les techniques de la biologie moléculaire. introductionintroduction
TRANSCRIPT
![Page 1: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/1.jpg)
Les techniques de la Les techniques de la biologie moléculairebiologie moléculaireLes techniques de la Les techniques de la biologie moléculairebiologie moléculaire
![Page 2: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/2.jpg)
IntroductionIntroductionIntroductionIntroduction
![Page 3: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/3.jpg)
• "Chercher une aiguille dans une meule de foin" ?
• Chercher à repérer un gène particulier dans un génome entier, qui en contient jusqu'à des centaines de milliers, c'est un peu comme chercher une aiguille dans une meule de foin...
![Page 4: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/4.jpg)
•La réponse a ce problème :
Les techniques de la biologie moléculaire
![Page 5: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/5.jpg)
L’électrophorèseL’électrophorèseL’électrophorèseL’électrophorèse
![Page 6: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/6.jpg)
![Page 7: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/7.jpg)
L’électrophorèse des acides nucléiques
• Déplacements de fragments d’acides nucléiques chargés selon leur taille sur un gel soumis a un champ électrique
![Page 8: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/8.jpg)
Le gel utilisé
L’agarose pourles fragments d’ADN
de taille (0,5-20kb)
L’acrylamide pour lesfragments de moins
de 1000 pairesde base
![Page 9: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/9.jpg)
L’électrophorèse en champs alternées
Principe• On change périodiquement
l’orientation du champ par a port au gel ,lors du changement de l’orientation du champ électrique l’acide nucléique change le sens de son orientation .
![Page 10: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/10.jpg)
![Page 11: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/11.jpg)
![Page 12: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/12.jpg)
Visualisation par autoradiographie
![Page 13: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/13.jpg)
But
Séparer, analyser ou purifier des acides nucléiques
![Page 14: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/14.jpg)
Remarque
• Les fragments d’acides nucléiques peuvent être séparer selon leur structure ;par exemple les différents formes d’un plasmide (ouvert ,linéaire ,surenroulé)
![Page 15: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/15.jpg)
![Page 16: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/16.jpg)
Remarque
• Elle permet aussi d’étudier des interactions des acides nucléiques avec des protéines
![Page 17: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/17.jpg)
La centrifugationLa centrifugationLa centrifugationLa centrifugation
![Page 18: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/18.jpg)
Centrifugation en gradient de saccharose
• Principe:
• Séparer les macromolécules selon leur poids moléculaire et/ou leur
forme
![Page 19: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/19.jpg)
Utilisations majeurs• Purification des phages• Sélection des fragments d’ADN
voulus• Isolement des polysomes• Fractionner les ARN (ARNm, ARNt,
…)
![Page 20: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/20.jpg)
Un exemple d'utilisation de la
centrifugation zonale : le fractionnement de
molécules d'ARN
![Page 21: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/21.jpg)
![Page 22: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/22.jpg)
Centrifugation en gradient de chlorure de
césium1. /Centrifugation isopycnique
(gradient continu)Utilisation d’une:
Solution de chlorure de césium(CsCl)
![Page 23: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/23.jpg)
Utilisations majeurs• Préparation de plasmides et de
phages
Exemple: La purification des plasmides
![Page 24: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/24.jpg)
![Page 25: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/25.jpg)
2/ .Centrifugation sur coussin (gradient
discontinu)
![Page 26: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/26.jpg)
Utilisation majeure
• préparation rapide et à grande échelle des phages ou des virus de densité connue.
![Page 27: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/27.jpg)
• Un exemple d'utilisation de la centrifugation sur coussin : la
purification des phages
![Page 28: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/28.jpg)
![Page 29: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/29.jpg)
La PCRLa PCRLa PCRLa PCR
![Page 30: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/30.jpg)
Historique• En 1960 dans les sources de
Yellowstone aux U.S.A. « Thermus aquaticus » est découverte vivant à 70°C, trente ans plus tard son ADNpoly <Taq > est utilisée dans la PCR
• (La revue Sciences décernait sa 1ere distinction de molécule de l’année à la Taq polymérase)
![Page 31: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/31.jpg)
Définition
• PCR « polymérase chain reaction ») technique d’amplification in vitro mis au point par le chimiste Kary MULLIS en 1985 ( Prix Nobel 1993)
![Page 32: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/32.jpg)
Principe
Faire progresser nos capacité d’analyse des gènes
![Page 33: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/33.jpg)
Composés utilisés• L’ADN matrice• Amorces d’oligonucléotides • Une ADN polymérase• Des désoxyribonucléotides
triphosphate (dNTP)
![Page 34: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/34.jpg)
Déroulement des cycles
d’amplification
• La dénaturation• L’appariement des primers• Elongation
Schéma de la PCR
![Page 35: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/35.jpg)
![Page 36: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/36.jpg)
ApplicationsLa PCR a apportée d’importantes
contributions dans beaucoup de domaines:
• Les maladies héréditaires• La recherche contre le cancer• Les sciences médico-légales • Les biotechnologies
![Page 37: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/37.jpg)
L’hybridationL’hybridationL’hybridationL’hybridation
![Page 38: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/38.jpg)
Généralités
Les techniques de l’hybridation reposent sur :
Complémentarité des
bases successives de
l’ADN
La réversibilité du processus de séparations deux brins d’ADN
![Page 39: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/39.jpg)
Les cas possibles pour une hybridation
1. Hybridation stable (100%) 2. Pas d’hybridation3. Hybridation partielle (50%)
![Page 40: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/40.jpg)
But
Repérer une molécule d’ADN ou d’ARN spécifique dans une
population hétérogène
![Page 41: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/41.jpg)
Les différentes techniques
d’hybridation• Hybridation ADN/ADN :
Southern blotting • Hybridation ARN/ADN :
Northern blotting• Hybridation Dot-blotting et
slot-blotting
![Page 42: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/42.jpg)
Southern
• Sonde ADN
• Cible ADN (nucléaire,
phagique plasmidique ou autres,…)
![Page 43: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/43.jpg)
Northern
• Sonde ADN
• Cible ARN
![Page 44: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/44.jpg)
Dot-blotting & Slot-blotting
• Sonde ADN
• Cible ARN ou ADN Monocaténaire
![Page 45: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/45.jpg)
Conclusion
• Grace aux techniques de la biologie moléculaire les chercheurs ont pu établir une partie de la carte des gènes humains, et espèrent obtenir le séquençage de tous le génome humain a des fins thérapeutique, médicales, a titre de prévention
![Page 46: Les techniques de la biologie moléculaire. IntroductionIntroduction](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062404/551d9d84497959293b8bf154/html5/thumbnails/46.jpg)
Référence• *Cours de l’institut national de recherche pédagogique • *Biologie moléculaire PCEM 1 2006-2007 Université de Paris –VI
Faculté de Médecine Pierre et Marie Curie • *Comprendre la biologie moléculaire V. Laudenbach’, (2), J. Mantz(1),
J.M. Desmontsl(1) (1) ‘Département d’anesthésie-réanimation chirurgicale, hôpitaux Bichat-Claude Bernard-Robert Paris ;
• (2)Laboratoire de neurologie du développement Paris • * Thèse de Licence d’informatique Année 2001-2002 Option :
Introduction à la biologie moléculaire • *Principes des techniques de biologie moléculaire 2° édition Par D.
Tagu, C.Moussard, éds (I.N.R.A. de Paris)• *Article du magazine La recherche édition spéciale < Les frontières
du vivant > N°317 Février 1999• * Participation à l’établissement d’une phylogénie moléculaire de
requins d’eau profonde de l’ordre des Squaliformes de L’Université de Nantes Département Sciences et Techniques Alimentaires Marines
• *L’essentiel en génétique Edition : BERTI • *Biochimie génétique biologie moléculaire de Jacqueline Etienne &
Eric Clauser Edition Masson• *Principe de génie génétique 6° édition ; édition De Boeck