M6decine et Maladies Infectleuses. 1972 - 2 - 10 - 367-370

Le diaonoslic biolooique des leplospiroses par M. M A I L L O U X * et H.H. M O L L A R E T **

Si l'associalion d'un ict~re [~brile, d'un syndrome mdning6 el d'tzne alleinle rOnale est plas qu'6vocutrice d'une leptospirose, les [ormes anictdriques, [~briles oil rdnales pures, les [ormes monosymptomatiques, lel/es les [opines ocuhdres, ne peuvent ~tre rattuch~es d leur ~tiologie sans l'aide du laboraloire. Quelle que salt la ,tartar clinique, celui-ci est indispensable pour a[[irmer le diagnostic de leplospiros'e, pr6ciser le skrogroupe de lu souche en cause el permetlre les enqu6les dpid~miologiques.

En raison des carucl~risliques lr~s parliculi~res des leplospires el de la necessttd de disposer, pour" tes examens sdrologiques, d'une gamme complete de souches vioantes de lous les sdrogroupes, le diagnostic biologique de leptospi- rose ne pent ~tre el[ecru6 que darts des luboraloires spdcialis~s " ' ' .

L E B I L A N B I O L O G I Q U E

Ce b i l a n " n t peut qu 'o r i en te r It d iagnost ic t n inerrant en 6vidence an synd rome r6nal, avec hyper- azot6mic et a l l )uminur ie , un syndrome h6pat ique avec augmenta t ion tics t ransaminases , de la b i l i ru- bine, des phosl)lmtases et des l ipides, une hypopro- t id6mie, une pc rhwba t ion ties 6preuves de Mac La- gan, de Hanger, (It Kunkel , de Gros, etc., et un syn- drome h6matologique et h6morragique avec an6mie mod6r6e, hyper l t tmocytose el polynucl6ose neutro- phile, I)aissc du htux des plaquettes, 16g~re augmen- ta t ion du temps de sa ignement et h6malur ic mi- croscol)ique. Cts r6sultats, s ' i ls sont d ' un in to '6 t pro-

nosl ique majeur , n ' appor t cn t aucune ind ica t ion ~tio- logiquc.

Deux ordres de m6thodes peuvent ~)tre utilisds pour aff irmer le d iagnost ic : la recherche directe des leptospires par cul ture ct par inocula t ion et la re- cherche des an l icorps qui peuvcnt ~h'e d6cel~s sous diverscs formes : agglut inine , lysine, prdcip i t ine , sens ib i l i sa t r ice , immuni s ine , h6nmgghl t in ine , etc.

L ' in t r ade r lno r~act ion n 'es | pas ulilis6e : il n 'existe ac tuel lement aucun allergdne valable.

Le choix des mOhodes (It d iagnost ic est fonct ion du stade de la maladie (fig. 1) : les leptospires p e u -

Fig. 1. - Lel)tOsl)irose ictdro-hOnorragique : chronologic des manifestations cliniques et biologiques.

4 0 *C

I57"C

Incubolion

PR~:S E N C E de L E P T O S P I R E S dons=

J f le S A N G . . . . . . . . . . I q le L . C . R . . . . . . . . . . i "~ Ii les U R I N E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . q. . . . . . . . . . . . . I- . . . . . . . . . . . . . '

P R i ~ S E N C E 1 I d ' A N T I C O R P S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .~ . . . . . . . . . . . . I

i P ~ r i o d e J ~ l o l o g i q u e m e n f

mueffe

COURBE THERMIOUE

0 5 e J O U R I O e J O U R I 5 e j O U R 2 0 e J O U R Phose pr~ict~rique O~fervescence Apyrexie Rechule

" 1 1

Convolescence

�9 Lal)or:tioire des Leptospires. Institut Pasteur, 25, rue

)

tilt l)r-Roux, F-75, Paris (15"). ** Service d'Epiddmiologie, Institut Pasleur, 25, rue du

D"-Roux, F-75, Paris (150.

" (l~3taill6 darts l'article tie M. ,Mailloux et M. C:,valier : Le Bilan Biologiquc d-ins les Leptospiroses >>, M~d.

et M,l. Infect., 1971, I, 10, 403-406.

"'" A Paris : Insli tut Pasleur, Laboratoire des Lep- tospires (Dr Mailloux) ; il Lille : Institut Pasteur (D r Catsaras) ; h Lyon : Institut Pasteur (D r Guil- lermel) ; h Nancy : Laboratoire de Bacteriologic du C.H.U. (Prof. Burdin) ; h Montpellier : Laboratoi W tie Baet[!riologie, Cliniques Saint-Eloi (Prof. Man- din) ; h Rouen : Laboratoire central de l'H61el-Dieu (Prof. Boiron) ; h Strasbourg : Faeult6 de M~!deeine (l)rof. Minck) ; a Toulouse : H6pital Purl)an (Prof. l.a reng).

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vent 6tre mis en 6vidence dans le sang et le l iquide c6phalo- rach id ien du 1 ~ au 7-8" jour de la maladie et dans les ur ines ~ pa r t i r du 15 ~ jour envi ron , ee- p e n d a n t que les an t icorps sont d6celables ~ pa r t i r du 10-12 ~ jour. ll existe donc, entre le 7-8 ~ jour el le 10-12 ~ ]our, une pdriode biologiquemenl muelle.

LA RECHERCHE DU GERME

a) D a n s le s a n g : L'h6mocul ture doit 6ire ex6cut6e dans les 6-8 pre-

miers jours, au lit du malade et en mi l ieu " conve- nable. I | est impor t an t de d i luer le sang successive- men t dans p lus ieurs tubes. Les tubes ensemenc6s dot- vent 6tre conserv6s h 30~ h l 'obscur i t6 et r6guli6re- ment examin6s du ran t deux roots.

L ' inocu la t ion du sang pa r vote in t rap6r i ton6ale ou sous-cutan6e fi l ' an ima l sensible (jeune cobaye, hams- ter dor6, m6rion, ]apereau) doit 6galement 6tre faite du ran t la p remibrc semaine de la maladie.

Le r6suitat de l ' i nocu la t ion d6pend de l 'esp6ce an imale utilis6e et de la vari6t6 de leplospire en cause, a ins i que de sa vi rulence. Le cobaye, sensible au groupe Icterohaemorrhagiae , Pest moins aux grou- pes Canicola, Sejroe et Hebdonmdis ; il ne l 'est pas aux groupes Grippolyphosa, Balaviae, Pomona, Hyos. Le hamster est sensible aux groupes Grippotyphosa, Pomona et Auslralis.

I . ' i nocu la t ion de L. Iclerohaemorrhagiae au cobaye en t ra ine le l endema in une hyper thermie , puts, vers le 4-5 ~ jour, alors que la fi6vre disparai t , un ict6re, visible il la cornde, qui s ' accentue jusqu'~ la mort. Les leptospires appara i ssen t dans le sang enh'e le 2 ~ et le 5 ~ jour. Ils l)euvent 6galement 6tre recher- ch6s dans les ur ines . La mort su rv ien t entre le 5 ~et le 12" jour de la maladie. L 'autopsie r6vble un ict+re g6n6ralis6 et des h6morragies visc6rales. Les lepto- spires sont faci lement mis en 6vidence dans le foie et les reins, par examen direct ou par culture.

b) D a n s l e l iqu ide e 6 p h a l o - r a c h i d i e n :

La recherche est posi i ive daos la premibre se- maine de la maladie ; elle se fera par cxamen direct du L.C.R. au microscope i] fond no i r ou en fluores- cence, par cul ture et par inocu la t ion i] l ' an imal . L ' examen direct dolt 6tre fait sur le l iquide lui- m6me et nora sur un culot de cen t r i fuga l ion dans le- quel les leptospires ne sont plus reconnaissables .

e) D a n s les u r i n e s :

La recherche peut 6Ire faite a parti]" du 15 ~ jour, soit par examen direct (en d is t inguant , chez la femme en par t icul ier , les leptospires des t r6pon6mes sapro- phytes), au microscope i~ fond noi r ou en fluores- cence, soil par culture, soit par inocula t ion i] l ' ani - real sensible.

Culture et inocula t ion doivent 61re prat iqudes aussit6t apr+s l '6miss ion des ur ines : apr~s deux heures, les leptospires, tr,~s fragiles, sont lys6es. Il est done inut i le d ' adrcsser des ur ines pa r vole pos- tale au laboratoire.

* It en existe plusieurs : milieu de Reiler-Ramme, de Stuart, de Korthof, elc., qui peuvent 6tre obtenus il l ' Insti tut Pasteur.

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d) D ' u n e f a g o n g 6 n 6 r a l e :

La raise en 6vidence du germe est possible : - - morphologiquement : l ' examen d i rec t apr6s co-

h)rat ion par la t echnique de Vago ou par colora- t ion de Giemsa prolong6e, plut6t qu 'apr6s ni- t ra ta t ion est ddlicat et ne peut 6tre fait que par une personne tr6s enlra in6e. L ' examen /a l '6tat frais, pe rmet lan t d ' app r6c ie r la mobil i td caract6r is t ique ou l ' examen en f luorescence assurent un diagnost ic plus stir ;

- - par culture et par inoculation d l 'animal : ces deux techniques doivent toujours 6tre teni6es conjo in tement .

Pot]]" la culture, on pr6f6rera les mi l ieux naturels pepton6s plut6t que les mi l ieux synth61iques, peu favorables h l ' i so lement au sor t i r de l 'organisme.

Le d6veloppement des 6ventuelles haet6ries con- t aminan tes sera inh ib6 pa r l ' ad jonc t ion de 5 Fluorou- raci l (200 it 400 p.g par nil) auquel les leptospires sont insensibles .

En ra ison de l ' ac t ion inh ib i t r i ce de cer ta ins cons- t r u a n t s du sang ou de l 'ur ine , les l iquides organiques pr61evds seront (lilu6s de tube i/ tube lors de leur ensemencement .

Dans l ' i gnorance du s6rogroupe en cause, l ' ino- culat ion il l ' an imal devra 6tre faite i] deux espdces s imullandment, eobaye et hamster en prat ique.

Era ra ison de la fragilitd des leptospires et de la rapidi t6 avec laquelle elles se lysent hors de l 'orga- nisme, la raise en cul ture comme l ' i nocu la l ion il l ' an imal doivent 6ire faites au lit mdme du mr

Les chances d ' i so lement de leptospires i] pa r t i r des ur ines sont faibles 2 heures apr6s leur 6mission et nulles passd 6 heures. Des isolements ont pu 6tre obtenus i] pa r t i r du sang ou du L.C.R. 24 et m6me 48 heures apr6s leur pr616vement ; en fait d 'auss i longs d61ais doivent 6tre proscr i ts . Dolt 6tre p rosc r i t dgalement l 'emploi de substances an t icoagulan tes aci- d.ifiantes (citrate de soude) lorsque le sang pr61ev6 ne peut 6tre imm6dia tement ensemenc6 ou inocul6.

L 'on re t i endra sur tout que la mei l leure faqon d 'as- surer la viabi l i t6 et le t ranspor t des leptospires est l ' i nocu la t ion in t rapdr i ton6a le du cobaye jeune.

L ' i so lement du germe permet son ident i f ica t ion et son typage. C'est done l ' a rgumen t 6tiologique de choix. Mats cette ident i f ica t ion ne peut 6ire faite que dans un laboratoi re sp6cialis6, poss6daut une collect ion de souches r6gul i~rement en t re tenues et une s6rie complete d ' i m m u n s 6 r u m s i] taux 61evds.

LA RECHERCHE DES ANTICORPS

Elle peut 6tre cffectu6e il pa r t i r du 10-12" jour de la maladie . Les an t icorps pers is tent au m i n i m u m plus ieurs mois aprbs la gu6rison et hab i tue l l ement p lus ieurs ann6es, h des taux significatifs. P lus ieurs r6aet ions ont 6t6 propos6es :

1) R 6 a c t i o n d ' A g g l u t i n a t i o n - L y s e (R.A.L.)

(Martin, Peltit el Kolochine-Erber) .

Cette r6action, fid+le et sp6cifiqne, n6cessite l 'em- plot de 12 il 20 antigbnes, &off la complexi t6 de son ex6cution et de sa lecture. Elle ne peut 6tre confi6e

qu'h un pe r sonne l Iongucment enlrain6. Son p r inc ipe consiste h meHre en cONtact les ant ig6nes (cul lures vivanles tie divers serotypes) et les d i lu t ions de s6rum de malade du 1/10" au 1/10.000".

La lecture se fair au microscope h fond noir pat" compara i son au t61noin. Trois pa ramOres sont ap- pr6ci6s :

lo nontbre de leptospires demeur6s l ibres ; - - l ' agglut inat ion : ntassive, moyenne ou faible ;

la lyse : forle, faible ou nulle.

La r6ponse peut ~tre : posilive lorsque l ' agglu t ina t ion et la lyse p e r -

s i s t e n t h des taux sup6r ieurs a u 1 / 1 0 0 ~ ;

- - m;gative lorsque l 'aspect est iden t ique fi eelui des t6moins ;

- - ou poser un problbme d'inlerprdlalion :

II faut savoir l '6ventual i t6 d ' tm ph6nom6ne de zone, mats sur tout il faut conna i t r e la pr6sence des coagglut in ines pouvant se mani fes | e r entre plu- s ieurs s6rogroupes. Elles sont frdquentes au dObut de la format ion des ant icorps . D'autres prOl6vements doivent alors 0Ire examin6s au 20"-30" jour et au delft.

Une r~ponse ndgalive est possible au tou r s d 'une au thent ique l ep tosp i rose ; il peut s 'agir :

- - s o i t d ' un prdl~vement sanguin Irop prOcoce, ell'ectu6 avant le 12" jour ;

- - s o i t d 'un s6rotype inhal)i luel , non compris dans la gamme des antigOnes utilisbs en rou- t ine courante, (l'oh la nOcessit6 pour le labo- ratoire de possdder une gamme 6tcn(lue tic s6rotypes et pour ]c c l in ic ien demandan t l 'exa- nten, d'adresser au tcrboraloire le ma:rimtHn de renseignemenls (profession du malade, voya- ges outre-mer, contact avec l 'eau ou les ani- lnaux, lieu 6venluel de la con ta ln ina t ion) afin d 'o r i en te r le choix ties antig6nes ;

- - soit de var in l ions ind iv idue l les dans l ' ap t i tude r6act ionnel le ties sujets ; c'est le cas ties ani- maux, por teurs sains de leptospires et h sdro- logic n@at ive ;

- - s o i t d 'un traitemeNt pr6coce par les ant ibio- tiques ou los cort ieoidcs.

Inversement , il faut connai l re , chez les anc icns malades, la possibil iI6 de la pers is tance d 'an t icorps , it des taux souvent 61cv6s nmis f ixes ; e'cst dire fi

nouveau la n6cessil6 tlc rdpdler los examens i, 10- 15 jours d ' in terval lc .

2 ) A u t r e s t e c h n i q u e s s 6 r o l o g i q u e s :

D'aulres techniques s6rologiques out 0 6 propo- s6es :

- - cer la ines ne sont que des var ian tes de la R.A.L. : relic l 'u t i l i sa t ion dc cul lures enr ich ies qui ndeessite la eent r i fugat ion des cultures, &oft le r isque de fausse posit ivit6 par cr6at ion m6canique d 'amas tie leptospires ou l 'ut i l isa- t ion tie suspens ions formolbes donl la lyse est real vis ible et les r6sultats peu sp6cifiques ;

- - d 'autres, comme la rdaclion macroscopique s u r lame ou la rdact ion cn tubes capi l la ires , util i- sant des ant igbnes tu6s, la r6action de t ixat ion du compl6nacnl et la l-6aclion d 'hdmolyse des h6maties sensibi l is6es sont nmins sensibles et peu sp6cifiques ;

- - les techniques d ' immunof lu , , rescence so,at li6cs ii des an t icorps qui pnra i ssen t trbs labiles. La r6action, moins sensible que la ILA.L., est sp6- cifique du genre et non du s6rotype. Les con- tr61cs vis-fi-vis d 'aut res ant igbnes (orni those- psittacose en par t icul ier ) doivent Ore mult i- pli6s ;

- - l a recherche d ' i m m u n i s i n e s peat se faire .a l)art ir du 15" juur. Ellc consiste en la raise en prOsencc tie 1 fi 2 ml tie s6rum du malade et de cul ture v i ru lente de L. iclerohaemorrhagiae pendan t 1/2 heure. Ce m61ange est ensuite ino- cul6 au cobaye. Si la r6acl ion est positive, l ' an imal cst protOg6. Le cobayc tOmoin qui a regu In cul ture mdlangde i, (Itl Sel'[lln normal succombe h la maladie expdr imcntale .

CONCLUSION

En cas de suspic ion de leptospirose, il doit t~'tre effectu6 :

1) dans la premi&'e semaine de la maladie u n e

hdntocullure en mil ieu spdcial et, si possible, une inoctdalion gt I'aninud. L,e L.C.R. pel'naeth-a 6gale- inent une culture, Vinoculat ion fi l ' an imal et an- ~ recherche directe tic leptospires en f luorescence ;

2) apr~s le 12" jottr, u n s&.odiagnostic qui peut et d , i t ~tre rdp6t6 10 fi 15 jours plus l a r d

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