東レリサーチセンター The TRC News No.116（Mar.2013）・41

●LC-MS/MSによる核酸医薬品の定量−アンチセンスDNAを用いた検討事例−

1.はじめに

　核酸医薬品とは、核酸（DNA，RNA）が十数個～数十個つながった鎖状の構造を持ち、遺伝子と異なりタンパク質をコードせず、核酸そのものが機能を持つ医薬品の総称である。核酸医薬品は、「分子標的薬」であり、疾患に関係する特定のmRNAやmiRNA、タンパク質を標的として、遺伝子発現を抑制したり、タンパク質の機能を阻害する。　核酸医薬品は、アンチセンス、siRNA、リボザイム、アプタマー、デコイ核酸という5つのジャンルに分類され、それぞれ作用機序に特徴を有し、最先端のバイオ医薬品として、がんやウイルス感染症を始め、様々な治療薬の開発が行われている。なお、アンチセンス及びアプタマーに関しては既に上市されている。　ところで、核酸医薬品の作用を知るうえで、従来の医薬品同様、その体内動態（吸収、分布、代謝、排泄）を把握することは重要である。その分析手法としては、汎用性の高いLC/MS/MS法が有効である。また、確立された方法は、各種の合成核酸化合物の純度分析にも展開することが可能である。　本稿では、癌原遺伝子であるC-mycの修飾アンチセンス（AS C-myc、分子量4857）を核酸医薬品のモデルとして、FDA BMV（Bioanalytical method validation）ガイダンスに従い、ヒト血漿中定量法の検討を行った事例を紹介する。

2.分析条件

2.1　AS C-mycの特徴及び内標準物質について　AS C-mycは、生体内に存在する各RNA分解酵素に対する抵抗性を高める目的で、3＇位のリン酸基の1つの水酸基（-OH）を、イオウ基（-S）で置換した、15 merのオリゴヌクレオチドである（図1参照）。したがって、AS C-mycは未修飾のオリゴヌクレオチドと比較して脂溶性が高いことから、内標準物質には、AS C-mycより塩基長が長く、未修飾の29 merオリゴヌクレオドを用いた。

2.2　前処理条件　フェノール－クロロホルムによる古典的な液－液抽出法の検討を実施した。前処理工程を下記に示す。

2.3　MS/MS条件　AS C-mycの標準溶液を負イオン検出ターボイオンスプレー法によりMS測定した結果を図2に示す。検出された多価イオンの中から、最も安定して検出された8価のイオン（［M-8H］8︲、m/z 606）をプレカーサーイオンとし、プロダクトイオンスキャンを実施した。

図2　AS C-mycのプレカーサーイオンスキャン

2.4　LC条件　イオンペア―逆相クロマトグラフィー（以下IP-

LC-MS/MSによる核酸医薬品の定量−アンチセンスDNA

を用いた検討事例−薬物動態研究部　安田　周平

図1　AS C-mycの構造

42・東レリサーチセンター The TRC News No.116（Mar.2013）

●LC-MS/MSによる核酸医薬品の定量−アンチセンスDNAを用いた検討事例−

RPC）によるLC条件検討を実施した。核酸分析におけるIP-RPCの特徴は、リン酸基が解離して生じる陰イオンに対して、カウンターイオンを提供する試薬（アミン系等）を移動相に添加することでイオンペアを形成させ、疎水性相互作用による逆相分配を利用し保持・分離することが挙げられる1︶。

2.5　評価項目

　2．1から2．4に記載した方法を用いて、ヒト血漿中のAS C-myc濃度測定を実施した。評価項目及びLC/MS/MS条件を下記に示す。

︵1︶　検量線の直線性　ヒト血漿に標準溶液を添加して4.00～2000 ng/mLの検量線用試料を調製し、直線性を確認した。 ︵2︶　日内再現性　3濃度水準のヒト血漿QCサンプル（LQC：10.0 ng/mL、MQC：100 ng/mL、HQC：1600 ng/mL）を調製し、真度（% Nominal）及び精度（% CV）を確認した。

LC/MS/MS分析条件HPLC：LC1100 seriesTM(Agilent)　　Column：ProtecolTM-PC18 HPH125

　　　5 µm, 2.1 mm I.D.×150 mm

　　Mobile phase A：2.85 mM TEA and 100 mM HFIP＊

＊1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol

　　Mobile phase B：methanol

　　Flow rate：0.15 mL/min

LC Time program：　　Gradient method

Mass spectrometer：4000QTRAP(AB Sciex)　　Ionization mode：Turbo ion spray︵Negative︶

　　Ionization voltage：-4.0 kV

　　Turbo probe temp.：600℃

　　Monitor ion：

　　　AS C-myc m/z 606 → m/z 95

　　　IS︵29 mer oligonucleotide︶ m/z 892 → m/z 79

3.測定結果

　4.00～2000 ng/mLの範囲において、濃度とピーク面積の間に直線関係が認められた。また、3濃度水準のヒト血漿QCサンプルを用いて、日内再現性を確認した結果、真度（% Nominal）は±15%以内、精度（% CV）は15%以内と良好であった。% Nominal及び% CVは以下の式から計算した。血漿QCサンプルの日内再現性の結果を表1に示す。代表的なクロマトグラムを図3に示す。

％ Nominal＝ 実測値の平均値

基準値 ×100

　　％ CV＝ 　 標準偏差 　 実測値の平均値

×100

表1　日内再現性の結果

図3　 MQC（100 ng/mL）クロマトグラム

4.まとめ

　LC-MS/MSによるヒト血漿中AS C-mycの定量法について紹介した。既にsiRNAやmiRNAの分析法開発にも着手しており、本手法が汎用性の高い方法であることが明らかになりつつある。miRNAは、臓器によって発現プロファイルが大きく異なり、正常時と疾患時において発現が異なっている。近年、血中においてmiRNAが安定して存在することが報告されている2︶ことからも、バイオマーカーとしての期待が高まっている。今後、核酸系化合物をバイオマーカーとして評価する系の構築が求められることが予想される。

5.参考文献

１） P. Deng et al.：J. pharm. biomed. Anal, 52, 571, （2010）

2）Gilad, S. et al.：PLoS One, 3, e3148（2008）．

■ 安田　周平（やすだ　しゅうへい） 薬物動態研究部　薬物動態研究室

趣味：バレーボール