leveduras e produção de biomassa - ufrj
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Leveduras e
Produção de
Biomassa
Prof Bernardo Dias
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
EQB353 - MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
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Levedura origem etimológica na palavra “levare”
(crescer ou fazer crescer) primeiras leveduras
descobertas a processos de fermentação
Existem aproximadamente 350 espécies diferentes
de leveduras, separadas em cerca de 39 gêneros.
São largamente encontradas na natureza solo,
superfícies de órgãos dos vegetais, principalmente
em flores e frutos, trato intestinal de animais, líquidos
açucarados e grande série de outros locais
INTRODUÇÃO
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Habitat
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As leveduras são fungos que se apresentam
predominantemente, sob forma unicelular.
Uma levedura típica células ovais, que se multiplicam
assexuadamente (brotamento ou gemulação) Não
formam corpos de frutificação.
Como células simples, as leveduras crescem e se
reproduzem mais rapidamente do que os bolores.
Leveduras eficientes na realização de alterações
químicas, por causa da sua maior relação área/volume.
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A maioria das leveduras não vive no solo adaptação
a ambientes com alto teor de açúcares (néctar das
flores e a superfície de frutas).
As leveduras também diferem das algas, pois não
efetuam a fotossíntese, e igualmente não são
protozoários porque possuem uma parede celular
rígida de quitina.
São facilmente diferenciadas das bactérias em virtude
das suas dimensões maiores e de suas propriedades
morfológicas
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Leveduras
Bolores
Penicillium
Aspergillus
Saccharomyces
Trichoderma
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Morfologia
Pleomorfismo:
Macroscopicamente:
Trigonopsis variablisSaccharomyces cerevisiae
Saccharomyces
Rhodotrula
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Redondas Trigonopsis
Candida
Saccharomyces
Ovais Hansenula
Saccharomyces
Trigonopsis
Cilíndricas Hansenula
Saccharomyces
Kloëckera
Triangulares Trigonopsis
Apiculares Kloëckera
Ogivas Bretanomyces Trigonopsis variablis
Bretanomyces dekkera
Candida albicansSaccharomyces
cerevisiae
Kloëckera
Saccharomyces
cerevisiae
Hansenula
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Dimorfismo nos fungos
O que é dimorfismo?
- Alguns fungos apresentam tanto a forma leveduriforme como a forma
filamentosa, sendo considerados dimórficos
Alguns fungos filamentosos em certas condições nutricionais (ambiente
rico em açúcar) podem crescer na forma leveduriforme.
Micologia médica crescimento micelial (22° e 28°C) e leveduriforme
(35°C e 37°C) reversibilidade da morfologia.
Dimorfismo fúngico Histoplasma capsulatum, Blastomyces
dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii.
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Dimorfismo nos fungos
Paracoccidioides brasiliensis
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Taxonomia – Filo Ascomycota
Subfilo Saccharomycotina
Classe Saccharomycetes
Subfilo Taphrinomycotina
Classe Schizosaccharomycetes
Schizosaccharomyces é um gênero de leveduras de fissão.
É o único gênero na família Schizosaccharomycetaceae, a única família da ordem
Schizosaccharomycetales, que é a única ordem na classe Schizosaccharomycetes
do filo Ascomycota.
A espécie mais bem estudada é S. Pombe.
Tal como a distantemente aparentada Saccharomyces cerevisiae, S. pombe é um
organismo modelo importante no estudo da biologia das células eucariotas.
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Taxonomia – Filo Basidiomycota
Leveduras Basidiomicéticas (Bensingtonia, Rhodotorula, Bullera, Cryptococcus,
Rhodotorula e Sporobolomyces – Sporidiobolous) são normalmente encontradas
em substratos que possuam componentes mais complexos.
Leveduras Ascomicéticas (Candida, Saccharomyces, Debaryomyces,
Schizosaccharomyces) são frequentemente encontradas em substratos ou fontes
ricas em açúcares simples (frutos)
Subfilo Agaricomycotina
Classes Tremellomycetes (fungos dimórficos)
Dacrymycetes
Actinomycota x Basidiomycota
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Aplicações
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LEVEDURA – MODELO DE ESTUDO DA CÉLULA
EUCARIÓTICA
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Parede Celular
Ligação Glicosídica
A parede celular das leveduras é composta principalmente por polissacarídeos de
glucose e manose, algumas proteínas e quitina.
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Parede Celular
Quitina
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Membrana Plasmática
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A) Grânulos metacromáticos, constituídos de
polimetafosfato inorgânicos.
B) Reserva de Glicogênio hidratos de carbono
encontrado em células adultas.
C) Grânulos lipóides em quantidade variável com a
espécie de levedura, a idade da célula e o substrato.
D) Mitocôndrias se apresentam com aspecto
filamentoso, constituídos de lipoproteínas com
pequena quantidade de ácido ribonucleico, e contendo
enzimas respiratórias
E) O núcleo é bem definido, pelo menos em células em
vias de reprodução; pequeno, esférico ou reniforme,
de localização variável, associado a vacúolo nuclear.
O Citoplasma
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O Núcleo
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Mitocôndria
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Retículo Endoplasmático;
Ribossomos
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Complexo de Golgi; Vacúolo; Lisossomas
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Nutrição e Fisiologia das Leveduras
Nutrição é heterotrófica absorção de nutrientes, digestão extracelular
Sob condições anaeróbicas, a via clássica, usada pela maioria das
leveduras, é a de Embden-Meyerhof (via glicolítica clássica), que
resulta na formação de piruvato.
As substâncias orgânicas, de preferência, são carboidratos simples
como D-glicose e sais minerais como sulfatos e fosfatos.
Oligoelementos (ferro, zinco, manganês, cobre, molibdênio e cálcio)
são exigidos em pequenas quantidades.
Temperatura de crescimento abrange uma larga faixa, havendo
espécies psicrófilas, mesófilas e termófilas. Não toleram pH alcalino
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Oxidativo: C6H12O6 CO2 + H2O + 36 ATP
Fermentativo: C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP
MetabolismoO2
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Reprodução
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Reprodução
Candida albicans
Blastoconídio - uma única estrutura
desenvolve-se por brotamento ou
gemulação, com separação posterior
entre este e a célula mãe
Clamidoconídio - as células terminais
ou intercaladas de uma hifa aumentam
de tamanho e desenvolvem paredes
espessas. Têm função de resistência
BROTAMENTO
FISSÃO
DIVISÃO BINÁRIA
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ReproduçãoAureobasidium pullulans
Leveduras pretas (melanizadas) – formação de
clamidoconídios
Debaryomyces etchellsii
Outros nomes: Kloeckera faecalis, Pichia etchellsii,
Pichia faecalis, Torulaspora etchellsii, Zygopichia
etchellsii
Formação de Pseudo-hifas
Sporobolomyces roseus
Leveduras vermelhas da
classe Urediniomycetes
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Reprodução – brotamento (pseudo-hifas)
Sporobolomyces phyllomatis
a-d CBS 7198.
a. yeast cells on YMoA;
b. pseudohyphae on Dalmau plate (YMoA);
c. germinating yeast cell on PDA;
d. ballistoconidia on CMA.
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Reprodução
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Reprodução Ascomicetos
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Aplicações
- Fermento de pão
- Bebidas
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- Etanol Combustível
-Proteína (“Single cell protein”)
Ração animal complemento
nutricional
- Medicamento
Aplicações
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-Enzimas
Invertase Lactase
Lipase
- Pró-vitamina A
- Biosurfactantes
Aplicações
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Produção de Biomassa
Cn(H2O)n + O2 + NH3 + P, S, K, Na, Mg, Ca, Fe
Substrato Oxigênio Amônia Sais Minerais
(CHNO)n + CO2 + H2O + ∆H
Biomassa Dióxido de Água Calor de reação
carbono
São convertidos por multiplicação
celular biosíntese em:
Objetivo = obter massa microbiana para uso industrial
CRESCIMENTO MICROBIANO
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Tempo geração
- variável para os diferentes organismos
- dependente de fatores genéticos e nutricionais e ambientais
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• Crescimento em Culturas Contínuas
- Quimiostato
- controle da densidade populacional e a taxa de crescimento
- taxa de diluição e concentração do nutriente limitante (fatores)
- manutenção das células em fase exponencial
- técnica muito utilizada em processos industriais
- crescimento em equilíbrio dinâmico
Crescimento Microbiano
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Crescimento Microbiano
• Quimiostato
- Taxa de Diluição Taxa de Crescimento
- densidade controlada pela quantidade do nutriente limitante
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Métodos Diretos
• Determinação do número de
células
Contagem ao microscópio;
Contagem de colônias formadas;
Número mais provável
Contagem eletrônica (Contador
Coulter, Citometria de fluxo)
Quantificação Celular
• Determinação da biomassa
microbiana Peso Seco;
Turbidimetria;
Volume de Centrifugado;
Viscosidade
Métodos Indiretos
• Constituintes celulares
Concentração total de N ou C;
ATP;
DNA, RNA;
Conteúdo protéico;
• Dosagem de elementos do
meio de cultura
Substrato;
Consumo de O2;
Produção de CO2;
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• Contagem de Células Viáveis
(contagem em placa e diluição seriada)
- coleta de alíquotas de uma cultura microbiana ou amostra ambiental
- utilização do método da diluição seriada
- inóculo em meio sólido (spread plate ou pour plate)
- contagem das colônias formadas (30 e 300 colônias)
- diminuição do erro triplicatas ou quintuplicatas (validação estatística)
Medidas do Crescimento Microbiano
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Medidas do Crescimento Microbiano
• Diluição Seriada + Spread Plate
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Métodos Diretos
Contagens de colônias
formadas;
• Determinação do número de células
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Medidas do Crescimento Microbiano
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Medidas do Crescimento Microbiano
• Número Mais Provável (NMP)
- amplamente utilizado em laboratórios de microbiologia
- utilização de volumes decimais de uma dada amostra (10, 1 e 0.1 ml)
- réplicas correspondentes a 5 tubos, observando ou não crescimento
- contagem de tubos positivos – cálculo pela Tabela do NMP
- exemplos: contagem de microrganismos com dada atividade metabólica
atividade nitrificante ou atividade celulolítica
contagem de coliformes fecais e totais em água
Bactérias diazotróficas
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Medidas do Crescimento Microbiano
- 95% de confiabilidade estatística da população conter realmente o número de
microrganismos relacionado na tabela.
• Número Mais Provável (NMP)
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Medidas do Crescimento Microbiano
• Contagem Total de Células (microscópio)
- Contagem direta no microscópio utilizando câmaras de contagem (amostra fixada
e corada ou a fresco – 10ml da suspensão de células)
- Não diferencia célula viva de célula morta (uso de corante vital)
- Microscopia de contraste de fase para lâminas não coradas (<106 células/ml)
Câmara de Petroff-Hausser
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Medidas do Crescimento Microbiano
• Contagem direta das células, usando uma câmara de contagem (ex.
Neubauer)
Vantagens:
◦ É o processo mais direto, econômico e rápido de contagem de
microrganismos
◦ Dá também informação sobre o tamanho e morfologia dos
microrganismos
Desvantagens:
◦ A população deve ser bastante grande para que a contagem seja o mais
real possível devido aos pequenos volumes que se utilizam para contar
◦ É impossível distinguir as células vivas das células mortas
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• Turbidimetria
- Quantificação em espectrofotômetro ou colorímetro (660 nm)
- Rápida confecção de uma curva
padrão
- baixa sensibilidade
- células viáveis X células mortas
(sem distinção)
Medidas do Crescimento Microbiano
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• Massa de Células (peso seco)
- estimativa através do peso seco
- baixa sensibilidade
- replicata – diminuição da margem de erro
- filtração da cultura líquida, secagem e
pesagem (100-160ºC / 16 horas)
Medidas do Crescimento Microbiano
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Métodos Indiretos
• Constituintes celulares
Concentração total de N ou C;
ATP;
DNA;
Conteúdo protéico;
Composto% em peso seco
Bactérias Leveduras Fungos
C 46-52 46-52 45-55
H 10 10 10
O 20 20 20
N 10-14 6-8,5 4-7
S 0,2-1 0,01-0,03 0,1-0,5
P 2-3 0,8-2,6 0,4-4,5
Mg 0,1-0,5 0,1-0,5 0,1-0,3
K, Ca 0,1-0,5 0,1-0,5 0,1-0,5
Na, Fe 0,01-0,1 0,01-0,1 0,01-0,1
Outros traços traços traços
Composição elementar
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Métodos Indiretos
• Constituintes celulares
Concentração total de N ou C;
ATP;
DNA, RNA;
Conteúdo protéico;
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Métodos Indiretos
• Dosagem de elementos do meio de cultura
Consumo de O2;
Produção de CO2;
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• Vantagens:
Tempo de geração curto
Bactérias: 30 min a 2 h
Leveduras: 1 a 3 h
Algas: 2 a 6 h
Fungos filamentosos: 4 a 12 h
Elevado teor de vitaminas
Alto conteúdo protéico
Variedade de fonte de carbono utilizada
Facilidade em realizar alterações genéticas
Instalações
Independe de fatores climáticos
Produção de Biomassa Microbiana
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Produção de Biomassa
• Leveduras de panificação
São empregadas linhagens selecionadas de S.
cerevisiae em função:
Características fisiológicas estáveis
Fermentação vigorosa do açúcar na massa
Crescimento rápido
Manutenção de boa qualidade sem
autólise
Alto rendimento no fermentador
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Produção de Biomassa
• Leveduras:
Melaço é a principal matéria-prima para a produção de
leveduras tais como S. cerevisiae e C. utilis
É um subproduto da produção do açúcar de cana e
beterraba
O melaço apresenta K, Mg, P, Zn, Fe, Cu, além de vitaminas
(biotina, ác. pantotenico, inositol, tiamina) e aminoácidos
(asparagina, ác. aspártico, alanina, ácido glutâmico e glicina)
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Produção de Biomassa
• Leveduras de panificação
Preparo do mosto:
Melaço é diluído ([açúcar]i = 0,5 a 1,5 %p/v)
Acidulado (pH 4,5 a 5,0)
Aquecido
Clarificado por filtração ou sedimentação
Esterilizado (vapor sob pressão)
Fortificado (sais de amônio, uréia sais de fósforo ou ác.
fosfórico, vitaminas) e retirada de SO3 (aeração em
temperatura alta)
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• Etapas do processo:
Cultivo do microrganismo
Esterilização
Aeração
Equipamento
Forma de Condução
Recuperação da Biomassa
Centrifugação (Leveduras e Bactérias)
Filtros rotatórios (Fungos Filamentosos)
Secagem
Quebra da parede celular (para SCP)
Produção de Biomassa Microbiana
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Produção de Biomassa
• Leveduras de
panificaçãoAltas taxas de aeração e
Sistema em batelada
alimentada com baixo teor
de açúcares favorece
respiração e crescimento
No fim da fermentação, não
se adiciona mais açúcar,
mas continua a aeração por
30–60 min, produção de
trealose.
Atua protegendo a levedura
contra congelamento e
desidratação
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Produção de Biomassa
Resolução CNNPA n. 38
Fermento biológico produto obtido de culturas puras de leveduras
(Saccharomyces cereviseae) por procedimento tecnológico adequado e
empregado para dar sabor próprio e aumentar o volume e a porosidade dos
produtos forneados” (ANVISA, 1977).
Classificação:
a) fermento fresco, também denominado: "fermento prensado", "fermento verde"
e "levedura prensada"; obtido depois da concentração, lavagem e
estabilização
b) fermento seco, também denominado: "fermento desidratado" e "levedura
seca“ ocorre a adição dos componentes abaixo, a concentração por
filtração, extrusão suave, e secagem em leito fluidizado a temperatura
ambiente
os fermentos biológicos poderão ser adicionados das seguintes substâncias,
próprias para uso alimentar: - farinhas, amidos e féculas, no máximo 5% p/p; -
óleos e gorduras comestíveis; - sulfato de cálcio; - carbonato de cálcio; - sorbitol;
- Monolaurato de Sorbitana e outras aprovadas pela CNNPA.
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Produção de Biomassa
Resolução CNNPA n. 38
Fermento fresco prensado pasta cremosa como manteiga, com textura lisa
e moldável, lembra massa de vidraceiro ou argila úmida. Pode ser adquirido em
lojas de especialidades alimentícias e mercearias de produtos naturais. 70%
umidade, se for mantido em geladeira (4 a 8ºC) se mantém por 15 dias
Para usar esse tipo de fermento esfarelá-lo diretamente na água ou no leite antes
de adicionar qualquer outro ingrediente, em temperaturas entre 20 e 32ºC.
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Produção de BiomassaResolução CNNPA n. 38
Fermento seco ativo ou fermento biológico seco a partir da secagem do
fermento fresco por ar quente. É quebrado em pequenas partículas ou grânulos do
tamanho de um alpiste. Pode ser adquirido em mercearias, supermercados e
algumas lojas de conveniências, apresenta umidade entre 7 e 9%, pode ser
conservado a temperatura de 25ºC em embalagem fechada, e estando sob
refrigeração dura de 3 a 4 meses
Uso: O fermento seco ativo deve ser reidratado em água morna (37 a 43ºC) por 10 a
15 minutos. Uma particularidade do fermento seco ativo é deixar a massa um pouco
menos elástica do que quando feita com fermento fresco, sendo preferível no
preparo de massa de pizzas
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Produção de BiomassaResolução CNNPA n. 38
Fermento biológico seco instantâneo as
leveduras são desidratadas, permanecem em estado
de dormência. Apresenta-se sob a forma de grânulos
muito pequenos, quase como areia fina, de coloração
creme claro, menores e mais lisos do que o fermento
seco ativo. Desenvolvido para dar ao padeiro agilidade
da reidratação rápida, permitindo que seja misturado
diretamente a farinha e mantendo o ótimo
desempenho do fermento fresco, vem sendo bastante
usado. Umidade de 5%, e em embalagem fechada
pode ser conservado a temperatura ambiente por até
dois anos, e sob refrigeração entre 3 e 4 meses
A reidratação não é necessária devido ao pequeno
tamanho dos grânulos. Pode ser adicionado à farinha,
porém a temperatura ótima da massa recomendada
no preparo deve ser elevada em cerca de 2 a 3ºC para
melhor desempenho.
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Produção de Biomassa
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Produção de Biomassa
• Levedura alimentar
S. cerevisiae e C. utilis são propagadas em diferentes
substratos e comercializadas como fonte de proteínas e
vitaminas do complexo B para suplementação humana ou
rações animais
As leveduras resultantes dos processos exclusivamente
destinados a sua propagação são denominados leveduras 1as,
enquanto que as obtidas como subprodutos de outra indústria
são denominadas leveduras 2as (recuperadas de cervejarias e
destilarias)
Componentes
Proteína > 45%
Gordura – 2%
Fibras – 2%
Cinzas – 7-8%
Ca – 0,1 -0,5%
P – 1,5%
Tiamina – 6 a 100 mg/kg
Riboflavina – 10 a 50 mg/kg
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Produção de Biomassa
• Levedura Alimentar
Obtenção de levedura
secundária
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Produção de Biomassa
• Levedura
Alimentar
Obtenção de
leveduras secas
em uma destilaria