le système de sécrétion de type ii chez v. cholerae melissa petiti m2 mbvb sécrétion des...
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Le système de sécrétion de type II
chez V. cholerae
Melissa PETITIM2 MBVB
Sécrétion des facteurs de virulence et relation bactéries-
hôtes
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Vibrio cholerae
Bactérie gram – 1 flagelle polaire Sécrétion de la
toxine cholérique
Introduction
Figure 1 : V. cholerae observées au microscope électronique
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Le système de sécrétion de type 2
Prise en charge des protéines après translocation dans le périplasme via Sec/Tat
Complexe inséré dans les deux membranes
Analogie avec le Pilus de type IV
Introduction
Figure 2 : Modèle de sécrétion des protéines via le SST2Chez P. aeruginosa (Voulhoux et al. 2001)
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Modèle du SST2 chez V. cholerae
Complexe protéique codé par les gènes eps
EpsD : sécrétine EpsE : ATPase de trafic EpsG : pseudopilus ( + Eps HIJK ) EpsM, L, C et F :
plateforme de membrane interne
Introduction
Figure 3 : Modèle du SST2 chez V. cholerae
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2001 : le complexe SST2 est localisé au pôle cellulaire
Figure 4 : Localisation des protéines de fusion pGFP-EpsL et pGFP-EpsM (Scott et al. 2001)
Figure 5 : Microscopie à fluorescence en temps réel pour la protéine de fusion pGFP-EpsM (Scott et al. 2001)
Partie 1
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EpsM est-elle localisée au pôle de la cellule ?
Observer la localisation cellulaire des protéines codées par les gènes eps
Fusion des protéines d’intérêt à la GFPExpression à partir d’un plasmide avec et sans induction dans une souche mutante
1 : Localisation cellulaire de la protéine pGFP-EpsM
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La distribution native d’EpsM n’est pas aux pôles cellulaires
Induction à l’IPTG : Foyers de fluorescence aux pôles de la cellules
Sans induction :Fluorescence visible à la périphérie de la cellule
1 : Localisation cellulaire De la protéine pGFP-EpsM
Figure 6 : Localisation cellulaire de la protéine chimère pGFP-EpsM dans une souche mutante epsM
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Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome
Observer la localisation cellulaire des protéines GFP-Eps produites à partir du chromosome
copies chromosomiques des gènes eps remplacées par les copies fusionnées à la GFP
(souches gfp-epsC et gfp-epsM)vérifier la production des protéinesvérifier la fonctionnalité du système avec ces
fusions
Partie 2
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Les protéines de fusion GFP-EpsM
et GFP-EpsC sont produites
Figure 7 : Western blot indiquant la production des protéines chimères
2 : Localisation des protéines chimères
exprimées à partir du chromosome
1 : souche WT2: gfp-epsM
1 : souche WT2: gfp-epsC
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Les protéines de fusion GFP-EpsM
et GFP-EpsC sont produites
Figure 7 : Western blot indiquant la production des protéines chimères
2 : Localisation des protéines chimères
exprimées à partir du chromosome
GFP-EpsCGFP-EpsM
1 : souche WT2: gfp-epsC
1 : souche WT2: gfp-epsM
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Les protéines de fusion GFP-EpsM
et GFP-EpsC sont produites
Figure 7 : Western blot indiquant la production des protéines chimères
2 : Localisation des protéines chimères
exprimées à partir du chromosome
GFP-EpsM
EpsC
GFP-EpsC
EpsM
1 : souche WT2: gfp-epsC
1 : souche WT2: gfp-epsM
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Les fusions gfp-epsC et gfp-epsM sont fonctionnelles
Mesure de l’activité des protéases sécrétées par V. cholerae via le SST2.
Les protéines de fusion sont des composants fonctionnels du SST2
2 : Localisation des protéines chimères
exprimées à partir du chromosome
Tableau 1 : Mesure de l’activité protéase des souches WT et possédant les fusions
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Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire
GFP-EpsM : 3,2 foyers / cellule
GFP-EpsC : 5,3 foyers / cellule
2 : Localisation des protéines chimères
exprimées à partir du chromosome
Figure 8 : localisation cellulaire des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM produites à partir du chromosome
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Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire
GFP-EpsM : 3,2 foyers / cellule
GFP-EpsC : 5,3 foyers / cellule
2 : Localisation des protéines chimères
exprimées à partir du chromosome
Figure 8 : localisation cellulaire des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM produites à partir du chromosome
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Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire
GFP-EpsM : 3,2 foyers / cellule
GFP-EpsC : 5,3 foyers / cellule
2 : Localisation des protéines chimères
exprimées à partir du chromosome
Figure 8 : localisation cellulaire des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM produites à partir du chromosome
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Les foyers de fluorescences correspondent-ils aux complexes
SST2 ?
Observer la co-expression des protéines natives et chimères.
souche gfp-epsM + pEpsM souche gfp-epsC + pEpsC
Partie 3
Construction de souches dans lesquelles l’opéron eps est sous le contrôle d’un promoteur inductible
Introduction des fusions gfp-epsC et gfp-epsM sur le chromosome
PBAD::eps gfp-epsC
PBAD:: eps gfp-epsM
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Les protéines natives ont remplacé les protéines chimères dans le complexe
Signal GFP diffus dans les cellules Absence de foyers distincts de fluorescence
3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes
SST2 ?
Figure 9 : localisation cellulaire des protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM dans des souches contenant respectivement les plasmides pEpsC et pEpsM
A B
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Le nombre de foyers et le taux de sécrétion augmentent avec le niveau
d’expression
Figure 10 : localisation cellulaire des protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM avec ou sans induction du promoteur pBAD
Figure 11 : quantification des foyers de fluorescence et mesure de l’activité protéase correspondante
x7
3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes
SST2 ?
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Les modèles précédents sont-ils fidèles à la distribution WT des
protéines Eps
Localisation du complexe SST2 par immunofluorescence
Anticorps anti-EpsCAnticorps anti-EpsG
3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes
SST2 ?
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EpsG est distribuée à la périphérie des cellules
Figure 12 : Localisation de la protéine EpsG native par immunofluorescence dans une souche WT et une souche ΔepsG
3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes
SST2 ?
WT WT
ΔepsG ΔepsG
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Comment s’assemble la machinerie SST2 ?
Relation entre le cytosquelette bactérien et le SST2inhibition des filaments MreB et observer l’effet
sur le SST2 Rôle d’ancrage, d’arrimage du complexe ?
Mutations des gènes eps dans les souches gfp-epsC et gfp-epsM
observer l’effet de ces mutations sur la sécrétion des protéines
observer l’effet de ces mutations sur la localisation des protéines chimères
Partie 4
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MreB forme des filaments hélicoïdaux qui structurent la cellule
4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ?
Figure 13 : Localisation cellulaire de MreB (Jones et al. 2001)
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Le SST2 s’assemble indépendamment des filaments MreB
Figure 14 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC et croissance bactérienne après traitement de la souche gfp-epsC au A22
Figure 15 : Effet du A22 sur le niveau de sécrétion
4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ?
ExtB
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Les mutations affectent la fonction du complexe SST
L’activité protéase est restaurée lorsque l’on complémente la mutation
Le complexe retrouve sa fonction de sécrétion
Tableau 2 : Mesure de l’activité protéase dans le surnageant de culture de souches mutantes et complémentées
4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ?
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Les mutations affectent la fonction du complexe SST
L’activité protéase est restaurée lorsque l’on complémente la mutation
Le complexe retrouve sa fonction de sécrétion
Tableau 3 : Mesure de l’activité protéase dans le surnageant de culture de souches mutantes et complémentées
4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ?
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EpsD est requise pour un assemblage focal d’EpsC
Figure 16 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC dans des souches mutantes eps
4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ?
ΔepsD : fluorescence diffuse
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EpsM et EpsL stabilisent EpsC à la périphérie de la cellule
Figure 16 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC dans des souches mutantes eps
4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ?
ΔepsM ou ΔepsL : fluorescence aux pôles en phase stationnaire
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EpsM requière EpsC pour sa localisation
Figure 17 : Localisation cellulaire de GFP-EpsM dans des souches mutantes eps
4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ?
ΔepsC : fluorescence diffuse
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EpsM requière EpsD et EpsCpour sa localisation
Figure 17 : Localisation cellulaire de GFP-EpsM dans des souches mutantes eps
4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ?
ΔepsD : fluorescence diffuse
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EpsD, EpsC et EpsL sont requises pour la localisation correcte d’EpsM
Figure 17 : Localisation cellulaire de GFP-EpsM dans des souches mutantes eps
4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ?
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Les protéines EpsM et EpsC sont partiellement colocalisées
Figure 17 : Colocalisation des protéines GFP-EpsM et mCherry-EpsC dans une souche WT de V. cholerae
11% de foyers jaunes :
complexes SST2 assemblés.
Foyers verts ou rouges :
complexes dont l’assemblage n’est pas terminé.
4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ?
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Enfin un premier modèle d’assemblage du SST2 !
2009 : Première publication au sujet de l’assemblage du SST2
Localisation membranaire latérale Importance de la stœchiométrie entre les
partenaires Mise en évidence d’un modèle d’assemblage
Conclusion
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Modèle d’assemblage EpsD semble être l’initiateur de la
formation du complexe EpsC s’associe pour former un
complexe mais interaction directe ? EpsL et EpsM s’assembleraient
ensuite et EpsM stabiliserait cette interaction
Conclusion
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Pour aller plus loin
Étude des interactions protéine/protéine physique (co-IP, double hybride)
Etude interactions protéine/protéine par fluo (dynamique)
Conclusion
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Merci de votre attention !