lbqp- peptídeos (4)
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SÍNTESE DE PEPTÍDEOS EM FASE SÓLIDA (SPFS)
Química Fmoc/tBu
Aline B. Guimarães e Daniel LogradoLaboratório de Bioquímica e Química de Proteínas
junho/2012
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SPFS E MERRIFIELD
Ligação de aminoácidos à um suporte sólido adição de
novos resíduos de aminoácidos por reações de
acoplamento síntese do peptídeo desejado ;
1963 = síntese de um tetrapeptídeo, usando um suporte
sólido poroso (trabalho polêmico – metodologia
questionada – produção de impurezas?)
1964 = síntese e purificação de um nonapeptídeo em
cinco dias revolucionou as estratégias de síntese de
peptídeos da época !!
Por sua concepção, o cientista foi agraciado com o Nobel
de Química em 1984!
ROBERT BRUCE MERRIFIELD (1921-2006)
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CASO PRÁTICOSíntese de Análogo do peptídeo Pentadactylin
16 resíduos – Gly, Leu, Lys, Ala, Asn,Val e Ser
http://amphibiaweb.org/cgi/amphib_query?where-genus=Leptodactylus&where-species=pentadactylus
Gly-Leu-Leu-Asp-Thr-Leu-Lys-Gly-Ala-Ala-Lys-Asn-Val-Val-Gly-Ser-Leu-Ala-Ser-Lys-Val-Met-Glu-Lys-Leu-NH2
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SINTETIZADOR DE PEPTÍDEOSPSSM-8 - SHIMADZU
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Compatível com a estratégia Fmoc;
O peptídeo é sintetizado com a porção C-terminal amidada.
VASO DE REAÇÃO
NovaPEG Rink Amide resin
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CARACTERÍSTICAS DA RESINA
Partículas quimicamente inertes a todos os solventes e
reagentes usados durante todo o processo de síntese;
Não deve interagir com a cadeia peptídica;
Facilidade de modificação química = o primeiro
aminoácido (da sequência) deve conseguir se ligar
eficazmente ao suporte;
Capacidade de “inchar” = aumento da área tornar
os pontos de reação acessíveis aos solventes e
reagentes .
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“LINKER” - ESPAÇADOR
Na síntese Fmoc/tBu, as condições de clivagem não são suficientemente agressivas para quebrar a ligação entre os aminoácidos e a resina importância do linker.
Ligação entre o peptídeo e o linker:estável a tratamentos repetitivos -
remoção do grupo protetor temporário e acoplamento dos aminoácidos;
deve permitir, ao final da síntese a clivagem da ligação peptídeo-resina sem danificar o produto final.
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FORMAÇÃO DA LIGAÇÃO PEPTÍDICA
Competição pode gerar produtos indesejáveis!
Leu
Leu
GlyGly
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ACOPLAMENTO
No sentido de promover a reação entre o aminoácido a ser adicionado à sequência peptídica e o último resíduo da cadeia (já desprotegido), é necessário ativar previamente o grupo carboxílico livre do aminoácido a incorporar.
O uso de agentes de acoplamento possibilita o aumento da rapidez de reação (mesmo entre aminoácidos estericamente impedidos) e a supressão ou minimização de reações laterais.
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ACOPLAMENTO
Racemização no carbono alfa (carboxila) a formação de subproduto (diasterisômero) pode ser evitada com a adição de grupos de proteção!!
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NMM Em DMFDMF
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GRUPOS DE PROTEÇÃO - TIPOS
TEMPORÁRIO = para aqueles que formam a ligação peptídica (Fmoc);
PERMANENTE = para grupos funcionais dentro de cada cadeia lateral (estes devem ser muito estáveis para suportarem a remoção dos GPT).
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CADEIA LATERAL = H, ALQUILA, ARILA
Sem grupo de proteção !
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CADEIA LATERAL = OH OtBU
CADEIA LATERAL = COOH COOtBU
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CADEIA LATERAL = CONH2Trt
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CADEIA LATERAL = SH DEPENDE...
CADEIA LATERAL = GRUPOS BÁSICOS E IMIDAZOL
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SAÍDA DO GRUPO Fmoc DO N-TERMINAL
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PIPERIDINA
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9 CICLOS DEPOIS...
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7 CICLOS DEPOIS...
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EXTRAÇÃO DOS PEPTÍDEOS
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EXTRAÇÃO DOS PEPTÍDEOS• Durante o processo são
geradas espécies catiônicas altamente reativas que podem, a menos que impedidas, reagir e modificar resíduos que contêm grupos funcionais nucleofílicos (Trp, Met, Tyr e Cys).
• Uso de reagentes nucleofílicos (scavengers) para capturar os cátions e impedir tais reações.
Reagentes: anisol, o p-cresol, o etan-1,2-ditiol, o sulfureto de dimetilo e trialquilsilanos.
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CLIVAGEM DOS GRUPOS PERMANENTES
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Remoção do grupo de proteção do resíduo Asn em condições ácidas radical tritila confere a mudança na cor da solução!
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Coleta
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PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS PEPTÍDEOS SINTÉTICOS
Avaliação : cromatografia líquida;
Espectrometria de massas = confirmação da sequência;
RMN = identificação estrutural e investigação do comportamento conformacional.
INDICA SE A SÍNTESE/PURIFICAÇÃO FOI BEM SUCEDIDA GRAU DE CONFIABILIDADE DO
MATERIAL SINTÉTICO.
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CROMATOGRAMA
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
Vantagens Desvantagens Suporte polimérico insolúvel Fácil remoção de material de
partida ou subprodutos não ligados à resina – lavagem a cada etapa
Pode-se utilizar excesso de reagentes aumento do rendimento
Purificação rápida e parcial a cada etapa
Possibilidade de automatização = combinação de velocidade e praticidade
Reações incompletas e modificações químicas das cadeias lateraiscontaminantes
Possibilidade de agregação: associação intercadeias peptídicas
Racemização provocada pela necessidade de ativar a carboxila alfa dos aminoácidos em meio básico para a formação da ligação peptídica
Não suporta síntese de longas sequências.
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RENDIMENTO
Não é 100%, mas
tentamos aumentar a
quantidade de peptídeo
sintetizado com o uso
de um excesso de
reagentes – isso não é
problema, pois o
excesso é lavado a
cada etapa!
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REFERÊNCIAS
Machado, A., et al. SÍNTESES QUÍMICA E ENZIMÁTICA DE PEPTÍDEOS: PRINCÍPIOS BÁSICOS E APLICAÇÕES .Quim. Nova, Vol. 27, No. 5, 781-789, 2004.
ESTUDO DA SÍNTESE CONVERGENTE DE PEPTÍDEOS EM FASE SÓLIDA: ABORDAGEM CLÁSSICA E USO DE TEMPERATURA ALTA. - César Manuel Remuzgo Ruiz.: Dissertação de Mestrado USP, São Paulo, 2003.
APPLIED Biosystems – Technical Bulletin Cleavage, Deprotection, and Isolation of Peptides after Fmoc Synthesis
The Chemical Synthesis of Peptides http://nzic.org.nz/ChemProcesses/biotech/12E.pdf
A NEW CONCEPTION OF POLYMERIC SUPPORTS FOR THE SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS: RIGIDITY AND POROSITY AS DETERMINANT FACTORS FOR THE SUCCESS IN INDUSTRIAL APPLICATIONS – Sara Cantone. Tese de Doutorado: Università degli studi di Triest, Itália, 2008.
Advanced Automated Peptide Protein Technologies – Coupling Reagents Thttp://www.aapptec.com/broch/Coupling%20Reagents.pdf
SÍNTESE DE PÉPTIDOS ENVOLVIDOS EM MECANISMOS DE ACÇÃO ANTIBIÓTICA - Sílvia Maria da Silva Pereira Faria. Dissertação de Mestrado: Faculdade de Ciências, Universidade do Porto, 2003
Organic Chemistry - Clayden, Jonathan; Warren, Stuart; Wothers, Peter; Clayden, Jonathan ; Greeves, Nick. Editora: Oxford Univ Press Usa
Organic synthesis in drug discovery - http://userwww.sfsu.edu/~cberkman/640_org_synth_drug_discov_1.pdf
![Page 37: LBQP- peptídeos (4)](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062303/5572020a4979599169a2d9d0/html5/thumbnails/37.jpg)
Muito obrigada!!!