kvalitāti.
Ņemot vērā KoNS pieaugošo lomu gan govju mastītu, gan cilvēku infekciju slimību patoģenēzē, vakcinācijas laikā veikti pētījumi par tās ietekmi uz minētajiem mikroorganismiem. Iegūtie rezultāti apkopoti 10. tabulā.
10. tabula
KoNS saturošo un nesaturošo piena paraugu attiecības vakcinētos ganāmpulkos
Pirms vakcinācijas
Pēc 1. vakcinācijas
Pēc 1. revakcinācijas
Pēc 2. revakcinācijas
KoNS klātbūtne
n % n % n % n % Izolēti 16 69.6 18 78.3 17 73.9 19 82.6 Nav izolēti 7 30.4 5 21.7 6 26.1 4 17.4 Kopā 23 100.0 23 100.0 23 100.0 23 100.0
27
Iegūtie rezultāti ļauj secināt, ka vakcinēšanas rezultātā govs organismā
notiek Staphylococcus ģints sugu spektra maiņa – S. aureus nišu aizņem citas stafilokoku sugas (11. tabula).
11. tabula
Staphylococcus ģints sugu spektra maiņa pienā govju vakcinēšanas rezultātā
S. haemolyticus S. simulans S. intermedius Citas KoNS sugas
Piena parauga ņemšanas laiks
n % n % n % n % Pirms vakcinācijas 4 13.3 1 12.5 2 50.0 9 32.1 Pēc 1.vakcinācijas 6 20.1 2 25.0 1 25.0 9 32.1 Pēc 1.revakcinācijas 10 33.3 2 25.0 1 25.0 4 14.3 Pēc 2. revakcinācijas 10 33.3 3 37.5 - - 6 21.5 Kopā 30 100.0 8 100.0 4 100.0 28 100.0
S. haemolyticus izolēšanas biežums pēc trīsreizējas vakcinācijas ar S. aureus
antigēnu pieaudzis 2.5 reizes, S. simulans – 3 reizes. Savukārt koagulāzes pozitīvā S. intermedius un dažādu neidentificētu KoNS sugu izolēšanas biežums samazinājies. Pētījumā iegūtie rezultāti norāda, ka S. aureus antigēna pielietošanas gadījumā vērojama tendence palielināties S. haemolyticus un S. simulans izolēšanas biežumam. S. haemolyticus bijusi visbiežāk izolētā KoNS suga subklīnisko (51.4 %) un klīnisko (88.2 %) mastītu gadījumos un S. simulans bieži (11.1 %) izolēts no subklīniski slimojošu govju sekrēta. Tas liecina par šo sugu patogēno dabu, un to atrašanās govs piena dziedzeros ir nevēlama. Abām šīm stafilokoku sugām ir būtiska ietekme dažādu infekciju izraisīšanā cilvēkiem ( BBL Crystal datu bāze), un to atrašanās pienā ir bīstama cilvēku veselībai. ZI “Sigra” ir uzsākts darbs pie kompleksa S. aureus, S. haemolyticus un S. simulans antigēna izstrādes.
Secinājumi un ieteikumi
1. Veselu govju pienā dominē koagulāzes negatīvie stafilokoki (76.5 %), ar subklīnisku mastītu slimojošu govju tesmeņa sekrētā - Staphylococcus aureus (57.6 %), bet ar klīnisku mastītu slimojošu govju tesmeņa sekrētā - koagulāzes negatīvie Staphylococcus haemolyticus.
2. Staphylococcus aureus ir visbiežāk izolētais subklīnisko mastītu ierosinātājs govīm. Staphylococcus aureus izolēja no subklīniski (57.6 % ) un klīniski (39.0 %) slimojošu govju sekrēta paraugiem, kas liecina, ka Staphylococcus aureus loma govju piena dziedzeru iekaisumu ierosināšanā vēl aizvien ir nozīmīga.
28
3. Streptococcus ģints mikroorganismi pētījumā no subklīniski slimojošu govju tesmeņa sekrēta izolēti 9.2, bet no klīniski slimojošu govju tesmeņa sekrēta 1.4 reizes retāk kā Staphylococcus ģints pārstāvji, tas nozīmē, ka pieaug prevalējošo tesmeņa iekaisumu ierosinātāju nomaiņa no Streptococcus ģints uz Staphylococcus ģints mikroorganismiem.
4. Staphylococcus aureus un koagulāzes negatīvie stafilokoki izraisa adekvātu somatisko šūnu skaita pieaugumu, attiecīgi, 1 579 un 1 521 tūkstoši šūnu ml-1 ar subklīnisku mastītu slimojošu govju sekrētā un 1 990 un 1 947 tūkstoši šūnu ml-1 ar klīnisku mastītu slimojošu govju sekrētā, kas liecina par šo mikroorganismu agresivitāti un spēju ierosināt govs organisma imūnsistēmas atbildes reakciju.
5. Staphylococcus aureus un koagulāzes negatīvo stafilokoku ierosinātā subklīniskā infekcijas procesā ir svarīgs ne tik daudz stafilokoku skaits sekrētā, cik stafilokoku sugu un celmu virulence.
6. Klīnisku mastītu gadījumos lielāks koagulāzes negatīvo stafilokoku skaits izraisa govs imūnsistēmas krasāku atbildes reakciju, kas rezultējas somatisko šūnu skaita pieaugumā (r = 0.507; R2 = 0.2566; p < 0.05).
7. Tirdzniecības vietās iegādājamais termiski neapstrādātais piens (n = 170) vairumā gadījumu pārsniedz maksimāli pieļaujamo mikrobiālā piesārņojuma normu. Rīgas pilsētas tirgos esošajām Pārtikas un veterinārā dienesta laboratorijām stingrāk jāseko piena kvalitātei un jāveic nepieciešamie pasākumi situācijas uzlabošanai.
8. Regulāri vakcinējot govis ar Staphylococcus aureus antigēnu, govju skaitam, kuru piens satur koagulāzes negatīvos safilokokus, ir tendence pieaugt. Vakcinēšanas rezultātā govs organismā notiek Staphylococcus ģints sugu spektra maiņa – Staphylococcus aureus nišu aizņem citas stafilokoku sugas.
9. LLU aģentūrā “Biotehnoloģijas un veterinārmedicīnas zinātniskais institūts “Sigra”” turpinās darbs kompleksa Staphylococcus aureus un koagulāzes negatīvo stafilokoku antigēna izstrādē, kas ļaus ievērojami samazināt Staphylococcus ģints mikroorganismu klātbūtni pienā.
29
EXPLANATION OF DENOTATIONS AND ABBREVIATIONS:
CoNS coagulase negative staphylococci cfu ml-1 colony forming units per 1 ml of milk LB * HM cows cross-breed – Latvia,s Brown and Black and White p p-value Milk secretion product of healthy cows Secretion secretion product of subclinically and clinically diseased cows spp. species SPSS software package SCC somatic cell count subsp. subspecies S. genus Staphylococcus S. aureus Staphylococcus aureus
mean x
THE RESEARCH SUBJECT AND TOPICALITY OF THE PROBLEM
For ensuring consumers with safe, healthy and high-quality food
products, confirming with European Union regulations about health and food safety, researchers in Latvia focus their attention on the products of animal origin, particularly milk, its production and processing.
Milk and milk products, as a dietary and high-grade food, are usually used by people of all age groups. As milk contains proteins, sugar, minerals and vitamins it is exceptionally important for the growing organisms of children. At the same time, milk is the medium that ensures growth of microorganisms. Many microorganisms from the surrounding environment are not dangerous for consumers, but pathogenic microorganisms can pass into milk usually from cows with subclinical and clinical mastitis. Staphylococcus aureus is a major bovine mastitis agent and primary human pathogen. Other Staphylococcus species, as coagulase negative staphylococci, are opportunistic pathogens and can cause infections and intoxications of consumers by milk and milk products. In Latvia, research on the presence of coagulase negative staphylococci in raw milk and its influence on the process of mammary glands infections is not sufficient, therefore these questions are particularly emphasized in the present research work.
30
THE AIM AND TASKS OF THE PROMOTION WORK
The aim of the promotion work is to evaluate qualitative and quantitative composition of cow’s milk microflora. The tasks of the promotion work are:
1. To determine microorganisms and their associations in healthy cows’ milk and in subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion;
2. To evaluate correlation between Staphylococcus aureus and coagulase negative staphylococci and somatic cell count in cows’ milk;
3. To find out microbiological contamination of raw milk in its market places;
4. To investigate the influence of the Staphylococcus aureus experimental vaccine on the composition of microflora in vaccinated cows’ milk.
SCIENTIFIC NOVELTY
1. For the first time in Latvia, a spectrum of coagulase negative
staphylococci species has been identified in healthy cows’ milk, and in subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion.
2. Correlation between coagulase negative staphylococci and somatic cell count has been evaluated.
3. The influence of the Staphylococcus aureus vaccine on the spectrum of Staphylococcus species has been determined in vaccinated cows’ milk.
APPROBATION OF THE RESEARCH WORK
The results of the promotion work have been reported in 12 international scientific conferences:
1. Konošonoka I. H. Mikroorganismus raksturojošo kvalitatīvo un kvantitatīvo rādītāju un somatisko šūnu skaita izvērtējums govs pienā. Starptautiskā zinātniskā konference “Zinātne lauku attīstībai”, Jelgava, 2001. gada 23. - 25. maijā.
2. Konošonoka I. H. Evaluation of Microflora and Somatic Cell Count Changes in Mastitic Udder Secretions. Starptautiskā zinātniskā konference “Zinātne lauku attīstībai”, Jelgava, 2002. gada 22. - 24. maijā.
31
3. Konošonoka I. H., Jemeļjanovs A. Piena un gaļas piesārņojums to realizācijas vietās. Starptautiskā konference “Eco-Balt 2002”, Rīga, 2002. gada 7. – 8. jūnijā.
4. Jemeljanovs A., Konosonoka I. H. Staphylococcus aureus Prevalence in a Mastitic Secret of Cows with Udder Inflammation. 27th World Veterinary Congress, Tunis, September 25 – 29, 2002.
5. Jemeļjanovs A., Blūzmanis J., Konošonoka I. H., Duļbinskis J. Imunizācija – tesmeņa iekaisuma profilakses efektīvākais pasākums. Starptautiskā zinātniskā konference “Dzīvnieki. Veselība. Pārtikas higiēna”, Jelgava, 2002. gada 14. novembrī.
6. Konošonoka I. H., Jemeļjanovs A. Pasterizēta piena mikrofloras kvantitatīvās un kvalitatīvās izmaiņas uzglabāšanas temperatūras ietekmē. Starptautiskā konference “Eco-Balt 2003”, Rīga, 2003. gada 15.-16. maijā.
7. Konošonoka I. H. Influence of Different Factors on Somatic Cell Count in Cows, Milk. International scientific conference “Research for Rural Development”, Jelgava, May 21-24, 2003.
8. Jemeljanovs A., Konosonoka I. H., Bluzmanis J. Staphylococcus species prevalence in cows, raw milk from dairy farms in Latvia. The 54th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, Rome, Italy, 31 August – 3 September, 2003.
9. Konošonoka I. H., Ciproviča I. Organic farming – opportunities for dairy farmers in Latvia? Starptautiskā zinātniski-praktiskā konference “Nekaitīgi pārtikas produkti veselīgam uzturam”, Jelgava , 2003. gada 14. maijā.
10. Konošonoka I. H. Estimation of Prevailing Pathogens in Cow,s Milk International scientific conference “Research for Rural Development”, Jelgava, May 19 – 22, 2004.
11. Jemeljanovs A., Konosonoka I. H., Bluzmanis J. Pathogenic microorganisms elevating somatic cell count in cow’s udder secretions. The 55th Annual Meeting of the European Association for Animal Production, Bled, Slovenia, September 5 - 9, 2004.
12. Konošonoka I. H., Jemeļjanovs A., Blūzmanis J. Staphylococcus ģints baktēriju sastopamība veselu govju pienā un slimu govju tesmeņa sekrētā. Zinātniskā konference “Dzīvnieki. Veselība. Pārtikas kvalitāte”, Jelgava, 2004. gada 15. oktobrī.
During the research period, 11 scientific articles have been published in the Latvian and English languages, 9 of which in scientifically recognized journals:
1. Konošonoka I. H. (2001) Mikroorganismus raksturojošo kvalitatīvo un kvantitatīvo rādītāju un somatisko šūnu skaita izvērtējums govs
32
pienā. Zinātne lauku attīstībai: Starptautiskās zinātniskās konferences referāti, 2001. g 23.-25. maijā, Jelgava, Latvija, 127.-130. lpp.
2. Konošonoka I. H. (2002) Evaluation of Microflora and Somatic Cell Count Changes in Mastitic Udder Secretions.Research for Rural Development. International scientific conference proceedings, 22-24 May, 2002, Jelgava, Latvia, pp. 173-176.
3. Konošonoka I. H., Jemeļjanovs A. (2002) Piena un gaļas piesārņojums to realizācijas vietās. Starptautiskā konference Eco-Balt 2002, Rīgā, 2002. gada 7.-8. jūnijā, 78.-79. lpp.
4. Jemeļjanovs A., Blūzmanis J., Konošonoka I. H., Duļbinskis J. (2002) Imunizācija – tesmeņa iekaisuma profilakses efektīvākais pasākums. Starptautiskās zinātniskās konferences “Dzīvnieki. Veselība. Pārtikas higiēna.” Raksti, Jelgava, 2002. gada 14. novembrī, 64.–69. lpp.
5. Konošonoka I. H., Jemeļjanovs A. (2003) Pasterizēta piena mikrofloras kvantitatīvās un kvalitatīvās izmaiņas uzglabāšanas temperatūras ietekmē. Starptautiskā konference Eco-Balt 2003, Rīgā, 2003. gada 15.-16. maijā, II-24.-II-25. lpp.
6. Konošonoka I. H. (2003) Influence of Different Factors on Somatic Cell Count in Cows, Milk. Research for Rural Development. LUA, International scientific conference proceedings, Jelgava, Latvia, 21-24 May, 2003, pp. 160-163.
7. Konošonoka I. H., Ciproviča I. (2003) Organic farming – opportunities for dairy farmers in Latvia? Starptautiskās zinātniski-praktiskās konferences “Nekaitīgi pārtikas produkti veselīgam uzturam” referāti. Jelgava, 61.- 64. lpp.
8. Jemeļjanovs A., Miculis J., Ramane I., Konosonoka I., Kaugers R. (2004) Development of organic livestock production and certification in Latvia. In: Organic livestoc farming: potential and limitations of husbandry practice to secure animal health and welfare and food quality. Proceedings of the 2nd SAFO Workshop 25-27 March 2004, Witzenhausen, Germany, pp. 183 – 191.
9. Konošonoka I. H., Jemeļjanovs A. (2004) Svaiga govs piena kvalitāti ietekmējošie mikrobiālie faktori. LLU Raksti 12 (307), 25. – 30. lpp.
10. Konošonoka I. H. (2004) Estimation of Prevailing Pathogens in Cow,s Milk. Research for Rural Development. LUA, International scientific conference, Jelgava, Latvia, 19-22 May, 2004, pp. 161-166.
11. Konošonoka I. H., Jemeļjanovs A., Blūzmanis J. (2004) Staphylococcus ģints baktēriju sastopamība veselu govju pienā un slimu govju tesmeņa sekrētā. Zinātniskā konferences “Dzīvnieki. Veselība. Pārtikas kvalitāte” rakstu krājums, Jelgava, Veterinārmedicīnas fakultāte, 150. – 155. lpp.
33
MATERIALS AND METHODS
The research was carried out from January 2001 to January 2004. The microbiological analyses were performed in the Laboratory of the Department of Veterinary Medicine of the Research Institute of Biotechnology and Veterinary Medicine “Sigra” of the Latvia University of Agriculture. In total, 196 healthy cows’ milk samples, 311 subclinical and 87 clinical mastitis secretion samples from the farms of Riga, Ogre, Cesis, and Gulbene regions were analyzed. Raw milk samples were bought in the Riga Central Market, in Agenskalns, Vidzeme and Purvciems markets. A total of 219 milk samples of cows of different breeds, lactations and productivity were investigated. 164 cows or 75.0 % were Latvian Brown (LB), 50 or 23.0 % were Holsteins Black (HM), 5 or 2.0 % were crosses LB*HM. Majority of cows (82,6 %) were from 1st to 4th lactation; productivity of 63.0 % of cows made 4 000 to 6 000 kg of milk per year. The veterinarians of the Veterinary Department of the Research Institute “Sigra” made clinical diagnosis of each cow. According to the conclusions of the veterinarians, cows were divided into three groups:
healthy cows; cows with subclinical mastitis; cows with clinical mastitis.
The samples of healthy cows’ milk and clinically and subclinically diseased cows’ secretion were taken aseptically at one and the same time - before morning milking. Milk samples were delivered to the laboratory in a thermos bag, with temperature not higher than +10º C. Bacteriological analyses were started at once after samples were delivered to the laboratory.
The total bacterial count of milk samples was detected in accordance with standard LVS 179:1999 “Detection of colony forming units of microorganisms. Colony counting technique at the 300 C”. The milk samples dilution was prepared in accordance with standard LVS 178:1999 “Tests samples dilution preparing for microbiological investigation”. For identification of microorganisms the following media were used:
5 % bovine blood agar; Baird - Parker agar (Difco BBL or Mast Diagnostic); Endo or MacConkey agar (Difco BBL); nutrient agar (Difco BBL); plate count agar (Difco BBL).
The samples were incubated at 37º C temperature for 72 hours, growth colonies were monitored and analyzed after 24 hours.
For further identification of microorganisms selective agars were used:
34
Mannitol Salt agar (Difco BBL); KF Streptococcal agar (Difco BBL); different sugar agars.
Colonies were examined for indole, oxidase and catalase production. To determine the shape of microorganisms, they were stained using Gram method and microscoping. Microorganisms were further identified using Gram-positive and Gram-negative kits of BBL Crystal Identification System. This system is a miniaturized identification method employing modified conventional, fluorogenic and chromogenic substrates. Bacteria were identified, comparing the results with the existent in the database. For isolation and identification of Staphylococcus species, the following media were used:
Baird-Parker agar; Mannitol Salt agar; 5 % bovine blood agar.
Finally, for identification of Staphylococcus aureus, Pastorex Staph Plus (Bio-Rad) latex agglutination test was used. For identification of other Staphylococcus species, Gram-positive kits of BBL Crystal Identification System was used. For statistical evaluation and comparing, the count of S. aureus and CoNS there were divided into the following groups:
up to 500 cfu ml-1; from 501 to 2 000 cfu ml-1; from 2 001 to 5 000 cfu ml-1; from 5 001 to 10 000 cfu ml-1; above 10 000 cfu ml-1.
The somatic cell count was determined according to LVS EN ISO 13366-3:1997 “Milk. Determination of the somatic cell counts - part 3. The Fluora-opto-electronic method”, using “Somacount 300”.
The data was processed using SPSS software package SPSS 11.0. and MS EXCEL.
To evaluate correlation between factors “productivity”, “health”, “isolated microorganisms from milk samples”, “number of isolated staphylococci” and “somatic cell counts”, ANOVA test was used.
35
RESULTS AND DISCCUSION
1. Microflora of healthy cows’ milk
The genus, species and associations of microorganisms isolated from bacteriological positive healthy cows’ milk samples are shown in Table 1.
Table 1
The microorganisms isolated from healthy cows’ milk Isolated microorganisms n %
CoNS 104 56.2 Micrococcus spp. and Aerococcus spp. associations
26 14.1
S. aureus 18 9.7 Aerococcus spp. 16 8.7 S. aureus and CoNS associations 14 7.6 Enterobacteriaceae 6 3.2 Bacillus spp. 1 0.5 Non isolated 11 0 Total 196 100
In the literature, among Staphylococcus spp., Micrococcus spp,
Bacillus spp. and Enterobacteriacea spp., which are described as a typical milk microflora (Королева, Семенихина, 1980; Robinson, 1990; Mantere-Alhonen, 1995), Aerococcus spp. is not mentioned. In the present research aerococci were isolated in 16 (8.7 %) cases, but together with micrococci in 26 (14.1 %) cases, which suggests that isolation of these microorganisms in cows’ milk is not of a casual character.
Gram-positive cocci and their associations (Staphylococcus spp., Micrococcus spp., and Aerococcus spp.) were isolated from healthy cows’ milk in 96.3 % of cases, but other microorganisms - only in 3.7 % of cases, from which 3.2 % were the gram-negative Enterobacteriaceae species. The results prove earlier research findings that gram-positive bacteria are more tolerant of disinfection of udder and teats than gram-negative bacteria (Воротинцева, Мазанкова, 2001). For example, stafilococci have receptors, which allow attaching to cells of epithelium in the channel of the teat (Myllys et al., 1995). Of course, milk contaminates with gram-negative bacteria during milking, transportation of milk by pipelines, etc. Aseptically taken milk samples haven’t gram-negative bacteria.
Staphylococcus spp. (76.4 %) was most widely represented gram-positive species in the analyzed milk samples (Figure 1).
36
Figure 1. Isolated gram-positive cocci from healthy cows’ milk samples
Figure 2. The percentage of the S. aureus and CoNS in healthy cows’ milk
As Staphylococcus species, especially S. aureus, are one of the main
reasons for infections and intoxications, such a high staphylococci occurence in milk should be considered as a risk for consumer health.
According to the research conclusions in the literature during the last 10 - 20 years, coagulase negative staphylococci (CoNS) are opportunistic pathogens (Baird-Parker, 1990; Carter et al., 1995). This led to find out which Staphylococcus species are present in healthy cows’ milk. The results obtained show further examination of staphylococci (Table 2).
CoNS dominated in healthy cows’ milk. S. aureus was isolated in 5.8 times fewer cases compared to other Staphylococcus species. The S. aureus and CoNS associations were isolated in 14 (10.3 %) cases, which suggests that Staphylococcus species have ability to unite in associations and possibly form a biofilm, which protects these microorganisms from the influence of environmental factors; as a result, the microorganisms colonize and reproduce in the udder.
A part of isolated coagulase negative staphylococci were identified. The spectrum of species is shown in Table 2.
Table 2 The species of coagulase negative staphylococci in healthy cows’ milk
Isolated Staphyloccocus species n % S. haemolyticus 26 31.3 S. simulans 15 18.2 S. xylosus 12 14.5 S. caprae 7 8.4 S. schleiferi subsp. schleiferi 6 7.2 S. kloosii 6 7.2 S. saprophyticus 4 4.8 S. cohnii subsp. urealyticum 4 4.8 S. gallinarum 3 3.6 Total 83 100.0
13.2 % 10.3 %14.6 %
76.4 %
9.0 %
76.5 %Staphylococcus spp
Micrococcus spp. and Aerococcus spp.associations
CoNSS. aureusAerococcus spp. S. aureus and CoNS associations
37
In general, 9 different CoNS species were identified. In the literature, six of them S. haemolyticus, S. simulans, S. xylosus, S. caprae, S. cohnii, and S. saprophyticus - are mentioned as raw milk contaminants (Botha, Brand, 1988; Harvey, Gilmour, 1995). S . gallinarum (3.2 %) , S. schleiferi subsp. schleiferi (7.2 %) and S. kloosii (7.2 %) were isolated too, however, in the literature, they are not mentioned as raw milk contaminants. Nevertheless repeated isolations of the species confirm their presence in the cow’s neighboring environment and the possibility to pass into the udder. For example, S. gallinarum can be isolated from hens, S. kloosii - from pigs, and S. schleiferi - from dogs (Balows et al., 1991). All these animals are connected with the environment of the cowshed, therefore resident microflora of these animals may pass into the udder.
The more often isolated species - S. haemolyticus (31.3 %), S. simulans (18.2 %) and S. xylosus (14.5 %) - are described as the agents of cows’ subclinical and clinical mastitis (Jefrey, 1984; Tuteja, Kapur, 1995; Waage et al., 1999). This suggests that, despite any significant increase in somatic cell count [ ± S x x = (130 ± 7)·103 cells ml-1] caused by microorganisms, the inflammation of udder is possible at a decreased protective mechanism of the cow’s immune system.
S. haemolyticus is one of the most frequent CoNS species involved in human infections, and which has been isolated from septicemia, peritonitis, urinary tract, and wounds infections. S. schleiferi is an opportunistic human pathogen, which is isolated from infected wounds, in cases of sepsis and may infect implants, thus causing post-operation inflammations. S. simulans, S. cohnii and S. xylosus are rarely isolated from human infections (Balows et al., 1991).
A conclusion can be drawn that raw cow milk, containing coagulase negative staphilococci is not desirable for humans and may be dangerous.
2. Microflora of subclinically and clinically diseased cows’
udder secretion samples
The genus, species and associations of microorganisms isolated from subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples are shown in Table 3.
Gram-positive cocci were isolated from subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples most frequently. Also in Finland, Sweden and Norway these microorganisms cause more than 95 % of subclinical mastitis (Pyōrālā, 1995). Other microflora (gram-negative microorganisms from the genus Citrobacter, gram-positive microorganisms
38
from the genera Bacillus and Corynebacterium, and fungi) were isolated in 13 (4.3 %) cases.
Table 3.
The microorganisms isolated from subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples
Subclinical mastitis Clinical mastitis Isolated microorganisms n % n %
Staphylococcus spp. 229 74.1 41 48.2 Aerococcus spp. and Micrococcus spp. associations
35 11.3 - -
Streptococcus spp. 25 8.1 29 34.1 Aerococcus spp. 7 2.2 2 2.4 Bacillus spp. 4 1.3 - - Fungi 4 1.3 - - Citrobacter spp. 3 1.0 - - Corynebacterium spp. 2 0.7 - - Enterobacteriaceae - - 10 11.8 Aeromonas hydrophila - - 3 3.5 Non isolated 2 0 2 0 Total 311 100.0 87 100.0
Gram-positive cocci from the genera Staphylococcus, Streptococcus
and Aerococcus predominated in clinically diseased cows’ udder secretion samples too. Compared to subclinical mastitis secretion samples, microorganisms from the family Enterobacteriaceae (i.e. Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli) were isolated more frequently - in 10 (11.8 %) cases (Table 3).
From gram-positive cocci, the more frequently isolated microorganisms were from the genus Staphylococcus both in subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples - in 229 (74.1 %) and 41 (48.2 %) cases, respectively (Table 3).
The obtained results demonstrate that microorganisms of the genus Staphylococcus predominate in subclinically as well as in clinically diseased cows’ udder secretion samples. The genus Streptococcus species, Streptococcus agalactiae and Streptococcus uberis were the main mastitis pathogens in the 1950s – 60s (Myllys et al., 1995; Mozgis, 1997). In this research, the genus Streptococcus was isolated from subclinically diseased cows’ udder secretion samples 9.2 times, but from clinically 1.4 times rarer compared to the representatives of the genus Staphylococcus. So, also in Latvia, as in other countries, due to modernisation of milk production, replacement of predominating agents of mastitis from the genus Streptococcus to the genus Staphylococcus has been observed.
The proportion of Staphylococcus genus species is demonstrated in Figures 3 and 4.
39
Figure 3. The percentage of the Staphylococcus species in subclinically diseased cows’ udder secretion samples
Figure 4. The percentage of the Staphylococcus species in clinically diseased cows’ udder secretion samples
Among the species of genus Staphylococcus, S. aureus predominated in
subclinically diseased cows’ udder secretion samples (Figure 3). The obtained results coincided with the conclusions made by Birģele et al. (1996), Moretti et al. (1998), Javed-Igbal, Siddique (1999), and Ameh et al. (1999) that S. aureus is the main most frequently isolated pathogenic agent from subclinical mastitis.
The high proportion of isolated CoNS and S. intermedius (Figures 3 and 4) reveals pathogenicity of these microorganisms and ability to cause subclinical and clinical inflammations of udder. CoNS infections are often connected with implants placed in the human organism. As milking tubes, similar by to implants, consist of rubber and various organic materials and can not be washed using the centralised washing, CoNS adapt on the tubes’ surface for growth in milk, forming a biofilm, in which the vegetative cells are covered with a polysaccharide layer. In such way, when microorganisms enter the udder of a cow, they can easily adapt to the medium, avoid the organism’s immune system, propagate and cause inflammation of milk gland tissue, which has also been reported by Myllys et al. (1995).
Various species of staphylococci (except S. aureus) isolated from subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples are shown in Table 4.
34.1 % 57.6 %
8.3 %
S. aureusCoNS and S. intermediusS. aureus and CoNS associations
39.0 %4.9 %
56.1 %
CoNS and S. intermediusS. aureusS. aureus and CoNS associations
40
Table 4
The staphylococci species isolated from clinically and subclinically diseased cows’ udder secretion samples
Subclinical mastitis Clinical mastitis Isolated staphylococci species n % n %
S. haemolyticus 37 47.4 15 65.2 S. simulans 8 10.3 - - S. xylosus 8 10.3 - - S. capitis 8 10.3 - - S. intermedius 6 7.7 6 26.1 S. saprophyticus 5 6.4 - - S. epidermidis 5 6.4 - - S. vitulus 1 1.2 - - S. kloosii - - 2 8.7 Total 78 100.0 23 100.0
Seven species of CoNS were established in subclinically diseased cows’
udder secretion samples, of which S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. simulans, and S. xylosus were isolated also from healthy cows’ milk samples, which may reveal heterogeneousness and different virulence of these microorganism species. Other species such as S. capitis, S. epidermidis, and S. vitulus were isolated only from subclinically diseased cows’ udder secretion samples. All isolated staphylococci species, with the exception of S. vitulus, are described as mastitis causing agents by various authors (Hummel, Lehmann, 1994; Myllys, 1995; Waage et al., 1999). Only two species of CoNS - S. haemolyticus and S. kloosii - were established in clinically diseased cows’ udder secretion samples (Table 4).
Coagulase positive S. intermedius, which was isolated in 6 (7.7 %) cases from subclinically and in 6 (26.1 %) cases from clinically diseased cows’ udder secretion samples, is a considerable pathogen, which causes not only mastitis but also various other infections as pioderma, abscesses, inflammations of genital tract, and infections of wounds (Balows et al., 1991).
S. haemolyticus was isolated from subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples most frequently (Table 4). There is a diverse range of opinion as to the most frequent reason for mastitis. For example, Kudinha and Simango (2002) state that S. chromogenes, S. epidermidis, and S. hominis were isolated from subclinically diseased cow’s udder secretion samples most frequently. Chaffer et al. (2000) most often have identified S. chromogenes and S. haemolyticus. As to Honkanen-Buzalski (1995), most frequently she has isolated S. hyicus, but Waage (1999) S. simulans. The researches in Latvia have revealed that S. epidermidis is the most frequently isolated CoNS species causing mastitis (Burģele, 1996).
41
The opinions of Waage et al. (2000), Hummel and Lehmann (1994) about more frequently isolated CoNS as clinical mastitis agents are divided. Waage et al. (2000) has found S. simulans, S. hyicus and S. chromogenes, whereas Hummel and Lehmann (1994) most frequently have isolated S. xylosus, S. simulans, S. haemolyticus and S. chromogenes from clinically diseased cows’ udder secretion samples.
In the present research work, isolated S. kloosii has not been mentioned in the literature as a causal agent of clinical mastitis.
Because sometimes subclinical mastitis can not be identified and in some cases the disease proceeds without a high somatic cells count, than firstly, the consumer is not protected from infection with pathogenic microorganisms and secondly, the changes in milk chemical composition hinder the consumer from receiving a valuable product and the producer from obtaining high-quality raw materials.
In addition, by increasing distribution of raw milk, the consumer cannot feel safe for his health.
3. Comparison of the microflora between healthy cows’ milk and subclinically and clinically diseased cows’
udder secretion samples
Gram-positive cocci species from the genera Aerococcus, Micrococcus, Staphylococcus and Streptococcus dominated in all cases: in aseptically taken healthy cows’ milk and in subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples. The results obtained reveal that above-mentioned genera microorganisms are the most wide-spread milk contaminants, which pass into milk during milking when milk is flowing through the channel of teat. At the same time, gram-positive microorganisms are causal agents of subclinical and clinical mastitis. As these microorganisms are present in the cow’s surrounding environment -on the particles of dust in the air, in bedding, in feed, on the cow’s hair cover and skin, on the surface of milking equipment, they can easily enter the channel of the teat. Though the channel of teat is a physical and immunological barrier for microorganisms, due to lymphocytes and blood plasma cells concentrating around the Furstenberg rosette, a part of microorganisms adapt to this media and can resist the effect of leaching during milking, propagate and remain in the cisterna of the teat (Sandholm, Korhonen, 1995).
Although in the environment of cowshed, especially in the manure of animals and in bedding, gram-negative bacteria such Escherichia spp., Enterobacter spp., Klebsiella spp., Salmonella spp., Shigella spp. and others are present, in healthy cows’ milk and in subclinically and clinically
42
diseased cows’ udder secretion samples gram-negative bacteria were established only in 3.2 %, 1.0 % and 11.7 % of cases, respectively, which shows the keeping of sanitary-hygienic conditions in these farms. From clinically diseased cows’ udder secretion samples, comparatively more gram-negative microorganisms (Escherichia coli – 5.8 %, Klebsiella oxytoca and Klebsiella pneumoniae – 4.7 %, other microorganisms of the family Enterobacteriaceae – 1.2 %) were isolated. Sandholm and Pyōrālā (1995) explain that the mentioned microorganisms, usually named as coliforms, are not able to colonise the canal of the teat and persist in the tissue of the milk gland for a long time as it is usually characteristic of the representatives of the genus Staphylococcus. However, endotoxins of these microorganisms cause a response of the cow’s immune system, developing in the form of serious clinical signs. Myllys et al. (1995) points out that as a rule the infections of gram-negative microorganisms are clinical and short.
Microorganisms from the genus Staphylococcus predominated in healthy cows’ milk, as well as in subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples. The identified Staphylococcus species are shown in Figure 5.
13.2
76.5
10.3
0
20
40
60
80
%
Figure 5. The percentage of species of the genus Staphylococcus in milk and in diseased cows’ secretion samples
CoNS (76.5 %) dominated in healthy cows’ milk samples, S. aureus
(57.6 %) - in subclinically, but CoNS species (56.1 %) - in clinically diseased cows’ udder secretion samples.
The results obtained coincide with Myllys et al. (1995) conclusions that, beginning with the 70s of the past century, CoNS isolations from healthy cows’ milk and mastitis diseased cows’ secretion samples is gradually increasing. At the same time, there has been an exchange of the spectrum of mastitis agents from Streptococcus agalactiae to S. aureus and coagulase negative staphylococci. With the intensification of cattle breeding, more productive cow breeds are formed, often not taking into consideration their resistance to diseases. Mechanised cow milking has replaced cow milking by hands; disinfecting of udder’s skin before and after milking has been introduced in farms; antibiotic treatment is being
57.6
34.1
8.3
39.0
56.1
4.9
healthy subclinical mastitis clinical mastitis
S. aureus S. aureus and CoNS associationsCoNS
43
practised for prophylaxis of mastitis during the dry off period. These measures have led to considerable changes - pathogenic microflora population has become heterogeneous, variable, and more aggressive. The obtained results reveal that about 34.1 % of subclinically and 56.1 % of clinically diseased cows’ udder secretion samples contained opportunistic pathogens - CoNS.
Pathogenic S. aureus was isolated from 57.6 % of subclinically and 39.0 % of clinically diseased cows’ secretion samples, which demonstrates that the effect of S. aureus as a mastitis causal agent is still significant.
4. The count of S. aureus and CoNS in cows’ milk and subclinically and clinically diseased cows’
udder secretion samples
Analysing the count of S. aureus in milk and secretion samples, it was established that the mean of S. aureus significantly differed in the samples of healthy cows’ milk, compared to subclinically (p < 0.01) and clinically (p < 0.01) diseased cows’ udder secretion samples, but was not significantly different in clinically and subclinically diseased cows’ udder secretion samples (p > 0.05).
Statistical parameters of the count of S. aureus in various samples are presented in Figure 6.
Fig. 6 The count of S. aureus in milk and subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples
The lowest count of staphylococci in subclinically and clinically
diseased cows’ udder secretion samples (160 and 900 cfu ml-1, respectively), and the highest count (8 800 cfu ml-1) of staphylococci in healthy cows’ milk can be explained by the different virulence of S. aureus strains and resistance of the cows’ immune systems to pathogenic microorganisms. Factors of virulence - the ability of attachment to sensitive cells receptors, capability of tissue
140 160900
8 800
103 400
21 000
020000400006000080000
100000120000
cfu ml-1
1 80011 200
7 900
min max average
healthy subclinical mastitis clinical mastits
44
colonisation and oppressing of phagocytosis, production of various kinds of toxins and exoenzymes - are different to strains of S. aureus (Борисов, 2002), and thus the ability of these strains to cause infections is different.
In 83.3 % of cases, the count of S. aureus in healthy cows’ milk was up to 2 000 cfu ml-1
, while in 82.4 % of subclinical mastitis cases and in 75.0 % of clinical mastitis cases it exceeded 2 000 cfu ml-1.
As in the case of S. aureus isolation, the count of CoNS was significantly different in healthy cows’ milk samples, compared to subclinically (p < 0.01) and clinically (p < 0.01) diseased cows’ udder secretion samples, did not differ significantly (p > 0.05) from subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples.
The minimum of CoNS in healthy cows’ milk and in subclinically, and clinically diseased cows’ udder secretion samples was similar, i.e., 20, 30 and 100 cfu ml-1, respectively (Figure 7).
14 500 15 00014 000
0
5000
10000
15000
cfu
ml-1
700
3 3005 400
2030
100
min max averagehealthy subclinical mastitis clinical mastits
Figure 7. The count of CoNS in milk and subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples
The results obtained demonstrate different virulence of various CoNS
species. If earlier this microorganisms group was referred to as “environmental staphylococci” and were not considered as mastitis causal agents (Honkanen - Buzalski, Seuna, 1995), the frequent isolation of these microorganisms from subclinical and clinical secretion samples reveal the possible high pathogenicity of some staphylococci species, in the result of which a small amount of these microorganisms can cause a response reaction of the cow’s immune system, formation of infection process.
Also the maximum of CoNS was similar - 14 500 cfu ml-1 in healthy cows’ milk, 15 000 cfu ml-1 in subclinically, and 14 500 cfu ml-1 in clinically mastitis diseased cow’s udder secretion samples (Figure 7). It is possible that S. caprae, S. gallinarum, S. cohnii subsp. urealyticum and S. schleiferi subsp. Schleiferi, isolated only from healthy cows’ milk samples, cannot cause the infection process. Other CoNS species (S. haemolyticus, S. simulans, S. xylosus, S. kloosii, and S. saprophyticus), which were isolated from healthy cows’ milk and from subclinically and clinically
45
diseased cows’ udder secretion samples, might have a different pathogenicity level.
Similarly as in cases of S. aureus isolation, the count of CoNS in healthy cows’ milk in 96.3 % of cases also was not higher than 2 000 cfu ml-1, but in subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples the count of CoNS in 47.4 % and 69.6 % of cases exceeded 2 000 cfu ml-1.
5. Connection between isolated S. aureus and coagulase negative staphylococci and somatic cell counts in cows’ milk
and subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples
SCC is one of milk quality parameters. High SCC changes the
chemical composition of milk and shows the state of health of cow’s udder thus warning of a possible infection of heard with mastitis agents. Table 5 generalises parameters of SCC in healthy cows’ milk, and in subclinically and clinically diseased cows’ udder secretion samples in the cases when the genus Staphylococcus microorganisms were isolated.
Table 5
Mean somatic cell count in samples with different isolated microorganisms (SCC · 103 cells ml-1)
Healthy cow Subclinical mastitis Clinical mastitis Isolated microorganisms n n n x x x ± S ± S ± S x x x
Staphylococcus aureus
18
160 ± 30 132 1 580 ± 130 16 1 990 ± 310
CoNS and S. intermedius
104 130 ± 10 78 980 ± 90 23 1 950 ± 240
Staphylococcus aureus and CoNS associations
14
70 ± 20 19 1 520 ± 290 2 6 100 ± 50
Though S. aureus (n = 18), CoNS (n = 104), S. aureus and CoNS
associations (n = 14) were isolated from the milk samples of healthy cows, the mean somatic cell count was not higher than 160 thousand cells ml-1 (Table 5). It shows that microorganisms of the genus Staphylococcus are characteristic microflora of healthy cows’ milk, which not always causes the infection process.
SCC was similar in separately isolated S. aureus as well as in S. aureus and CoNS associations from subclinically diseased cows’ udder secretion samples - 1 580 and 1 520 thousand cells ml-1, respectively. The mean SCC was lower and reached 980 thousand cells ml-1 in the secretion of udder,
46
from which various CoNS species were isolated. The results confirm the conclusions in the literature that CoNS causes increase in somatic cell count to a lower degree than obligatory pathogens S. aureus and Streptococcus agalactiae (Dohoo, Leslie, 1987; Ariznabarreta et al., 2002).
The highest SCC was found in clinically diseased cows’ udder secretion samples, when S. aureus and CoNS associations (6 100 thousand cells ml-1) were isolated from the secretion of udder. The mean SCC when S. aureus and various CoNS species and S. intermedius were isolated was 1 990 and 1 950 thousand ml-1, respectively (Table 5).
It was established that in clinical mastitis cases S. aureus and CoNS associations have caused 4 times, CoNS and S. intermedius - 1.9 times, but S. aureus - 1.2 times higher SCC growth than in cases of subclinical mastitis. It is possible to draw the conclusion that in cases of clinical mastitis one strain of microorganisms has caused a sharper response of the organism’s immune system compared to subclinical mastitis, which can be explained by different virulence of microorganisms.
Evaluation of SCC in samples with different count of staphylococci suggests that it is significantly different (p < 0.01).
SCC in the secretion samples differed significantly, if the count of S. aureus was up to 500 cfu ml-1 compared to secretion samples, in which the count of S. aureus exceeded 500 cfu ml-1. The conclusion can be drawn that the count of S. aureus above 500 cfu ml-1 causes significant growth of SCC, but increase in the count of staphylococci up to 10 000 cfu ml-1and more did not cause a statistically significant growth of SCC.
Connection between SCC and the count of S. aureus in subclinically diseased cows’ udder secretion samples is shown in Figure 8.
Figure 8. Connection between SCC and the count of S. aureus in secretion samples
0
1
2
3
4
5
6
0 2 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 0
S C C , c e l l s m l - 1
S.a
ureu
s, c
fu m
l-1
0 0 0 0
0 0 0 0
0 0 0 0
0 0 0 0
0 0 0 0
0 0 0 0 y = 0 . 0 0 0 3 x + 1 5 6 8 6 3 7R 2 = 0 . 0 0 2
47
The connection between SCC and the count of S. aureus in secretion samples can be expressed by equation:
y = 0.0003x + 1568637; R2 = 0.002 (p > 0.05).
The equation demonstrates that less than 1 % of the SCC changes in secretion samples can explain with the influence of S. aureus. Increased count of S. aureus in the secretion did not raise the amount of SCC. Whereas high SCC was observed also at a low number of S. aureus.
This data agrees with Shoshani et al. (2000) that during illness the count of S. aureus is non-constant and there is no connection between the count of staphylococci and SCC in mastitis secretion.
SCC varied within a narrower range in secretion in cases of isolated CoNS species, compared to cases of isolated S. aureus, i.e., from 510 to 1 250 thousand cells ml-1. SCC in subclinically diseased cows’ udder secretion samples differed significantly if the count of CoNS was not higher than 500 cfu ml-1, compared to secretion samples with the count of these microorganisms from 500 to 5 000 cfu ml-1 (p < 0.05). Further increase of the number of CoNS in secretion did not significantly increase the SCC (p > 0.05). This suggests that during the process of infection excited by CoNS, the number of staphylococci in secretion is not so important as their virulence. This conclusion does not contradict the data in the literature that CoNS’s species have different levels of pathogenicity, of which S. hyicus is the most pathogenic (Myllys, 1995).
This is also confirmed by the connection between SCC and count of CoNS in subclinically diseased cows’ udder secretion samples as shown in Figure 9.
Figure 9. Connection between SCC and count of CoNS in subclinically diseased cows’ secretion samples
y = 0,0002x + 3417.3R2 = 0.001
0
00
00
00
00
0 2000000 4000000 6000000-1
50
100
150
200
SCC, ml
CoN
S, c
fu m
l-1 y = 0,0021x + 1R2 = 0,2566
0
5000
10000
15000
20000
0 2000000 4000000 6000SCC, ml-1
CoN
S, c
fu m
l-1 224
000
Figure 10. Connection between SCC and count of CoNS in clinically diseased cows’ udder secretion samples
The connection between SCC and CoNS in secretion samples can be
expressed by equation: y = 0.0002x + 3417.3; R2 = 0.001 (p > 0.05).
48
Similarly as in cases of S. aureus isolation, the high level of SCC does not change significantly, if the number of CoNS increases considerably.
The mean of SCC in clinically diseased cows’ udder secretion samples varied from 970 to 3 000 thousand cells ml-1. However, the statistical data analysis showed that there was no significant difference between the mean values of SCC depending on the count of isolated S. aureus (p > 0.05). Though, there was a tendency observed for somatic cell count to increase when the count of S. aureus was exceeding 2 000 cfu ml-1. The results obtained suggest that clinical mastitis might be caused by S. aureus strains with a high level of virulence. When the count of S. aureus exceeds 2 000 cfu ml-1, SCC does not change significantly, however, well-pronounced clinical signs develop in the cow’s organism.
When CoNS species were isolated from clinical mastitis secretion samples, SCC varied within a narrower range. SCC is 2 520 thousand cells ml-1 in the secretion, which is 1.3 times higher than in the case when a similar number of S. aureus (10 000 cfu ml-1) was isolated. This conclusion contradicts the opinion of several other authors (Dohoo, Leslie, 1987; Saloniemi, 1995) that CoNS causes a more moderate response reaction of the cow’s immune system than S. aureus.
The mean of SCC was significantly different in secretion samples with the count of CoNS from 501 to 2 000 cfu ml-1, compared to samples with the count of staphylococci from 5 001 to 10 000 cfu ml-1 and above 10 000 (p < 0.05).
The data shows that a higher count of CoNS is the cause for a more marked response of the cow’s immune system, resulting in the SCC increase.
The connection between SCC and CoNS demonstrated in Figure 10 can be expressed by equation:
y = 0.0021x + 1224; R2 = 0.2566 (p < 0.05).
The equation reveals that changes in the count of CoNS explain about 25 % of the somatic cell count changes in secretion. There is an average close linear correlation between the count of CoNS and SCC in clinically diseased cows’ udder secretion samples: increase in the count of CoNS significantly increases SSC too.
6. Spectrum of microflora and somatic cell count in raw milk
The results of analysed microbiological contamination of milk
purchased in various marketing places are shown in Table 6.
49
Table 6
Indicators of raw milk microbiological contamination Indicators n Min Max x ± S x Total bacterial count, cfu ml-1
170 6 000 55 500 000 7 598 510 ± 899 350
S. aureus, cfu ml-1 57 30 10 000 1 320 ± 250 CoNS, cfu ml-1 162 30 14 000 2 770 ± 200 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, cfu ml-1
152
10
2 000
400 ± 30
Regulation No. 251 regarding handling of milk issued by the Cabinet
of Ministers of the Republic of Latvia on 6 April 2004 state that the total mesophilic aerobic and facultative anaerobic bacteria in the cows’ milk intended for distribution should not exceed 100 000 cfu ml-1. The data shows that in 94.1 % of cases (n = 170) the milk exceeded the maximum permissible level of microbial contamination even 555 times, reaching 55 500 000 cfu ml-1.
Above mentioned regulations provide that raw milk can be sold directly to the consumer only, if in two tested milk samples from five, S. aureus varies from m = 500 to M = 2 000 (m – minimal number of S. aureus cfu ml-1, which is satisfactory; M – maximal number of S. aureus cfu ml-1, which is unsatisfactory).
The mean S. aureus was 1 320 cfu ml-1, but the maximal reached 10 000 cfu ml-1. In 14 milk samples (24.6 %), the count of S. aureus was above 2 000 cfu ml-1. Mastitis diseased cows’ milk and milk stored at inadequate temperatures, (a suitable place for staphylococci propagation), is sold to the consumer, which is not permissible from the point of view of the consumer’s safety.
This suggests that raw milk bought in various marketing places is not safe for the consumer’s health, as it may contain not only a considerable amount of vegetative cells of S. aureus, but also their toxins.
CoNS were established in 95.3 % of milk samples. Mean CoNS was 2 770 cfu ml-1, the maximum - 14 000 cfu ml-1 (Table 6). As earlier research has established that coagulase negative staphylococci as S. hyicus and S. epidermidis (Baird-Parker, 1990; Gilmour, Harvey, 1990) and S. simulans, S. xylosus, S. haemolyticus, S. lugdunensis etc. are opportunistic pathogens (Database BBL Crystal) and can produce toxins, the possibility to buy safe raw milk in the marketing places is not possible in most cases. This compels the state institutions controlling food trade to make a decision about additional measures to improve the terms of raw milk trade. This would ensure a more frequent control of the presence of S. aureus and CoNS species in milk.
50
The presence of microorganisms from the genus Enterococcus was established in 152 samples (89.4 %). The mean of faecal streptococci was 400, the maximal - 2 000 cfu ml-1 (Table 6). Enterococcus, the same as coliform bacteria, is the natural microflora of the intestine in humans and animals. Their presence in milk reveals faecal contamination (Королева, Семинихина, 1980). The results obtained show that hygienic conditions have not been observed during milk production, pre-treatment, storage and trade.
The percentage of isolated gram-negative microorganisms in analysed milk samples is shown in Figure 11.
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
%
% 5 7 ,1 5 0 ,6 3 4 ,7 2 7 ,6 1 5 ,3 1 1 ,8 0 ,6
E n tero b a cter sp p .
H a fn ia sp p . C itro b a cter sp p .
P ro teu s sp p . E sch erich ia sp p .
K leb siella sp p .
S a lm o n ella sp p .
Figure 11. The percentage of gram-negative microorganisms isolated from
raw milk samples
Bacteria from the genus Enterobacter, as Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, and Enterobacter aerogenes, were established most frequently (57.1 %) in milk samples. The isolated microorganisms are opportunistic pathogens for humans.
Hafnia alvei (the unique Hafnia family kind) was isolated from 50.6 % of samples.
Bacteria from the genus Citrobacter, as Citrobacter freundii, were isolated from 34.7 % of milk samples. In many cases Citrobacter spp. were isolated from the clinical material of the human organism, which reveals pathogenic nature of this bacteria (Хоулт и др., 1997).
Bacteria from the genus Proteus, as Proteus vulgaris and Proteus mirabilis, were isolated in 27.6 % of samples.
Bacteria from the genus Escherichia, of which also Escherichia coli, were isolated from 15.3 % of milk samples.
51
Klebsiella spp., as Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca, was isolated in 11.8 % of samples.
Bacteria from the genus Salmonella were isolated from 0.6 % of samples.
In accordance with Latvian legislation (Regulations No. 251 issued by the Cabinet of Ministers and adopted on 6 April 2004), presence of Salmonella species is not permissible in the 1 ml of raw milk sold in marketing places.
The comparison of the amount of mesophilic aerobic and facultative anaerobic microorganisms in the raw milk sold in marketing places by different years established that the level of contamination has increased very fast (Table 7).
Table 7
The total bacteria count in raw milk samples, cfu ml-1
Year n Geometrical mean x ± S x 2000. 51 516 700 2 492 730 ± 107 400 2001. 29 746 800 2 929 380 ± 148 960 2003. 44 3 377 180 6 466 980 ± 957 360 2004. 46 17 000 000 22 000 000 ± 2 393 130
In 2004, the total count of mesophilic aerobic and facultative
anaerobic microorganisms in analysed milk samples has increased, compared to the years 2000, 2001 and 2003. Milk producers have stricter requirements on milk quality and at the same time farmers, not being able to adapt to these requirements, sell their produce in the market. As a result, milk microbiological quality decreases, which is threatening the health of milk consumers.
An incorrect milk cooling after milking, lack of suitable cooling equipment, inadequate milk storage temperature in the marketing places can be the reason for the high total count of microorganisms in milk. I.Ciproviča has established (1997) that the amount of microorganisms in milk, cooled to the temperature of 10 0C, 58 times exceeds that in milk cooled to 3.80 C, reaching several millions of cfu ml-1. As in the marketing places raw milk is stored in cans, which are not kept in the refrigerators but in the market hall, the high amount of microorganisms and its increase in milk is an objective outcome. The temperature above 200 C is sufficient for an especially quick enterotoxin production by S. aureus (Bad Bug Book, 1991).
The amount of S. aureus in milk samples taken in different seasons of the year differed significantly (p < 0.05). The majority of S. aureus was isolated from milk samples during the winter of 2004 and autumn of 2000. As staphylococci mastitis is mostly observed in the autumn and winter
52
periods (Pyōrālā, 1995), it may be supposed that these microorganisms pass from the diseased animals and their milk into the milk intended for sale.
The count of CoNS in milk samples taken in various times of the year did not differ significantly (p > 0.01), but significantly differed (p < 0.01) in the milk samples from different marketing places and different owners.
The data suggests that majority of raw milk samples from the marketing places exceeded the maximum permissible level of microbial contamination. As this situation is a usual phenomenon, the laboratories of the Food and Veterinary Service in the Riga city markets should follow the milk quality much more carefully and should elaborate proper measures to improve the situation.
The SCC in raw milk in marketing places is shown in Table 8.
Table 8 Somatic cell counts in raw milk samples in the marketing places
SCC cell ml-1 n % Min Max Mean
Up to 400 000 ml-1 76 44.7 1 000 395 000 195 450 Above 400 000 ml-1
94
55.3
405 000
3 470 000
447 970
Total 170 100.0 The Regulations No. 251 issued by the Cabinet of Ministers on 6 April 2004 state that the SCC in cow’s milk intended for distribution should not exceed 400 thousand cells ml-1. The research revealed that 55.3 % of milk samples exceeded the permissible 400 thousand cells ml-1 level. The increased SCC in milk suggests that milk from the cows diseased with mastitis have been added to the bulk milk. Such milk is dangerous to the consumer’s health, therefore a particular attention should be paid to the control of SCC in raw milk in marketing places.
7. Qualitative and quantitative changes of microorganisms from the genus Staphylococcus
in milk as a result of vaccination of cows’ Immunization of cows using specific antigens is one of the types of
mastitis prophylaxis. S. aureus antigen is developed and experimentally tested at the Agency “Research Institute of Biotechnology and Veterinary Medicine “Sigra”” of the Latvia University of Agriculture. The results of bacteriological examination of immunized cows’ milk samples are shown in Table 9.
53
Table 9 The changes of S. aureus presence in vaccinated cows’ milk
Before vaccination
After 1st vaccination
After 1st revaccination
After 2nd revaccination
Presence of S. aureus n % n % n % n % Isolated 9 39.1 6 26.1 7 30.4 4 17.4 Not isolated 14 60.9 17 73.9 16 69.6 19 82.6 Total 23 100.0 23 100.0 23 100.0 23 100.0
The results established that the number of cows, the milk of which
contains S. aureus, after the 1st vaccination diminished 1.5 times. The number of cows, the milk of which contains S. aureus, tends to diminish as a result of regular vaccination, which proves the positive role of S. aureus antigen in the prophylaxis of mastitis. Besides, also the microbial quality of milk is improved considerably.
During vaccination, research was done on its influence on CoNS, as great attention is being paid to these microorganisms as agents causing mastitis to cows. The obtained results are generalized in Table 10.
Table 10
The changes of CoNS presence in vaccinated cows’ milk Before vaccination
After 1st vaccinations
After 1st revaccination
After 2nd revaccination
Presence of CoNS
n % n % n % n % Isolated 16 69.6 18 78.3 17 73.9 19 82.6 Not isolated 7 30.4 5 21.7 6 26.1 4 17.4 Total 23 100.0 23 100.0 23 100.0 23 100.0
The obtained results allow drawing conclusion that the spectrum of
the genus Staphylococcus is changing in the cow’s organism. S. aureus is being replaced with other staphylococci (Table 11).
Table 11 The change of the spectrum of the genus Staphylococcus species
as a result of vaccination of cows S. haemolyticus S. simulans S. intermedius Other CoNSTime of taking
milk samples n % n % n % n % Before vaccination
4
13.3 1 12.5 2 50.0 9 32.1
After 1st vaccination
6 20.1
2 25.0 1 25.0 9 32.1
After 1st revaccination
10 33.3 2 25.0 1 25.0 4 14.3
After 2nd revaccination
10 33.3 3 37.5 - - 6 21.5
Total 30 100.0 8 100.0 4 100.0 28 100.0
54
The frequency of S. haemolyticus and S. simulans isolation after triple vaccination with S. aureus antigen has increased 2.5 and 3 times, respectively. Whereas the frequency of isolation of coagulase positive S. intermedius and different nonidentified CoNS species has diminished. The research results demonstrate that the frequency of the S. haemolyticus and S. simulans isolation tended to increase in the case of S. aureus antigen application. The pathogenic nature of these microorganisms is revealed in the fact that S. haemolyticus was the most frequently isolated CoNS in subclinical (51.4 %) and clinical (88.2 %) mastitis cases and S. simulans was often (11.1 %) isolated in subclinical mastitis cases; their presence in mammary glands is undesirable. Both these staphylococci species are involved in many human infections (BBL Crystal Database), and their presence in milk is dangerous for human health. At the Scientific Institute “Sigra”, a research has been started to develop a complex S. aureus, S. haemolyticus and S. simulans antigen.
Conclusions and suggestions
1. Coagulase negative staphylococci (76.5 %) prevail in the milk of healthy cows, Staphylococcus aureus prevails in subclinically diseased cows’ udder secretion samples (57.6 %), and coagulase negative Staphylococcus haemolyticus - in clinically diseased cows’ udder secretion samples.
2. Staphylococcus aureus is the most frequently isolated subclinical mastitis agent from cows. Staphylococcus aureus was isolated from 57.6 % of subclinically and 39.0 % of clinically diseased cows’ secretion samples, which suggests that Staphylococcus aureus has still considerable role in causing udder inflammation to cows.
3. Microorganisms from the genus Streptococcus were isolated 9.2 times rarer from subclinically and 1.4 times rarer from clinically diseased cows’ secretion samples compared to the microorganisms from the genus Staphylococcus. The replacement of predominating causing agents of mastitis has been observed: microorganisms of the genus Streptococcus have been replaced with microorganisms of the genus Staphylococcus.
4. Staphylococcus aureus and coagulase negative staphylococci caused an adequate somatic cell count increase: 1 579 and 1 521 thousand cells ml-1 in subclinically and 1 990 and 1 947 thousand cells ml-1 in clinically diseased cows’ secretion samples, respectively, which reveals the aggressiveness of these microorganisms and ability to induce a response of the immune system of the cow’s organism.
5. The virulence of the species of coagulase negative staphylococci and strains of Staphylococcus aureus is a more important factor in the
55
subclinical infection process than the count of these bacteria in the udder secretion.
6. A high count of coagulase negative staphylococci induces a sharper immune response of the clinically diseased cows’ organism, which result in an increase in somatic cell count (r = 0.507; R2 = 0.2566; p < 0.05).
7. In most cases, the raw milk in its marketing places exceeded the maximum permissible level of microbial contamination. The laboratories of the Food and Veterinary Service in the markets of Riga should control the quality of milk more strictly and take all the necessary measures to improve the situation.
8. The number of cows, the milk of which contains coagulase negative staphylococci, has a tendency to increase, if Staphylococcus aureus antigen is regularly vaccinated to cows. In the result of vaccination, the spectrum of the genus Staphylococcus changes: Staphylococcus aureus is replaced with other species of staphylococci.
9. A complex Staphylococcus aureus and coagulase negative staphylococci antigen is being developed, which would allow to produce milk and milk products free from microorganisms of the genus Staphylococcus.
56
57