legionella kolonizáció diverzitása...
TRANSCRIPT
LegionellaLegionella kolonizáció diverzitása kolonizáció diverzitása
ivóvízhálózatbanivóvízhálózatban
Barna Zsófia
Eötvös Loránd Tudományegyetem - Természettudományi KarKörnyezettudományi Doktori Iskola
Barna Zsófia
Témavezetı: Dr. Vargha Márta
Országos Környezetegészségügyi Intézet
Belsı konzulens: Dr. Márialigeti Károly
ELTE Mikrobiológiai Tanszék
A A Legionella Legionella baktériumbaktérium
� Gyakran vízzel asszociált kórokozó – nedves
meleg környezetben fordul elı
� Vízi egysejtő eukarióta szervezetekben
intracellulárisan is szaporodik
� Szaporodásának optimális hımérséklete: 25-45°C
� Gram-negatív, aerob, poláris vagy szubpoláris � Gram-negatív, aerob, poláris vagy szubpoláris
csillós pálca
� A Legionella genusnak > 50 ismert faja van
� Eddig 21 fajról derült ki, hogy képes humán
megbetegedést okozni
� A jelentett fertızések 80-90 %-a a Legionella
pneumophila-ra vezethetı vissza
� L. pneumophila-nak 16 szerotípusa ismert
� L. pneumophila 1 okozza a legtöbb megbetegedést
A legionellosisA legionellosis
A Legionella által okozott
humán megbetegedések
összefoglaló neve
� Pontiac-láz
(nem pneumóniás forma)
� Legionárius betegség
(pneumónia)
Kockázatot jelentı közegekKockázatot jelentı közegek
� hőtıtornyok
� légkondícionáló berendezések
� épületek nedves hőtési technológiával üzemelı légkondicionáló berendezései (hőtıtornyok)
� rosszul kialakított felületi hőtık (pl. split-klíma)
� (nagy) épületek hideg- és melegvíz-rendszerei
� Kórházak
� Szállodákban/irodaházak
� Oktatási intézmények
� szökıkutak
� légnedvesítı berendezések
� pezsgıfürdık
� kerti locsolók
� talaj
Bejelentett legionellosis esetek számaBejelentett legionellosis esetek számaMagyarországon Magyarországon (1998(1998--2008)2008)
60
80
100
120
Esetszám [fı]
nem halálos kimenetelő
halálos kimenetelő
Egyedi vizsgálati járványügyi lap
bevezetése
A nyilvántartásban
csak pneumoniával
járó megbetegedések
0
20
40
1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
Esetszám [fı]
Morbiditás [fı/millió lakos] 1,3 1,2 2,0 2,7
Letalitás [%] 15,4 8,3 30,0 14,8
Forrás:Dr. Horváth Judit Krisztina
Országos Epidemiológiai Központ, Járványügyi Osztály
CÉLKITŐZÉS:Legionella hazai elterjedésének vizsgálataLegionella hazai elterjedésének vizsgálata
LegionellaLegionella kolonizáció hazai hálózati kolonizáció hazai hálózati vízrendszerekben vízrendszerekben –– objektumokobjektumok
Összes vizsgált objektum: 102102
Legionella-val kolonizált: 66 66 (65 %)(65 %)
15
20
25
objektumok száma [db]
0
5
10
objektumok száma [db]
Szállodák
Egészségügyi Int.
Oktatási int.
Élelmiszereá. üzem
Gyógyszergyár
Üzem - egyéb
Irodaház
Magánház
Áruház
nem kolonizált kolonizált
Mintavételi pontokMintavételi pontok
szállodák
eü. intézmények
oktatási intézmények
élelmiszer eá. üzem
irodaház
üzem - egyéb
gyógyszergyár
150
200
250
300
vízm
inták szám
a [db]
Összes vizsgált minta: 10651065
Legionella kimutatható: 466 466 (44%)(44%)
1 000 CFU/L felett: 267 (25 %)267 (25 %)
LegionellaLegionella kolonizáció hazai hálózati kolonizáció hazai hálózati vízrendszerekben vízrendszerekben –– mintákminták
0
50
100
vízm
inták szám
a [db]
Szállodák
Egészségügyi Int.
Oktatási int.
Élelmiszereá. üzem
Gyógyszergyár
Üzem - egyéb
Irodaház
Magánház
Áruház
< 10 10-1000 > 1000
Hımérséklet hatása a Hımérséklet hatása a LegionellaLegionella--kolonizációrakolonizációra
N=656
Kritikus hımérséklet-tartomány
60
80
100
120
140
160
Vízminták száma [db]
40%
60%
80%
100%
<1000
>1000
75,2 %N=656
� Szaporodási hımérséklet tart.: 20-50°C
� 20°C alatt perzisztál
� 60°C-on 3 perc alatt pusztul el
� 70°C felett azonnal elpusztul
0
20
40
60
Hımérséklet [°C]
Vízminták száma [db]
� Összesen 656 minta
� Minták 75,2 %-a esik a 20-54,9°C-os tartományba
0%
20%
< 10
10-14,9
15-19,9
20-24,9
25-29,9
30-34,9
35-39,9
40-44,9
45-49,9
50-54,9
55-59,9
> 60
Hımérséklet [°C]
CÉLKITŐZÉS: Intézkedések a Legionella csíraszám Intézkedések a Legionella csíraszám
visszaszorítására
Védekezési lehetıségek Védekezési lehetıségek
a legionellák ellena legionellák ellen
� Aktív módszerek: csökkentik a baktériumok számát
� Klóros fertıtlenítés (pl. klór-dioxid)
� Ózonos fertıtlenítés
� UV-sugaras fertıtlenítés
� UV-sugárzás + ultrahang
� "aacheni-módszer"
� Mikrobicidek alkalmazása
� Termikus fertıtlenítés
� Passzív módszerek: megakadályozzák a baktériumok
szaporodását
� A gyár egész területén problémát jelent a Legionella jelenléte
� Kísérleti jelleggel hıfertıtlenítés az egyik – 2004-ben épült – épületben
� Vegyszeres kezeléstıl elzárkóznak
� Választott kezelés: rendszeres hıfertıtlenítés
HıkezelésHıkezelés
10 000
100 000
Legionella [CFU/l]
1. pont
2. pont
3. pont
2009.04.17.
2008.11.01.
2009.03.07.
1
10
100
1 000
2007.07.26
2008.04.07
2008.10.08
2008.11.03
2008.12.11
2009.03.12
2009.04.22
Legionella [CFU/l]
4. pont
Egyszeri vegyszeres fertıtlenítésEgyszeri vegyszeres fertıtlenítés� Egészségügyi intézmény – használati melegvíz-hálózata a tényleges vízfogyasztáshoz képest
jelentısen túlméretezett
� HMV tartály cseréje az elsı vízvizsgálati eredmények után
� Fertıtlenítés:
� A használati melegvízhez nagy koncentrációban klór-dioxid oldatot adagoltak
� 100 l 0,3%-os klór-dioxid oldat (kb. 600 mg/l végkonc.)
� 24 órát maradt a rendszerben a fertıtlenítıszer (10 mg/l végkonc.)
� Csapok kifolyatása 0 mg/l szabad-klór koncentrációig49
46 4646 4644 43
10 000
100 000
50
60
� 50% hidrogén-peroxid és ezüst: kb. 5-10mg/l (2-58 mg/l) - jelenleg folyamatos4140 40 40
44 4340
1
10
100
1 000
2007.11.06 2009.02.02 fertıtl. elıtt
2009.02.02 -fertıtl. után
2009.05.05
0
10
20
30
40
HMV tartály
3. emelet
1. emelet
Legionella csíraszám [CFU/l]
Hımérséklet [°C]
CÉLKITŐZÉS: CÉLKITŐZÉS: Legionella-törzsgyőjtemény
létrehozása és jellemzése létrehozása és jellemzése
Pozitív vízmintákból 3-3 izolátumTörzsgyőjtemény:
864 Legionella törzs
Faj alatti szintő azonosítás Faj alatti szintő azonosítás
szerológiai vizsgálattalszerológiai vizsgálattal
N=520
3,5%9,0% 0,6% 21,3%
17,7%
2,1%
nem aggl.
L. pn. 1
L. pn. 2
L. pn. 3
L. pn. 4
L. pn. 5
L. pn. 6
1,3%14,0%27,5%
1,5%1,3%
L. pn. 6
L. pn. 8
L. pn. 9
L. pn. 10
L. pn. 12
L. pneumophila 3: 14,0 %
L. pneumophila 6: 17,7 %
L. pneumophila 1: 27,5 %
Kérdések:
• Miért kizárólag Legionella pneumophila?
• 21,3 %-ban L. pn. 2-14 szerocs. (=nem aggl.)
→ további vizsgálatok
Denka Seiken Ltd.
A A L. pneumophilaL. pneumophila 22--14 szerocsoportú 14 szerocsoportú
törzsek molekuláris vizsgálataitörzsek molekuláris vizsgálatai
rpoB PCR-RFLP is – probléma a PCR optimalizálásával
� cél: a törzsek faj alatti szintő azonosítása
ARDRA1 csoport1 faj
Hinf I
Alu I
Genus specifikus PCR – minden izolátum pozitív
� cél: a törzsek faj alatti szintő azonosítása
� csoportosítás REP-PCR-rel (11 csoport)
� reprezentánsok → szekvencia-analízis
� mip gén – 16S rDNS-nél variábilisabb régió
� faji szintő azonosítás 95% hasonlóság felett
� 6 törzs > 95% hasonlóság → Legionella pneumophila
� nagy hasonlóság több Legionella pneumophila szerotípussal is
Szekvencia-analízis
Megoldás: MLST beállítása
� REP-PCR vizsgálat (ERIC primerekkel)
� 377 vizsgált izolátum (+ típustörzsek):
� Egy-egy dendrogram a kül. intézményekbıl izolált törzsek hasonlósági viszonyait ábrázolja
� Összevetettük a kül. intézményekbıl izolált jellemzı törzsek mintázatait egymással
� Különbözı mintavételi helyekrıl is lehet hasonló REP-PCR mintázat1
� Összes izolátum: 12 nagyobb REP-PCR csoport
Ismert szerotípusú Ismert szerotípusú L. pneumophilaL. pneumophila
törzsekkel végzett vizsgálatoktörzsekkel végzett vizsgálatok
� REP-PCR-rel kapott csoportosítás összevetése a szerotípusokkal
szerotípusok alatti felbontás
szerotipizálás kiváltására közvetlenül nem alkalmas
1 REP-PCR csoport – több szerotípus
1FPQuestTM Software (verziószám: 4.5)
Dice hasonlósági index, UPGMA távolságszámítás
0
1
2
3
4
5
6
7
1.eü
.*2.eü
.4.eü
.8.eü
.10
.eü.*
11.eü.
12.eü.*1.sz
.2.sz
.3.sz
.4.sz
.5.sz
.*7.sz
.*8.sz
.
szerotípusok
REP-PCR csoportok
Célkitőzés: Célkitőzés:
Real-time PCR beállításaReal-time PCR beállítása
DNS kivonásDNS kivonás� Feltételezett elıny: csak az élı sejtek
� Alátámasztás: Pseudomonas aeruginosa-val elölt Legionella
� További elıny: Alacsony csíraszámnál is reprodukálhatóan mőködik
� Módszer beállítása: 1. Legionella-val inokuált steril deszt. víz minta (10-104 CFU/l)
2. Legionella-val + P. aeruginosa-val inokuált steril deszt. víz minta (mátrix: 10 és 103 CFU/L)
3. Legionella-val inokuált steril deszt. víz minta (10-104 CFU/l) + összcsíra (104CFU/L)
y = -1,0945x + 9,1293
R2 = 0,8248
y = -0,51x + 3,9136
R2 = 0,9492
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2
minták
értékek
DNS konc. [ug/ml]
log 10 Legionella csíraszám[CFU/100ml]
Lineáris (DNS konc. [ug/ml])
Lineáris (log 10 Legionellacsíraszám [CFU/100ml])
RealReal--time PCRtime PCR
102 kópia
� 16S rDNS és mip gén alapú egyidejőleg
� Alacsony csíraszámnál is
� Elızetes eredmények: 100 kópia – számunkra elégséges érzékenység
� Eddig csak inokuált vízmintán teszteltük (Legionella pneumophila 1)
Célkitőzés: Célkitőzés:
FISH technikán alapuló módszer beállítása
Fluorescens Fluorescens in situin situ hibridizálás (FISH)hibridizálás (FISH)
CÉL: FISH-technika alapú módszer kidolgozása a
legionellák megtelepedésének és túlélésének
közvetlen vizsgálatára biofilmekben
1. A legionellák megtelepedésének nyomon-
követése tárgylemezen növesztett biofilmben
Kérdés: amıbák nélkül képesek-e szaporodni?
2. Legionellák vízmintából történı kimutatására 2. Legionellák vízmintából történı kimutatására
alkalmas FISH technika kidolgozása
Terv:
� A vízmintát membránszőrın szőrjük
� A filtert néhány órán át elıinkubáljuk
� Közvetlenül a filteren végezzük a hibridizációt
Beállítás alatt – eddig beállítva tárgylemezen
Célkitőzés: Célkitőzés: Bevezetett módszerek alkalmazása
járványügyi kivizsgálásoknáljárványügyi kivizsgálásoknál
Járványügyi kivizsgálásokJárványügyi kivizsgálások
� A bevezetett vizsgálati módszerek alkalmazása járványügyi kivizsgálásoknál
� Szerotipizálás (pontos szerotípus meghatározás)
� Törzsek elızetes vizsgálata: REP-PCR
� PFGE (pulse field gel electrophoresis)
� Esetek� Esetek
� Nosocomiális eset I. – ø humán izolátum
� Nosocomiális eset II. (két kórház érintett) – ø humán izolátum
� Területen szerzett legionárius megbetegedés – ø humán; økörnyezeti izolátum
� Utazással összefüggı legionárius megbetegedés
Utazással összefüggı legionárius Utazással összefüggı legionárius megbetegedés kivizsgálásamegbetegedés kivizsgálása
Dice (Opt:1.00%) (Tol 1.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]Legionella_9812
100
90
80
70
60
Legionella_9812
�
�
�
�
�
.
.
.
.
.
1251/1/1
1258/2/1
1251/1/2
1254/2/2
1253/2/2
.
.
.
.
.
1
1
1
1
1
Vizsgálati módszer: kromoszóma restrikciós enzim emésztést követı PFGE (pulzáltatott mezejő gél elektroforézis)
Lpn001
N=27
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
1253/2/2
1258/1/08
198
1256/1/1
1250/1/1
732/1/08
723/1/08
725/1/08
726/1/08
716/2/08
734/2/08
711/2/08
.
.
.
.
.
1
1
1
3
3
1
1
1
1
1
1
1
Lpn001
Lpn002
ÖsszefoglalásÖsszefoglalás� Az összesen vizsgált 102 objektum 65 %-a legionellával kolonizált
� Az összes vizsgált minta (1 065) 25%-nak Legionella-csíraszáma haladja meg az 1 000 CFU/l-t
� A rendszeres hıfertıtlenítés megfelelı védelmet biztosít; a vegyszeres fertıtlenítésnél elengedhetetlen a megfelelı méretezés
� 864 törzsbıl álló törzsgyőjtemény összeállítása
� Leggyakoribb szerotípus: L. pneumophila 1, 6, 3� Leggyakoribb szerotípus: L. pneumophila 1, 6, 3
� REP-PCR nem alkalmas a szerotipizálás kiváltására, de járványügyi kivizsgálásoknál elıszőrésre kiválóan alkalmazható
� Beállított módszerek sikeres alkalmazása járványügyi kivizsgálásoknál
� További feladatok:
1. Real-time PCR alkalmazása valós vízmintákon
2. FISH beállítása (és FISH beállítása biofilm-vizsgálatokra)
3. MALDI-TOF MS eredmények kiértékelése
4. MLST beállítása és alkalmazása a járványügyi szempontból releváns törzseken
PublikációkPublikációkCikk referált folyóiratban:
Zs. Barna, K. Antmann, R. Bánfi., M. Németh., A. Szax, M. Vargha: Role of drinking water system in the transmission of Pseudomonas aeruginosa and Legionella ssp. in an intensive care unit. in: Journal of Water and Health – folyamatban
Nemzetközi konferencia részvételek:
� Vargha, M.; Barna, Zs.; Illés, E.; Varga, D.; Kádár, M.: Tracing Legioneallae in a hospital’s hot water system by rep-PCR and intact cell MALDI-TOF MS. International Symposium on Microbial Ecology, Bécs, Ausztria, 2006. 08
� Barna, Zs.; Bognár, Cs.; Horváth, K.; Kalácska, J.; Kádár, M.; Vargha, M.: Prevelance of Legionella types in Hungarian water samples by different typing methods. 22nd Meeting of European Working Group for Legionella Infections. Stockholm, Svédország, 2007.06
� Barna, Zs.; Bognár, Cs.; Kádár, M.; Kalácska J.; Szax, A.; Vargha, M.: Current status of environmental Legionella prevalence in Hungary. 23th Meeting of European Working Group for Legionella Infections. Madrid, Spanyolország, 2008.05
� Zs. Barna, K. Antmann, J. Pászti, M. Németh, R. Bánfi, M. Vargha Tap water as a potential source of nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections in an intensive care unit, 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Helsinki, Finnország, 2009.05
Témavezetés:
� Szax Anita (ELTE TTK): Legionella környezeti elıfordulásának jellemzése, Budapest, 2009