lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi
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Le reazioni
antigene - anticorpo
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• La capacità di rilevare le reazioni Ag-Ab
è l’elemento fondante della
immunoematologia
• La reazione Ag-Ab nella sierologia dei
gruppi sanguigni può dar luogo a:
• agglutinazione
• emolisi
• precipitazione
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Emolisi 1
• Rottura dei GR con conseguente rilascio
dell’emoglobina
• In vitro, l’emolisi Ab-mediata dipende dall’attività del
complemento (unità di attacco alla membrana)
• Non c’è emolisi se: • l’Ag e Ab interagiscono in un siero che manca di complemento
• o se nel plasma l’anticoagulante ha chelato i cationi di Calcio e
Magnesio necessari per l’attivazione del complemento
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Emolisi 2
• Nei test per il rilievo degli Ab anti-eritrocitari,
l’emolisi è un risultato positivo in quanto dimostra
l’unione dell’Ag con l’Ab con l’attivazione della
cascata complementare
• Un sopranatante rosato in un test con il siero ed i
GR è un’osservazione importante che può indicare
l’avvenuta reazione tra l’Ag e l’Ab
• Ab che sono emolitici in vitro:
• anti-Vel
• anti-Lea
• anti-Jka
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Precipitazione
• Formazione di un complesso insolubile,
solitamente visibile, che viene originato dalla
reazione di un Ab solubile con un Ag solubile
• La precipitazione del complesso Ag-Ab richiede che
entrambi siano presenti in proporzioni ottimali
• Se l’Ab è presente in eccesso, restano disponibili
troppo pochi siti antigenici per legare a ponte le
molecole e la struttura reticolare non viene formata
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Agglutinazione
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Agglutinazione 1
• Aggregazione mediata da anticorpi, di particelle che
presentano il relativo Ag sulla loro superficie
• L’agglutinazione dei GR avviene perché le
molecole degli Ab si legano ai determinanti antigenici
dei GR adiacenti, legandoli tra di loro a formare un
aggregato visibile
• E’ il risultato finale della maggior parte degli esami
di immunoematologia
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Agglutinazione 2
• In alcuni casi, l’Ab colma direttamente la distanza
tra i GR adiacenti
• In altri casi invece, le molecole di Ab si legano agli
eritrociti ma non li agglutinano. Si rende quindi
necessaria una fase aggiuntiva per indurre
un’agglutinazione visibile
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Agglutinazione 3
• E’ una reazione chimica REVERSIBILE che
avviene in 2 fasi:
• SENSIBILIZZAZIONE: attacco dell’Ab all’Ag
sulla membrana del GR
• formazione dei ponti tra gli eritrociti
sensibilizzati per creare il reticolo che
costituisce l’agglutinazione
• Diversi elementi sono in grado di agire sulle due
fasi per potenziare o ridurre l’agglutinazione
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Agglutinazione:
fase 1, sensibilizzazione
• Al principio, l’Ag e l’Ab devono avvicinarsi e
interagire in un’idonea relazione spaziale
• Elementi che possono aumentare la probabilità che
l’Ag e l’Ab si leghino:
• centrifugazione
• agitazione
• modificando le concentrazioni di entrambi
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• l’Ab e l’Ag devono adattarsi
l’un l’altro in modo
complementare sia dal punto
di vista strutturale (sterico)
sia chimico
• affinché avvenga la
sensibilizzazione, si deve
formare un legame chimico
non covalente tra l’Ag e l’Ab
• Le forze che tengono uniti
Ag e Ab sono deboli e attive
solo a brevissima distanza
Tratto da Technical Manual AABB 15th Edition
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Sensibilizzazione: legami chimici
• i legami Ag-Ab sono reversibili e legami casuali si
creano e si spezzano continuamente, fino a quando
non si raggiunge uno stato di equilibrio
• Tipi di legame:
• legami idrogeno
• legami idrofobici
• legami elettrostatici o ionici
• forze di Van der Waals
• i differenti tipi di legame hanno diverse
caratteristiche termodinamiche
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Caratteristiche termodinamiche dei
legami Ag-Ab
• i legami possono essere esotermici o endotermici
• le caratteristiche termodinamiche possono alterare i
fenomeni sierologici rilevati in un test
• Gli Ag glicidici tendono a formare legami idrogeno
ESOTERMICI con l’Ag, sicché i legami sono più
stabili a basse temperature
• I legami idrofobici tipici dei legami tra Ab e Ag
proteici sono ENDOTERMICI, pertanto più forti a
temperature più elevate
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Costante di equilibrio dell’Ab 1
• la costante di equilibrio (o di affinità) K0 di una reazione è
determinata dalle velocità relative di associazione o
dissociazione
• per ogni reazione Ag-Ab la K0varia. Essa riflette il grado con
il quale un Ab e un Ag si ASSOCIANO e si legano uno all’altro
e la velocità della reazione
• Più elevato il valore di K0 migliore l’associazione
• quando K0 è elevata, la reazione avviene più velocemente
ed è dissociabile con più difficoltà; ne consegue che questi Ab
avranno una maggiore rilevanza clinica
• Il grado di conformità tra Ag e Ab è influenzato dal tipo di
legami predominanti
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Costante di equilibrio dell’Ab 2
• I legami idrofobici sono solitamente associati a
valori più elevati di K0 rispetto ai legami idrogeno
• La K0 è influenzata da condizioni fisiche come la
temperatura, il pH, la forza ionica del mezzo di
sospensione e naturalmente, alle concentrazioni di
Ag e Ab
• Nei test di laboratorio che utilizzano come risultato
finale l’agglutinazione, la modifica delle condizioni
fisiche del sistema può incrementare o ridurre la
sensibilità
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Costante di equilibrio dell’Ab 3
• La reazione Ag-Ab è reversibile e può essere descritta con
la seguente formula:
Ab+Ag AbAg
• a equilibrio raggiunto, la costante di equilibrio K è definita
con:
K1
K2
[AbAg]
[Ab]X[Ag]
[K1]
[K2] K = =
[AbAg]
[Ab] = K[Ag]
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Costante di equilibrio dell’Ab 4
• Più elevata la costante di equilibrio, maggiore sarà la
quantità di Ab che si legherà all’Ag (nella condizione di
equilibrio)
• La K di un Ab può essere considerata come una misura
della bontà dell’incastro tra l’Ab ed il suo Ag
corrispondente
• la K dipende anche dal tipo di legame: idrofobici danno
origine a maggiori affinità dei legami idrogeno
• quando K è elevata, il legame AgAb generalmente sarà
più saldo e si romperà con maggiore difficoltà
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Fattori che influenzano la reazione Ag-Ab:
la temperatura 1
• la maggior parte degli Ab contro Ag ematici reagisce in un
range di temperatura ristretto
• Gli Ab che reagiscono in maniera ottimale a temperature tra
4°-25°C vengono chiamati Ab ‘freddi’
• Quelli che reagiscono tra 30° e 37°C sono Ab ‘caldi’
• gli Ab che reagiscono in vitro solo a temperature < 30°C
raramente provocano la lisi delle emazie trasfuse positive per
l’Ag corrispondente e quindi considerati clinicamente non
significativi
• Molti Ab freddi sono IgM
• Nella maggior parte dei casi gli Ab caldi sono IgG
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Fattori che influenzano la reazione Ag-Ab:
la temperatura 2
• Non è la classe anticorpale a determinare la
temperatura di reazione dell’Ab ed il suo significato
clinico
• la temperatura di reazione è influenzata dal tipo di
reazione e la natura chimica dell’Ag
• gli Ag glicidici sono con maggior frequenza
associati con gli Ab freddi
• gli Ag proteici sono con maggior frequenza
associati con Ab caldi
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Fattori che influenzano la reazione Ag-Ab:
Il pH
• I cambiamenti di pH possono influenzare i legami
elettrostatici
• Si presume che per la maggior parte degli Ab
importanti in immunoematologia, il pH fisiologico sia
quello ottimale
• In alcuni casi è noto il pH ottimale: ad esempio
l’anti-M reagisce meglio a pH più bassi
• Per la maggior parte dei test di routine, andrebbe
utilizzato un pH attorno a 7.0
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Fattori che influenzano la reazione Ag-Ab:
Il tempo di incubazione
• il tempo necessario per raggiungere l’equilibrio è
diverso per i diversi anticorpi gruppoematici
• Variabili: temperatura, classe Ig, specifiche interazioni
tra la configurazione dell’Ag e l’Ab, l’uso di agenti
potenzianti
• per un sistema in salina in cui si utilizza un siero anti-
globulina per dimostrare l’adesione di un Ab, tempi di
incubazione tra 30 e 60 minuti sono adeguati
• il tempo di incubazione a 37°C può essere ridotto a 10-
15 min se si utilizza una soluzione a bassa forza ionica
(LISS)
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Fattori che influenzano la reazione Ag-Ab:
la forza ionica
• In una soluzione salina standard, gli ioni Na e Cl
neutralizzano parzialmente le cariche opposte presenti su
Ag e Ab
• Questo ostacola l’associazione tra Ag e Ab
• Abbassando la forza ionica della soluzione in cui
avviene la reazione, l’effetto ostacolo può essere
superato e l’attrazione elettrostatica incrementata
• Riducendo la concentrazione salina siero-cellule viene
aumentata la velocità con cui gli Ag e Ab si incontrano e
può essere aumentata la quantità di Ab legato
![Page 24: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/24.jpg)
Fattori che influenzano la reazione Ag-Ab:
concentrazioni relative di Ag e Ab
• un eccesso di Ag dovrebbe portare ad un incremento
della quantità di Ab adeso; ciò è favorevole per gli
assorbimenti
• Per la maggior parte dei test, un eccesso di Ag riduce il
numero di molecole di Ab fissate ad ogni GR, limitando la
loro capacità di agglutinare
• E’ preferibile un eccesso di Ab
• Standard: 2 gocce di siero + 1 goccia di sospenzione
dal 2 al 5% di GR
• se l’Ab è debolmente reattivo, l’aumento della quantità
di Ab può migliorare la sensibilità del test
![Page 25: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/25.jpg)
Agglutinazione:
fase 2, creazione dei ponti tra i GR
• Dopo l’adesione degli Ab agli Ag sulla superficie dei
GR (sensibilizzazione), i GR devono essere legati in un
reticolo
• Il reticolo consente la visualizzazione della reazione
• Fattori che influenzano la formazione del reticolo: • dimensioni e proprietà fisiche delle molecole Ab
• concentrazione degli Ag su ogni GR
• la distanza tra i GR
• i ponti tra gli Ab legati ai GR si producono per collisione
casuale tra GR sensibilizzati
![Page 26: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/26.jpg)
Agglutinazione:
fase 2, creazione dei ponti tra i GR
• in condizioni isotoniche, i GR non possono
avvicinarsi ad una distanza inferiore a 50-100
Angstrom
• le molecole di IgG non riescono a colmare questa
distanza tra i GR e quindi determinano la
sensibilizzazione senza formare il reticolo
(eccezione: IgG anti A, B, M, N)
• Con le molecole IgM, l’agglutinazione di verifica
facilmente
![Page 27: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/27.jpg)
Agglutinazione:
fase 2, creazione dei ponti tra i GR
• i GR sospesi in soluzione salina hanno una carica netta
di superficie elettronegativa e di conseguenza si
respingono tra di loro
• le molecole elettronegative sulla membrana cellulare
provocano repulsione
• Metodi per ridurre la repulsione: centrifugazione, siero
antiglobuline, riduzione carica elettronegativa mediante
enzimi proteolitici, riduzione dello stato di idratazione
atorno ai GR, introduzione di macromolecole cariche
positivamente
![Page 28: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/28.jpg)
Il test
all’antiglobulina
![Page 29: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/29.jpg)
test all’antiglobulina 1
• 1945: Coombs, Mourant e Race descrivono un test per
evidenziare gli anticorpi che non producono
agglutinazione
• utilizza un Ab contro le globuline umane
• inizialmente usato per evidenziare Ab nel siero, è stato
poi usato per studiare l’adesione di Ab e complemento a
GR in vivo
• produce agglutinazione visibili delle emazie
sensibilizzate
![Page 30: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/30.jpg)
test all’antiglobulina 2
• Test all’antiglobulina INDIRETTO (TAI)
• usato per rilevare in vitro le reazioni tra gli eritrociti e
gli Ab che sensibilizzano ma NON agglutinano i GR
con Ag corrispondenti
• Test all’antiglobulina DIRETTO (TAD)
• per lo studio della sensibilizzazione in vivo dei globuli
rossi
![Page 31: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/31.jpg)
test all’antiglobulina 3
Principi del test
• tutte le molecole anticorpali sono globuline
• se inoculiamo un animale da laboratorio con globuline
umane, il suo sistema immunitario produrrà anticorpi
specifici anti-globuline
• il siero che reagisce contro le globuline umane viene
chiamato AHG (anti human globulin)
• l’AHG può reagire contro immunoglobuline oppure
componenti del complemento
• attualmente si impiegano ibridomi per produrre AHG
![Page 32: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/32.jpg)
Tratto da Technical Manual AABB 15th Edition
Test all’antiglobulina 4:
Principi del test
• l’anti-IgG si lega
principalmente alla porzione
Fc degli Ab adesi alla
superficie dei GR
• I due siti Fab dell’anti-IgG
formano un ponte tra cellule
adiacenti rivestite di Ab,
contribuendo a formare
l’agglutinazione
• Naturalmente i GR non
sensibilizzati da anticorpi non
produrranno agglutinazione
![Page 33: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/33.jpg)
test all’antiglobulina 5
Principi del test
• L’intensità dell’agglutinazione è solitamente
proporzionale alla quantità di globuline adese
• Poiché oltre a reagire con le IgG adese ai GR, l’AHG
reagisce anche con le IgG libere nel siero, è importante
prevedere una fase di lavaggio dei GR sensibilizzati
prima di aggiungere l’AHG pena il rischio di falsi negativi.
Questo è indispensabile per i test in provetta
• E’ prevista anche l’aggiunta finale di GR sensibilizzati
(Coombs Control) per controllare l’efficacia del AHG
(sempre per i test in provetta)
![Page 34: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/34.jpg)
test all’antiglobulina DIRETTO (TAD)
• Utilizzato per dimostrare il legame in vivo dei GR con
anticorpi o complemento, soprattutto IgG e C3d
• Utilizzo del TAD:
– indagini sull’anemia emolitica autoimmune (AIHA)
– emolisi indotta da farmaci
– malattia emolitica del neonato
– reazioni alloimmuni contro emazie recentemente
trasfuse
![Page 35: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/35.jpg)
test all’antiglobulina INDIRETTO (TAI)
• il siero o plasma è incubato con GR, successivamente
lavati per rimuovere globuline non-adese (provetta)
• se dopo l’aggiunta di AHG si osserva agglutinazione,
significa che il siero conteneva Ab specifici contro Ag
presenti sui GR
• SITUAZIONE 1: siero noto, assetto antigenico dei GR
ignoto. Fenotipizzazione dei GR
• SITUAZIONE 2: siero (del paziente) ignoto, GR con Ag
noti (pannelli). Ricerca ed identificazione Ab.
• SITUAZIONE 3: siero e GR ignoti. Crossmatch.
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reattivi antiglobulinici
• AHG polispecifici:
– utilizzati per il TAD. Contengono di norma Ab anti-
IgG e C3
– poiché la maggior parte degli Ab clinicamente
significativi sono IgG, la principale funzione dell’AHG
polispecifico è di dimostrare l’adesione dell’IgG
• AHG monospecifici:
– anti-IgG, anti-C3b, anti-C3d
![Page 37: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/37.jpg)
Tratto da Technical Manual AABB 15th Edition
• agglutinazione su
microcolonna
-schedina di microprovette
(6)
- una camera di reazione
ai vertici di ogni colonna
per la sospensione di GR
da soli oppure GR+siero
- quando le cellule
passano attraverso la
colonna (centrifugazione) il
mezzo nella colonna (gel)
separa le emazie
agglutinate da quelle non
agglutinate sulla base della
dimensione degli aggregati
- non è necessario lavare
le emazie
![Page 38: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/38.jpg)
Automazione
• Attualmente sono disponibili diversi strumenti automatici
per evidenziare le reazioni Ag-Ab
• tutti i passaggi sono eseguiti dallo strumento,
dall’aliquota al referto
• tecnologie in fase solida, gel su colonna o micropiastra
• identificazione dei campioni e dei reagenti mediante
lettura di bar-code
• il computer dello strumento viene interfacciato con il
gestionale del trasfusionale per la refertazione
• necessità di validare la seduta mediante CQ interni
![Page 39: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/39.jpg)
Immunofluorescenza
• permette di identificare e localizzare Ag all’interno o
sulla superficie dei GR
• una molecola di Ab può essere ‘marcata’ con un
fluorocromo (fluoresceina, ficoeritrina) senza alterarne la
specificità
• l’adesione degli Ab marcati agli Ag cellulari rendono le
cellule fluorescenti
• gli Ab marcati possono essere utilizzati nelle procedure
dirette o indirette, con la fluorescenza anziché
l’agglutinazione come risultato visibile
![Page 40: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/40.jpg)
Servizio Sanitario Regionale
AZIENDA OSPEDALIERO – UNIVERSITARIA
Ospedale di rilievo nazionale e di alta specializzazione
( D.P.C.M. 8 aprile 1993)
OSPEDALI RIUNITI DI TRIESTE FACOLTA' DI MEDICINA E CHIRURGIA
DIPARTIMENTO INTERAZIENDALE DI MEDICINA TRASFUSIONALE - Direttore: dott. Vincenzo De Angelis
Servizio di Medicina Trasfusionale - Direttore: dott. Vincenzo De Angelis
L’evoluzione della ricerca degli
anticorpi irregolari
Lorenzo Carlini
FACOLTA’ DI MEDICINA E CHIRURGIA
dott. Luca Giovanni Mascaretti
dott. Luca Giovanni Mascaretti
FACOLTA’ DI MEDICINA E CHIRURGIA
![Page 41: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/41.jpg)
Cell 1
Cell 2
Cell 2
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Ricerca Ab in fase liquida:
procedura
Dispensazione siero paziente (~ 3 gocce)
Dispensazione emazie pannello 3% (1 goccia)
Incubazione 37 °C x 30’ (15’ con sol. forza ionica
Lavaggio/centrifugazione x3
Aggiunta siero di Coombs
Centrifugazione
Striscio vetrino
Lettura microscopio (1 cell x volta)
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Cell 1
Cell 2
Cell 3
Cell 4 Cell 5
Cell 6 Cell 7
Cell 8 Cell 9
Cell 10 Cell 11
Auto
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Ricerca Ab in fase liquida:
Pregi
Buona sensibilità
Grande versatilità
Poco costosa
Difetti
Poco standardizzata
Relativamente laboriosa
Non automatizzabile
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Metà anni ’90:
Schedine (Agglutinazione
su colonna)
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Principio agglutinazione su
colonna:
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Principio agglutinazione su
colonna:
![Page 48: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/48.jpg)
Principio agglutinazione su
colonna:
![Page 49: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/49.jpg)
Principio agglutinazione su
colonna: risultati
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Principio agglutinazione su
colonna: risultati
Positività: 0,5
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Principio agglutinazione su
colonna: risultati
Positività indeterminata:
RIPETERE
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Ricerca Ab su colonna: procedura
Dispensazione diluente (50 μl bliss)
Dispensazione emazie pannello 3% (10 μl)
Dispensazione siero/plasma
Incubazione 37 °C x 15’
Centrifugazione 5’
Lettura macroscopio (fino a 2 pz. x volta o 1
pannello 11 cell con 2 schedine)
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Ricerca Ab su colonna:
pregi
Buona/Ottima sensibilità (> vs. fase liquida)
Metodo standardizzato
Meno laborioso e più pulito
Volumi ridotti di campioni e reattivi
Interpretazione dei risultati + facile e veloce
Possibilità di automazione
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Ricerca Ab su colonna:
difetti
Metodo un po’ più rigido
Metodo più costoso
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Ricerca Ab su micropiastra
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Ricerca Ab su micropiastra: Piastre vergini:
+
Utilizzo microquantità reattivi/campioni
Pulito
Automatizzabile
Standardizzabile
-
Scarsa sensibilità
(< fase liquida)
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Ricerca Ab su micropiastra: Piastre preseminate:
+ Utilizzo microquantità reattivi/campioni
Pulito
Automatizzabile
Standardizzabile
Ottima sensibilità
-
Estrema specificità
(solo vs. Ig G)
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Ricerca Ab su colonna:automazione
Fine anni ’90: Dispensatore/incubatore
Estate 2005: Sistema automatico
Walk away
Interfacciamento “Host querry”
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tizio
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tizio
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![Page 72: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/72.jpg)
![Page 73: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/73.jpg)
![Page 74: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/74.jpg)
…quando le cose si complicano…
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![Page 76: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/76.jpg)
![Page 77: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/77.jpg)
![Page 78: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/78.jpg)
![Page 79: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/79.jpg)
Quindi
Utilità dell’automazione
se…
Usata con intelligenza
Tenendo presente che..
Proposta del risultato (no referto)
![Page 80: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/80.jpg)
Sistemi di gruppo
sanguigno che stimolano
la produzione di anticorpi
“caldi”
![Page 81: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/81.jpg)
• Sono in genere stimolati da antigeni
proteici (polipeptidi) sotto diretto controllo
genico – (MNS)
– Rh
– Kell
– Kidd
– Duffy
– Lutheran
– Others • Chido/Rodgers
• Bg
• Xga
• Diego
Anticorpi “caldi”
![Page 82: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/82.jpg)
Anticorpi diretti contro gli antigeni
del sistema Kidd
1. Attivano il complemento
2. Si trovano spesso in combinazione con altri anticorpi
3. Spesso deboli, tendono ad andare sottosoglia di rilevazione nel tempo;
4. Si deteriorano durante la conservazione del campione;
5. I principali sono gli alleli codominanti Jka and Jkb
6. Anticorpi immuni IgG (MEN)
7. Possono essere esclusi SOLO con cellule omozigoti
8. Danno importanti reazioni emolitiche ritardate
![Page 83: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/83.jpg)
Anticorpi diretto contro gli Ag del
sistema Kell
1. Anticorpi in genere
immuni
2. Effetto dose
3. Alcuni Attivano il
complemento
4. Causano reazioni
emolitiche
trasfusionali e MEN
• Dopo gli anticorpi ABO e
Rh, anti-K è l’anticorpo
più frequente
• Meno frequentemente si
incontrano anticorpi anti
Kpa, Jsa
• Anticorpi anti k, Kpb, Jsb:
Molto rari Perchè?
• Sono antigeni ad alta
frequenza (>99,8%) !
20 antigeni di cui i due principali: K e k alleli codominanti
Altri di rilievo Kpa, Jsa , Kpb , Jsb
Frequenza fenotipi : Kk : 1/10 - kk: 9/10 - KK: 2/1000
![Page 84: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/84.jpg)
Anticorpi anti Fya e Fyb
• L’antigene Duffy è una glicoproteina che funge da recettore per il Plasmodium Vivax (60% africani Fy (a-b-)
• Anti Fya e Fyb sono anticorpi immuni
• Non agglutinano le cellule trattate con enzimi
• Escludibili solo con cellule omozigoti
• Anti-Fya Causa MEN e Reaz. Emol. Tr.
• Anti-Fyb: raro e in genere poco reattivo
– Presente per lo più in associazione ad altri anticorpi.
![Page 85: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/85.jpg)
Antigeni MNSs
RBC
Glicoforina A
Glicoforina B
M
N
S s
U
M & N due amminoacidi
differenza
S & s solo 1
amminoacido di
differenza
….5, 4, 3, 2, 1 (NH2 ) COOH e …..
![Page 86: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/86.jpg)
Anti-S anti-s ed anti-U
• IgG reattive a 37oC e AHG
• CLINICAMENTE SIGNIFICATIVO
• Anti-S di solito NON reagisce con cellule trattate con enzimi
• Anti-s ha comportamento variabile con cellule trattate con enzimi
• Anticorpo immune
• Escludibile con cellule omozigoti
• Anti-U: reagisce con tutte le cell S+ e/o s+
• U- < 1% dei soli neri
![Page 87: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/87.jpg)
Anticorpi anti-M anti-N
• Presentano effetto dose
– IgM (raramente IgG)
– In genere clinicamente non significativi
– Se IgG raramente implicate nella MEN
– Gli antigeni M ed N sono distrutti dal
trattamento enzimatico
– Gli anti-M sono potenziati in ambiente
acido (acidificazione)
![Page 88: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/88.jpg)
Caratteristiche degli anticorpi
MNSs Anticorpo Classe Ig Significatività
clinica
Anti-M IgM (rare IgG) No
Anti-N IgM No
Anti-S IgG Si
Anti-s IgG Si
Anti-U IgG Si
![Page 89: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/89.jpg)
Anticorpi anti-Lutheran
1.Anti-Lua
Non Immune (Naturale)
– Presenti componenti IgG, IgM o IgA
– Reagisce bene a temp. ambiente
– Per lo più clinicamente insignificante
2 Anti-Lub
No HTR o HDN
Agglutinazione campi misti
3. Anti-Lu3
Immune, classe IgG Reagisce a 37oC e in fase AHG
• Moderata HDN e HTR
• Clinicamente significativo
Inseparabile da anti-Lua e anti-Lub
• Fase AHG, Reagisce con tutti i GR tranne Lu (a-b-)
• Si trova in fenotipi Lu (a-b-)
![Page 90: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/90.jpg)
Anticorpi Chido/Rogers
Alto titolo, Bassa avidità (HTLA)
• Alto titolo: 1:64 o più
• Bassa avidità: 1+ o meno in tutte le diluizioni
• Agglutinazione debole e variabile.
• RBC Immuni: IgG, non legano il complemento
• NON CLINICAMENTE SIGNIFICATIVI
• Risoluzione: se si sospetta un HTLA anticorpo:
1) Titolare il siero del proposito: gli anticorpi HTLA hanno
alto titolo (> 1:64)
2) Neutralizzare il siero del proposito con siero fresco
normale : ciò rimuove l’anticorpo HTLA
![Page 91: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/91.jpg)
Sistemi di gruppo sanguigno che
stimolano la produzione di
anticorpi “freddi”
![Page 92: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/92.jpg)
Anticorpi freddi sono più spesso diretti
contro gruppi e collezioni con antigeni
costituiti da catene di carboidrati
• I geni controllano l’espressione di un enzima che
attacca lo zucchero immunodominante ad un
supporto “precursore” presente sulla membrana del
globulo rosso.
– ABO
– Ii
– Lewis
– P e Globoside Collection
![Page 93: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/93.jpg)
Collezione Globoside
• Presenti due antigeni principali: Pk (raro) e P :
• nel fenotipo P1 sono presenti due antigeni P1 e
P (Simile al gruppo A1-A2)
• Nel fenotipo P2 solo P
Anticorpo Anti-P1
1.Si trova nei fenotipi P2
• Debole, a freddo
2.Anticorpo IgM reagisce bene a <25 oC
• Non Immune (Naturally occurring)
• Non Clinicamente significativo
3.Aumentato dal trattamento enzimatico
![Page 94: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/94.jpg)
Anti-P
• Anticorpo naturale nei fenotipi Pk , IgM può
causare Emolisi immune
• Auto Anti-P (IgG) si trova in Emoglobinuria
Parossisitica a Frigore ed è noto come anticorpo
di Donath–Landsteiner
– Emolisina Bifasica: Lega il complemento a
basse temperature e lo attiva a caldo
– Si può manifestare in pazienti giovani <14
anni, dopo infezioni virali e nella sifilide
terziaria.
![Page 95: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/95.jpg)
Anticorpi del sistema P: Anti-PP1P
k (Tja)
1. Molto significativo sul piano clinico
2. Classe immunoglobulinica
3. Non-RBC Immune
4. Si trova solo nel fenotipo amorfo p piccolo
1. HTR, HDN e aborti spontanei
frequenti
2. IgM con componente IgG. Ampio
spettro termico, attiva il C’
3. Non richiede stimolo trasfusionale
4. Separabili specificità anti-P, anti-
P1 e anti-Pk. Reagisce con tutte le
cellule eccetto p phenotype
![Page 96: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/96.jpg)
Antigeni Lewis
• Solubili e riscontrabili nei liquidi biologici
• Adsorbiti sui globuli rossi
Le geni
Sostanza Le nel
plasma
RBC
La sostanza Lewis
aderisce
reversibilmente al GR e
ne costituisce un
antigene
![Page 97: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/97.jpg)
SIGNIFICATO CLINICO DEL SISTEMA
LEWIS
• In genere NATURALI (non Immuni) nei soggetti Le(a-b-)
• Non implicato in HDN
– Gli Ag Lewis non sono ancora adsorbiti sulla membrana dei GR dei
neonati
– Possono essere rilevati all’inzio di una gravidanza quando le donne
possono diventare temporaneamente Le(a-b-)
– Molti Abs Lewis Abs sono IgM: agglutinano direttamente a TA
• Reazioni trasfusionali possibili ma rare: in genere non significativi
– Gli Ag Lewis nel plasma dei donatori possono neutralizzare alcuni
Abs Lewis del ricevente
– Gli Ag Lewis sulle cellule dei donatori possono disassociarsi
• La più parte dei riceventi con Abs Lewis Abs può ricevere emazie
Lewis positive
![Page 98: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/98.jpg)
Collezione di Gruppo Ii
• Stesso olisaccaride degli
antigeni A-B-H ma una porzione
più interna
• antigene i, non ramificato è
presente sulle emazie del
neonato (cordonale)
• antigene I, ramificato , si forma
durante I primi 2 anni di vita
![Page 99: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/99.jpg)
Anticorpi Anti-I
1. Non-immune
2. Frequente autoanticorpo. IgM a freddo. NON
CLINICAMENTE SIGNIFICATIVO
3. Reagisce con quasi tutte le emazie di adulto
– Quale reattività con le cellule cordonali ?
4. Reattività aumentata con cellule trattate con enzima
5. Autoanti-I “Benigni” (presenti a tit. < 1:64)
– Diffusi. Reagiscono a temperatura ambiente e possono
essere evidenziati in fase antiglobulinica usando antisieri
polispecifici (C)
– Le tecniche di preriscaldamento riducono o rimuovono la
reazione, quelle di raffreddamento la potenziano.
![Page 100: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/100.jpg)
Anticorpi anti-I
Anti-I Patologici
1. Più ampio spettro termico di reattività ed alto titolo
2. Implicati in malattia emolitica da anticorpi freddi
3. Può essere secondaria a infezione da Mycoplasma pnuemoniae.
4. Possono essere associati a malattia linfoproliferativa ( IgM monoclonale)
5. Possono mascherare allo-anticorpi clinicamente significativi: panagglutinazione con autocontrollo positivo
Anti-IH
1. Sono stati identificati nel siero di fenotipi A1 (reagiscono di più con emazie 0)
![Page 101: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/101.jpg)
Anticorpi Anti-i
• Reagiscono di preferenza con cellule cordonali e a 4oC
• Non immuni
• Potenti auto-anti-i a seguito di Mononucleosi Infettiva.
– Transitori: presenti solo nella fase della malattia
![Page 102: Lezione 5 reazione ag ab ab caldi e freddi](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022081721/568bd5bf1a28ab20349996b3/html5/thumbnails/102.jpg)
Per saperne di più
- AABB Technical Manual. 15th edition 2005. - M.
Murphy
- D. Pamphilon eds. Practical Transfusion Medicine.
Blackwell 2001
- Massimo La Raja.
http://immunoematologia.blogspot.com/2009/03/proce
sso-trasfusionale-prova.html
- Si ringrazia il Dr. Lorenzo Carlini per l’autorizzazione
all’utilizzo delle proprie diapositive