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Libro de ResúmenesBook of Abstracts

XI Congreso de la SBE

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Libro de Resúmenes


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Libro de Resúmenes/Book of Abstracts. XI Congreso de la Sociedad de Biofísica de EspañaJuan Carmelo Gómez Fernández (coord.).- Murcia :Universidad de Murcia, Servicio de Publicaciones 2011

Maquetado por Geyseco Congresos.

ISBN:

Impreso en España - Printed in Spain

Imprime: Servicio de Publicaciones. Universidad de MurciaC/ Actor Isidoro Máiquez 9. 30007 MURCIA

Geyseco CongresosC/ Diego de León, 47. 28006 . MadridTlf. 902 195 545 Fax. 902 199 854


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Índice

PROGRAMA

COMITÉS

ENTIDADES PATROCINADORAS

ENTIDADES COLABORADORAS

PONENCIAS PLENARIAS

PREMIOS BRUKER Y SBE-IZASA-BECKMAN-COULTER

MESA REDONDA CONMEMORATIVA DE LOS XXV AÑOS DE LA SBE

PONENCIAS EN SESIONES TEMÁTICAS

COMUNICACIONES ORALES

COMUNICACIONES EN FORMA DE CARTELES

ÍNDICESPONENCIAS PLENARIAS

PREMIADOS




ÍNDICE DE AUTORES

LISTADO DE ASISTENTES

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ProgramaMiércoles, 1 de Junio

Jueves, 2 de Junio

16.00h Inscripción y Recogida de Documentación

18.30h ACTO INAUGURAL, ACTUACIÓN MUSICAL Y CONFERENCIA INAUGURAL. Conferencia: Preside: J. C. Gómez-Fernández, Murcia. (Salón de Actos)STRUCTURAL MECHANISMS OF ACTIVATION AND INHIBITION OF PHOSPHOINOSITIDE 3-KINASES. Roger Williams, Cambridge (U.K.). (Salón de Actos)

20.15h. Recepción de Bienvenida

9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 1-ESTABILIDAD DE PROTEÍNAS, PLEGAMIENTO Y DINÁMICA.Javier Sancho, Zaragoza (Salón de Actos)

9.00h. Intrafaces proteicas en estabilidad y dinámica de proteínas. Javier Sancho, Zaragoza9.30h. Las murein hidrolasas de neumococo: ¿un mecano versátil de módulos y bisagras?

Margarita Menéndez, Madrid10.00h Contribución de los puentes disulfuro a la estabilidad, plegamiento y agregación del dominio

SH3. Salvador Ventura-Zamora, Barcelona10.30h Modelos de simulación simples para problemas de plegamiento complejos.

Antonio Rey Gayo, Madrid

9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 2-DINÁMICA Y ORGANIZACIÓN DE MEMBRANAS. Alicia Alonso, Lejona. (Sala Multiusos)

9.00h. Synthetic Compounds that Mimic Membrane Lipids act as HIV-1 Entry Inhibitors Possibly by Changing Membrane Structure. Maier Lorizate, Heidelberg

9.30h. Novel tools to manipulate and interrogate supported lipid bilayers: dynamic modulation of their glycolipid content and label-free detection of clustering of membrane-bound proteins. Ralph Richter, San Sebastián

10.00h Gel and fluid membrane domains in interaction with proteins: Membrane morphological alterations and amyloid-like fiber formation. Manuel Prieto, Lisboa

10.30h Importance of ordered/ disordered phase coexistence in lung surfactant membranes. Cristina Casals, Madrid

9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 3-FÍSICA BIOLÓGICA. Marisela Vélez, Madrid (Sala Didáctica)

9.00h. Bacterial FtsZ polymers on surfaces: understanding and controlling their shape. Marisela Vélez, Madrid

9.30h. Abnormal tissue hardening in lung fibrosis and cancer. Jordi Alcaraz, Barcelona10.00h From Biophysics to animal societies. Gonzalo de Polavieja, Madrid10.30h Física virológica. Pedro J. de Pablo, Madrid11.00h. DESCANSO: Café (Restaurante)

11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 1 (CONTINUACIÓN) ESTABILIDAD DE PROTEÍNAS, PLEGAMIENTO Y DINÁMICA - COMUNICACIONES ORALESJavier Sancho, Zaragoza. (Salón de Actos)

11.30h. Ligand-induced disorder-to-order transition: Study of the Calcium-dependent folding of the RTX (Repeat in ToXin) proteins. Ana C. Sotomayor-Pérez, París.

11.45h. Halophilic enzyme activation induced by salts. Gabriel Ortega, Derio (Vizcaya)

12.00h. Observación directa de isomerización de puentes disulfuro en una proteína individual. Jorge Alegre-Cebollada, New York.

12.15h. Caracterización de los procesos microscópicos determinantes en la formación de fibras amiloides. Nunilo Cremades, Cambridge, UK.

11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 2 (CONTINUACIÓN) DINÁMICA Y ORGANIZACIÓN DE MEMBRANAS - COMUNICACIONES ORALESAlicia Alonso, Lejona. (Sala Multiusos)

11.30h. Pore formation by Bax-alpha5 in numbers: counting single pores and single Bax-alpha5 peptides. Gustavo Fuertes, Valencia


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16.45h. DESCANSO: Café (Restaurante)

17.15h. MESA REDONDA CONMEMORATIVA DE LOS XXV AÑOS DE LA SBE: Pasado presente y futuro de la Sociedad de Biofísica de España. Patrocinada por el Comité Español IUPAB Moderador: J.C. Gómez-FernándezIntervienen: J. Subirana, M. Cortijo y A. Alonso. (Salón de Actos)

18.45h. ASAMBLEA GENERAL DE LA SBE. (Salón de Actos)

19.30h. BIOFÍSICA PARA TODOS: CONFERENCIA DE DIVULGACIÓN. ”Contribución de la Biofisica y la Fisiologia Celular al Diagnostico y Tratamiento de la Diabetes Mellitus” Bernat Soria. (Aula de Cultura de Cajamurcia, Calle Gran Vía)

11.45h. Hydrophobic pulmonary surfactant proteins SP-B and SP-C induce pore formation in planar lipid membranes: Evidence for proteolipid pores. Elisa Parra, Madrid.

12.00h. Estudio en monocapas del comportamiento de fases de una mezcla lipídica que imita la membrana del VIH. Dependencia del colesterol y efectos de péptidos derivados del dominio MPER, Nerea Huarte, Bilbao.

12.15h. Mechanics of membranes with lipid domains. Iván López-Montero, Madrid.

11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 3 (CONTINUACIÓN) FÍSICA BIOLÓGICA - COMUNICACIONES ORALESMarisela Vélez, Madrid.(Sala Didáctica)

11.30h. Interaction of a viral ATPase with nucleotides measured with a microcantilever.María E. Daudén, Madrid.

11.45h. Using DNA as a molecular marker to determine protein-protein interactions with atomic force microscopy. M.E. Fuentes-Pérez, Madrid.

12.00h. Performance of Pulmonary Surfactant exposed to Gold NPs. Virginia Bouzas, Madrid

12.15h. Diffusion in macromolecular crowded media. Monte Carlo simulation of obstructed diffusion vs. FRAP experiments. Francesc Mas, Barcelona

12.30h. SESIÓN PLENARIA 1 Preside: J. García de la Torre, MurciaTHE PHYSICAL BASIS FOR PRESSURE EFFECTS ON PROTEIN STABILYPonente: Catherine Royer, Montpellier, Francia. (Salón de Actos)

13.00h. SESIÓN PLENARIA 2 Preside: F.M. GoñiDESIGNED PEPTIDES AS MODELS FOR INTRINSIC MEMBRANE PROTEINSPonente: Antoinette Killian, Utrecht, The Netherlands. Patrocinada por el Comité Español IUPAB (Salón de Actos)

13.45h. Almuerzo (Restaurante)

15.15h.-16.45h.

SESIÓN DE CARTELES (Correspondientes a Sesiones Temáticas 1 al 5).

15.30h. SEMINARIO TÉCNICO A CARGO DE TA INSTRUMENTS:“Caracterización de proteínas y biolmoléculas mediante la técnica microcalorimetría” (Sala didáctica)

Jueves, 2 de Junio

Viernes, 3 de Junio9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 4 -ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS.

Ignacio Fita, Barcelona. (Salón de Actos)

9.00h. Redesign of selectivity and lipid chain encapsulation in human GLTP . Lucy Malinina, Derio (Vizcaya)

9.30h. Catching a virus in the act of RNA release: A Rhinovirus uncoating intermediate characterized by X-ray crystallography. Nuria Verdaguer, Barcelona

10.00h Smad phosphoserine code broken by W W domain containing proteins. María J. Macías, Barcelona

10.30h Structural Biology of Remodelling Bacterial Cell Wall Machines. Juan Hermoso, Madrid

9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 5- CANALES IÓNICOS Y TRANSPORTADORES. Javier Alvarez, Valladolid. (Sala Multiusos)

9.00h. Dinámica del Ca2+ en la mitocondria. Javier Alvarez, Valladolid9.30h. Determinantes moleculares del acoplamiento alostérico en termoreceptores.

Antonio V. Ferrer Montiel, Elche10.00h Calcium sensing of the acidic stores in human platelets. Juan Antonio Rosado, Cáceres


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10.30h Tráfico de canales Kv7 a la membrana plasmática. Álvaro Villarroel, Lejona (Vizcaya)

9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 6- ESTUDIOS BIOFÍSICOS DE MOLÉCULA INDIVIDUAL. Félix Ritort, Barcelona (Sala Didáctica)

9.00h. Unraveling nucleic acids interactions by unzipping. Felix Ritort, Barcelona9.30h. Single-molecule approaches to study the AddAB helicase-nuclease. Fernando Moreno Herrero,

Madrid10.00h Exploring mechanical properties of biomaterials with atomic force microscopy. José Luis Toca-

Herrera, Viena10.30h Conformational dynamics of single proteins under force. Sergi García Manyes, Londres


11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 4 (CONTINUACIÓN) ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS - COMUNICACIONES ORALESIgnacio Fita, Barcelona. (Salón de Actos)

11.30h. Descifrando estructuralmente la regulación génica por la proteína señalizadora PII en el sistema que involucra al regulador global de nitrógeno NtcA. Inferencias para la superfamilia de reguladores transcripcionales Crp-Fnr. José Luis Llácer, Valencia

11.45h. Linking function to dynamics in globular, multidomain and unstructured proteins using NMR. Santi Esteban-Martín, Barcelona

12.00h. Análisis estructural del colágeno tipo IV y sus implicaciones moleculares en los síndromes de Alport y Goodpasture. Patricia Casino, Valencia.

12.15h. Respuesta al estrés abiótico en plantas. Cristina Yunta, Madrid

11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 5 (CONTINUACIÓN) -CANALES IÓNICOS Y TRANSPORTADORESCOMUNICACIONES ORALESJavier Alvarez, Valladolid. (Sala Multiusos)

11.30h. Differential plasma membrane abundance of epithelial sodium channel d subunit splice isoforms. Diana Wesch, Tenerife.

11.45h. Efecto funcional de la asociación oligomérica de las subunidades KCNE sobre los canales Kv7.5 (KCNQ5). Núria Comes, Barcelona.

12.00h. Electroforesis “blue-native” para la cuantificación de la auto-asociación de KcsA.José Antonio Poveda, Elche.

12.15h. Conformational studies of the M3 Acetylcholine Muscarinic Receptor and its Binding Site.Marlet Martínez, Barcelona.

11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 6 (CONTINUACIÓN) -ESTUDIOS BIOFÍSICOS DE MOLÉCULA INDIVIDUAL. COMUNICACIONES ORALESFélix Ritort, Barcelona.(Sala Didáctica)

11.30h. A single-molecule comparison of the mechanical properties of dsRNA and DNA.Elías Herrero-Galán, Madrid.

11.45h. Unwinding and Strand Annealing Activities of T4 Phage UvsW Protein: a single molecule study. María Manosas, París.

12.00h. DC-SIGN nanodomain formation revealed by single molecule fluorescence microscopy.Juan A. Torreño-Piña, Barcelona..

12.15h. La polimerasa de PHI29 presenta un mecanismo activo de apertura del ADN.Borja Ibarra, Madrid

12:30h. PREMIO BRUKER 2011: LARGE PROTEIN SHELLS WITH AND WITHOUT ICOSAHEDRAL SYMMETRY: VIRUSES & VAULTS. Ignacio Fita , Barcelona. (Salón de Actos)

13.00h. PREMIO SBE IZASA-BECKMAN-COULTER-2011: STATE-DEPENDENT FRET REPORTS LARGE GATING-RING MOTIONS IN BK CHANNELS. Teresa Giráldez, Tenerife. (Salón de Actos)

13.30h. Almuerzo (Restaurante)

15.00h. SESIÓN DE CARTELES 2 (correspondientes a las Sesiones Temáticas 6 a 12)

16.30h. SESIÓN TEMÁTICA 7- INTERACCIONES MOLECULARES EN MEMBRANAS. Antonio Ortiz, Murcia (Salón de Actos)

16.30h. Trealosalípidos biotensioactivos: la interacción con membranas base de su acción biológica. Antonio Ortiz, Murcia

17.00h. Interacción virus-célula a nivel de membranas: un asunto entre proteínas, pero también lípidos. Enrique Villar, Salamanca

Viernes, 3 de Junio


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16.30h. SESIÓN TEMÁTICA 8- BIOFÍSICA DE COMPLEJOS MACROMOLECULARES. José López Carrascosa, Madrid (Sala Multiusos)

16.30h. Ensamblaje de FtsZ y nuevos antibióticos. José Manuel Andreu, Madrid17.00h. Reconstitución de divisomas mínimos de E.coli en sistemas biomiméticos de membrana.

Germán Rivas Caballero, Madrid

16.30h. SESIÓN TEMÁTICA 9- BIOFÍSICA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. Carlos González, Madrid (Sala Didáctica)

16.30h. Structural studies on modified nucleic acids. Carlos González, Madrid17.00h. Studies on the Molecular Recognition of Aminoglycoside antibiotics by RNA and Resistence

Enzymes. Juan Luis Asensio, Madrid


18.00h. SESIÓN TEMÁTICA 7 (CONTINUACIÓN) INTERACCIONES MOLECULARES EN MEMBRANAS - COMUNICACIONES ORALESAntonio Ortiz, Murcia. (Salón de Actos)

18.00h. La proteína NS4B del virus HCV. Un territorio inexplorado. José Villalaín, Elche18.30h. Selectividad lipídica y distribución de lactosa permeasa de E.Coli en bicapas. Estudios de AFM y

FRET. Jordi Hernández-Borrell, Barcelona19.00h. Insertion of helix-C of bacteriorhodopsin into the ER membrane. Manuel Bañó Polo, Valencia19.15h. Interacción del segmento H1 de la proteína NS4B del HCV con biomembranas modelo.

Mª Francisca Palomares Jerez, Elche19.30h. Diferencias y semejanzas en la unión a membranas de los dominios C2 de rabfilina 3A.

Jaime Guillén, Murcia19.45h. Reconstitution of proto-ring elements (FtsZ AND ZipA) from Escherichi. coli in phospholipid

bilayer nanodics. Víctor M. Hernández-Rocamora, Madrid.

18.00h. SESIÓN TEMÁTICA 8 (CONTINUACIÓN) BIOFÍSICA DE COMPLEJOS MACROMOLECULARES - COMUNICACIONES ORALESJosé López Carrascosa, Madrid. (Sala Multiusos)

18.00h. Cambios conformacionales de la proteína de la cápsida de T7 ligados a la maduración viral. José López Carrascosa, Madrid

18.30h. La estructura a alta resolución de la chaperonina CCT en complejo con su sustrato tubulina. José Mª Valpuesta, Madrid

19.00h. Biophysical studies reveal different disruption patterns in the adenovirus capsid. A.J. Pérez-Berná, Madrid.

19.15h. La interacción de discodermolida y docetaxel con tubulina. Caracterización de los sitios de unión de los agentes estabilizantes de microtúbulos mediante RMN y modelado molecular. J. Fernando Díaz, Madrid.

19.30h. Resistencia mecánica del DNA en las placas de cromatina metafásica. Estudio de fricción a escala nanométrica. Joan-Ramón Daban, Barcelona

19.45h. Bacterial tubulin distinct loop sequences and primitive assembly properties support its origin from a eukaryotic tubulin ancestor. María A. Oliva, Madrid

18.00h. SESIÓN TEMÁTICA 9 (CONTINUACIÓN) BIOFÍSICA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS - COMUNICACIONES ORALESCarlos González, Madrid. (Sala Didáctica)

18.00h. Bacterial tubulin distinct loop sequences and primitive assembly properties support its origin from a eukaryotic tubulin ancestor. María A. Oliva, Madrid

18.30h. Exploration of biologically relevant binding motifs using carbohydrate oligonucleotide conjugates. Juan Carlos Morales, Sevilla

19.00h. Physicochemical characterisation of cationic liposome-DNA lipoplexes. Alberto Martín-Molina, Granada.

19.15h. Real time folding of DNA. Guillem Portella, Barcelona.19.30h. Understanding RNA / Protein Co-Habitation in the RNA World. Fernando Diez-García, Madrid19.45h. Oligonucleótidos Modificados en Nanotecnología. Álvaro Somoza, Madrid.21.00h. Cena del Congreso (Restaurante del Hotel Arco de San Juan)

Viernes, 3 de Junio


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Sábado, 4 de Junio

9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 10-BIOFÍSICA CELULAR. Guillermo Álvarez de Toledo, Sevilla (Salón de Actos)

9.00h. Organización funcional de las vesículas sinápticas en neuronas de hipocampo. Guillermo Álvarez de Toledo, Sevilla

9.30h. La organización de la maquinaria secretora en el modelo de la célula cromafín. Luis Miguel Gutiérrez, Alicante

10.00h Optical control of neurosecretion. Pau Gorostiza, Barcelona10.30h Spontaneous Activity in Neuronal Cultures: Experiments and Model. Jordi Soriano, Barcelona

9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 11- AVANCES EN BIOFÍSICA TEÓRICA Y BIOCOMPUTACIÓN. José García de la Torre, Murcia (Sala Multiusos)

9.00h. Metodologías para la simulación de proteínas globulares, desnaturalizadas e intrínsecamente desordenadas en disolución diluída. José García de la Torre, Murcia

9.30h. Estudio mediante dinámica molecular del comportamiento mecánico y termodinámico asociado a la inserción de anestesia en una membrana celular. Javier López Cascales, Cartagena

10.00h Variabilidad en redes metabólicas de síntesis de aminoácidos esenciales en endosimbiontes bacterianos. Análisis estequiométrico. Federico Morán, Madrid

10.30h Identificación mediante metabolómica de dianas terapéuticas y biomarcadores en enfermedades multifactoriales. Marta Cascante, Barcelona

9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 12-AVANCES EN MÉTODOS EXPERIMENTALES BIOFÍSICOS. Juan José Calvete, Valencia. (Sala Didáctica)

9.00h. Proteomic tools for venomic analysis. Juan José Calvete, Valencia9.30h. Nano-devices for in cell delivery of apotosis inhibitors. Enrique Pérez-Payá, Valencia.10.00h ICP-Espectrometría de Masas: una técnica revolucionaria para proteómica guiada por

heteroátomos. Alfredo Sanz-Medel, Oviedo10.30h Fluorescence fluctuation spectroscopy as a tool to characterize biomolecular complexes.

Silvia Zorrilla, Madrid

11.00h. Descanso: Café (Restaurante)

11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 10 (CONTINUACIÓN) BIOFÍSICA CELULAR- COMUNICACIONES ORALESGuillermo Álvarez de Toledo, Sevilla. (Salón de Actos)

11.30h. Direct mapping of nanoscale compositional connectivity on intact cell membranes. Thomas S. van Zanten, Barcelona

11.45h. Active Mechanics of the Red Blood Cell. Ruddi Rodríguez-García, Madrid

12.00h. α-sinucleína A30P rescata transitoriamente la liberación de neurotransmisor en los terminales motores en el ratón CSPα KO. Rocío Ruiz, Sevilla.

12.15h. Membrane Remodeling Induced by the Dynamin Related Protein Drp1 Stimulates Bax Oligomerization. Ohiana Terrones, Lejona (Vizcaya).

11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 11 (CONTINUACIÓN) AVANCES EN BIOFÍSICA TEÓRICA Y BIOCOMPUTACIÓN - COMUNICACIONES ORALES. José García de la Torre, Murcia. (Sala Multiusos)

11.30h. Influencia de la presión en la simulación del plegamiento de proteínas. Ramiro Perezzan, Madrid.

11.45h. Modelos implícitos para el estudio de la interacción lípido-proteína. Lidia Prieto, New York

12.00h. Pores from the point of view of the membrane: A general model valid for the action of peptides and proteins. Jesús Salgado, Valencia.

12.15h. Influencia de los enlaces de hidrógeno en el plegamiento de proteínas. Marta Enciso, Madrid.

11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 12 (CONTINUACIÓN) AVANCES EN MÉTODOS EXPERIMENTALES BIOFÍSICOS -COMUNICACIONES ORALESJuan José Calvete, Valencia. (Sala Didáctica)

11.30h. Estudio Infrarrojo de BHMT por 2DCOS y supresión de banda. M. García Pacios, Lejona

11.45h. Un estudio 2DCOS del efecto de los lípidos en el proceso de amiloidogénesis de la insulina. Nagore Andraka, Lejona.


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12.00h. Electrokinetics and thermodynamics of the interaction of melittin with lipid nanovesicles and Langmuir-Blodgett monolayers. Orlando L. Sánchez-Muñoz, Valencia

12.15h. Nanoscale fluorescence correlation spectroscopy on intact living cell membranes with NSOM probes. Carlos Manzo, Barcelona

12:30h. CONFERENCIA DE CLAUSURA Preside: J.L. López Carrascosa “SUPER RESOLUTION MICROSCOPY AND NANOSCOPY WITHIN LINEAR AND NON LINEAR REGIMES”. Alberto Diaspro, Génova, Italia (Salón de Actos)

13.15h. SESIÓN DE CLAUSURA Y ENTREGA DE PREMIOS A LOS MEJORES CARTELES (Salón de Actos)


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COMITÉ ORGANIZADOR

COMITÉ CIENTÍFICO

PRESIDENTEJuan Carmelo Gómez Fernández. Murcia.SECRETARIO:Francisco J. Aranda Martínez. MurciaVOCALES:Alicia Alonso. Lejona. Vizcaya.José García de la Torre. MurciaFrancisco J. Guillermo Díaz Baños. MurciaJosé López Carrascosa. MadridAntonio Ortiz López. MurciaJavier Sancho. ZaragozaJosé Antonio Teruel Puche. MurciaFrancisco Gavilanes. MadridJavier Alvarez. Valladolid

Alicia Alonso. Lejona. Vizcaya.Javier Alvarez. ValladolidJuan José Calvete. ValenciaXavier Daura. BarcelonaJosé García de la Torre. MurciaJuan Carmelo Gómez-Fernández. MurciaMargarita Menéndez. MadridAntonio Ortiz. MurciaJavier Sancho.Zaragoza


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Entidades Patrocinadoras

MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN

FUNDACIÓN SÉNECA

UNIVERSIDAD DE MURCIA

COMITÉ NACIONAL IUPAB

BRUKER ESPAÑOLA S.A.

IZASA-BECKMAN-COULTER

CAJA MURCIA


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Entidades Colaboradoras

GE HEALTH CARE

IESMAT

IBERLASER S.A.

T.A. INSTRUMENTS

WYATT TECHNOLOGY FRANCE


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PONENCIAS PLENARIAS


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PP1STRUCTURAL MECHANISMS OF ACTIVATION AND INHIBITION OF PHOSPHOINOSITIDE 3-KINASES

Oscar Vadas, John Burke, Xuxiao Zhang, Alex Berndt, Olga Perisic and Roger WilliamsMedical Research Council, Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge, England

The phosphoinositide 3-kinases (PI3Ks) consist of a family of lipid kinases that have evolved from a primordial enzyme that uses ATP to phosphorylate phosphatidylinositol (PtdIns), Vps34. PI3Ks derive from the same origin as protein kinases but they incorporate a number of adaptations enabling them to carry out catalysis at membrane interfaces. Class I PI3Ks produce the lipid second messenger PtdIns(3,4,5)P3, which has a pivotal role in a variety of signaling pathways, while the class III enzyme initiates a range of intracellular trafficking processes. Class I enzymes participate in cell cytoskeletal rearrangement, proliferation and cell survival. Our structural and functional studies of these enzymes have focused on how PI3Ks are regulated and how they can be inhibited for anti-cancer, anti-thrombotic and anti-inflammatory applications. Despite the conserved substrate-binding sites of the class I PI3Ks, there are elastic features that can be exploited in the design of small-molecule inhibitors. Given their fundamental roles in cell survival and proliferation, it is not surprising that upregulated class I enzymes can be oncogenic. Somatic mutations in the PI3K pathway are involved in a wide range of tumors. Consequently, PI3Ks are normally strongly inhibited in cells under basal conditions and the p85 regulatory subunit is key to this inhibition. Our work with PI3Kβ and PI3Kδ has combined X-ray crystallography and deuterium exchange mass spectroscopy (DXMS) to understand how receptor tyrosine kinases (RTKs) activate class I PI3Ks. PI3Kβ is unique among PI3Ks in that it is activated by both RTKs and Gβγ heterodimers. The p85 subunit incorporates three brakes on PI3Kβ and PI3Kδ catalytic activity: the nSH2, cSH2 and iSH2 domains. Although p85 regulates all RTK-activated PI3Ks, not every braking mechanism works for every enzyme, and the PI3Kα is uniquely poised to become oncogenic when mutated.


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PP2THE PHYSICAL BASIS FOR PRESSURE EFFECTS ON PROTEIN STABILITY

Catherine A. RoyerCentre de Biochimie Structurale INSERM U1054, CNRS UMR5048, Montpellier France

It has been known for nearly a century that the application of hydrostatic pressure leads to the unfolding of proteins. However, the physical basis for the effects of pressure on protein stability have remained the object of debate. Using model protein systems and high pressure fluorescence and NMR, we systematically tested the contributions of size, sequence, shape and internal voids to the volume change of unfolding. The results of these studies reveal the molecular mechanisms of pressure effects on proteins and provide novel insight into the folding landscape.


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PP3DESIGNED PEPTIDES AS MODELS FOR INTRINSIC MEMBRANE PROTEINS

J.Antoinette KillianResearch group Biochemistry of Membranes, Department of Chemistry Faculty of Science, Utrecht University, The Netherlands

Interactions between proteins and lipids form the basis of virtually all membrane processes, but on a molecular level they are still poorly understood. A powerful tool to uncover basic principles of protein-lipid interactions is the use of designed peptides as models for the membrane spanning segments of membrane proteins. Such peptides can be incorporated in synthetic lipid bilayers and properties of peptides as well as lipids can be systematically varied, enabling detailed analysis of the systems by experimental and computational approaches. Questions that can be addressed are for example how the lipid environment influences the structure and dynamics of transmembrane helices, how tryptophans as residues that flank the transmembrane segments can anchor helices at the lipid-water interface, how the length and hydrophobicity of the helices influence the organization and dynamics of membrane lipids and how lipids influence helix-helix interactions. As a further step towards mimicking membrane proteins, one can covalently link two or more of such peptides and compare the helix-lipid interactions of monomers and oligomers. We will discuss recent results obtained on these relatively simple peptide/lipid model systems and we will discuss future prospects and challenges concerning the use of these systems as tool to understand membrane structure and function.


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PP4SUPER RESOLUTION MICROSCOPY AND NANOSCOPY WITHIN LINEAR AND NON LINEAR REGIMES

Alberto Diaspro, Paolo Bianchini, Francesca Cella, Benjamin Harke, Silvia Galiani, Jenu Chacko, Zeno LavagninoIIT – Istituto Italiano di Tecnologia, via Morego 30, I 16163 and Department of Physics, University of Genoa, Genova, Italy

We report a short overview of super resolution methods focusing on optical architectures recently developed and established at the IIT, Istituto Italiano di Tecnologia and operating across the objectives of the IIT platforms and network. It is evident that optical microscopy is a fundamental tool for analysis of cellular structures and function and, more in general in the Life Sciences. Since the bottleneck, despite the great number of advantages when study biological systems, is given by the diffraction limited resolution on the submicron scale, the race for resolution improvements is always running and different approaches are continuously developed [1, 2]. A recognized advantage of optical microscopy lies in the fact that allows non-invasive three-dimensional (3D) imaging of live cells at the submicron scale with high specificity [1]. The advent of the visible fluorescent proteins [3] and of a myriad of fluorescent tags pushed fluorescence microscopy to become the most popular imaging tool in cell biology. The confocal and multiphoton versions of fluorescence microscopy reinforce this condition [4]. In general, is a well-known paradigm the given inability of a lens-based optical microscope to discern details that are closer together than half of the wavelength of light. Recently, the viewpoint for improving resolution moved from optical solutions to the side of the object, more specifically, of the fluorescent molecule to be detected. Today, for the most popular imaging mode in optical microscopy, i.e. fluorescence, the diffraction barrier is crumbling and the term “optical nanoscopy”, coined earlier [5], comes to be a real far field optical microscope available for the scientific community as the ones of the localization precision kind. Here we discuss with architectures, calibrations and application of targeted and stachastic readout methods using both single and multiphoton excitation with particular attention for 4D (x-y-z-t) developments.

Acknowledgments:We thank S.W. Hell, E.H.K. Stelzer, S.T. Hess and respective groups for experimental training and helpful discussions.

[1] Diaspro, A. (2010) Optical Fluorescence Microscopy: From the Spectral to the Nano Dimension, Springer Verlag.[2] Diaspro A. (2010) Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy, Taylor and Francis, CRC[3] Chalife M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC (1994). Science 263 (5148): 802.[4] Diaspro A. (2001) Confocal and Two-photon excitation microscopy, Wiley Liss.[5] Hell SW. (2009) Nat Methods. 6(1):24.

PREMIOS BRUKER Y SBE IZASA-BEKMAN-COULTER


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Premio Bruker LARGE PROTEIN WITH AND WITHOUT ICOSAHEDRAL SYMMETRY: VIRUSES & VAULTS

Arnau Casañas1 , Ignacio Fita1,2, Núria Verdaguer1

1 Institut de Biología Molecular de Barcelona (CSIC)2 IRB Barcelona. Parc Científic de Barcelona, Baldiri i Reixac 10, 08028-Barcelona, Spain

The Vault particle, with a molecular weight of 13 MDa, is one of the largest ribonucleoprotein complexes ever described..Vaults show an overall barrel-shaped structure organized in two identical moieties, each consisting of thirty-nine copies of the major vault protein MVP that result in an accurate D39 particle symmetry.We solved the crystal structure of the Vault particle at 8 Å resolution, together with the 2.1 Å structure of the seven N-terminal domains (R1-R7) of MVP (Querol-Audí, Casañas et al, 2009). This information complemented the 3.5Å X-ray structure of the vault particle, published by Tsukihara and co-workers (Tanaka et al. 2009), showing that MVP monomers folded into twelve distinct domains: nine repeat domains, a shoulder domain, a cap-helix and a cap ring. The comparison between the structures of R1-R7 and the equivalent region in the 3.5Å structure of the entire particle showed important discrepancies in the tracing of domains R1 and R2, revealing the interactions that govern Vault association and providing an explanation for a reversible dissociation induced by low pH.The structure of Vaults confirms the feasibility of protein shells with accurate molecular symmetries having multiplicities higher than sixty, the icosahedral multiplicity.

The mechanism of vault opening from the high resolution structure of the N-terminal repeats of MVP. Querol-Audí J, Casañas A, Usón I, Luque D, Castón JR, Fita I, Verdaguer N. EMBO J. 2009 Nov 4;28(21):3450-7. Epub 2009 Sep 24.The structure of rat liver vault at 3.5 angstrom resolution. Tanaka H, Kato K, Yamashita E, Sumizawa T, Zhou Y, Yao M, Iwasaki K, Yoshimura M, Tsukihara T. Science. 2009 Jan 16;323(5912):384-8


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Premio SBE Izasa- Bekman- CoulterSTATE-DEPENDENT FRET REPORTS LARGE GATING-RING MOTIONS IN BK CHANNELS

Teresa GiráldezResearch Division, University Hospital NS Candelaria, S. C. Tenerife, Spain

Large conductance voltage- and calcium-activated potassium channel (BK) activation is regulated by intracellular calcium and membrane voltage. Ca2+-sensitivity of this channel is conferred by a large, cytosolic domain forming a gating ring structure. Crystal structures of the gating ring have been solved in several prokaryotic channels and transporters such as the Ca2+-activated MthK channel, and recently in eukaryotic BK channels. Calcium binding to this region reduces the energy required to open the channel, but the exact mechanism underlying this process is still uncertain. Different structures of MthK have led to the theory that Ca2+ binding causes an increase in its diameter, physically inducing the opening of the channel gate. Given its sequence homology and structural similarity to MthK, it could be inferred that BK’s gating mechanism by Ca2+ is similar to that of the prokaryotic channel. We have measured movements within the BK gating ring domain of whole functional BK channels expressed in oocyte membrane macropatches using Patch-Clamp Fluorometry. We used heterotetramers of YFP- and CFP-tagged subunits to measure simultaneously ionic currents and FRET signals between equivalent tagged-sites on adjacent subunits. We have detected relative movement at three different positions within the gating ring. Our results unequivocally demonstrate that upon Ca2+ binding there is a structural rearrangement of the gating ring.


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MESA REDONDA CONMEMORATIVA DE LOS XXV AÑOS DE LA SBE


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Mesa Redonda Conmemorativa“PASADO, PRESENTE Y FUTURO DE LA SOCIEDAD DE BIOFÍSICA DE ESPAÑA”- FUNDACIÓN DE LA SBE Y SUS PRIMEROS AÑOS. INICIO DE LAS RELACIONES CON LA INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED BIOPHYSICSJ. SUBIRANA (BARCELONA)

- LA SBE EN LOS AÑOS 90. RELACIONES CON LA URSS Y CON LA EUROPEAN BIOPHISYCS SOCIETIES ASSOCIATIONM. CORTIJO (MADRID)

- ACTIVIDADES HASTA EL PRESENTE. CONFIRMACIÓN DE RELACIONES INTERNACIONALES. ADONDE QUEREMOS O DEBEMOS DIRIGIRNOS.A. ALONSO (LEJONA, VIZCAYA)

OTROS INTEGRANTES DE LA MESA:- EXPRESIDENTES DE LA SBE: FÉLIX GOÑI (LEJONA,VIZCAYA), BERNAT SORIA (SEVILLA) Y JOSÉ LÓPEZ CARRASCOSA (MADRID)- MODERADOR: JUAN CARMELO GÓMEZ FERNÁNDEZ (MURCIA)


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1.01INTRAFACES PROTEICAS EN ESTABILIDAD Y DINÁMICA DE PROTEÍNAS

Javier Sancho1,2, Vladimir Espinosa1,2 1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular. Facultad de Ciencias. Universidad de Zaragoza2 Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI). Universidad de Zaragoza

La secuencia de aminoácidos de una proteína determina su estructura tridimensional y sus propiedades dinámicas que, conjuntamente, determinan su función. La evidencia experimental y computacional indica que incluso las proteínas con comportamientos sencillos asimilables a equilibrios de dos estados pueden presentar regiones de baja estabilidad local. La identificación experimental de estas regiones, que podrían tener relevancia funcional, en bastante laboriosa y no se conoce si presentan propiedades fisico-químicas comunes.Mediante un análisis computacional de estructuras tridimensionales (a partir de ficheros PDB) hemos determinado que las proteínas contienen de forma general intrafaces conservadas de relativamente alta polaridad y bajo empaquetamiento que aparecen implicadas en procesos tardíos de plegamiento, constituyen regiones inestables del estado nativo y correlacionan con

sitios funcionales. El método desarrollado es rápido y se puede utilizar a escala proteómica.


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1.02LAS MUREIN HIDROLASAS DE NEUMOCOCO: ¿UN MECANO VERSÁTIL DE MÓDULOS Y BISAGRAS?

Margarita Menéndez1,2, Cristina Gallego1,2, Noemí Bustamante1,2, Laura Lagartera1,2, Pedro García2,3, Rubén Martínez-Buey4, y Fernando Díaz3

1 Instituto de Química-Física Rocasolano (CSIC), Serrano 119, 28006 Madrid2 Ciber de Enfermedades Respiratorias (CIBERES)3 Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), Ramiro de Maeztu 9, 28040 Madrid4 Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer de Salamanca (CSIC), Campus Miguel de Unamuno, 37007 Salamanca

Streptococcus pneumoniae (neumococo) es un colonizador habitual de la nasofaringe y el agente causal de infecciones oportunísticas (otitis, sinusitis, etc.) y procesos infecciosos severos (neumonía, bacteriemia, meningitis, etc.) cuyos índices de mortalidad superan a los de ningún otro patógeno humano. Esta situación, unida a la aparición de multiresistencias y a la moderada eficacia de las vacunas dentro de los grupos de riesgo, hace necesaria la búsqueda de nuevas estrategias para la prevención y el tratamiento de las infecciones neumocócicas. Por su capacidad para modificar la estructura de la pared celular, esencial para la supervivencia de la bacteria, tanto las murein hidrolasas de neumococo como las producidas por sus bacteriófagos (endolisinas) son dianas potenciales en la búsqueda de nuevos fármacos basados en la inhibición de las enzimas endógenas (implicadas también en colonización y virulencia), o en la utilización como agentes antimicrobianos (enzibióticos) de las enzimas capaces de inducir de forma eficaz y específica la lisis de la bacteria cuando se utilizan en su forma purificada. Todas las enzimas de la familia tienen una estructura modular que es esencial para la actividad; constan de un módulo catalítico, que determina la especificidad del enlace a hidrolizar, y de un módulo que reconoce y une de forma específica los residuos de colina presentes en los ácidos (lipo)teícoicos asociados a la pared, estableciendo así la especificidad de sustrato. El módulo de unión a colina (CBM) está formado a su vez por repeticiones conservadas de secuencia que, en número y posición variable, se unen al módulo catalítico mediante segmentos conectores cuyas secuencias determinan en gran medida la topología general y la flexibilidad de la molécula.Hemos caracterizado mediante dispersión de rayos-X a ángulos pequeños (SAXS) y ultracentrifugación analítica la estructura en solución y la organización modular de las cuatro hidrolasas mayoritarias de neumococo (LytA, LytC, LytB y Pce) y tres endolisinas (Cpl-1, Pal y Skl) portadoras de módulos catalíticos diferentes. Su comparación con las estructuras cristalográficas disponibles o con los modelos tridimensionales generados para los distintos módulos que contienen ha permitido analizar la flexibilidad conformacional y valorar, en determinados casos, su posible relevancia para la actividad. Hemos construido, asimismo, los primeros modelos de los dímeros inducidos por la unión de colina a LytA, Cpl-1, Pal y Skl. Aunque contienen módulos catalíticos diferentes, todas ellas muestran topologías similares y sus CBMs tienen secuencias y estructuras altamente conservadas, a pesar de las enormes diferencias encontradas tanto en afinidad como en la capacidad de unión a colina, y por tanto en el reconocimiento de la pared celular, tal y como se desprende de los experimentos de valoración realizados por dicroísmo circular, ultracentrifugación analítica y calorimetría diferencial de barrido. LytB y LytC son por el contrario monoméricas en presencia de colina y su comportamiento y estabilidad están determinados en gran medida por el gran tamaño y las propiedades específicas de sus CBMs.


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1.03CONTRIBUCIÓN DE LOS PUENTES DISULFURO A LA ESTABILIDAD, PLEGAMIENTO Y AGREGACIÓN DEL DOMINIO SH3.

Salvador Ventura-Zamora. Barcelona.

The failure of proteins to fold or to remain folded very often leads to their deposition into amyloid fibrils and is the origin of a variety of human diseases. Accordingly, mutations that destabilize the native conformation are associated with pathological phenotypes in several protein models. Protein backbone cyclization by disulfide bond crosslinking strongly reduces the entropy of the unfolded state and, usually, increases protein stability. The effect of protein cyclization on the thermodynamic and kinetics of folding has been extensively studied, but little is know on its effect on aggregation reactions. The PI3-SH3 domain is a small globular protein, whose folding and amyloid properties are well characterized, providing thus a framework for the simultaneous study of the effect of cyclization on these processes. We show that a cyclised PI3-SH3 variant is more stable, folds faster, aggregates slower and forms conformationally different amyloid fibrils than the wild type domain. The present study demonstrates that disulfide bridges may act as important molecular determinants of both productive protein folding and deleterious aggregation reactions.


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1.04MODELOS DE SIMULACIÓN SIMPLES PARA PROBLEMAS DE PLEGAMIENTO COMPLEJOS.

Antonio Rey1 y María Larriva1

1 Universidad Complutense de Madrid. Depto. Química Física I. 28040 Madrid

Las técnicas de simulación molecular en las que se representa la cadena polipeptídica mediante un modelo simple, de resolución reducida, permiten explorar de forma eficiente un espacio conformacional amplio, que en general no resulta accesible a modelos más detallados, con resolución atomística. Esto resulta especialmente adecuado para estudiar las transiciones conformacionales amplias, tanto en la escala espacial como sobre todo en la temporal, que aparecen en el proceso de plegamiento de proteínas.En esta comunicación presentamos resultados de dos de estos modelos, aplicados a problemas actuales relacionados con la estabilidad y el plegamiento de proteínas. En el primero de los modelos, usamos un potencial de interacción basado en la topología del estado nativo, completado en ocasiones con una “perturbación” que tiene en cuenta la secuencia de aminoácidos, para estudiar las características termodinámicas y estructurales del proceso de plegamiento de la proteína S6 y de varios de sus permutantes circulares. En las condiciones adecuadas, el modelo completo, simulado mediante la técnica de Monte Carlo con intercambio de réplicas [1], es capaz de reproducir, a nivel semicuantitativo, las características de la transición determinadas experimentalmente [2]. El modelo nos permite entonces discutir la contribución relativa de la estructura nativa y de la secuencia en el plegamiento de estos sistemas.En el segundo usamos un modelo de simulación todavía más simple, en el que la estructura de la proteína se proyecta sobre una red cúbica. La simplicidad del modelo permite un cálculo numérico tremendamente eficiente [3], por lo que se pueden simular muchas estructuras diferentes, en un tiempo breve, con un coste bastante reducido. En nuestro caso, lo hemos aplicado al estudio de la relación encontrada experimentalmente entre las velocidades de plegamiento y ciertos parámetros estructurales de la topología nativa (el denominado “orden de contacto” [4], o alguna de sus definiciones alternativas). Nuestros resultados permiten analizar bajo qué condiciones se manifiesta verdaderamente esa correlación.

[1] Prieto, L. and Rey, A. (2007) J. Chem. Phys. 127, 175101 1 – 11.[2] Haglund, E., Lindberg, M.O., and Oliveberg, M. (2008) J. Biol. Chem. 283, 27904 – 279155.[3] Travasso, R., Faisca, P., and Rey, A. (2010) J. Chem. Phys. 133, 125102 1 – 9. [4] Plaxco, K. W., Simons, K. T., and Baker, D. (1998) J. Mol. Biol. 277, 985 – 994.


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2.01SYNTHETIC COMPOUNDS THAT MIMIC MEMBRANE LIPIDS ACT AS HIV-1 ENTRY INHIBITORS POSSIBLY BY CHANGING MEMBRANE STRUCTURE.

Maier Lorizate1

1 Department of Virology, University Hospital of Heidelberg, Im Neuenheimer Feld 324, D-69120 Heidelberg, Germany

The envelope of the Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) is a liquid-ordered membrane enriched in raft-lipids. A number of outstanding studies have demonstrated that alteration in viral membrane (lipid) composition, in which membrane structure or curvature are altered, causes the loss of virus infectivity. Here, we describe a set of antiviral compounds (J391B, IBS70 and J582C) that mimic membrane lipids and target the viral membrane. Compound-membrane interaction inhibited virus infectivity—without causing any change in virus stability or virion associated levels of envelope glycoproteins—, induced a change in virus density and inhibited virus entry. Interestingly, using Laurdan as a polar sensitive dye, we have shown that, upon compound treatment, the viral membrane structure was affected. In sum, J391B, IBS70 and J582C inhibited virus entry by changing its membrane structure. Therefore, viral membrane could serve as a novel antiviral target with little possibilities of developing resistance.


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2.02NOVEL TOOLS TO MANIPULATE AND INTERROGATE SUPPORTED LIPID BILAYERS: DYNAMIC MODULATION OF THEIR GLYCOLIPID CONTENT AND LABEL-FREE DETECTION OF CLUSTERING OF MEMBRANE-BOUND PROTEINS.

Ixaskun Carton1, Lucy Malinina2, Alain R. Brisson3, Ralf P. Richter1,4

1 CIC biomaGUNE, Biosurfaces Unit, Donostia – San Sebastian, Spain2 CIC bioGUNE, Structural Biology Unit, Derio, Spain3 Laboratory of Molecular Imaging and Nanobiotechnology, IECB, UMR-5248 CBMN, CNRS-University Bordeaux 1-ENITAB, Talence, France4 Max Planck Institute for Metals Research, Stuttgart, Germany

Supported lipid bilayers (SLBs) have become popular, as models of cell membranes and for biotechnological applications [1]. We will present two novel tools to manipulate and interrogate the properties of SLBs.First, we report on a label-free method to detect and characterize the clustering of membrane-bound proteins [2]. The method exploits the contrast between two different mass and surface sensitive detection methods: quartz crystal microbalance with dissipation monitoring and ellipsometry. The time-resolved correlation of both techniques provides insight into subtle changes in the clustering state of surface-bound molecules that is not accessible with either technique alone. A theoretical model can provide quantitative predictions about the size of surface-bound clusters. By extension, the method should also be of interest for the investigation of the organization of nanosized particles, including viruses or drug delivery vehicles, at surfaces in general.Second, we report on a method to dynamically and selectively modulate the content of a biologically important class of lipids - glycosphingolipid (GSL) – in SLBs [3]. Glycolipid transfer protein (GLTP) can selectively transfer GSLs between membrane compartments. Using the ganglioside GM1 as a model glycolipid, we demonstrate that GLTP is an efficient and robust biochemical tool to dynamically modulate the GSL content of SLBs, and to quantitatively control the GSL content in the bulk-facing bilayer leaflet. By exploiting this tool, we provide evidence that GM1 distributes highly asymmetrically in silica-supported lipid bilayers, and that the pentameric B-subunit of cholera toxin binds with close-to-maximal stoichiometry to GM1 in SLBs over a large range of GM1 concentrations.

[1] Richter, R. P., Bérat, R., and Brisson, A. R. (2006) Langmuir 22, 3497-3505.[2] Carton, I., Brisson, A. R., and Richter, R. P. (2010) Anal. Chem. 82, 9275-9281.[3] Carton, I., Malinina, L., and Richter, R. P. (2010) Biophys. J. 99, 2947-2956.


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2.03GEL AND FLUID MEMBRANE DOMAINS IN INTERACTION WITH PROTEINS: MEMBRANE MORPHOLOGICAL ALTERATIONS AND AMYLOID-LIKE FIBER FORMATION

Ana Coutinho1,2, Ana Melo 1, Luís M. S. Loura 3,4, Manuel Prieto1

1 Centro de Química Física Molecular and IN, Complexo I, Instituto Superior Técnico, Lisboa, Portugal2 Departamento de Química e Bioquímica, Bloco C8, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, R. Ernesto de Vasconcelos, Lisboa, Portugal3 Faculdade de Farmácia, Universidade de Coimbra, Pólo das Ciências da Saúde, Coimbra, Portugal4 Centro de Química de Coimbra, Universidade de Coimbra, Coimbra, Portugal

Proteins with no specific propensity to form molecular aggregates, upon interaction with membranes with acidic lipids, form macroscopic fibers which are lipid-protein complexes. Our study aims to elucidate the factors that govern the formation of these structures, namely the effect of pre-existing or induced membrane domains. Towards this end, both a model basic peptide and lysozyme were selected, and microscopy (image, FLIM, FCS) and spectroscopy, were used. It was concluded that in case that the interaction happens with a system with previous gel –fluid phase separation, a strong interaction is observed but no morphological alterations of the vesicles happen, and there is no significant rearrangement of the existing domains. At variance, if the membrane system is in a fluid phase, vesicles are disrupted. From state of the art time-resolved FRET methodologies it was concluded that the aggregates formed by the basic protein lyzosyme and negatively charged membranes are multibilayers. Multiple FRET pairs (involving wild-type or labelled protein and/or membrane probes) were used. It was concluded that, whereas for high L/P the protein binds to one vesicle without connecting adjacent bilayers, higher concentrations of lyzosyme induced formation of a “pinched lamellar” structure. This state is characterized by bridging of adjacent bilayers by protein molecules, with reduced interbilayer distance (“pinches”) in the regions where there is bound protein, and increased interbilayer distance (stabilized by hydration repulsion) outside these areas. In this case, no significant formation of negative lipid domains are induced, only small lipid clustering is compatible with the quantitative models used.Acknowledgements: Funding from “Fundação para a Ciência e Tecnologia” (FCT, Portugal) is acknowledged (Project: PTDC/QUI-BIQ/099947/2008 and grant SFRH/BD/61723/2009 to A. M).


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2.04IMPORTANCE OF ORDERED/ DISORDERED PHASE COEXISTENCE IN LUNG SURFACTANT MEMBRANES

Cristina Casals1

1 Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular I & CIBER de Enfermedades

Respiratorias,Universidad Complutense de Madrid, 28040-Madrid, Spain

The respiratory epithelium has evolved to produce a complicated network of extracellular membranes that are essential for breathing, and, ultimately, survival. Surfactant membranes form a stable monolayer at the air-liquid interface with bilayer structures attached to it. By reducing the surface tension at the air-liquid interface, surfactant stabilizes the lung against collapse and facilitates inflation. Quantitative or qualitative changes in surfactant composition, whether caused by premature birth, lung injury, or mutations in genes critical to surfactant production or function, cause respiratory failure. The particular composition of surfactant membranes results in the coexistence of two distinct micrometer-sized ordered/disordered phases maintained at subphysiological and physiological temperatures [1,2]. Phase coexistence might facilitate bilayer-to-monolayer phase transition, which means the rapid insertion of phospholipids into the expanding monolayer. In addition, phase coexistence might facilitate folding through three-dimensional structures during exhalation, and hence allow the film to attain minimal surface tension. These folded structures act as a membrane reserve and attenuate the increase in membrane tension during inspiration. The capability of surfactant membranes to act as structural mechanosensors would depend on its lateral structure, which in turn depends on its lipid and protein composition. Surfactant biophysical activity can be inactivated by incorporation of materials inhaled from the upper airways, leaked from capillaries, or secreted by alveolar cells. The fact that C-reactive protein, a potent surfactant inhibitor that increases in the alveolar fluid of individuals with lung injury, leads to a striking disappearance of micrometer-sized ordered domains, argues that micrometer-sized ordered/disordered phase coexistence is important for surfactant function [3]. Likewise, small amounts of bacterial lipopolysaccharide inhibit surfactant function by increasing membrane fluidity [4]. Thus, entwining of ordered and disordered domains seems to provide a potential mechanism for maintenance of a stable interfacial film. A better understanding of surfactant membrane structure, surfactant susceptibility to inhibition, and potential mechanisms to counteract this inhibition, is important for the development of new therapies for lung immaturity and chronic inflammatory lung diseases.

[1] Nag, K., Pérez-Gil, J., Ruano, M.L.F., Stewart, J., Casals, C., and Keough K. Phase transitions in films of lung surfactant at the air-water interface. (1998) Biophys. J. 74, 2983-2995.[2] [Bernardino de la Serna, J., Perez-Gil, J., Simonsen, A.C, and Bagatolli, L. A. (2004) J. Biol. Chem. 279,40715–40722.[3] Saenz, A., Lopez-Sanchez, A., Mojica-Lazaro, J., Martinez-Car,o L., Nin, N., Bagatolli, L.A., and Casals, C. (2010) FASEB J. 24, 3662-3673.[4] Cañadas, O., Keough, K.M.W., and Casals, C. (2011) Biophys. J, 5, 108-116.


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3.01BACTERIAL FTSZ POLYMERS ON SURFACES: UNDERSTANDING AND CONTROLLING THEIR SHAPE

Mario Encinar del Pozo (1), Pablo Mateos-Gil (1), Ileana Márquez (1), Marisela Vélez (1,2)

1 Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, c/Marie Curie 2, Cantoblanco, Madrid 280492 IMDEA NanocienciaFacultad de Ciencias Módulo C-IX, 3ª planta,Avda. Fco. Tomás y Valiente, 7, Cantoblanco, Madrid 28049

Some of the most interesting biological self assembling materials are the cytoskeletal proteins. They are soluble proteins that can polymerize in a reversible manner when exposed to a soluble nucleotide. The nanometer individual units assemble into micrometer long dynamic structures that perform different mechanical or structural functions.The bacterial protein FtsZ is a soluble GTPase structurally analogous to eukaryotic tubulin and in vivo it assembles on the inner side of the cytoplasmic membrane in the mid region of the bacteria at the time of cell division. The protein self-organizes on the surface after binding to a protein membrane anchor, protein ZipA in the case of E. coli, and triggers the cell division process. It contributes to the recruitment of other proteins participating in forming the protein complex called the divisome. The polymer formed also participates in the force generating process that divides the cell [1].The characterization of the structure and dynamics of in vitro polymerization of FtsZ on mica with atomic force microscopy has provided information about how individual filaments interact to form higher order aggregates [2]. This high resolution information has been analyzed theoretically to help identify relevant interactions governing the behavior [3]. The study of the polymer behavior on lipid membranes of different composition, using the membrane protein ZipA as the anchor to mimic the situation found in vivo, has revealed a large polymorphism in the structures formed and the sensitivity of their shape to the underlying lipid composition as well as to the structure and orientation of the anchoring protein [4].In order to further understand the observed polymorphism and to gain deeper insight into the importance of the protein orientation and interaction with the surface, we have also explored alternative ways of anchoring the protein to lipid surfaces. Orienting genetically modified FtsZ proteins* by covalent linkage to lipids included in a fluid two dimensional membrane provides two main advantages: restricting the orientation of the polymerizing units on the surface and allowing them to diffuse to explore the most favorable interactions. We found that the shape of the polymer assemblies on the surface is greatly dependent on the orientation of the individual monomers on the lipid membrane, revealing that other monomer-monomer interaction regions, aside from the longitudinal interactions favored by the presence of GTP, are relevant for the formation of higher order filament aggregates and could therefore also play a role in the formation of the FtsZ polymers active during cell division.

*Kindly provided by Miguel Vicente ( CNB, CSIC) and Germán Rivas ( CIB, CSIC)

[1] Vicente,M., Rico, A. I., Martínez-Arteaga,R. and Mingorance, J. (2006) J of Bacteriology 188, 19–27[2] Mingorance, J. ; Tadros , M.; Vicente, M. ; González , J. M.; Rivas , G. and Vélez, M. (2005) J. Biol.Chem. , 280, 20909–20914.[3] Paez , A., Mateos-Gil , P. Hörger,I, Mingorance ,J. Rivas , G. Vicente ,M. Vélez, M. and Tarazona, P (2009) PMC Biophysics, 2:8 [4] López Navajas, P., Rivas, G. , Mingorance, J., Mateos-Gil,P, Hörger,I, Velasco, E. , Tarazona, P and Vélez,M. J Biol Phys (2008) 34:237–247


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3.02ABNORMAL TISSUE HARDENING IN LUNG FIBROSIS AND CANCER

Alícia Giménez1, Marta Puig1,2, Marta Gabasa3,4, Roberto Lugo1, Roland Galgoczy1, Antoni Xaubet3,4, Daniel Navajas1,4, Pere Gascón2, Noemi Reguart2, Jordi Alcaraz1,4

1 Unitat de Biofísica i Bioenginyeria, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain, 2 Oncología Mèdica, Institut d’Investigacions Biomèdiques Agustí Pi y Sunyer (IDIBAPS), Hospital Clínic, Barcelona, Spain3 IDIBAPS, Servei de Pneumologia, Hospital Clínic, Barcelona, Spain4 CIBER de Enfermedades Respiratorias, Bunyola, Spain.

A hallmark of fibrotic tissue and most solid tumors in the lung and other organs is a reactive stroma rich in alpha-smooth muscle actin (a-sma) positive cells and fibrillar collagens. A-sma positive cells are indicative of activated fibroblasts or myofibroblasts. In normal conditions, myofibroblasts appear at the final stages of wound healing and are regarded as essential contributors to tissue repair. In tumors and fibrotic tissue, myofibroblasts provide biochemical and mechanical cues that either mediate fibrogenesis or support tumor progression. Although it is currently thought that most myofibroblasts arise from the activation of resident fibroblasts, it has been suggested that resident epithelial cells undergoing epithelial-to-mesenchymal transformation (EMT) may also acquire a myofibroblast-like phenotype. However this hypothesis has not been examined yet. Human non-small cell lung cancer (NSCLC) carcinoma cell lines or primary lung fibroblasts were cultured for 3 days in serum free medium with or without the potent fibroblast activator TGF-b1. Expression of vimentin and a-sma, which are standard markers for EMT and myofibroblasts, respectively, were examined by immunofluorescence. Expression of fibrillar collagens was performed by qRT-PCR. The elastic modulus E (indicative of cell stiffness) of single cells was assessed by Atomic Force Microscopy. TGF-b1 induced a ~two-fold increase in vimentin expression in two of the NSCLC cell lines examined (H1975, A549), whereas vimentin levels remained unaltered in the other cell lines (H441, PC9). Unlike vimentin, TGF-b1 failed to induce a marked increase in a-sma in the NSCLC cell lines. In contrast, the percentage of a-sma positive fibroblasts rose from 10 to 25% upon treatment with TGF-b1, whereas it remained below 1% in NSCLC cell lines. Likewise, expression of fibrillar collagens was more than 3 orders of magnitude larger in fibroblasts than in NSCLC cells. Interestingly, TGF-b1 efficiently stiffened all vimentin positive NSCLC cells, whereas it only stiffened ~50% of fibroblasts and non vimentin positive NSCLC cells. Our data indicate that EMT, as induced by treatment with TGF-b1 for 3 days, is not sufficient to render NSCLC cells with a myofibroblast-like phenotype. These results suggest that either cancer cells undergoing EMT do not contribute to the abnormal increase of myofibroblasts in NSCLC, or that higher doses of TGF-b1 or other factors are required to efficiently transdifferentiate carcinoma cells into myofibroblasts. Furthermore, these findings strongly suggest that TGF-b1 is a key effector molecule in altering the normal balance of forces in NSCLC.


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3.03FROM BIOPHYSICS TO ANIMAL SOCIETIES

Gonzalo de Polavieja11 Instituto Cajal, CSIC

Para entender la estructura y función de los sistemas nerviosos es necesario un enfoque multidisciplinar. En esta comunicación resumiré los esfuerzos de nuestro laboratorio en este sentido. Abordaré problemas de estructura del sistema nervioso basándome en la idea de mínimo cable propuesta por Cajal. También describiré cómo entender la codificación neuronal, basándome en la Teoría de Información de Shannon. Por último, describiré nuestros esfuerzos por entender el comportamiento animal colectivo basándonos en el teorema de Bayes. Además de asomarnos al sistema nervioso usando están ‘ventanas’, intentaré aunar lo que sabemos del sistema nervioso y comportamiento animal en la idea sencilla de que los sistemas nerviosos tienen como función básica la estimación. Con el fin de discutir posibilidades futuras, también describiré técnicas modernas, desde la genética o la biofísica hasta la caracterización comportamental, con el fin de aislar problemas básicos que podemos atacar en los próximos años.


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3.04FÍSICA VIROLÓGICA

P.J. de Pablo 1

1 Departamento de Física de la Materia Condensada. Universidad Autónoma de Madrid.

Los virus se pueden concebir como contenedores proteicos (cápsida) de tamaño nanométrico, rellenos de material genético (ADN o ARN), que se autoensamblan de forma automática dentro del citoplasma de las células infectadas. Los virus no realizan ningún tipo de actividad metabólica y se sirven de la maquinaria molecular de la célula huésped para su reproducción. El entendimiento de estos procesos exige, además del conocimiento de la estructura del virión (la cápsida con el genoma en su interior), el estudio de diversas propiedades físicas del mismo a escala nanométrica, como pueden ser su elasticidad y resistencia mecánica. Aunque la criomicroscopía electrónica o la difracción de rayos x nos proporcionan las estructuras de los virus con detalle atómico o cuasiatómico, el conocimiento de las mismas no nos garantiza la caracterización de sus propiedades físicas. Durante los últimos años, la utilización del microscopio de fuerzas (AFM) se ha revelado como una potente herramienta para realizar averiguaciones sorprendentes sobre las propiedades mecánicas de los virus, como son su resistencia mecánica y su elasticidad. Estos experimentos consisten en realizar deformaciones controladas de virus individuales y extraer información sobre su elasticidad y resistencia mecánica que puede tener profundas implicaciones en su ciclo biológico. En esta charla se mostrará una revisión de los resultados obtenidos en nuestro laboratorio durante los últimos años en virus bacteriófagos (phi29) y eucariotas (virus diminuto del ratón MVM), (1-4) así como diversos experimentos recientes realizados con el fago T7 y adenovirus.

Imágenes de virus individuales de MVM (25 nm de diámetro) mostrando los tres ejes de simetría.

[1] PNAS 103, 13706 (2006). [2] PNAS 105, 4150 (2008).[3] PNAS 106, 5475 (2009).[4] BJ en prensa (2011).


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4.01REDESIGN OF SELECTIVITY AND LIPID CHAIN ENCAPSULATION IN HUMAN GLTP

Lucy Malinina1, Aintzane Cabo-Bilbao1, Alexander N. Popov2, Valeria Samygina1, Borja Ochoa-Lizarralde1, Xiuhong Zhai3, Dinshaw J. Patel4, Rhoderick E. Brown3

1 Structural Biology Unit, CIC bioGUNE Technology Park of Bizkaia, 48160 Derio, Spain2 European Synchrotron Radiation Facility, 38043 Grenoble, France3 Hormel Institute, University of Minnesota, Austin, MN 55912, USA4 Structural Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY 10021, USA

Glycolipid transfer proteins (GLTPs) [1-2] are known for their ability to accelerate the intermembrane transferring of glycoshingolipids (GSLs) [3], the key regulators of cell growth, development, and apoptosis [4]. Here, we present a simplest redesign of human GLTP that changes its transferring selectivity in favor of sulfatides (SFs) and simultaneously switches the mode of lipid chain encapsulation. Newly determined crystal structures of a wild-type GLTP and two mutants (D48V and A47D||D48V), all complexed with 24:1 sulfatide, show an adaptive rearrangement of lipid chains within mutants and reveal the sulfogroup binding center on the protein surface, which ensures the anchoring of sulfated (but not non-sulfated) galactosylceramide to the mutant. Two other new structures involve lipid-free GLTP and complex with 18:1 glucosylceramide, which reveal the intrinsic layer mobility of the GLTP-fold and unusual roles of phenylalanine residues in a lipid adaptation process. Transferring activity assay confirms that D48V GLTP mutant cannot transfer nonsulfated galactosylceramide but effectively transfers sulfatide. Dynamic light scattering data prove the role of dimeric arrangement in the GLTP-SF binding mode decision.

[1]Malinina, L., Malakhova, M., Teplov, A., Brown, R.E., Patel, D.J. (2004) Structural basis for glycosphingolipid transfer specificity. Nature 430, 1048-1053 [2]Malinina, L., Malakhova, M.L., Kanack, A.T., Lu, M., Abagyan, R., et al. (2006) The liganding of glycolipid transfer protein is controlled by glycolipid acyl structure. PLoS Biol. 4, e362 [3]Brown, R.E., and P. Mattjus. (2007) Glycolipid transfer proteins. Biochim Biophys Acta 1771, 746-760. [4]Bektas, M., Spiegel, S. (2004) Glycosphingolipids and cell death. Glycoconj. J. 20, 39-47


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4.02CATCHING A VIRUS IN THE ACT OF RNA RELEASE: A. RHINOVIRUS UNCOATING INTERMEDIATE CHARACTERIZED BY X-RAY CRYSTALLOGRAPHY

Damià Garriga3, Angela Pickl-Herk2, Daniel Luque3, José R. Castón3, Dieter Blaas2, Núria Verdaguer1

1 Institut de Biologia Molecular de Barcelona (CSIC), Parc Científic de Barcelona, Baldiri i Reixac 10-12, E-08028 Barcelona, Spain.2 Dept. Med. Biochem., Max F. Perutz Laboratories, Vienna Biocenter, Medical University of Vienna, Dr. Bohr Gasse 9/3, A-1030 Vienna, Austria. 3 Centro Nacional de Biotecnología (CSIC), Darwin 3, Cantoblanco, 28049 Madrid, Spain

Human rhinoviruses (HRV) are members of the Picornaviridae family that represent the major cause of the comon cold in humans. They constitute a group of approximately 100 serotypes, all containing a single-stranded RNA genome that is protected by an icosahedral capsid, of about 30 nm in diameter, built from sixty copies of each of four coat proteins VP1,VP2, VP3 and VP4. Once the HRV particle attaches to the host cell, it must undergo a structural conversion from its native, packaged form into a conformation capable of delivering the viral genome into the cell. This step, commonly referred to as “uncoating”, is triggered by different events for the major and minor group HRVs. For the major group HRVs, binding of the ICAM-1 receptor in the canyon directly catalyzes uncoationg [1]. In contrast, binding of HRV2 (a member of the minor group HRVs) to the LDR receptor does not induces uncoating, instead, the viral particles travel with the receptor following its normal itinerary through clathrin-coated pits to the endosome, where viral uncoating is triggered by the lowered pH [2]. To better understand the conformational changes associated with the release of the viral genome, we have determined the 3.0 Å resolution X-ray structure of the end-state of HRV2 uncoating, the 80S particle. Compared to the native structure, the 80S capsid shows an expansion of about 3% in its surface that is induced by a hinge type movement around the pocked region of VP1 and the concerted displacements of VP2 and VP3. This movement, together with the rearrangement of the N-terminal extension and a loop of VP2, result in a disruption of the inter-pentamer interfaces at the particle two-fold axes. In contrast, the VP3 “plug” at the five-fold axis remains intact in the 80S structure. This plug blocks a channel through the capsid that has been proposed to be the route for RNA egrees from the protein shell. Recent evidences in poliovirus, a closely related picornavirus, showed the RNA footprint on the particle surface located close to a two-fold axis [3]. All these observations, strongly suggest that in contrary to the previous predictions, the RNA genome is released from the capsid near a two-fold symmetry axis.Furthermore, the structure of the 80S particle and the comparison with the structure of the native virus unveal a number of residues that are sensitive to a reduction in pH and strictly conserved in the acid labile rhinoviruses, directly participating in the different structural rearrangements occurred in the transformation from native to 80S particles.

[1] Rossmann MG, He Y, Kuhn RJ. (2002) Picornavirus-receptor interactions. Trends Microbiol. 7:324[2] Snyers L, Zwickl H, Blaas D. (2003) Human rhinovirus type 2 is internalized by clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 77:5360-9.[3] Bostina M, Levy H, Filman DJ, Hogle JM (2011) Poliovirus RNA is released from the capsid near a twofold symmetry axis. J Virol. 85:776-83.


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4.03A SMAD PHOSPHOSERINE CODE BROKEN BY W W DOMAIN CONTAINING PROTEINS

Eric Aragón 1,5, Nina Goerner 1,5, Alexia-Ileana Zaromytidou 2, Qiaoran Xi 2, Albert Escobedo1, Joan Massagué 2,3,6 and Maria J. Macias 1,4,6

1 Structural and Computational Biology Programme, Institute for Research in Biomedicine, 08028 Barcelona, Spain 2 Cancer Biology and Genetics Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY 10021, USA 3 Howard Hughes Medical Institute (HHMI)4 Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)

An important gap in the current understanding of cytokine-driven transcriptional control is about the processes that remove mediator molecules that have participated in gene regulation. A case in point is the Smad transcription factors, central mediators of the TGF-beta and BMP pathway. Fundamental aspects of metazoan embryo development and tissue homeostasis are controlled by TGF-beta and BMP through Smad-mediated transcription of master regulator genes. In the course of this action in the nucleus, Smad proteins undergo certain phosphorylation events that enable peak transcriptional activity but also mark the proteins for destruction. These findings presented a paradox but also an opportunity to define how the delivery of TGF-beta and BMP signals is coupled to the turnover of the Smad signal transducers. We show here that tandem WW domains in Smad binding proteins function as readers of a phosphoserine code that dictates Smad peak transcriptional action as well as the subsequent elimination of Smad molecules that participate in transcription. The code of this action-turnover switch is written by kinases CDK8/9 and GSK3 acting on the linker region of activated, transcriptionally poised Smad proteins. In our model, CDK8/9 create binding sites that are preferentially recognized by WW-containing Smad transcriptional cofactors. These phosphorylations additionally prime Smads for subsequent GSK3-mediated phosphorylation, which creates sites for ubiquitin ligase binding at the expense of transcriptional cofactor binding sites. Thus, GSK3 switches the phosphorylation code in the Smad linker region from one that favors Smad action to one that favors Smad destruction. As a result, TGF-beta/BMP signal delivery becomes coupled to Smad turnover. Our work provides a structural and functional basis for the involvement of tandem WW domains in these protein-protein interactions. The interaction of these proteins with Smads is determined not only by the binding specificity of individual WW domains but also by the configuration of the two domains. For example, Smurf1 cannot bind Smad3 because the N-terminal position of the pT[PY] motif relative to the pSer cluster in Smad3 is opposite to the orientation required by the WW1 and WW2 domains of Smurf1. The present findings expand the known structural and functional versatility of WW domains as protein-protein interaction modules. The WW2 domains of Smurf1 and YAP recognize a canonical PY motif in Smad1, whereas the WW2 domain of Nedd4L and the Pin1 WW domain recognize a phosphothreonine-PY motif in Smad3. The PY-independent, mono-phosphoserine motif of Smad1 is recognized by the WW1 domain of YAP, whereas the atypical WW1 domain of Smurf1 and the Nedd4L WW3 domain recognize di-phosphoserine motifs in Smads 1 and 3, respectively. The ability of WW domains to recognize both pT[PY] and pS(-4)pS motifs was previously unknown. The action-turnover switch delineated here involves a remarkable concentration of opposing protein-binding functions in a discrete region of the Smad proteins. The core TGF-beta/Smad pathway is therefore characterized by a remarkably economical use of structural elements that switch key pathway components from one activation state to another.


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4.04STRUCTURAL BIOLOGY OF REMODELLING BACTERIAL CELL WALL MACHINES

Juan A. Hermoso1

1 Departamento Cristalografía y Biología Estructural. Instituto de Química-Física “Rocasolano”. CSIC; 28006-Madrid. Spain.

The bacterial cell wall is comprised of cross-linked strands of peptidoglycan (PG), which encase the entire cytoplasm. A healthy cell wall is critical for survival of bacteria and serves as a docking station for bacterial surface proteins, some of them representing key players in adhesion, colonisation and virulence. Therefore cell wall remodeling is critical in host-pathogen interactions, cell division, virulence, PG recycling and antibiotics resistance. Choline-binding proteins (CBPs) are pneumococcal surface proteins that have received considerable attention because of their versatility, and their sophisticated role in the interaction with host proteins. The three-dimensional structure of Pce (70 KDa), in complex with the reaction product and choline analogs has been solved [1]. We have showed that Pce hydrolyses PAF, a potent lipidic first messenger of inflammatory processes. Besides, the structural analysis indicated that Pce selectively remodels the bacterial surface impairing the ability of host proteins to efficiently bind the bacteria, and would provide a mechanism for pneumococci escaping attack by the host defense system [1]. Choline-binding protein F (CbpF, 38 KDa) has been solved in complex with choline [2]. Our results demonstrated that CbpF inhibit the activity of autolysin LytC providing the first example of a regulatory system to tune the activity of an autolysin. LytC is involved in the virulence mechanism of fratricide. Pneumococci that are competent for natural genetic transformation kill and lyse non-competent sister cells or members of related species that are present in the same environment. This phenomenon has been termed fratricide. We have reported the functional characterization of the key effector of pneumococcal fratricide CbpD [3] and the crystal structure of LytC in a ternary complex with choline and a PG fragment [4] that explain the activation of LytC by CbpD in fratricide and provide the first structural insights into the critical and central function that LytC plays in pneumococcal virulence.During homeostasis, including growth, cell wall is simultaneously biosynthesized and degraded. Lytic transglycosylases (LTs) initiate the degradative events on cell wall. The crystal structure of the first endolytic LT MltE from Escherichia coli has been reported [5] explaining the ability of this endolytic enzyme to cleave in the middle of the peptidoglycan chains and revealing how the enzyme is sequestered on the inner leaflet of the outer membrane. The products of LTs are internalized to the cytoplasm, and hydrolised by glucosaminidase NagZ and amidase AmpD. The reaction products of AmpD play roles in both the entry into the ensuing peptidoglycan recycling events and in an induction event that leads to the expresion of β-lactamase, a key β-lactam antibiotic resistance enzyme. Despite the 3D structure for AmpD enzyme was known by NMR techniques, we have performed crystal structure determination of AmpD with different substrates. Unexpectedly we have observed that AmpD undergoes an activation mechanism from an inactive form (that determined by NMR) to an active form we solved. Changes produced in the activation process are among the largest structural rearrangements ever reported for a single domain protein. We will present a description of the structural results concerning the activation mechanism, the substrate recognition in AmpD and their physiological implications.

[1] Hermoso, J.A. et al. (2005), Nat. Struct. & Mol. Biol.12, N 6; 533-538.[2] Molina, R. et al. (2009), EMBO rep. 10, 246-251.[3] Eldholm, V. et al. (2010), Mol. Microbiol. 76(4), 905-917.[4] Pérez-Dorado, I. et al. (2010), Nat. Struct. & Mol. Biol. 17, N5; 576-581.[5] Artola-Recolons, C. et al., (2011) Biochem. doi:10.1021/bi200085y


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5.01DINÁMICA DEL Ca2+ EN LA MITOCONDRIA

Javier Álvarez1, Sergio de la Fuente1, Pablo Montenegro1, Alfredo Moreno1, Carmen D. Lobatón1, Rosalba Fonteriz1 y Mayte Montero1

1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología, Instituto de Biología y Genética Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Valladolid, C/Ramón y Cajal 7, 47005 Valladolid

Las mitocondrias juegan un papel esencial en la homeostasis del Ca2+ celular. Además de la dependencia de Ca2+ de varias deshidrogenasas mitocondriales, la rápida acumulación de Ca2+ en las mitocondrias que ocurre durante la estimulación celular constituye un importante mecanismo de buffering transitorio de Ca2+. La baja afinidad por Ca2+ del uniportador de Ca2+ mitocondrial hace que las mitocondrias están muy bien adaptadas para captar Ca2+ de los microdominios locales de Ca2+ que se forman tras la activación de canales de Ca2+ de la membrana plasmática o del retículo endoplásmico. Estos microdominios son responsables de muchos fenómenos dependientes de Ca2+, tales como la secreción de neurotransmisores o la contracción muscular. Las mitocondrias son por tanto capaces de modular estas funciones celulares actuando como sumideros locales de Ca2+, que acumulan transitoriamente una gran parte del Ca2+ que entra en estas células durante la estimulación celular.

Sin embargo, aunque el papel de la mitocondria como modulador de la señalización celular de Ca2+ está bien establecido, aún existen discrepancias significativas entre las medidas de dinámica y concentración de Ca2+ mitocondrial ([Ca2+]M) obtenidas por diferentes autores. Mientras que los colorantes fluorescentes proporcionan valores máximos de [Ca2+]M de 2-3μM [1,2], los datos de nuestro y otros laboratorios obtenidos con proteínas luminiscentes y fluorescentes indican que la [Ca2+]M puede alcanzar valores mucho más altos, hasta decenas o cientos de micromolar [3-5]. Conocer los valores reales de [Ca2+]M durante la estimulación celular es esencial para interpretar sus efectos sobre el metabolismo mitocondrial, la apertura del poro de transición o la homeostasis del Ca2+ citosólico. Por ello, nuestro grupo ha puesto en marcha recientemente varias técnicas nuevas de medida de [Ca2+]M para investigar este problema y para obtener más información sobre la dinámica mitocondrial de [Ca2+]. Estas técnicas incluyen proteínas fluorescentes como el pericam, nuevas aequorinas mutadas con afinidad reducida por Ca2+, y colorantes fluorescentes de baja afinidad. Nuestros datos demuestran que las mitocondrias pueden alcanzar niveles de [Ca2+]M en el rango milimolar bajo diversas condiciones y muestran directamente la dinámica de los flujos de captación y liberación de Ca2+ mitocondrial, proporcionando nueva información sobre su mecanismo y sobre el buffering de Ca2+ intramitocondrial, que resulta ser mucho menor de lo que se pensaba hasta ahora y similar al del citosol. Además, las proteínas dirigidas fluorescentes y luminiscentes proporcionan datos consistentes entre sí y con los obtenidos con colorantes fluorescentes de baja afinidad, mientras que colorantes de alta afinidad como el rhod-2 tienen serios problemas para medir [Ca2+]M, especialmente en experimentos prolongados o con estimulaciones repetitivas.

[1] Collins, T.J., Lipp, P., Berridge, M.J. and Bootman, M.D. (2001) J. Biol. Chem. 276, 26411–26420.[2] Chalmers, S. and Nicholls, D.G. (2003) J. Biol. Chem. 278, 19062–19070.[3] Montero, M. et al. (2000) Nat. Cell Biol. 2, 57–61.[4] Arnaudeau, S. eta l. (2001) J. Biol. Chem. 276, 29430–29439.[5] Filippin, L. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 39224–39234.


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5.02DETERMINANTES MOLECULARES DEL ACOPLAMIENTO ALOSTÉRICO EN TERMORECEPTORES

Lucia Gregorio Teruel1, Pierluigi Valente1, Francisco Taberner1, Ainara López-Córdoba1, Asía Fernández Carvajal1, Gregorio Fernández Ballester1, José Manuel González Ros1, Antonio Ferrer Montiel11 Instituto de Biología Molecular y Celular. Universidad Miguel Hernández, Avda. de la Universidad, s/n, 03202 Elche

El receptor TRPV1 es un canal iónico polimodal activado por estímulos físicos y químicos que pertenece a la familia de los receptores TRP (receptores de potencial transitorio). Entre la diversidad de estímulos activadores destacan temperaturas superiores a 43ºC, cambios de voltaje en la membrana celular, compuestos vanilloides (capsaicina) y pH extracelular ácido, así como toxinas peptídicas de algunos arácnidos. La región C-terminal adyacente a la compuerta intracelular del canal, una región conocida como el dominio TRP, tiene una doble funcionalidad; por una parte está implicada en la oligomerización de las subunidades para rendir el tetrámero funcional [1]; y, por otra, juega un papel clave en la funcionalidad de la proteína [2,3], por cuanto su intercambio con el dominio equivalente de otros receptores TRPV no impide la tetramerización, ni expresión superficial del receptor, pero notablemente afecta su funcionalidad [2]. El estudio biofísico de estas quimeras revela que el dominio TRP contribuye a definir la energía de activación de la compuerta del canal. Así, las quimeras presentan una respuesta alterada a todos los estímulos activadores, indicando que su rol se centra en las últimas etapas del cambio conformación que conduce al estado abierto del canal [2]. Mutagénesis de esta región identifica determinantes moleculares del proceso y define las características de los aminoácidos compatibles con la función [3]. Es más, péptidos que imitan la secuencia aminoacídica de este dominio bloquean la activación del receptor mediante su interacción con el dominio TRP [4]. Nuestros resultados desvelan que la interacción de las distintas subunidades a nivel del dominio TRP es esencial para el acoplamiento correcto entre la recepción del estímulo activador y la apertura del canal iónico. Financiado por: MICINN, CONSOLIDER-INGENIO 2010, Fundació La Marató de TV3, Prometeo-GVA.

[1] García-Sanz, N., Fernández-Carvajal, C., Morenilla-Palao, C., Planells-Cases, R., Fajardo-Sanchez, E., Fernández-Ballester, G. and Ferrer-Montiel, A. J. Neurosci. 24, 5307-5314. 2004[2] García-Sanz, N., Valente, P. Gomis, A., Fernández-Carvajal, A., Fernández-Ballester, G., Viana, F., Belmonte, C. and Ferrer-Montiel, A.J. Neurosci. 27,11641-11650, 2007. [3] Valente, P. García-Sanz, N.Gomis, A., Fernández-Carvajal, A., Fernández-Ballester, G., Viana, F., Belmonte, C. and Ferrer-Montiel, A. FASEB J 22, 3298-3309, 2008. [4] Valente, P, Fernández-Carvajal A, Camprubí-Robles M, Gomis A, Fernandez-Ballester G, Viana F, Gonzalez Ros JM, Belmonte C, Planells-Cases, R, Ferrer-Montiel A. FASEB J. (In press). 2011.


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5.03CALCIUM SENSING OF THE ACIDIC STORES IN HUMAN PLATELETS

Juan A. Rosado1, Isaac Jardín1, Hanene Zbidi1, Geoffrey E. Woodard2, Gines M. Salido1

1 Department of Physiology (Cell Physiology Research Group) University of Extremadura, 10003 Cáceres, Spain2 National Institutes of Diabetes, Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA

Store-operated calcium entry (SOCE) is a Ca2+ influx mechanism regulated by the filling state of the intracellular Ca2+ stores. It has long been described that Ca2+ is mainly stored in the endoplasmic reticulum (ER), the best-characterized agonist releasable Ca2+ store; however, a number of studies have revealed that Ca2+ is also dynamically accumulated in intracellular organelles acidic in nature, including secretory granules, lysosomes and lysosome-related organelles, endosomes and vesicles of the Golgi complex [1-3]. Mammalian cells accumulate Ca2+ into agonist-sensitive acidic organelles through a process that involves the vacuolar proton-ATPase (V-ATPase). Current evidence indicates that acidic Ca2+ stores participate in cell signaling and function, including the activation of SOCE in human platelets. STIM1 has been presented as the ER Ca2+ sensor that communicates the information concerning the filling state of the stores to the plasma membrane channels, but its role sensing intraluminal Ca2+ concentration in the acidic stores has not been investigated. We have found that STIM1 and STIM2 are expressed in the lysosomal-related organelles and dense granules in human platelets isolated by immunomagnetic sorting. Depletion of the acidic Ca2+ stores using the specific V-ATPase inhibitor, bafilomycin A1, enhances the association between STIM1 and STIM2 with the plasma membrane capacitative channel Orai1. Bafilomycin A1 also induces time-dependent co-immunoprecipitation of STIM1 with the TRPC proteins hTRPC1 and hTRPC6, as well as between Orai1 and both TRPC proteins, and stimulates Ca2+ entry. In addition, bafilomycin A1 enhances the association of STIM1 and STIM2 with the sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase SERCA3. We propose a molecular mechanism model by which discharge of the acidic Ca2+ stores results in association of STIM1 sensing the ER and its homologue STIM2, located in the acidic Ca2+ stores, with proteins-forming Ca2+ channels in the plasma membrane and Ca2+-ATPases in both endomembranes and plasma membrane to finely regulate SOCE. This proposed model, which is not exclusive to platelets, is robust enough to convincingly explain such complex physiological and clinically relevant processes as platelet aggregation.

[1] Calcraft PJ, Ruas M, Pan Z, Cheng X, Arredouani A, Hao X, Tang J, Rietdorf K, Teboul L, Chuang KT, Lin P, Xiao R, Wang C, Zhu Y, Lin Y, Wyatt CN, Parrington J, Ma J, Evans AM, Galione A, Zhu MX.(2009) Nature 459, 596-600.[2] Lopez JJ, Camello-Almaraz C, Pariente JA, Salido GM, Rosado JA. (2005) Biochem. J. 390, 243-52.[3] Patel S, Docampo R. (2010) Trends Cell. Biol. 20, 277-86.

Supported by MICINN grant BFU2010-21043-C02-01 and Junta de Extremadura-FEDER (GR10010).


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5.04TRÁFICO DE CANALES KV7 A LA MEMBRANA PLASMÁTICA

Álvaro Villarroel11 Unidad de Biofísica, UB, CSIC-UPV/EHU, Barrio Sarriena s/n, 48940 Leioa, Spain

M-channels are voltage-gated potassium channels composed of Kv7.2-7.5 subunits that serve as important regulators of neuronal excitability. Ensuring that the correct numbers of these channels are present at the plasma membrane is crucial to control cell excitability. Calmodulin binding is required for Kv7 channel function and mutations in Kv7.2 that disrupt calmodulin binding reduce their surface expression and cause Benign Familial Neonatal Convulsions (BFNC), a dominantly inherited human epilepsy. However, the mechanisms by which calmodulin regulates surface expression remain largely unknown. The Kv7.2 calmodulin binding site is made up of two discontinuous alpha helices (helix A and B). Calmodulin is formed by two lobes, each having two calcium binding sites. Both lobes are involved in the interaction with Kv7.2, concealing a trafficking determinant located in helix B. The calmodulin lobes swing around the axis formed by residues flanking the first calcium binding site (site 1) in contact with helix A. Upon calcium binding, the lobes of calmodulin tilt, such that weights of the interactions moves from the site 1 to site 4, increasing the efficiency for ER exit of the channel.

Supported by grants from Spanish Ministry of Education and Technology (SAF2006-1450) and the Spanish Ion Channel Initiative Consolider project (CSD2008-00005)


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6.01UNRAVELING NUCLEIC ACIDS INTERACTIONS BY UNZIPPING

Félix Ritort1,2, 1 Deparament de Fisica Fonamental, Facultat de Física, Universitat de Barcelona, Diagonal 647, 08028 Barcelona (Spain)2 CIBER-BBN, Networking centre for bioengineering, biomaterials and nanomedicine, ISCIII, Madrid (Spain)

Recent developments in micro and nano-technologies allow for the controlled manipulation of individual molecules by exerting and detecting forces in the piconewton range. Molecular unzipping is a force-induced reaction that makes possible to disrupt the bonds that hold molecular structures in nucleic acids and proteins [1]. In this way a double stranded DNA molecule can be converted into two individual single strands by pulling apart the two strands [2]. The capability of single molecule techniques of detecting weak forces together with the ability of measuring extensions with nanometer resolution allow scientists to monitor molecular reactions in real time (e.g. molecular folding) [3]. In this talk I will review the most recent applications of molecular unzipping that make possible to derive base-pair free energies in DNA with unprecedented accuracy within tenths of a kcal/mol [4,5]. I will then show the potentialities of molecular unzipping as a tool to detect structural transitions in DNA and to unravel DNA-peptide interactions.

Ritort, F. (2006) Single molecule experiments in biological physics: methods and applications. Journal of Physics C (Condensed Matter)18, R531-R583

[1] Essevaz-Roulet ,B., Bockelmann, U., Heslot, F. (1997) Mechanical separation of thecomplementary strands of DNA. Proc Natl Acad Sci USA 94, 11935–11940.[2] Forns, N., De Lorenzo, S., Manosas, M., Hayashi, K., Huguet, J. M., Ritort, F. (2011) Improving . Improving signal-to-noise ratio in single molecule experiments using molecular constructs with short handles, to be published in Biophysical Journal vol. 100 issue 7[3] Huguet, J. M. , Bizarro, C. V., Forns, N., Smith, S. B., Bustamante, C. and Ritort, F. (2010) Single-molecule derivation of salt dependent base-pair free energies in DNA,Proceedings of the National Academy of Sciences 107, 15431-15436[4] Huguet, J. M. , Forns, N. and Ritort, F. (2009) Statistical properties of metastable intermediates in DNA unzipping, Physical Review Letters 103, 248106


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6.02SINGLE-MOLECULE APPROACHES TO STUDY THE ADDAB HELICASE-NUCLEASE

Fernando Moreno-Herrero1

1 Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnologia (CNB-CSIC), Darwin 3, 28049 Cantoblanco, Madrid, Spain

Recombinational repair of DNA breaks requires processing of a DNA end to a 3´-ssDNA overhang. In B.subtilis, this task is done by the helicase-nuclease AddAB which generates ssDNA overhangs terminated at a recombination hotspot (Chi) sequence. In this work, I will discuss our recent progress in investigating the dynamics of this molecular motor using stopped flow DNA unwinding assays, atomic force microscopy and magnetic tweezers. In the absence of single-stranded binding proteins, we found that translocation and unwinding activities of AddAB are uncoupled due to re-annealing of nascent single-stranded DNA. The coupling between translocation and unwinding is however restored through the recognition of Chi sequences during AddAB translocation via formation of a single stranded DNA loop. Moreover, helicase activity of AddAB is also activated by binding of SSB proteins or activity of multiple AddAB in multiple turnover reactions by preventing re-annealing of DNA strands. This work suggests that unwinding intermediates may differ from the classical “Y-shape” and that the coupling between translocation and unwinding in a helicase is a complex parameter.


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6.03EXPLORING MECHANICAL PROPERTIES OF BIOMATERIALS WITH ATOMIC FORCE MICROSCOPY

José L. Toca-Herrera1 1 Biophysics Unit, Department of Nanobiotechnology, BOKU-University of Natural Resources and Life Sciences, Muthgasse 11, 1190 Vienna, Austria

Today I would like to present some studies about mechanical properties of proteins and cells carried out with atomic force microscopy. Firstly I will show results concerning the mechanical unfolding of TI27 [1]. This muscle protein has also been used to make poly-proteins constructs to elucidate the mechanical unfolding of other biomolecules [2].Afterwards I will briefly show a unified method to investigate the mechanical properties of breast cancer cells (MCF-7). Stress relaxation and creep compliance measurements permitted to determine, the relaxation times, the Young moduli and the viscosity of breast cancer cells (MCF-7). The results show that the mechanical behaviour of MCF-7 cells responds to a two-layered model of similar elasticity but differing viscosity [3,4].

[1] Williams, P.M., Fowler, S.B., Best, R.B., Toca-Herrera, J.L., Scott, K.A., Steward, A., and Clarke, J. (2003) Nature 422, 446-449[2] Steward, A., Toca-Herrera, J.L., and Clarke, J. (2002) Protein Science 11, 2179–2183[3] Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., and Toca-Herrera, J.L. (2010) Journal of Biomechanics 43, 349-354[4] Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. dM., and Toca-Herrera, J.L. (2010) Nanotechnology 21 445101 (8pp)


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6.04CONFORMATIONAL DYNAMICS OF SINGLE PROTEINS UNDER FORCE

Sergi Garcia-Manyes1, Julio M. Fernández1

1 Department of Biological Sciences, Columbia University, New York

Understanding the molecular mechanisms that confer mechanical stability to well-defined biological systems is a major challenge in modern physics, chemistry and biology. Single molecule techniques are now providing a new vista on the molecular mechanisms by which proteins equilibrate under the effect of a constant stretching force. In this vein, force clamp spectroscopy allows us to monitor for the first time, with exquisite sub-Ǻngström sensitivity, the conformational dynamics of a single refolding protein during its individual folding trajectory from highly extended states. Contrary to previous belief, our experiments demonstrate that the acquisition of the protein’s native conformation occurs after dynamic maturation of an ensemble of collapsed states that are mechanically labile and structurally heterogeneous. These results support the validity of statistical mechanics models in describing the folding of a small protein on biological timescales. Remarkably, the existence of such newly discovered ensemble of collapsed states that hold the key to explaining how an extended polypeptide folds while regaining its mechanical stability is likely to have profound implications on the onset of conformational diseases, occurring at the level of a single molecule. Finally, mechanical force provides an alternative means to heat or electricity to activate chemical reactions. However, the full reconstruction of the potential energy surface governing a chemical reaction under force remains still largely incomplete. Using a combination of protein engineering techniques with single molecule force-clamp spectroscopy we examined the influence of force on the rate at which a protein disulfide bond is reduced by nucleophiles in a bimolecular substitution reaction (SN2). Our experiments directly identify a reactivity switch occurring at ~500 pN, resulting from a force-induced conformational change in the ground state of the disulfide bond. The single protein data is providing a new view that will help guide the development of theories on the statistical dynamics of folding and ab-initio studies of a chemical reaction while placed under a stretching force; of common occurrence in nature.


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7.01TREALOSALÍPIDOS BIOTENSIOACTIVOS: LA INTERACCIÓN CON MEMBRANAS BASE DE SU ACCIÓN BIOLÓGICA

Antonio Ortiz1

1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia E-30100 Murcia

Los tensioactivos constituyen un grupo importante de productos químicos tanto por los volúmenes de venta como por la gran variedad de aplicaciones que poseen. Entre los microorganismos, la producción de compuestos anfifílicos con carácter tensioactivo (tensioactivos biológicos o biotensioactivos) parece ser una propiedad ampliamente distribuida, probablemente consecuencia de la elevada relación superficie/volumen que presentan y de la nutrición basada en el transporte de nutrientes a través de las envueltas. Junto con los lipopéptidos, los glicolípidos son los biotensioactivos de peso molecular bajo mejor conocidos. Los ramnolípidos y los trealosalípidos son mono o disacáridos acilados con ácidos grasos de cadena larga o ácidos grasos hidroxilados. El trealosalípido de Rhodococcus contiene dos unidades de glucosa unidas por enlace glicosídico α1→1 (trealosa). Las cadenas de ácido graso varían entre C7 y C11, y contiene además un residuo de succinilo que le confiere carga negativa a pH neutro. Estos succinil trealosalípidos inducen diferenciación en líneas celulares de leucemia, e inhiben la actividad de la proteína quinasa C. Se ha sugerido que estas actividades podrían estar basadas en su acción sobre las membranas, por lo que hemos dirigido esta investigación a evaluar la acción de nuestro trealosalípido biotensioactivo sobre membranas fosfolipídicas modelo y membranas biológicas.Mediante DSC de muestras de fosfatidilcolinas de varias longitudes de cadena, se ha observado una buena miscibilidad del glicolípido en fase gel, e inmiscibilidad en fase fluida, sugiriéndose la formación de dominios. Estos dominios se han visualizado y caracterizado por primera vez mediante AFM. Por otra parte, mediante FTIR se ha observado que la incorporación de trealosalípido en membranas de fosfatidilcolina desplaza la banda de tensión antisimétrica de los grupos CH2 hacia valores mayores, indicando un aumento de la fluidez. Del estudio de la banda de tensión de los grupos C=O se deduce que el trealosalípido aumenta la deshidratación de la bicapa. La distancia repetitiva interlamelar es mayor en las membranas que contienen trealosalípido que en el caso de los fosfolípidos puros, según se ha observado mediante SAXS, mientras que WAXS indica que el trealosalípido altera el empaquetamiento de las cadenas acílicas. La incorporación del biotensioactivo a membranas de DEPE promueve la formación de la fase hexagonal invertida-HII.De todos los resultados anteriores parece claro que el trealosalípido produce alteraciones estructurales en la membrana que pueden conducir a una modificación importante de sus propiedades. Efectivamente, mediante ensayos de liberación de sondas fluorescentes se ha observado que el trealosalípido también produce la permeabilización de membranas de fosfatidilcolina, a concentraciones por debajo y por encima de la CMC, observándose un período de retardo inicial. Concomitantemente se produce una pequeña disminución de la turbidez de las vesículas, que no se debe a solubilización, sino probablemente a un cambio en las propiedades de la bicapa. La permeabilización de la bicapa es selectiva, no permitiendo el paso de solutos de peso molecular elevado. Hemos propuesto un mecanismo para explicar detalladamente todos los efectos observados. Por otra parte, el trealosalípido produce la hemólisis de eritrocitos humanos por medio de un mecanismo osmótico-lítico. Usando protectores osmóticos adecuados se ha determinado un tamaño de poro en torno a 25 ängstrom para las ‘lesiones’ de membranas provocadas por este glicolípido. Los resultados de esta línea de investigación contribuyen a establecer un mecanismo molecular para explicar las acciones de membranas de los trealosalípidos biotensioactivos.Subvencionado por el proyecto CTQ2007-66244 (I.P. A.Ortiz) del Ministerio de Ciencia e Innovación.


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7.02INTERACCIÓN VIRUS-CÉLULA A NIVEL DE MEMBRANAS: UN ASUNTO ENTRE PROTEÍNAS, PERO TAMBIÉN LÍPIDOS

Enrique Villar1, Juan Ayllón1, Juan J. Martín1, Javier Holguera1, Lorena Sánchez1, Anna Shnyrova1, Vadim Frolov1, Isabel Muñoz Barroso1

1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Salamanca.

El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un paramixovirus que posee una nucleocápsida con RNA monosegmentado de polaridad negativa y nucleoproteínas, rodeada de una bicapa lipídica a la que se asocian tres proteínas: M, HN y F. Para que un virus con membrana como éste infecte una célula, es necesario que su ribonucleocápsida penetre en el citoplasma celular y para ello debe sobrepasar una barrera importante: la membrana plasmática de la célula hospedadora. Las tres proteínas de la membrana del NDV están implicadas en las interacciones moleculares proteína-proteína y proteína-lípido que se establecen en distintas fases del ciclo de infección vírico, entre esos dos tipos de membranas tan diferentes, como son la vírica y la celular.El primer evento en esas interacciones entre membranas es el reconocimiento del receptor, y precisa el concurso tanto de la proteína HN vírica (su actividad hemaglutinante) como de las sialoglicoproteínas y sialoglicolípidos de la membrana diana. No obstante, nosotros hemos demostrado la implicación del colestrol y los rafts lipídicos en este reconocimiento, necesitándose una asociación física entre las glicoproteínas víricas y los rafts lipídicos de la membrana diana. El NDV muestra una reducida capacidad de unión a células diana previamente tratadas con metil-β-ciclodextrina, compuesto que elimina el colesterol de su membrana y disgrega sus rafts lipídicos.El segundo evento molecular del ciclo de infección vírico es la fusión de membranas, vírica y celular. La herramienta que utilizan los virus con membrana es la proteína F, gracias a su actividad fusogénica. Esta proteína posee el llamado “péptido de fusión”, que penetra en la membrana plasmática de la célula diana y desencadena la formación de un poro en la misma por el que penetrará hacia el citoplasma la ribonucleocápsida vírica. En el proceso de fusión es clave la interacción previa entre las proteínas F y HN, para que la primera pase de un estado prefusogénico al activo, fusogénico. No obstante, nuestros datos sugieren también la implicación del colesterol en este proceso, ya que la actividad fusogénica del virus queda significativamente reducida cuando el NDV infecta células tratadas con metil-β-ciclodextrina y esta actividad se recupera casi al 100% si a las células previamente tratadas, se les añade colesterol exógeno, antes de la infección con NDV.Otro del los eventos clave en el ciclo de infección de los virus con membrana es la salida de los nuevos viriones fuera de la célula. En este proceso, que tiene lugar mediante gemación, es necesario que los componentes de los nuevos viriones provoquen una curvatura negativa en la célula hospedadora. Nuestros datos demuestran que para este proceso únicamente se necesita el concurso de la proteína M. Además, la proteína M ejerce esta función asociándose a dominios proteolipídicos, en los que el colesterol juega un papel primordial, favoreciendo la interacción de esta proteína con la bicapa lipídica.Agradecimientos:Trabajo financiado por el Fondo de Investigaciones Sanitarias, y cofinanciado por fondos FEDER de la EU (FIS) PI081813 a EV. JA ha sido becario predoctoral del Ministerio de Educación. JH y LSF son PDI en Formación de la Junta de Castilla y León en la Universidad de Salamanca.


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7.03LA PROTEÍNA NS4B DEL VIRUS HCV. UN TERRITORIO INEXPLORADO

José Villalaín1, Francisca Palomares-Jerez1, Henrique de Castro Nemésio1, Lidia Núño1

1 Instituto de Biología Molecular y Celular, Campus de Elche, Universidad Miguel Hernández, E-03202 Elche-Alicante.

El virus de la hepatitis C (HCV), virus que pertenece al género Hepacivirus de la familia Flaviviridae, es el mayor causante de enfermedades relacionadas con el hígado, como cirrosis y hepatocarcinoma, infectando a más de 180 millones de personas en todo el mundo. Hasta el momento no existe ninguna vacuna disponible y el tratamiento actual es muy limitado, tanto por su baja efectividad como por sus importantes efectos secundarios. El HCV es un virus con envuelta, contiene una sola cadena de RNA positivo que codifica una poliproteína que después de su procesado da lugar a varias proteínas estructurales (core, E1, E2 y p7) y no estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) [1]. La entrada del virus se realiza mediante endocitosis, la membrana viral y la del endosoma se fusionan para que el genoma se pueda replicar dentro de la célula, y tanto la replicación como la morfogénesis están relacionadas con un complejo de replicación (CR) resultante de la modificación de membranas del retículo endoplásmico (RE) [2]. Mientras que las proteínas E1 y E2 están relacionadas con la fusión de membrana, las proteínas NS están relacionadas con la replicación, interacciones proteína-proteína y proteína membrana.La proteína NS4B es una proteína fundamental en el ciclo del HCV pero la menos caracterizada debido a la alta hidrofobicidad. Es una proteína altamente hidrofóbica, está palmitoilada y asociada a las membranas del CR, induce la desorganización de las membranas del RE y parece ser una proteína multifuncional [3]. Una de las funciones más importantes de NS4B podría ser por tanto la formación del entramado que da lugar al CR. Se ha predicho que NS4B tenga al menos cuatro dominios transmembrana, y que pueda disponerse en más de una conformación. La región C-terminal de NS4B exhibe bastantes similitudes con otras proteínas de otros virus de la misma familia, presentando dos regiones α-hélice, cuya característica principal es que son capaces de interaccionar con membranas y posiblemente con otras proteínas [4, 5]. La región N-terminal posee también al menos dos regiones α-hélice, con capacidad alguna de ellas de poder atravesar la membrana del RE, y se ha sugerido la posible existencia de una cremallera de leucinas. Tanto la región N-terminal como la C-terminal podrían ser dianas potenciales para encontrar inhibidores de la replicación del HCV. Nuestro grupo de investigación ha estudiado esta y otras proteínas del HCV, con el fin de comprender el mecanismo de interacción con membranas y de la replicación del HCV. En esta comunicación presentamos nuestros últimos estudios sobre la proteína NS4B de HCV, la gran desconocida de entre todas sus proteínas, su topología, la locación e interacción con membranas de los diferentes segmentos de la misma así como la posibilidad de obtener inhibidores de la replicación del HCV utilizando a NS4B como diana molecular.

[1] D. Moradpour, F. Penin, C.M. Rice (2007) Nat Rev Microbiol, 5, 453-463.[2] N. El-Hage, G. Luo (2003) J Gen Virol, 84 (2003) 2761-2769.[3] M. Poenisch, R. Bartenschlager (2010) Semin Liver Dis, 30, 333-347.[4] J. Guillen, A. Gonzalez-Alvarez, J. Villalain (2010) Biochim Biophys Acta, 1798, 327-337.[5] M.F. Palomares-Jerez, J. Villalain (2011) Biochim Biophys Acta, 1808, 1219-1229.


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7.04SELECTIVIDAD LIPÍDICA Y DISTRIBUCIÓN DE LACTOSA PERMEASA DE E.COLI EN BICAPAS. ESTUDIOS DE AFM Y FRET

Jordi Hernández Borrell11 Departament de Fisicoquímica, Facultat de Farmàcia, Institut de Nanociència i Nanotecnologia, Universitat de Barcelona, 08028-Barcelona, España.

La proteína de transmembrana Lactosa permeasa, ha sido reconstituida en bicapas planas soportadas (BPS) y en proteoliposomas de diferentes composiciones lipídicas (POPE:POPG, DOPE:POPG, DPPE:POPG, 3:1 mol/mol). Las observaciones de las BPS mediante microscopia de fuerza atómica (AFM) muestran la tendencia natural de la proteína a segregarse lateralmente en las regiones fluidas. La naturaleza de los dominios ha sido establecida a partir de medidas de espectroscopia de fuerza (FS). La investigación de la región anular de la proteína se ha realizado mediante la técnica de FRET, empleando el mutante con un único triptófano (W151/C154G LacY) como dador, y derivados fosfolipídicos de pireno, como par aceptor. Para obtener información sobre la selectividad lipídica de la proteína, se ha ajustado un modelo teórico a los resultados de FRET obtenidos. Se concluye de éstos, que el fosfolípido mayoritario en la región anular es POPE. Esta afinidad especial, sin embargo, depende de la existencia de dominios lipídicos. Así la reconstitución de la proteína en DPPE:POPG determina un aumento de la afinidad por POPG. Se concluye mediante el estudio comparativo de los resultados de FRET y AFM, que: (i) la inserción de la proteína se produce preferentemente en dominios en estado fluido; y (ii) que en caso de haber separación de fase estos dominios fluidos están enriquecidos en el fosfolípido de temperatura de transición más baja.


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8.01ENSAMBLAJE DE FTSZ Y NUEVOS ANTIBIÓTICOS

José Manuel Andreu. Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid

Cell division protein FtsZ is the organizer of the bacterial cytokinetic ring and possibly its constriction motor [1]. An emerging target for new antibiotics, FtsZ shares the structural fold of eukaryotic tubulin, which forms the microtubules of the mitotic spindle, a well known target of antitumor drugs. Both proteins bind GTP at their apical protofilament-forming association interfaces, and disassemble following GTP hydrolysis to GDP. FtsZ is thought to generate constriction force by a combination of filament bending, condensation and recycling. The nucleated self-assembly of FtsZ into single-stranded filaments is explained by the switching of inactive monomers into active monomers induced by the polymer contacts [2]. Mapping the flexibility and the assembly switch of FtsZ has indicated a closure motion of its C-terminal domain onto the core helix H7 and the N-terminal domain [3].Two main cavities for ligand binding in a FtsZ monomer are the GTP binding site at the axial contact interface with the next monomer along the FtsZ filament, and the long lateral cleft between its N and C-terminal domains, which overlaps the taxol binding site of tubulin.Several GTP analogues inhibit purified FtsZ polymerization but support tubulin assembly, revealing differences in their GTP binding sites [4]. Although these nucleotides lack antibacterial activity themselves, they may be exploited to design new FtsZ inhibitors. We have estimated the relative contributions of the parts of GTP to binding, complemented by computer modelling and virtual screening methods, and have developed a fluorescence anisotropy assay to analyze the binding of any molecule capable of replacing GTP in FtsZ [5], which we are using to seek nucleotide mimetic FtsZ inhibitors with specific antibacterial activity.FtsZ has been validated as a new target for antibiotics with a difluorobenzamide derivative which inhibits cell division in susceptible bacteria and effectively protects mice from infection, and is thought to bind somewhere in the long side cleft between both FtsZ domains [6]. We have found that this compound modulates FtsZ assembly and stabilizes its polymers [7], analogously to the microtubule stabilizing agent taxol on tubulin. A closely related benzamide compound has been reported to distort the FtsZ ring into abnormal structures promoting helical cell division [8].

PC190723? GTP (FtsZ sites) Taxol GDP (beta-tubulin sites)[1] Osawa, M., Anderson, D. E., and Erickson, H. P. (2008) Science 320, 792-794[2] Huecas, S., Llorca, O., Boskovic, J., Martin-Benito, J., Valpuesta, J. M., and Andreu, J. M. (2008) Biophys. J. 94, 1796-1806[3] Martin-Galiano, A. J., Buey, R. M., Cabezas, M., and Andreu, J. M. (2010) J. Biol. Chem. 285, 22554-22565[4] Lappchen, T., Pinas, V. A., Hartog, A. F., Koomen, G. J., Schaffner-Barbero, C., Andreu, J. M., Trambaiolo, D., Lowe, J., Juhem, A., Popov, A. V., and den Blaauwen, T. (2008) Chem Biol 15, 189-199[5] Schaffner-Barbero C., Gil-Redondo, R., Ruiz-Avila L.B., Huecas S., Läppchen T., den Blaauwen T., Diaz J.F., Morreale A., Andreu J.M. (2010) Biochemistry 49, 10458-10472[6] Haydon, D. J., Stokes, N. R., Ure, R., Galbraith, G., Bennett, J. M., Brown, D. R., Baker, P. J., Barynin, V. V., Rice, D. W., Sedelnikova, S. E., Heal, J. R., Sheridan, J. M., Aiwale, S. T., Chauhan, P. K., Srivastava, A., Taneja, A., Collins, I., Errington, J., and Czaplewski, L. G. (2008) Science 321, 1673-1675[7] Andreu, J. M., Schaffner-Barbero, C., Huecas, S., Alonso, D., Lopez-Rodriguez, M. L., Ruiz-Avila, L. B., Nuñez-Ramirez, R., Llorca, O., and Martin-Galiano, A. J. (2010) J. Biol. Chem. 285, 14239-14146[8] Adams, D. W., and Errington, J. (2011) Mol. Microbiol, in press


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8.02RECONSTITUCIÓN DE DIVISOMAS MÍNIMOS DE E.COLI EN SISTEMAS BIOMIMÉTICOS DE MEMBRANA

Germán Rivas1

1 Centro de Investigaciones Biológicas. CSIC. Madrid. Spain.

El objetivo de nuestro laboratorio es la reconstrucción del conjunto mínimo de proteínas funcionales necesarias para iniciar la división bacteriana (el proto-anillo) en sistemas que reproduzcan la organización estructural del divisoma en la membrana celular. En E. coli el proto-anillo está formado por tres proteínas (FtsZ, GTPasa ancestro de la tubulina; FtsA, una proteína anfitrópica; y ZipA, una proteína de membrana) que ensamblan en la membrana citoplásmica formando una estructura que se requiere para la incorporación del resto de las proteínas de division [1,2]. Combinamos tecnologías biofísicas, bioquímicas y de imagen para estudiar la actividad, las interacciones y el ensamblaje de los elementos del proto-anillo usando membranas artificiales y naturales estructuradas en nanodiscos, micro-esferas funcionalizadas, bicapas y vesículas gigantes (GUVs) [3,4]. Este abordaje proporcionará i) información para entender los factores que modulan la asociación de FtsZ a la membrana y su posterior disociación de la misma, ii) un procedimiento sintético para reconstituir los eventos iniciales de la división bacteriana en el tubo de ensayo, y iii) nuevas herramientas y ensayos para identificar compuestos inhibidores de interacciones proteína-proteína esenciales en división, que puedan dar lugar al descubrimiento de nuevos antibióticos. Our ultimate goal is to reconstruct the minimum functional protein set needed to initiate bacterial division (the proto-ring) in systems that reproduce the structural organization of the divisome at the cell membrane. In E. coli the proto-ring is formed by three proteins (the GTPase FtsZ, bacterial ancestor of tubulin; FtsA, an amphitropic protein; and ZipA, a membrane protein) that assemble at the cytoplasmic membrane forming a structure required for the incorporation of the remaining division proteins [1,2]. We combine biophysical, biochemical and imaging technologies to study the biochemical activities, interactions and assembly of proto-ring elements using artificial and natural membranes structured as nanodiscs, functionalized micro-beads, supported bilayers and giant vesicles (GUVs) [3,4]. This approach will provide i) information to understand the factors that modulate the association of FtsZ to the membrane and its eventual dissociation, ii) a synthetic procedure to reconstruct the initial events of bacterial division in the test tube, and iii) new and powerful tools and assays to identify compounds that will inhibit specific protein-protein interactions essential for cell division, which might lead to the discovery of new antibiotics.

[1] Vicente et al. (2006) J. Bacteriol. 188, 19-27[2] Mingorance et al. (2010) Trends Microbiol. 18, 348-356[3] Martos et al. (2010) Biochemistry 49,10780-10787[4] Jimenez et al. (2011) J. Biol. Chem. (doi/10.1074/jbc.M110.194365)


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8.03CAMBIOS CONFORMACIONALES DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA DE T7 LIGADOS A LA MADURACIÓN VIRAL

Alina Ionel1, Javier A. Velázquez Muriel2, Daniel Luque3, Ana Cuervo1, José R. Castón1, José M. Valpuesta1, Jaime Martín-Benito1 y José L. Carrascosa1

1 Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC). Darwin 3. Cantoblanco. 28049 Madrid.2 California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco, California 94158.3 Centro Nacional de Microbiología, ISCIII. Carretera Pozuelo Majadahonda, Km 2.2, 28220 Majadahonda, Madrid.

Los virus bacterianos de DNA bicatenario se ensamblan, siguiendo pautas muy similares, a partir de unas pocas (3-6) proteínas en precabezas de forma y tamaño definidos. Estas precabezas interaccionan con otros componentes virales (proteínas, DNA) para dar lugar al virus infectivo maduro. En el proceso de empaquetamiento del DNA se producen una serie de cambios estructurales que llevan a una expansión y estabilización de la cápsida viral que, una vez empaquetado el DNA, es capaz de ensamblar los elementos responsables de la interacción con la célula huésped (cola).

Hemos estudiado este proceso en el bacteriófago T7 [1] mediante la comparación de la estructura de la precabeza [2] con la de la cabeza madura [3] utilizando criomicroscopia electrónica y métodos de reconstrucción tridimensional. Los resultados obtenidos a resolución subnanométrica, junto con el modelado de datos de resolución atómica, han dado lugar a mapas quasi-atómicos para la comparación de ambas cápsidas La cabeza madura de T7 es mayor y la cápsida es más fina que en la precabeza. Esta expansión está basada en una serie de cambios estructurales en la proteína gp10 (la proteína mayoritaria de la cápsida), así como en el patrón de interacciones intermoleculares que determina la red hexagonal en la que está basada la cápsida icosaédrica. La proteína gp10 presenta tras la maduración un cambio en la orientación relativa de los dominios A y P, de manera que la molécula se hace más plana. Estos cambios intramoleculares están acompañados por cambios mucho más notables en el patrón de contactos intermoleculares entre las subunidades de gp10: Los capsómeros hexaméricos elipsoidales de la precabeza sufren un cambio radical y adoptan una estructura más hexagonal, al tiempo que se produce una expansión en dirección radial, terminando todas las subunidades a la misma altura en el plano de la cápsida. Estos cambios globales están acompañados por un giro de cada subunidad de unos 30 º en el plano de la cápsida y en un cambio de unos 22º en la inclinación de cada subunidad de gp10 respecto a la superficie de la cápsida. En conjunto, los cambios conformacionales durante la maduración de la cápsida se reflejan en un aumento significativo de las superficies de interacción entre las subunidades de gp10 y en un cambio radical en las interacciones polares e iónicas de las superficies de contacto entre subunidades.Estos resultados se correlacionarán con el estudio de la estabilidad global y las propiedades nanomecánicas de las distintas formas de las cápsidas para tratar de entender las bases moleculares de la formación y estabilización de estos contenedores proteicos [4].[1] X. Agirrezabala, J. Martín-Benito, J.R. Castón, R. Miranda, J.M. Valpuesta and J.L. Carrascosa. (2005).EMBO J., 24, 3820-3829.[2] X. Agirrezabala, J. A. Velázquez-Muriel, P. Gómez-Puertas, S. H.W. Scheres, J. M. Carazo and J. L. Carrascosa. (2007). Structure, 15, 461-472.[3] Ionel, J.A. Velazquez-Muriel, D. Luque, A. Cuervo, J. R. Caston, J. M. Valpuesta, J. Martin-Benito and J. L. Carrascosa. (2011). J Biol Chem., 286 (1) 234-242.[4] Carrasco, A. Luque, M. Hernando-Pérez, R. Miranda, J.L. Carrascosa, P.A. Serena, M. de Ridder, A. Raman, J. Gómez-Herrero, I.A.T. Schaap, D. Reguera and P.J. de Pablo. (2011). Biophysical Journal, 100, 1100-1108


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8.04LA ESTRUCTURA A ALTA RESOLUCIÓN DE LA CHAPERONINA CCT EN COMPLEJO CON SU SUSTRATO TUBULINA

José M Valpuesta1, Hugo Yébenes1, Inés G Muñoz2, Min Zhou3, Pablo Mesa2, Marina Serna1, Ah Young Park3, Elisabeth Bragado-Nilsson2, Ana Beloso1, Guillermo de Cárcer4, Marcos Malumbres4, Carol V Robinson3 y Guillermo Montoya2 1 Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Campus de la Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, Spain.2 Macromolecular Crystallography Group, Structural Biology and Biocomputing Programme, Spanish National Cancer Research Centre (CNIO), Madrid, Spain.3 Department of Chemistry, Physical and Theoretical Chemistry Laboratory, Oxford, UK. 4Cell Division & Cancer Group, Molecular Oncology Programme, Spanish National Cancer Research Centre (CNIO), Madrid, Spain

El plegamiento de proteínas está asistido en muchos casos por un grupo de proteínas denominadas chaperonas moleculares. Dentro de esta gran familia de proteínas se encuentras las llamadas chaperoninas o Hsp60 [1]. Las chaperoninas se encuentran en todos los organismos descritos hasta la fecha y todas tienen una estructura común que está formada por doble barril dispuesto espalda contra espalda, con una cavidad cada uno de ellos donde se produce el plegamiento. El ciclo funcional tiene dos confórmeros principales, uno con la cavidad abierta, que sirve para reconocer y unir la proteína a plegar, y otro con la cavidad cerrada, para que en el interior se lleve a cabo el plegamiento de la proteína [2,3].Hay dos tipos de chaperoninas, las que se encuentran en eubacterias y organismos endosimbiontes (tipo I), y las que se encuentran en arqueobacterias o en el citosol de eucariotas, que se llama CCT. Esta chaperonina es la más compleja de todas ellas, pues está compuesta por ocho subunidades distintas pero homólogas, formando un doble octámero, y está involucrada en el plegamiento de proteínas muy importantes, como son las actinas y tubulinas. En este trabajo hemos conseguido determinar la estructura cristalográfica de CCT a 5,5 Å de resolución [4]. La estructura, en su conformación abierta y receptora de sustrato, muestra la presencia de una molécula de tubulina en cada uno de los anillos. La estructura muestra que el sustrato interacciona con lazos en los dominios ecuatorial y apical. Los datos que hemos obtenido contribuyen a la caracterización estructural y funcional de esta compleja nanomáquina.

[1] Horwich, A.L. et al. (2007) Two families of chaperonins: physiology and mechanism. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 23, 115-145[2] Braig, K. et al. (1994) The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8 A. Nature 371, 578-86.[3] Xu, Z., Horwich, A.L. & Sigler, P.B (1997) The crystal structure of the asymmetric GroELGroES-(ADP)7 chaperonin complex. Nature 388, 741–750.[4] Muñoz, I. et al. (2010) Crystal structure of the mammalian cytosolic chaperonin CCT in complex with tubulin” Nat Struct Mol Biol. 18, 14-19.


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9.01STRUCTURAL STUDIES ON MODIFIED NUCLEIC ACIDS

N. Martín-Pintado1, I. Gómez-Pinto1, A. Aviñó2, R. Eritja2, M. Damha3, C. González1

1 Instituto de Física Química Rocasolano. CSIC. Madrid2 IRB and IBMB-CSIC. Barcelona3 McGill University, Montreal.

Advances in synthetic chemistry afford new nucleic acids with intriguing properties. Some are interesting because they mimic natural DNA lesions, while others have possible medical applications in anti-sense therapy or for RNA interference. Finally, some have applications in the fascinating new field of Synthetic Biology. During the last few years, we have carried out structural studies on several modified nucleic acids in close collaboration with synthetic chemistry groups.In this communication we will present some of our results on modified quadruplexes, and hybrid duplexes. We will pay particular attention to our studies on fluorine-modified nucleic acids. In particular, nucleic acids analogs containing 2’-fluoro-arabino (2’F-ANA) and 2’-fluoro-ribosa (2’F-RNA) are interesting compounds for its potential applications in antisense and interference RNA therapy. When 2’F-ANA hybridizes to its complementary RNA, the resulting complex is a substrate of the enzyme RNase H, which cleaves the RNA strand of DNA/RNA hybrids, but is not active against pure RNA duplexes. On the other hand, siRNAs composed of combinations of 2’F-ANA and 2’F-RNA can activate the RISC complex and elicit potent gene silencing. The favored conformations of these two analogs are different, and combining 2’F-ANA and 2’F-RNA led to reduce affinity relative to an RNA/RNA duplex. Thus, the binding affinity at key regions of the siRNA duplex could be tuned by changing the pattern of incorporation of DNA-like and RNA-like nucleotides. By combining 1H and 19F NMR spectroscopy, we have determined the solution structure of several quimeric and hybrid duplexes, which sequences combine different patterns of 2’F-ANA and 2’F-RNA nucleotides. In this communication, we discuss the three-dimensional structure of these duplexes, and compare them with the structure of 2’F-ANA/RNA hybrids determined in a previous study. We have also determined the structure of a modified DNA/RNA hybrid duplex containing a 2’,2’-difluoro-deoxycytidine nucleotide. In all cases, the overall structure of the duplexes belong to the A-family of structures, with 2’F-RNA and RNA nucleotides adopting a North conformation, and 2’F-ANA a general East-type sugar conformation. The high stability of these duplexes is related to several factors, among them, the occurence of favorable pseudohydrogen bond between 2’F and purine H8. In alternating 2’F-RNA/2’F-ANA sequences, this stabilization factor is partially modulated by unfavorable electrostatic interactions between fluorine atoms across the minor groove.


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9.02STUDIES ON THE MOLECULAR RECOGITION OF AMINOGLYCOSIDE ANTIBIOTICS BY RNA AND RESISTENCE ENZYMES

Agatha Bastida1, Julia Revuelta1 and Juan Luis Asensio1

1 Instituto de Química Orgánica General. CSIC. Madrid

Aminoglycosides are highly potent, broad-spectrum antibiotics widely used in clinics. These drugs bind specifically to the bacterial decoding site, in the 16S ribosomal RNA (A-site), and thereby interfere with the accuracy of protein synthesis, leading to bacterial cell death. Additional targets such as the DIS kissing-loop complex, the Tat-responsive element and the Rev-responsive element, have been identified within the HIV genomic RNA and are also located in different functionally relevant RNA fragments, including self-splicing ribozymes and tRNAs. In addition, to specifically interact with RNA receptors, aminoglycosides are also recognized by the enzymes involved in antibiotic inactivation that play a central role in bacterial resistance processes. These proteins represent primary pharmacological targets. The emergence of high-resolution structural data for aminoglycoside/protein and /RNA complexes, during last decade, has greatly stimulated the structural based design of new bioactive derivatives with improved properties. More specifically, research has been focused on the preparation of tighter and more specific RNA binders, enzymatic inhibitors and new drugs non susceptible to enzymatic inactivation. Unfortunately, design efforts have frequently met a limited success, which, in our opinion, partially reflects our incomplete understanding of the molecular forces that stabilize the aminoglycoside complexes at a fundamental level. Herein, we analyze several key aspects of the aminoglycoside recognition by the ribosomal RNA and resistance enzymes employing a pluridisciplinar approach that combines Molecular Modeling, Organic Synthesis, Molecular Biology, NMR and different biophysical techniques as microcalorimetry and fluorescence. The implications of our results for the design of improved amionglycoside-based ligands will be discussed.

Notes and References:1 Tatiana Vacas, Francisco Corzana, Gonzalo Jimenez-Oses, Carlos Gonzalez, Ana M. Gomez, Agatha Bastida,Julia Revuelta, and Juan Luis Asensio. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 12074-12090.2 J. Revuelta, T. Vacas, F. Corzana, C. Gonzalez,A. Bastida, J. L. Asensio, Chem. Eur. J., 2010, 16, 2986-2991.3 J. Revuelta, F. Corzana, A. Bastida, J. L. Asensio, Chem. Eur. J., 2010, 16, 8635-8640.4 J. Revuelta, T. Vacas, F. Corzana, C. Gonzalez, A. Bastida, J. L. Asensio, Chem. Eur. J., 2010, 16, 2986-29915 J. Revuelta, T. Vacas, M. Torrado, F. Corzana, C. Gonzalez, J. Jiménez-Barbero, M. Menendez, A. Bastida, and J. L. Asensio. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 15, 5085-5103.6 J. L. Asensio, A. Bastida, J. Jiménez-Barbero, Topics in Current Chemistry, 2008, 273, 117-138.7 F. Corzana, I. Cuesta, F. Freire, J. Revuelta, M. Torrado, A. Bastida, J. Jimenez-Barbero, J. L. Asensio, J. Am. Chem. Soc. ,2007, 129(10); 2849-2865.8 F. Freire, I. Cuesta, F. Corzana, J. Revuelta, C. González, M. Hricovini, A. Bastida, J. Jiménez-Barbero, J. L. Asensio, Chem. Comm. 2007, 2, 174-176.9 M. Latorre, P. Peñalver, J. Revuelta, J. L. Asensio, E. García-Junceda, A. Bastida, Chem. Comm. 2007, 27, 2829-2831.10 A. Bastida, A. Hidalgo, J. L. Chiara, M. Torrado, F. Corzana, J. M. Cañadillas, P. Groves, E. Garcia-Junceda, Carlos Gonzalez, Jesús Jimenez-Barbero and Juan Luis Asensio, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 1, 100-116.11 J. L. Asensio, ,A. Hidalgo, A. Bastida, M. Torrado, F. Corzana, E. García Junceda, J. Cañada, J. L. Chiara, J. Jiménez-Barbero, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 23, 8278-8279.


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9.03BIDIMENSIONAL ASSEMBLIES OF DNA

Brendan Manning1, Alejandra Garibotti1, Sonia Pérez-Rentero1, Isaac Gállego1, Ramon Eritja1 1 Institut de Recerca Biomédica de Barcelona, Instituto de Química Avanzada de Cataluña-CSIC, CIBER-BBN. Baldiri i Reixac 10, 08028 Barcelona.

Nucleic acids are very important biomolecules in charge of the transmission of the genetic inheritance. In order to perform their biological functions, they have unique molecular recognition properties and they are chemically and physically stable. The self-assembly properties of nucleic acids have attracted a large interest in the scientific community for their use on nanosciences [1]. This is also a consequence of the existence of a robust method for the preparation of nucleic acid derivatives that allows the production of these compounds carrying a large variety of functional groups, molecules of interest and materials.In the present communication we will describe our recent work on the use of nucleic acids derivatives in the organization of molecules and materials on surfaces. Specifically we will describe the assembly of chemically-modified bidimensional DNA lattices to obtain defined arrays as well as the preparation of origami DNA. As a general aim synthetic oligonucleotides are being exploited to incorporate functionalities in molecular constructs and for the rational construction of 2-dimensional supports with well defined structures. First, unmodified DNA arrays described in the biblbliography [2] have been produced and observed by AFM on mica. Then, methodology for the synthesis of building blocks carrying reactive groups such as thiol and amino groups was developed [3, 4]. The resulting modified oligonucleotides were mixed with the appropriate oligonucleotides yielding the modified 2D DNA array. The modified arrays were deposited on mica and gold substrates. It was observed that the modified array was readily formed on gold surfaces and no array was formed on mica. In contrast the unmodified array was formed only on mica demonstrating that the introduction of the thiol groups on the DNA tiles enhances attachment of DNA to the surfaces. Further work is being directed to the preparation of 2D DNA arrays carrying nanoparticles, peptides and fluorescent molecules.Origami DNA is a new method for the rational organisation of structures that circumvents serious previous difficulties in the use of synthetic oligonucleotides for the preparation of two-dimensional, where small errors in the individual oligonucleotides results in the appearance and propagation of severe disruptions of the structures formed by base-pairing. These problems are obviated by the Origami approach [5] resulting in a high degree of predictability of the structures formed. In the presentation we will show the first origami DNAs produced in our group during this year.

[1] Aldaye, F.A., Palmer, A.L., and Sleiman, H.F. (2008) Science 321, 1795-1799[2] Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L.A., and Seeman, N.C. (1998) Nature 394, 539-544.[3] Manning, B., Pérez-Rentero, S., Garibotti, A.V., Ramos, R., and Eritja, R (2009) Sensor Lett. 7, 774-781.[4] Garibotti, A.V., Sisquella, X., Martínez, E., and Eritja R. (2009) Helv. Chim. Acta 92, 1466-1472.[5] Rothemund P.W.K. (2006) Nature 440, 297-302.


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9.04EXPLORATION OF BIOLOGICALLY RELEVANT BINDING MOTIFS USING CARBOHYDRATE OLIGONUCLEOTIDE CONJUGATES

R. Lucas1, I. Gómez-Pinto2, A. Aviñó3, E. Vengut1, J. J. Reina1, R. Eritja3, C. González2, J. C. Morales1 1 Department of Bioorganic Chemistry, Instituto de Investigaciones Químicas, CSIC - Universidad de Sevilla, Sevilla, Spain2 Instituto de Química-Física Rocasolano, CSIC. Serrano 119, 28006 Madrid, Spain3 Instituto de Investigación Biomédica de Barcelona, IQAC, CSIC, CIBER - BBN Networking Centre on Bioengineering, Biomaterials and Nanomedicine. Barcelona, Spain

Our research group is exploring carbohydrate-oligonucleotide conjugates as an energetic probe to study carbohydrate-aromatic stacking interactions in aqueous media. We first measured monosaccharide-benzene interactions and found that a fucose-benzene pair was the most stabilizing of the studied series (-0.4 Kcal.mol-1) with values in the same range of other interactions with aromatic residues found in proteins.[1] We have continued this approach to study carbohydrate-DNA stacking interactions. This type of recognition motif is present in the interaction of aminoglycosides with 16S rRNA A-site (2’-amino-2’-deoxyglucose moiety stacks over guanine 1491). We have observed that mono- and disaccharides, such as glucose or cellobiose, attached to the 5’-end of short DNA sequences stabilize a DNA duplex up to 0.9 kcal.mol-1 respect to the DNA control.[2] These results are quite remarkable since these carbohydrates are highly polar molecules. Carbohydrate-DNA stacking has been confirmed by NMR experiments and molecular dynamics calculations.

[1] Morales, J. C., Reina, J. J., Díaz, I., Aviñó, A., Nieto, P. M., Eritja R. (2008) Chem. Eur. J., 14, 7828-35. (Highlighted in Nature Chem. Biol., (2008) 4(10), 586-7).[2] Lucas R., Gómez-Pinto, I., Aviñó, A., Reina, J. J., Gonzalez, C., Eritja, R., Morales, J. C.J. Am. Chem. Soc. (2011), 133, 1909-1916.


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10.01ORGANIZACIÓN FUNCIONAL DE LAS VESÍCULAS SINÁPTICAS EN NEURONAS DE HIPOCAMPO

Imane Jemal1, María Ángeles Montes1 and Guillermo Álvarez de Toledo1 Department of Physiology & Biophysics, School of Medicine. University of Seville. 41009 Seville. Spain

Exocytosis, endocytosis and recycling of synaptic vesicles are three key elements in synaptic physiology Here we combine two optical probes, Sinaptophysin tagged to pHluorin `SypHy´ and Styryl dye `FM4-64´ for live imaging of exocytosis and endocytosis of synaptic vesicles. Bafilomycin A1 has been used to examine the partitioning of these probes into the recycling and resting pools. Neurons in culture were activated by a located field stimulation using a microelectrode. We show that a terminal contains about 92 vesicles spreads between the recycling (53 vesicles) and the resting pool (40 vesicles). This implicates a fraction of 54.4% of vesicles in the recycling pool and 45.6% in the resting pool. The fast releasable fraction of the recycling pool `readily releasable pool´ constitute 7.4% of the total pool, with an average of 9 vesicles per terminal. The release probability for fusion is 0.14. These parameters, however, vary from neuron to neuron, and among nerve terminals. From one hand, the total content oscillates between 46 and 262 vesicles, and in the other hand, the repartition between the different pools varies randomly. A fraction of the functional pool determines a synaptic efficacy and it doesn´t seem to be related with the spatial location of the terminal. An application of high external calcium does not vary the fraction of the pool but it narrow the range buy a homogenization of the synaptic boutons. Finally, we see that the recycling pool is depleted exponentially suggesting a dynamic equilibrium between pools that allows for compensation. Our assay can be used to investigate the effects of genetic and chemical modulation of the synaptic vesicle cycle. The quantitative parameters that can be extracted with the approaches outlined here should help to elucidate how pools reorganize in synaptic plasticity (potentiation and depression).


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10.02LA ORGANIZACIÓN DE LA MAQUINARIA SECRETORA EN EL MODELO DE LA CÉLULA CROMAFÍN

Luis Miguel Gutiérrez Pérez1 1 Instituto de Neurociencias de Alicante, Centro Mixto CSIC-Universidad Miguel Hernández. Sant Joan d’Alacant, 03550. Alicante

Las células cromafines especializadas en el almacenamiento y liberación de catecolaminas han sido ampliamente utilizadas como un modelo neurosecretor de referencia, por ejemplo para entender la dinámica del calcio vinculada a la exocitosis. En dicho sentido, los modelos matemáticos desarrollados toman en consideración aspectos funcionales como las características de los canales de calcio dependientes de voltaje (CCDV) pero suelen ignorar otros factores esenciales como la organización y geometría de la maquinaria secretora. En dicho contexto se presentará datos que evidencian que la citoarquitectura de la zona cortical constituida por un entramado de F-actina determina la disposición de los microdominios de CCDV y de proteínas SNARE constituyentes de la maquinaria de fusión [1,2]. Nuestros estudios plasmados en un modelo de arquitectura celular en forma de cajas citoesqueletales que asocian los elementos fundamentales del mecanismo molecular de la exocitosis evidencian que la organización en citoarquitecturas moleculares específicas favorecen las característicos de liberación rápida de sustancias activas propias de modelos neuroendocrinos. Así mismo, nuestros modelos indican que la posible porosidad de las estructuras de F-actina podría ser una factor importante para el establecimiento de niveles heterogéneos de calcio intracelular y para la persistencia de dicha señal esencial para la secreción.

[1] Villanueva, J., Torregrosa-Hetland, C.J., Gil, A., González-Vélez, V., Segura, J., Viniegra, S., and Gutiérrez, L.M. (2010).. HFSP Journal. 4, 85-92. [2] Torregrosa-Hetland, C-J., Villanueva, J., Giner, D., Lopez-Font, I., Nadal, A., Quesada, I., Viniegra, S., Exposito-Romero, G., Gil, A., González-Vélez, V., Segura, J. and Luis M. Gutiérrez (2010).. J. Cell. Science. 124, 727-734


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10.03OPTICAL CONTROL OF NEUROSECRETION

M. Izquierdo-Serra1, D. Trauner2, A. Llobet3, P. Gorostiza1, 41 Institut de Bioenginyeria de Catalunya (IBEC), Barcelona, Spain2 University of Munich, Germany3 Institut d’Investigació de Bellvitge (IDIBELL), Barcelona, Spain4 Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), Barcelona, Spain

Exocytosis is a key process in neurotransmission. It has been studied in great detail in neuroendocrine cells like chromaffins, because their size and shape provide good experimental access. However, in more conventional and relevant examples like hippocampal neurons, terminal size is about one micron and limits exocytosis studies with the current techniques. Thus, new methods for directly and accurately triggering exocytosis at a synaptic terminal are necessary and will help to further dissect the molecular mechanisms of neurotransmission.An appealing possibility is to use photoswitchable ion channels like the light-gated glutamate receptor (LiGluR, Fig 1A), because light stimulation is non-invasive and provides spatial and temporal control at the level of individual synaptic terminals and single action potentials.To test whether secretion of neurotransmitters could be controlled optically in neurosecretory cells, LiGluR channels were expressed in chromaffin cells. Amperometric recordings using carbon microfibers on LiGluR expressing cells showed that UV illumination could trigger secretion repeatedly in individual cells (Fig 2). This observation evidenced that MAG conjugated to LiGluR behaves as an optical switch controlling secretion of catecholaminergic vesicles in chromaffin cells. To gear optical control of neurosecretion, we took advantage of the graded behavior MAG photoswitch elicited on LiGluR channels. On this basis, we used the MAG photoswitch to define a three gear control of neurotransmission where neurosecretion was stopped at 500 nm, and exocytosis could be driven to a low or high frequency depending on whether cells were illuminated at 410-420 nm or 410-380 nm, respectively. The analysis of amperometric spikes indicates that kinetics of individual vesicle fusion events are not modified by light, thus being comparable to those obtained by depolarization. However, amperometric recordings showed that light triggered secretion occurred with a delay that was not observed when depolarizing stimuli were applied. Release probability in a neuroendocrine cell is greatly determined by the temporal and spatial characteristics of calcium influx. Several studies point out the existence of clusters of voltage gated calcium channels (VGCCs) that effectively determine secretion, while such level of organization was not expected for LiGluR channels.To further investigate these differences in coupling of calcium influx sites to secretion, exocytosis was compared for calcium influxes through the two channel types using membrane capacitance measurements. We observed capacitance increase was about two fold larger when calcium ions permeated via VGCCs, than when did it through LiGluR, suggesting that secretion was more efficiently triggered by the VGCCs. Finally, we limited the intracellular diffusion of calcium with EGTA, expecting to have a higher impact on uncoupled channel-vesicle than on co-localized channel-vesicle secretion, for which Ca2+ ions should travel a shorter distance. Results supported our hypothesis and showed that EGTA has a significantly stronger impact on LiGluR than on VGCCs.Overall we demonstrate that light-gated calcium influx through LiGluR can be used to control calcium-regulated cellular processes. In particular, exocytosis can be triggered using light without need of perfusion or voltage clamping. Furthermore, the combination of light stimulation and whole cell patch capacitance measurements allows a deeper study of secretion, which suggests that co-localization of native VGCC and secretory vesicles in chromaffin cells, is important for effective exocytosis under physiological conditions.


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10.04SPONTANEOUS ACTIVITY IN NEURONAL CULTURES: EXPERIMENTS AND MODEL

Jordi Soriano1, Sara Teller1, Javier G. Orlandi1, Enric Álvarez-Lacalle2, Jaume Casademunt1, Elisha Moses3

1 Departament d’Estructura i Constituents de la Matèria, Universitat de Barcelona, Barcelona.2 Departament de Física Aplicada, Universitat Politècnica de Catalunya, Barcelona.3 Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel

Neuronal networks, from the smallest culture to the entire brain, are characterized by a rich repertoire of spontaneous rhythmic dynamics, in the form of electric activity that propagates throughout the system [1]. Spontaneous activity in the brain plays a fundamental role in the development of synaptic connections and is crucial for proper synchronization between brain areas. The principles that govern the emergence, propagation, and stability of spontaneous activity fronts are proving elusive to the neuroscience community. In particular, the interplay between the connectivity of a neuronal network and its dynamics is still a fundamental paradigm.Here we present experiments designed to shed light on the role of neuronal connectivity on spontaneous neuronal dynamics [2]. We use the concept of patterned neuronal cultures, where neurons and connections are guided or constrained along predefined circuits. The patterns are prepared by using a topographical mould made of a soft polymer (PDMS) and manufactured using soft–lithography. Neurons are then placed over the mould in such a way that they grow and connect only along the valleys of the pattern. Patterned cultures show a repertoire of activity that is much richer and complex than standard, non–patterned cultures. For instance, we observe that the front advances in the form of patches of activity that propagate following complex paths, and with a velocity that is about 100 times slower than standard cultures. We also observe that activity preferentially starts in specific areas known as ’Burst Initiation Zones’. Experiments are analyzed in the framework of a numerical model that combines neuronal dynamics with a realistic description of the 2D network and graph-theory concepts. We show that this description gives rise to non-trivial spatial and temporal correlations that are crucial to comprehend the observed experimental behaviour.

[1] Eckmann, J.P., Feinerman, O., Gruendlinger, L., Moses, E., Soriano, J., and Tlusty, T. (2007) Phys. Rep. 449, 54-76.[2] Soriano, J., Rodríguez Martínez, M., Tlusty, T., and Moses, E. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 13758-13763.


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11.01METODOLOGÍAS PARA LA SIMULACIÓN DE PROTEÍNAS GLOBULARES, DESNATURALIZADAS E INTRÍNSECAMENTE DESORDENADAS EN DISOLUCIÓN DILUÍDA

Alvaro Ortega1, Diego Amorós1, José García de la Torre1

1 Grupo de Química Física Macromolecular (Polímeros), Departamento de Química Física, Universidad de Murcia, 30071 Murcia, España

Durante las dos o tres últimas décadas se ha producido, por un lado un resurgimiento del interés de la caracterización de macromoléculas biológicas en disolución diluida (coeficientes hidrodinámicos, dispersión de rayos X (SAXS) o neutrones, relajación RMN, etc). Y por otro, una eclosión de información estructural con alto nivel de detalle – atómico, en muchos casos. Para poder relacionar propiedades en disolución con estructuras con ese nivel de detalle, nuestro Grupo ha diseñado metodologías computacionales para el cálculo de esas propiedades a partir de estructuras atómicas, a nivel de residuo, o incluso procedentes de SAXS o microscopías. Nuestros programas HYDROPRO e HYDRONMR [1] (basados en los denominados bead models, que llevan usándose desde hace una década para este propósito, ha sido objeto recientemente de notables mejoras de rendimiento y aplicabilidad.Al paradigma de estructura global, que considera proteínas nativas como partículas rígidas, o como cadenas flexibles cuando están desnaturalizadas, se ha añadido recientemente el concepto de proteínas intrinsecamente desordenadas, que comprenden tanto zonas rígidas, ordenadas, como otras que no lo son. Para el mencionado propósito de predecir propiedades a partir de la estructura es preciso incorporar en los modelos la flexibilidad. Para este propósito – habitual en otros casos, como polisacáridos, grandes ADNs y polímeros sintéticos - , hemos desarrollado metodologías implementada en los programas MONTEHYDRO [1] (método de Monte Carlo) y SIMUFLEX [2] (simulación de dinámica browniana).Mediante estas metodologísa hemos abordado el caso de proteínas no rígidas. Adoptamos una aproximación de coarse graining, con modelos a nivel de resíduo (un elemento por aminoácido). Un paso previo estriba en la parametrización de los elementos del modelo (conectores, angulos, torsiones, efectos estéricos… que describen la flexibilidad. Para ello, hemos hecho un estudio del caso extremo de proteínas completamente (químicamente) desnaturalizadas, consiguiendo una reproducción excelente de datos hidrodinámicos y de SAXS. Habiendo establecido los modelos y parámetros necesarios, los hemos aplicado al calculo de propiedades en disolución de diversas proteínas intrínsecamente desordenadas, consiguiendo una calidad en la predicción de sus propiedades que, considerando las peculiaridades de estas proteínas, así como la complejidad de las teorías y metodologías computacionales implicadas, nos parecen muy satisfactorias, como se pone de manifiesto en varios ejemplos que se presentan.Trabajo financiado por las subvenciones CTQ2009-08030 del Ministerio de Ciencia e Innovación y 04531/GERM/06, como Grupo de Excelencia Científica de la Región de Murcia.

[1] García de la Torre, J. Huertas, M.L., B. Carrasco (2000) Biophys. J. 78, 719-730; (2000) J. Magn. Reson. 147, 138-146. [2] García de la Torre, J., Ortega, A., Pérez Sanchez, H.E., Hernández Cifre (2005) Biophys. Chem. 116, 12-128.[3] García de la Torre, J., Hernandez Cifre, J.G., Ortega A., Rodríguez Schmidt, R., Fernandes M.X., Pérez Sánchez, H.E., Pamies, R., J. Chem. Theor. Comput. (2009) 5, 2606-2618.


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11.02ESTUDIO MEDIANTE DINÁMICA MOLECULAR DEL COMPORTAMIENTO MECÁNICO Y TERMODINÁMICO ASOCIADO A LA INSERCIÓN DE ANESTESIA EN UNA MEMBRANA CELULAR

J.J. López Cascales1 y S.D. Oliveira Costa1

1 Grupo de Bioinformatica y Macromoleculas (BIOMAC), Escuela Superior Ing. Industrial, Campus Alfonso XIII, Aulario II-Universidad Politecnica de Cartagena, 30203, Cartagena, Murcia

El empleo de fármacos con propiedades anestésicas se encuentra muy extendido en medicina desde hace más de un siglo [1] en los tratamientos paliativos del dolor y en cirugía. Sin embargo, persiste el debate referente al mecanismo molecular de actuación de dichos fármacos. En este sentido, los mecanismos propuestos en la bibliografía podrían englobarse en dos grandes grupos: el primero esta basado en la actuación directa del anestésico sobre los canales iónicos bloqueando el transporte de sodio asociado con la transducción nerviosa [2], y el segundo mecanismo esta basado en la perturbación de las propiedades de la membrana celular asociadas a la presencia del anestésico en su interior (como pueden ser su fluidez, presión superficial o espesor de la membrana), las cuales perturban de forma indirecta la estructura de los canales iónicos, desembocando en el consiguiente bloqueo de la transducción nerviosa [3]. En este trabajo estudiamos como la presencia de anestésico, benzocaina en nuestro caso, perturba las propiedades de la membrana celular en función de su composición lipidica (dada la relación existente entre la actividad anestésica y la composición lipidica de la membrana). La benzocaina fue elegida como el anestésico a estudiar por ser una molécula muy utilizada como anestésico local, bien caracterizada en sus propiedades fisicoquímicas y de baja solubilidad en condiciones fisiológicas. Con el fin de estudiar la interacción de la benzocaina con diferentes bicapas lipidicas, el DPPC (dipalmotoilfosfatidil colina) y el DPPS (dipalmotoilfosfatidil serina) fueron los lípidos empleados en los modelos de membrana celular, y la técnica de Simulación de Dinámica Molecular fue la técnica utilizada en nuestro estudio, dado que dicha técnica computacional ha venido mostrándose como una técnica útil en el estudio de las interacciones moleculares en bicapas lipidicas con resolucion atomica [4].En este sentido, mediante la simulación de diferentes modelos de bicapas simétricas y asimétricas de DPPC/DPPS, los parámetros termodinámicos asociados a la inserción de una molécula de benzocaina en el interior de la bicapa lipidica, tales como ΔHo, ΔSo y ΔGo, pudieron ser determinados. Por otra parte, dada la relación existente entre la variación en la fluidez de la bicapa lipidica y la solubilidad de la anestesia en su interior, propiedades elásticas de la membrana, tales como el modulo de esparcimiento, tensión superficial o la presión lateral de la membrana, fueron algunas de las propiedades determinadas para diferentes concentraciones de anestesia en su interior, obteniéndose como la composición de la bicapa afecta notablemente a la barrera termodinámica de inserción de la benzocaina.Agradecimientos: Al centro de Supercomputo Ben-Arabi de la Fundación Parque Científico de Murcia y al Centro de Calculo Científico de la Universidad Politécnica de Cartagena.

[1] S. Freud (1884) Zentralbl. Ges. Ther. 2, 289-314.[2] N.P. Franks and W.R: Lieb (1988) Nature, 333, 662-664.[3] A. Seeling, P.R. Allegrini and J. Seeling, (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 267-276.[4] J.J. Lopez Cascales, J. Garcia de la Torre, S.J. Marrink and H.J.C. Berendsen (1996), 104, 2713-2720.


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11.03VARIABILIDAD EN REDES METABÓLICAS DE SÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS ESENCIALES EN ENDOSIMBIONTES BACTERIANOS. ANÁLISIS ESTEQUIOMÉTRICO

Federico Morán1, Sara Vazquez1, Clara Higuera1, Miguel Ponce2, Soledad Delgado3, Amparo Latorre4, Juli Peretó4, Francisco Montero1

1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I. Universidad Complutense de Madrid2 Departamento de Bioquímica. Universidad de la República. Montevideo (Uruguay) 3 Departamento de Organización y Estructura de la Información, EU Informática. Universidad Politécnica de Madrid4 Institut Cavanilles de Biodiversitat i Biologia Evolutiva de la Universitat de València

El análisis estequiométrico, combinado con el análisis de balances de flujos (FBA) de redes metabólicas es una poderosa herramienta para estudiar la organización de rutas metabólicas dentro de una red compleja de reacciones, tal como la proporcionada por un organismo en su conjunto (para una completa revisión, ver [1]. En la presente comunicación se muestra la aplicación de estas herramientas al estudio del diseño de las rutas en una bacteria endosimbionte (Buchnera aphidicola BCc) de aquellos aminoácidos que son esenciales para el huésped. Para determinar estas rutas se optimizó, utilizando programación lineal, la producción del aminoácido deseado, siguiendo a continuación la siguiente estrategia, previamente utilizada por otros autores[2]: en primer lugar, se encontró la distribución de flujo que optimiza la salida del aminoácido seleccionado; a continuación, el valor óptimo de la salida obtenido se introdujo, con un determinado grado de tolerancia, como restricción en el sistema, en el cual cada flujo de la red fue maximizado y minimizado. Por medio de este procedimiento, conocido como análisis de la variabilidad, se pueden identificar los flujos que serán inactivos cuando se impone la nueva restricción, así como aquellos flujos que, aunque correspondiendo a reacciones reversibles, siempre operan en la misma dirección, y por tanto se pueden considerar como irreversibles. Consecuentemente, se obtiene una red reducida donde es posible calcular los modos elementales de flujo, evitando la explosión combinatoria de la red inicial. Sobre esa red reducida se ha calculado, por tanto, todos los modos elementales, y sobre la totalidad de esos modos se han llevado a cabo diferentes estudios. De ellos, el más interesante y novedoso es un intento de clasificación, utilizando redes neuronales de dichos modos elementales. Para ello se han usado los métodos de Self Organizing Maps (SOM) y Growing Cell Structures (GCS) [3]. Como consecuencia, la totalidad de modos elementales aparecen clasificados en “clusters”, de los cuales es posible deducir importantes propiedades del sistema, como es la incidencia de reacciones que son fundamentales, robustez de la red frente a knock-outs, etc. Además, se ha evaluado sobre la red total una optimización multiobjetivo, teniendo en cuenta no sólo la producción de un determinado aminoácido, si no simultáneamente la de otros compuestos y la de biomasa. Este análisis ha permitido determinar el frente Pareto correspondiente, que proporciona información de conjunto sobre las propiedades de los diferentes modos elementales y de la red metabólica.Con todos los resultados obtenidos es posible conjeturar y discutir la estrategia general del diseño de las rutas metabólicas del sistema estudiado, y los métodos utilizados se proponen como metodología general de estudio de otros sistemas, entre ellos otras bacterias endosimbiontes relacionadas (en este caso, por ejemplo, con Buchnera aphidicola Aps), a fin de encontrar semejanzas, diferencias, y diferentes estrategias evolutivas en ambos casos.[1] Llaneras, F., and Pico, J. (2008) J. Biosc. Bioeng. 105(1): 1-11.[2] Ponce de Leon, M., Cancela, H., and Acerenza, L. (2008) J. Biol. Phys. 34, 73-90[3] Delgado S., Gonzalo C., Martínez E. y Arquero A.: Topology preserving visualization methods for growing self-organizing maps. . F. Sandoval et al (Eds.) IWANN 2009. Lecture Notes in Computer Science. Vol. 5517. Pp: 197-204, (2009)


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11.04IDENTIFICACIÓN MEDIANTE METABOLÓMICA DE DIANAS TERAPÉUTICAS Y BIOMARCADORES EN ENFERMEDADES MULTIFACTORIALES

Marta Cascante1, Vitaly Selivanov1, Gema Alcarraz-Vizá1, Adrià Benito1, Susana Sanchez-Tena1, Josep Centelles1, Anibal Miranda1, Santiago Diaz-Moralli1, Silvia Marin1, Pedro de Atauri11 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Biology, Universitat de Barcelona, Av. Diagonal, 645, 08028 Barcelona, Spain.Institute of Biomedicine of the Universitat de Barcelona (IBUB), Barcelona, Spain

The metabolome of an organism is the result of the in vivo function of gene products and it is closely tied to its physiology and its environment. Thus, while transcriptomic and proteomic analysis do not explain the whole story of what might be happening inside a cell, the metabolic flux profile offers a unique opportunity to look at the relationships between genotype and phenotype as well as their interaction with the environment.In this work we show a computational tool developed to quantify metabolic flux distributions in living cells according to specific conditions regarding cell fate or pathology. The metabolic fluxes are estimated from experiments in which cells are incubated with a substrate containing an isotopic label, usually 13C, that is redistributed in the metabolites through the metabolic network during cell incubation. Metabolite concentrations, the distribution of isotopologues and their time courses are quantified by mass spectrometry (MS). The metabolic flux map obtained allows us to quantify the importance of different metabolic pathways, thus establishing a distinctive metabolic fingerprint. Furthermore, we present some applications showing how metabolic models allow the understanding of the metabolic adaptations accompanying essential cell fates and pathological alterations associated with multifactorial diseases such as cancer, diabetes and obesity. The possibilities to exploit pathological metabolic reprogramming in target discovery are also discussed. We conclude that a full understanding of the metabolic adaptation accompanying multifactorial diseases opens new ways for the developing of novel multi-hit therapies that work on the simultaneous attack of several pathways at once.

This work was supported by funds of Spanish Government and European Union FEDER SAF2008-00164; RTICC-ISCIII Spanish Government and European Regional Development Fund (RD06/0020/0046); European Commission DIAPREPP (FP7-202013) and ETEHRPATHS (FP7-222639) and Generalitat de Catalunya (2009SGR-1308 and Icrea Academia award 2010 granted to M. Cascante).


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12.01PROTEOMIC TOOLS FOR VENOMIC ANALYSIS

Juan J. Calvete1

1 Instituto de Biomedicina de Valencia, CSIC

El veneno representa un arma básica y un factor trófico adaptativo en la evolución de las serpientes. Unas 640 especies de ofidios actuales son venenosas, aunque apenas una pequeña parte son un peligro para nuestra especie. Anualmente 5,4 millones de accidentes, y más de 125.000 muertes, por mordedura de serpientes, ocurren en países tropicales de Centro- y Suramérica, África subsahariana y Asia, y afectan sobre todo a trabajadores y niños de zonas rurales. La clave para hacer frente a esta patología radica en el entendimiento de la evolución y la composición de los venenos. Nuestro laboratorio ha desarrollado técnicas proteómicas (venómica, antivenómica y fenotipado de venenos) para hacer frente a la

patología desatendida que es el envenenamiento por mordedura de serpiente.


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12.02NANO-DEVICES FOR IN CELL DELIVERY OF APOTOSIS INHIBITORS

Laura Mondragón1, Mar Orzáez1, María J. Vicent1, Félix Sancenón2, Ramón Martínez-Mañez2, Enrique Pérez-Payá1,3

1 Centro de Investigación Príncipe Felipe. E-46012 Valencia, Spain.2 Departamento de Química. Universidad Politécnica de Valencia. E-46022 Valencia, Spain3 IBV-CSIC. E-46010 Valencia, Spain.

Virtually all cells of higher metazoans harbour a genetic death program called programmed cell death (apoptosis) that has evolved to eliminate unwanted and potentially dangerous cells. Defects in the regulation of apoptosis are at the root of a variety of diseases. When cells acquire resistance to induction of apoptosis it correlates with cancer or autoimmune diseases. In contrast, excessive apoptosis induces unwanted cell death and promotes several pathological conditions such as tissue infarctation, ischemia-reperfusion damage and degenerative diseases. To identify molecules that could ameliorate disease-associated excessive apoptosis, drug discovery efforts initially targeted the inhibition of caspase activity. However, caspase inhibitors have encountered problems in their pharmacological development. Alternatively, we proposed that multiprotein complexes upstream of caspase activation, in particular the formation of the Apaf-1-dependent apoptosome, can be also relevant points of intervention for the development of modulators of apoptosis pathways. The apoptosome is a holoenzyme multiprotein complex which main function is to activate the initiator caspase-9. We have reported that chemical inhibitors of Apaf-1 improved cell viability in cells induced to undergo apoptosis. In a near future, it is going to be feasible to inhibit apoptosis and we will assist to the succesful application of apoptosis inhibitors in therapy; the problem is to do this in such a way that only those cells we wish to target are effectively inhibited. This is the basis to introduce concepts as controlled release and nanomedicines as promising research fields in biomedical sciences. We approached the field a few years ago by exploring the use of polymer therapeutics that conjugate a bioactive agent to a polymer carrier and improve the therapeutic response. More recently we have explored the use of alternative polymeric materials, as silica mesoporous supports (SMPS) as inorganic scaffolds for the storage and controlled release of antiapoptotic drugs.


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12.03ICP-ESPECTROMETRÍA DE MASAS: UNA TÉCNICA REVOLUCIONARIA PARA PROTEÓMICA GUIADA POR HETEROÁTOMOS

Sanz Medel, A.

La proteómica cuantitativa y la determinación “absoluta” de proteínas son temas de interés creciente, ya que sólo la cantidad de proteínas, o los cambios en su abundancia, reflejan la situación y el alcance real de los cambios en un sistema biológico dado. La cuantificación de las proteínas de interés en un tejido se ha llevado a cabo mediante técnicas de Espectrometría de Masas, específicas para las biomoléculas buscadas. Sin embargo, es común hasta ahora que dicha cuantificación sea relativa, incluso recurriendo a técnicas de marcaje con isótopos estables como ICAT y SILAC. En la última década se ha materializado la idea de usar detección por espectrometría de masas elemental, es decir, selectiva para un elemento de la proteína (e.g. instrumentos de ICP-MS) para conseguir cuantificaciones absolutas. Sin duda, el ICP-MS es hoy una nueva herramienta con un gran potencial en el campo de la proteómica cuantitativa.Trataremos de ilustrar el novedoso papel del ICP-MS en el análisis de proteínas y en proteómica. Se discute y demuestra el potencial de los métodos y estrategias del ICP-MS para detectar múltiples heteroátomos en proteínas y sus mezclas, así como su capacidad para hacer frente al problema de la cuantificación absoluta de proteínas, a través de robustas determinaciones de los heteroátomos. Se abren nuevos caminos derivados de la capacidad del ICP-MS para hacer medidas precisas de la abundancia de diferentes isótopos. Se explica el concepto del llamado “heteroátom(isotope)-tagged proteomics” para incluir el uso de “etiquetas” presentes de forma natural (e.g. S, P, Se, metales) y también para extender las aplicaciones del ICP-MS a cualquier otra proteína mediante reacciones de bioconjugación (por ejemplo introduciendo heteroátomos detectables por el ICP-MS en la proteína o péptido de interés). El objetivo principal aquí es mostrar las hasta ahora desconocidas y poderosas capacidades de usar una fuente de ionización “dura” (como el ICP) para complementar las bien establecidas fuentes de ionización “blandas” (como MALDI-, ESI-, etc) en Espectrometría de Masas para hacer frente al análisis proteómico actual(1-3).

1.“Heteroatom(isotope)-tagged proteomics via ICP-MS (Trends)”. A. Sanz-MedelAnalytical and Bioanalytical Chemistry. 623 (2008) 140-145.2.“The emerging role of ICP-MS in proteomic analysis”J. Bettmer, M. Montes Bayón, J. Ruiz Encinar, M.L. Fernández Sánchez, M.R. Fernández de la Campa and A. Sanz-MedelJournal of Porteomics. 72 (6) (2009) 989-10053.“ICP-MS for multiplex absolute determinations of proteins”. A.Sanz-Medel.Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (2010) 1853-1859


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12.04FLUORESCENCE FLUCTUATION SPECTROSCOPY AS A TOOL TO CHARACTERIZE BIOMOLECULAR COMPLEXES

Silvia Zorrilla1

1 Instituto de Química-Física “Rocasolano”. CSIC. Serrano 119. 28006. Madrid. Spain.

Fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) is a general name for a group of methods based on the analysis of the intensity fluctuations arising from a small number of fluorescent molecules within a tiny detection volume (~1fL) created by a microscope-focused laser beam. These methods allow determination of the energetic and dynamic parameters of macromolecular complexes with high sensitivity, low sample consumption and high temporal resolution [1]. One of these FFS methods is fluorescence correlation spectroscopy (FCS), in which the intensity fluctuations are processed to obtain autocorrelation functions from which the translational diffusion and the concentration of the fluorescent particles can be reliably determined. Thanks to its low invasiveness, FCS has been applied to study multiprotein, lipoprotein and nucleoprotein complexes in diluted and crowded solutions, in biological membranes and in live cells. The two color fluorescence cross-correlation spectroscopy (TCFCCS) method is an extension of FCS still under development that provides access to the affinity and also to the stoichiometry [2,3] of biomolecular complexes. For TCFCCS analysis the interacting molecules need to be labeled with two spectrally different dyes whose emission is detected in two separate channels. Correlation of the fluctuations arising from the complexes bearing the two dyes gives rise to a cross-correlation curve indicative of binding. Moreover, the amplitude of the cross-correlation signal is related to the degree of interaction between the two labeled molecules. We are currently applying FFS methods, including multiphoton FCS and TCFCCS, to characterize protein assembly under different experimental conditions, and to study the heteroassociation of soluble proteins with membrane proteins reconstituted in cytomimetic membrane models. Our results show that although TCFCCS methods are best suited to detect and quantify high affinity interactions in the picomolar-nanomolar range, this approach can be extended to characterize complexes of moderate affinity involving polymers.

[1] Margeat, E., Boukari, H., and Royer, C.A. (2007). In Protein Interactions. P. Schuck, ed. Springer, New York. 1–38.[2] Kim, S.A., Heinze, K.G., Bacia, K., Waxham, M.N. and Schwille, P. (2005). Biophys. J. 88, 4319–4336.[3] Zorrilla, S., Ortega, A., Chaix, D., Alfonso, C., Rivas, G., Aymerich, S., Lillo, M.P., Declerck N., and Royer C.A. (2008). Biophys. J. 95, 4403–4415.


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O1.05LIGAND-INDUCED DISORDER-TO-ORDER TRANSITION: STUDY OF THE CALCIUM-DEPENDENT FOLDING OF THE RTX (REPEAT IN TOXIN) PROTEINS.

Ana Cristina Sotomayor-Pérez1, Daniel Ladant 1, Alexandre Chenal 1

1 Institut Pasteur, CNRS URA 2185, Unité de Biochimie des Interactions Macromoléculaires, Département de Biologie Structurale et Chimie, 28 rue du Dr Roux, 75724 Paris

Ligand-induced disorder-to-order transition plays a key role in the biological functions of many proteins that contain intrinsically disordered regions. This trait is exhibited by so-called RTX (Repeat in ToXin) motifs found in many virulence factors secreted by numerous Gram-negative pathogenic bacteria: RTX-proteins are natively disordered in the absence of calcium but fold upon calcium binding. The adenylate cyclase toxin (CyaA) produced by Bordetella pertussis, the causative agent of whooping cough, contains approximately 40 RTX motifs organized in 5 successive blocks separated by non-RTX flanking regions. This RTX domain (RD) mediates toxin binding to its eukaryotic cell receptor. We previously showed that the last block of RD, block V, which is critical for CyaA toxicity, exhibits the hallmarks of intrinsically disordered proteins in the absence of calcium [1]. Here, we have investigated the electrokinetic and hydrodynamic properties of several RTX polypeptides derived from the block V of RD, by a combination of complementary biophysical approaches. We showed that RTX blocks could fold and stabilize upon multimerization, a cooperative process that might contribute to improve the secretion efficiency. We further showed that, in the absence of calcium, RTX block V polypeptides adopt a pre-molten globule state that switches to a native state in the presence of calcium. This transition appeared finely tuned from a thermodynamic point of view, to respond to calcium binding in physiological conditions. Moreover, we showed that the high number of calcium bound per protein allows to switch from an intrinsically disordered, highly-charged apo-form to a folded holo-state with a reduced mean net charge. Our data suggest that the folding of the RTX proteins is controlled by a charge change effect due to the variations of physiological concentrations of calcium. The simplicity of this calcium-induced, charge-driven disorder-to-order transition may favor a robust and chaperone-independent protein folding process adapted to the biogenesis of the RTX proteins.

[1] Sotomayor-Pérez, A.C., Karst, J.C., Davi, M., Guijarro, I., Ladant, D., and Chenal, A. (2010) J. Mol.Biol.397, 534-549.


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O1.06HALOPHILIC ENZYME ACTVATION INDUCED BY SALTS

Gabriel Ortega1, Ana Laín1, Xavier Tadeo1, Blanca López-Méndez1 and Óscar Millet1

1 Structural Biology Unit, CICbioGUNE, Bizkaia Technology Park, Building 800, 48160, Derio, Spain

Halophilic archaea grow in hypersaline environments, avoiding osmotic shock by increasing the ionic strength of their cytoplasm by up to 4–6 M. To remain biologically active, halophilic proteins have evolved towards a biased amino acid composition [1], and are monotonically stabilized by KCl and NaCl [2]. However, activity dependence upon salt addition is much more complex and the underlying mechanisms are currently unknown. The NAD+-dependent ligase N from Haloferax volcanii (Hv LigN) is activated by KCl, but when NaCl is added instead, the enzyme is inactive at all salt concentrations. [3]Structural analysis revealed that the enzyme undergoes a conformational rearrangement during catalysis [4]. Two isoforms, corresponding to different conformations in the reaction coordinate, were isolated and their stabilities measured at increasing concentrations of salts.Our results show that enzyme activation induced by salt is an indirect effect, resulting from the differential stabilization of two enzyme conformations with different exposed hydrophobic area and ultimately related to the Hofmeister effect. This model could also explain the salt effect in other halophilic enzymes and it was successfully applied to reengineer Hv LigN to recover enzymatic activity in the presence of NaCl.

[1] Paul S., Bag S.K., Das S., Harvill E.T., & Dutta C. Genome Biol, 9, R70 (2008)[2] Tadeo X., López-Méndez B., Trigueros T., Laín A., Castaño D., & Millet O. PLoS Biol 7: e1000257 (2009)[3] Poidevin L., MacNeill S.A. BMC Mol Biol 7: 44 (2006)[4] Gajiwala K.S., Pinko C. Structure 12: 1449-1459 (2004)


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O1.07OBSERVACIÓN DIRECTA DE ISOMERIZACIÓN DE PUENTES DISULFURO EN UNA PROTEÍNA INDIVIDUAL

Jorge Alegre-Cebollada1, Jaime Andrés Rivas-Pardo1,2, y Julio M. Fernández1.1Department of Biological Sciences, Columbia University, New York, 1212 Amsterdam Avenue, 10027 NY, USA. 2Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, Casilla 653, Santiago, Chile

La dinámica y la regioselectividad de los intercambios tiol/disulfuro son esenciales para multitud de procesos fisiológicos, como el plegamiento oxidativo en el retículo endoplásmico. Actualmente, se predice que las cisteínas libres que se generan tras la reducción de puentes disulfuro pueden reaccionar con otros puentes disulfuro, lo que conlleva la isomerización de estos enlaces. Por tanto, se espera que la reducción del ~19% de proteínas con más de un puente disulfuro se caracterice por una creciente complejidad. Como consecuencia de la ausencia de técnicas experimentales que permitan observar intercambios tiol/disulfuro paralelos, hasta el momento no ha sido posible describir de un modo cuantitativo reacciones intramoleculares de intercambio tiol/disulfuro en proteínas. En esta comunicación, presentamos una técnica de molécula individual para cuantificar la cinética y la regioselectividad de reacciones intramoleculares de intercambio tiol/disulfuro que dan lugar a isomerización de puentes disulfuro en proteínas. Para ello, se diseñó una proteína que incluye una cisteína “enjaulada” y un puente disulfuro críptico. En presencia del aminoácido L-Cys, la aplicación de fuerza a la proteína libera el residuo de cisteína, que queda reactivo, y expone el puente disulfuro. La cisteína liberada es capaz de romper el puente disulfuro mediante sendos ataques nucleofílicos sobre cualquiera de sus átomos de azufre. De este modo, se generan diferentes caminos de reacción paralelos que pueden ser diferenciados en nuestros experimentos a fuerza constante por el número de aminoácidos que se liberan tras la ruptura de los puentes disulfuro. Mediante esta aproximación experimental, es posible estimar constantes cinéticas de reacciones intramoleculares de intercambio tiol/disulfuro. El valor que obtenemos para estas constantes es comparable con la velocidad de reducción intermolecular de puentes disulfuro por agentes rédox celulares. Nuestros experimentos demuestran la liberación por aplicación de fuerza de una especie reactiva que actúa localmente dentro de una proteína

individual. Esta metodología podría ser ampliada al estudio de otras reacciones químicas.


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O1.08CARACTERIZACIÓN DE LOS PROCESOS MICROSCÓPICOS DETERMINANTES EN LA FORMACIÓN DE FIBRAS AMILOIDES

Nunilo Cremades1, Samuel I. A. Cohen1, Allen Y. Chen1, Angel Orte1,2, Massimo Sandal1, Richard W. Clarke1, Paul Dunne1, Francesco A. Aprile1, Carlos W. Bertoncini1,3, Tuomas P. J. Knowles1, Christopher M. Dobson1 and David Klenerman1 1 Department of Chemistry, Lensfield Road, University of Cambridge, Cambridge CB2 1EW, United Kingdom.2 Department of Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, University of Granada, Campus Cartuja, 18071, Granada, Spain.3 Institute for Research in Biomedicine, Baldiri Reixac 10, 08028, Barcelona, Spain.

Existe un importante conjunto de enfermedades, entre las que destacan la enfermedad de Alzheimer o de Parkinson, que comparten un proceso común constituido por el plegamiento anómalo y agregación ordenada de una proteína/péptido especifico, y diferente para cada tipo de enfermedad, que resulta en la formación de estructuras fibrilares, insolubles, altamente estables y ricas en lámina beta, comúnmente denominadas fibras amiloides. A pesar del intenso esfuerzo en el campo, todavía se desconocen los mecanismos por los cuales proteínas funcionalmente monoméricas sufren estos procesos de agregación, tanto in vivo como in vitro. En concreto, se conoce muy poco de las especies oligoméricas que se forman al inicio de la agregación y que no sólo representan un paso obligado para la formación de fibras amiloides, sino que se erigen en recientes estudios como las especies más tóxicas directamente relacionadas con el desarrollo de enfermedad. Esta ausencia de información experimental es consecuencia de los problemas y retos inherentes al estudio de especies altamente heterogéneas y escasamente pobladas. Nosotros hemos desarrollado un procedimiento experimental por el cual hemos caracterizado la agregación de la proteína cuyo plegamiento anómalo se asocia con la enfermedad de Parkinson (alfa-sinucleina) a nivel de partícula individual, utilizando FRET intermolecular, e identificado una reorganización estructural a nivel de oligomero clave para la adquisición de la estructura amiloide. Finalmente, hemos derivado un modelo cinético que nos ha permitido determinar los procesos microscópicos esenciales para la formación de fibras amiloides al menos para esta proteína.


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O2.05PORE FORMATION BY BAXα5 IN NUMBERS: COUNTING SINGLE PORES AND SINGLE BAXα5 PEPTIDES

Gustavo Fuertes1, Ana J. García-Sáez2, Santi Esteban-Martín3, Diana Giménez1, Orlando L. Sánchez-Muñoz1, Petra Schwille4, Jesús Salgado1

1 Instituto de Ciencia Molecular. Universidad de Valencia. Paterna (Valencia), Spain2 Bioquant, Heidelberg, Germany3 Institute for Research in Biomedicine, Barcelona, Spain4 Biotechnologisches Zentrum der TU Dresden, Dresden, Germany

Amphiphatic cationic peptides, like antimicrobial peptides and fragments derived from pore-forming toxins, bind spontaneously to membranes and perturb bilayer integrity usually through the formation of transmembrane pores after a threshold peptide concentration is reached. Both peptides and lipids cooperate in the induction and stabilization of membrane pores. Such pores have been shown to have a time-dependent size: they shrink from an initially large size after the peptide attack to a final stable structure [1,2]. To get further insight into the action mechanism of a membrane-active fragment derived from the apoptotic protein Bax, Baxα5, we set out to determine how many peptides are required for pore formation and how many pores are formed in such process. Pore size was quantified by analyzing the entry kinetics of externally added dyes into single giant unilamellar vesicles (GUVs) after addition of Baxα5. Three parameters could be extracted from a fitting protocol derived from the Fick law of diffusion: the total pore areas at short-term (kinetic) and long-term (equilibrium) regimes and the relaxation time. These areas could be further converted into apparent pore numbers. Most GUVs appeared to be “infected” with only one pore of ~15 nm in radius which reduced its size in a few minutes to ~4 nm. The Baxα5 membrane-bound concentration responsible for the formation and stabilization of such pores was next investigated by scanning fluorescence correlation spectroscopy. We observed an apparent weak correlation between the amount of bound peptide and vesicle leakage, with porated and non porated GUVs coexisting for a given surface density of Baxα5. Taken together our results suggest that the concentration of membrane-bound Baxα5 is only one of the factors driving pore formation and that the number of pores per vesicle is rather small.

[1] Fuertes, G., García-Sáez, A.J., Esteban-Martín, S., Giménez, D., Sánchez-Muñoz, O.L., Schwille, P. and Salgado, J. (2010) Biophys J. 99, 2917-25.[2] Tamba,Y., Ariyama, H., Levadny, V., Yamazaki, M. (2010) J. Phys Chem B, 114, 12018-26


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O2.06HYDROPHOBIC PULMONARY SURFACTANT PROTEINS SP-B AND SP-C INDUCE PORE FORMATION IN PLANAR LIPID MEMBRANES: EVIDENCE FOR PROTEOLIPID PORES

Elisa Parra1, Antonio Alcaraz2, Antonio Cruz1, Vicente M. Aguilella2, Jesús Pérez-Gil11 Dept. Biochemistry and Molecular Biology I, UCM, Madrid.2 Dept. Physics, Laboratory of Molecular Biophysics, University Jaume I, Castellón

Pulmonary surfactant is a complex mixture of lipids and proteins whose main function is to reduce surface tension at the alveolar air–liquid interface of lungs in order to avoid alveolar collapse at the end of expiration and to facilitate the work of breathing. It is composed by around 90% lipids and 8-10% specific surfactant proteins, including the hydrophobic proteins SP-B and SP-C. SP-B is essential for breathing. In vitro, SP-B induces aggregation, fusion and lysis of phospholipid vesicles, and improves the adsorption of phospholipids into air-liquid interfaces. SP-C also facilitates the interchange of lipids between bilayers or between bilayers and interfacial monolayers, and its N-terminal segment seems to disrupt lipid packing in bilayers and monolayers. The combined action of both proteins is responsible for the proper dynamics of membrane arrays in the pulmonary surfactant system. In the present study we have explored the possibility that hydrophobic surfactant proteins induce the permeabilization of phospholipid membranes via pore formation. To this end, electrophysiological measurements were carried out in planar lipid membranes (PLM) prepared with different lipid/protein mixtures. Our main result is that channel-like structures were detected in the presence of SP-B, SP-C or the mixture of both.Pore conductance and ion selectivity experiments provided different and complementary information about the system. On the one hand, pore conductance experiments, performed in symmetrical electrolyte concentrations, showed a high variety of conductance states that were found to be dependent on the potential applied to the membrane. On the other hand, ionic selectivity, which was measured under a salt concentration gradient, showed a critical dependence on the charge of the lipid polar headgroup. All those results point to the formation, by the action of SP-B and SP-C, of proteolipid channels in model phospholipid bilayers, which are protein-promoted pores total or partially lined by lipid molecules. Possible implications of these membrane-permeabilizing structures in the biological context of the pulmonary surfactant system will be discussed.


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O2.07ESTUDIO EN MONOCAPAS DEL COMPORTAMIENTO DE FASES DE UNA MEZCLA LIPÍDICA QUE IMITA LA MEMBRANA DEL VIH. DEPENDENCIA DEL COLESTEROL Y EFECTOS DE PÉPTIDOS DERIVADOS DEL DOMINIO MPER

Nerea Huarte1, Antonio Cruz2, Jesús Pérez-Gil2, José L Nieva1

1Unidad de Biofísica (CSIC – UPV/EHU) y Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea, Apartado 644, 48080 Bilbao, España2Departamentode Bioquímica y Biología Molecular, Universidad Complutense de Madrid, Ciudad Universitaria, 28040 Madrid, España

El VIH funde su envoltura con la membrana de la célula diana para dar inicio a su ciclo de replicación. Se postula que la inserción en la monocapa externa de MPER, un dominio de interfase que precede al anclaje transmembrana de la glicoproteína fusogénica gp41, genera en la membrana vírica el tipo de perturbación requerida para la fusión (disminución de la cohesión lipídica y alteración de sus propiedades elásticas) [1,2]. Sin embargo, el alto contenido en colesterol [3,4] hace que la membrana del VIH sea extremadamente resistente a la deformación por compresión o torsión [5], lo que a su vez limita la inserción de secuencias proteicas y la alteración de su curvatura. Utilizando monocapas lipídicas como modelo de la monocapa externa de la membrana viral, en este trabajo hemos contrastado la hipótesis de que MPER pudiera estar involucrado en la generación de dominios desordenados, es decir, con bajo contenido en colesterol, que en el contexto del virión fueran utilizables como plataformas para la ejecución local de la fusión [6].

[1] K. Salzwedel, J.T. West, E. Hunter. (1999) J. Virol. 73, 2469–2480.[2] T. Suarez, S. Nir, F.M. Goni, A. Saez-Cirion, J.L. Nieva. (2000) FEBS Lett. 477, 145–149.[3] R.C. Aloia, F.C. Jensen, C.C. Curtain, P.W. Mobley, L.M. Gordon. (1988) Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 900–904.[4] B. Brugger, B. Glass, P. Haberkant, I. Leibrecht, F.T. Wieland, H.G. Krausslich. (2006) Proc. Natl Acad. Sci. USA 103, 2641–2646.[5] W. Rawicz, B.A. Smith, T.J. McIntosh, S.A. Simon, E. Evans. (2008) Biophys. J. 94, 4725–4736.[6] B. Apellániz, A. García-Sáez, S. Nir, J.L. Nieva. (2011) Biochim. Biophys. Acta


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O2.08MECHANICS OF MEMBRANES WITH LIPID DOMAINS

Iván López-Montero1, Laura R. Arriaga1,2, Francisco Monroy1.1 Departamento de Química-Física I, Universidad Complutense, 28040 Madrid, Spain2 Laboratoire de Physique des Solides, Université Paris Sud XI, 91405 Orsay, France

The ‘raft hypothesis’ was originated on the idea that cell membranes are multicomponent lipid assemblies able to separate into small and labile domains enriched in cholesterol [1]. Lipid rafts are usually attributed to play functional roles in many cellular processes including signal transduction, membrane trafficking, cytoskeleton organization, and pathogen entry. However, the mechanical role of lipid domains has not been sufficiently explored [2,3,4]. In model systems, microscopic phase separation is usually observed as ordered liquid domains on a disordered continuous phase, both in monolayers and bilayers built up as giant unilamellar vesicles (GUVs). In this communication we present the impact of phase coexistence on the mechanics of lipid membranes subjected to a lateral stretching stress. Surface rheology experiments performed in Langmuir monolayers of two different lipid systems (DPPC, E. Coli lipids and DOPC/bSM/Chol) and micropipette experiments performed in GUVs (DOPC/bSM/Chol) show that the presence of lipid domains produces a softening in membrane elasticity (plastic-like behaviour) with respect to single lipid models. The results will be discussed in the frame of the general transport theory of dilational mechanics. Lipid domains are invoked as material reservoirs for efficient lateral transport. [1] Simons K and Ikonen E. (1997) Nature 387: 569-72.[2] Arriaga LR, López-Montero I, Rodríguez-García R and Monroy F. (2008) Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 77: 061918.[3] López-Montero I, Arriaga LR, Rivas G, Vélez M and Monroy F. (2010) Chem Phys Lipids 163: 56-63. [4] Arriaga LR, López-Montero I, Ignés-Mullol J and Monroy F. (2010) J Phys Chem B. 114: 4509-20.


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O3.05INTERACTION OF A VIRAL ATPASE WITH NUCLEOTIDES MEASURED WITH A MICROCANTILEVER

Johann Mertens 1, María I. Daudén 2, Javier Tamayo 1 & José L. Carrascosa 2.1 Institute of Microelectronics of Madrid (IMM-CNM), CSIC, Tres Cantos, 28760, Spain2 Centro Nacional de Biotecnología (CNB- CSIC). Darwin 3, Cantoblanco, 28049 Madrid, Spain.

Microcantilevers are nanomechanical transducers, which convert intermolecular reaction forces to detectable cantilever deflection in nanometers. When specific reactions among biomolecules occur on the surface of a cantilever, the cantilever deflects due to the change of surface stress and indicates the occurrence of the specific biomolecular reaction [1, 2]. Here we apply this technique to the measurement of the interaction of gp19-ATPase with different nucleotides in order to evaluate the activity of this type of molecular motor. gp19 is the mayor subunit of the terminase complex of bacteriophage T7, which has been proposed as the macromolecular motor that converts chemical energy from ATP hydrolysis into mechanical movement of DNA during phage morphogenesis. In this process the preformed prohead interacts with the major subunit of the terminase (gp19), while DNA attaches the smaller terminase subunit (gp18). Prohead and DNA then interact and the packaging process starts with ATP consumption until the unit length DNA is encapsidated. DNA translocation is the only viral morphogenetic process driven by ATP hydrolysis [3]. Although a number of models have been proposed, neither the mechanism of DNA translocation nor the detailed conformational changes of the terminase to perform so are completely understood.We report measurements of label-free protein-nucleotides interaction using a cantilever-based sensor functionalized with gp19 to act as receptor molecules. Experiments conducted under flow conditions show that DSP modified cantilevers are suitable to immobilize histidine-tagged terminases. In agreement with the immobilization curves, AFM images show the existence of two immobilization regimes. Higher concentrations of protein form aggregates on the surface while lower concentrations configure a self-assembled monolayer (SAM); moreover in each regime gp19 responds sensitively to different nucleotides binding. We found large irreversible conformational changes in both regimes after the interaction with ATP. The aggregate regime shows large compressive stress with ATP, interpreted as dissagregation of the proteins clusters at the surface of the primary terminase monolayer. The SAM regime shows a stepped behavior with ATP interpreted as a coupled release of tensile stress accumulated by the molecular machines during hydrolysis. The interaction with ATP in the aggregates and SAM regimes can be respectively slowed down or stopped by the injection of AMP-PNP. The presented data provide the basis for a more detailed understanding of the sequence of molecular events that contribute to the motion of a nanomechanical device. Understanding how to control force generation has implications not only in assessing the ATP-driven motors motility potential but also in the development of active nanodevices and sensors.

[1] Shu, W., Liu, D., Watari, M., Riener, C.K., Strunz, T., Welland, M.E., Balasubramanian, S., McKendry, R.A. (2005) Journal of the American Chemical Society 127 (48), pp. 17054-17060. [2] Wu, G., Datar, R.H., Hansen, K.M., Thundat, T., Cote, R.J., Majumdar, A. (2001) Nature Biotechnology 19 (9), pp. 856-860.[3] Cerritelli, M. E., Conway, J. F., Cheng, N., Trus, B. L., and Steven, A. C. (2003). Adv Protein Chem 64, 301-323.


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O3.06USING DNA AS A MOLECULAR MARKER TO DETERMINE PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS WITH ATOMIC FORCE MICROSCOPY

M.E. Fuentes-Perez1, E.J. Longman2, M.S. Dillingham2, and F. Moreno-Herrero1

1 Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnologia, CSIC, Darwin 3, 28049 Cantoblanco, Madrid, Spain.2 DNA:protein Interactions Unit,,School of Biochemistry, Medical Sciences Building, University of Bristol, University Walk, Bristol BS8 1TD, UK.

Atomic Force Microscopy (AFM) is a surface technique that can obtain a snapshot image of the components of a reaction, stalled at the moment of adsorption on a surface. AFM topography images can give information about conformational changes, interactions, and volume of proteins ([1]). For instance, volume analysis has been previously applied to globular proteins with a reasonable success ([2]). In this study, we present a new approach to measure volumes of non globular proteins as Structural Maintenance of Chromosome (SMC) proteins. Together with the protein of interest, we co-adsorb a DNA molecule and use it as a molecular marker to counterbalance any possible tip-induced artifact. This allows us to compare protein volumes from images taken in different days and with different tips. This novel approach is used to characterize the elements of the B. subtilis SMC complex, formed by the characteristic V-shaped dimer of the SMC protein, and the ScpA and ScpB proteins ([3,4,5]). Volume analysis reveals that SMC protein and ScpB are dimers while ScpA is a stable monomer. Interestingly and considering the well-know AFM tip convolution effects, we find a linear dependence between protein volumes and their molecular weights. We also study the interaction between the components of the SMC complex and find that ScpA binds to SMC protein. In contrast, no interaction between ScpB and SMC protein is observed. Experiments with ScpA and ScpB suggest a specific interaction between these proteins and this is further confirmed in experiments involving the three components of the SMC complex. The applicability of these methods and the relevance of our findings will be discussed.

[1] Bustamante, C., and Keller, D. (1995). Physics Today. 48, 32-38.[2] Schneider, S. W., et al. (1998). Pflugers Arch – Eur. J. Physiol. 435, 362-367.[3] Jessberg, R., (2002) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 767-778.[4] Hirano, T., (2006) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 311-322.[5] Graumann, P. L. and Knust, T., Chromosome Res. (2009) 17, 265-275.


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O3.07PERFORMANCE OF PULMONARY SURFACTANT EXPOSED TO GOLD NPS

Virginia Bouzas1, Isabel Pastoriza2, Luis M. Liz-Marzán2, Mercedes Echaide1, Jesús Pérez-Gil1 1 Dpto. Bioquímica, Facultad de Biología, Universidad Complutense de Madrid2 Facultad de Química. Universidad de Vigo

Lungs are one of the most difficult organs to be diagnosed or treated due to their complexity and inaccessibility. The emergent discipline known as nanomedicine have gained considerable interest in pulmonary/respiratory tract diseases such as asthma, tuberculosis, cystic fibrosis or even cancer. An innovation of this speciality is the use of Nanoparticles (NPs). These small systems have a large surface to volume ratio (S/V), being their properties strongly influenced by their surface. As a result, their properties differ substantially from those bulk materials of the same composition, allowing them to perform exceptional feats.The vast potential of NPs to be used in biomedical applications is their size, as some specific physical and/or chemical interactions with the biological environment occur at the nano-scale range. Therefore novel diagnostic and therapeutic treatments can be designed using NPs with desired properties. Different nano-materials are being explored, but gold NPs are the most commonly used in biomedical applications, due to:

1) High biocompatibility, because it is a noble metal element with the adequate stability even in aggressive fluids as biological ones.2) Easy surface-functionalization with different biomolecules, which allow modulating the way the particles interact with biological structures and even targeting them to selective biological contexts. 3) Outstanding optical properties caused by Surface Plasmon Resonance.

Inhalation is the most significant exposure route for airborne NPs. In this case, NPs will have the chance to interact with pulmonary surfactant, a lipid-protein complex that covers the thin aqueous lining layer of the alveoli. Thus LS would be the first contact where NPs impinge.The aim of our study is to investigate the effects of the interactions between Gold NPs and native lung surfactant (NLS) complexes obtained from animal lungs, using biophysical in vitro methods. As the deposition of NPs within the respiratory tract depends on the particle size, density and surface properties, we are studying whether the interaction of these particles in/with LS is size and surface-charge dependent and results will be presented on the measurable impact of the different NP types on the ability of NLS to spread at the interface and to form a surface-active film. In addition, spectroscopy experiments are being carried out to confirm that optical properties of the Gold NPs are not modified in the presence of NLS.


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O3.08DIFFUSION IN MACROMOLECULAR CROWDED MEDIA. MONTE CARLO SIMULATION OF OBSTRUCTED DIFFUSION VS. FRAP EXPERIMENTS

Francesc Mas1, Eudald Vilaseca1, Isabel Pastor1, Adriana Isvoran2, Sergio Madurga1 and Josep-Lluís Garcés3

1Physical Chemistry Department and Research Institute of Theoretical and Computational Chemistry (IQTCUB) of the University of Barcelona (UB), C/ Martí i Franquès, 1, 08028-Barcelona (Catalonia, SPAIN)2Department of Chemistry, University of the West Timisoara, Timisoara, (ROMANIA)3Chemistry Department, Lleida University (UdL), Lleida (Catalonia, SPAIN)

The diffusion of tracer particles in 3D macromolecular crowded media has been studied using two methodologies, simulation and experimental, with the aim of comparing their results.Firstly, the diffusion of a tracer in an obstructed 3D lattice with mobile and big size obstacles has been analyzed through a Monte Carlo (MC) simulation procedure [1]. Secondly, Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) experiments have been carried out to study the diffusion of a model protein (alpha-chymotrypsin) in in vitro crowded solution where two type of Dextran molecules are used as crowder agents [2]. To facilitate the comparison the relative size between the tracer and the crowder is the same in both studies.The results indicate a qualitative agreement between the diffusional behaviors observed in the two studies. The dependence of the anomalous diffusion exponent and the limiting diffusion coefficient with the obstacle size and excluded volume shows, in both cases, a same tendency. The introduction of a reduced mobility parameter in the simulation model accounting for the short range tracer-obstacle interactions allows to obtain a quantitative agreement between the limiting diffusion coefficient values yielded by both procedures [3].The simulation-experiment quantitative agreement for the anomalous diffusion exponent requires further improvements. As far as we know, this is the first reported work where both techniques are used in parallel to study the diffusion in macromolecular crowded media.

[1] Vilaseca, E., Isvoran, A., Madurga, S., Garcés, J.L., Pastor, I., Mas, F., (2011) Phys. Chem. Chem. Phys. DOI: 10.1039/C0CP01218A.[2] Pastor, I., Vilaseca, E., Madurga, S., Garcés, J.L, Cascante, M., Mas, F., (2010) J. Phys. Chem. B 114, 4028-4034.[3] Vilaseca, E., Pastor, I., Isvoran, A., Madurga, S., Garcés, J.L, Mas, F., (2011) Theor. Chem. Acc. 128, 795-805.


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O4.05DESCIFRANDO ESTRUCTURALMENTE LA REGULACIÓN GÉNICA POR LA PROTEÍNA SEÑALIZADORA PII EN EL SISTEMA QUE INVOLUCRA AL REGULADOR GLOBAL DE NITRÓGENO NTCA. INFERENCIAS PARA LA SUPERFAMILIA DE REGULADORES TRANSCRIPCIONALES CRP-FNR

José Luis Llácer1, Javier Espinosa2,3, Miguel Ángel Castells2, Asunción Contreras2, Karl Forchhammer3, Vicente Rubio1.1 Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC)2 División de Genética, Universidad de Alicante3 Interfakultäres Institut für Mikrobiologie und Infektionsmedizin der Eberhard-Karls-Universität Tübingen.

PII es una proteína señalizadora conservada, antigua y muy difundida que sin embargo no se da en animales. Señaliza el grado de abundancia de nitrógeno, carbono y energía al unir los efectores alostéricos 2-oxoglutarato (2OG), que refleja abundancia de carbono y pobreza de amonio, y ATP o ADP. Es además objeto de fosforilación, uridililación o adenililación reguladas en residuos dados de su lazo flexible T, un largo lazo que participa centralmente en las interacciones del trímero de PII con sus dianas. Estas últimas son proteínas, bien enzimas metabólicas o reguladoras, bien canales para amonio, bien reguladores de la expresión génica. Se han determinado previamente las estructuras de los complejos de PII con el canal de amonio AmtB y con el enzima controlador de la síntesis de arginina N-acetilglutamato quinasa. Ahora aclaramos cómo puede PII regular la expresión de genes, revelando cómo lo hace en un ejemplo tomado de cianobacterias, el sistema que involucra al factor de transcripción NtcA y a la proteína coactivadora de NtcA, PipX. NtcA, el regulador global de nitrógeno de cianobacterias, pertenece a la superfamilia Crp-Fnr de reguladores transcripcionales, controlando un amplio regulón de genes que incrementan su expresión cuando el nitrógeno escasea. El 2OG activa alostéricamente NtcA. La proteína PipX, de la que no se sabía nada excepto que interacciona con PII, es un potente coactivador de NtcA. Hemos descifrado el sistema regulador completo determinando las estructuras cristalinas de los complejos PII-PipX y PipX-NtcA, así como de NtcA solo, en conformaciones activa e inactiva (resoluciones respectivas, 3.2, 2.25, 2.3 y 3.05Å). Probamos la relevancia de las interacciones observadas en estos complejos mediante estudios funcionales y de mutagénesis dirigida. La mayoría de la estructura de PipX la constituye un dominio Tudor-like (TLD) que monopoliza los contactos con PII y NtcA, y que nos ha proporcionado las primeras imágenes de un TLD unido a sus dianas proteicas completas. En el complejo PII-PipX un trímero de PII secuestra entre su cuerpo y sus lazos T extendidos los TLDs de tres moléculas de PipX, evitando que PipX interaccione con NtcA y lo active. Cambios en los lazos T inducidos por 2OG explican la disociación del complejo PII-PipX por este efector, lo que deja libre a PipX para activar a NtcA. Las estructuras del dímero de NtcA activo y del factor de transcripción bacteriano CRP activo (por la unión de cAMP) se asemejan mucho, indicando que ambos factores comparten formas similares de activación por efectores y transcripcional. En el complejo PipX-NtcA dos monómeros de PipX estabilizan la conformación activa de un dímero de NtcA, y posiblemente ayudan a reclutar la RNA polimerasa. También hemos determinado (resolución, 3.03 Å) la estructura del complejo NtcA-DNA, excluyendo que PipX coactive por unirse directamente al DNA, y aclarando por qué NtcA se une específicamente a su secuencia diana en el DNA (un palindromo imperfecto llamado caja NtcA) sin reconocimiento cruzado con la muy parecida secuencia diana del factor de transcripción Crp, que está también presente en cianobacterias. Finalmente, la observación de dos formas cristalinas distintas de NtcA inactivo revela que en ausencia de 2OG el factor de transcripción existe en una multiplicidad de formas y que el efector alostérico selecciona la forma activa, forma que es estabilizada por las uniones de PipX y de la secuencia diana de DNA. La multiplicidad de formas inactivas y la existencia de una sola forma activa del factor de transcripción es posiblemente de aplicación a todos los reguladores transcripcionales de la familia Crp-Fnr. Apoya esta idea la publicación reciente de dos formas diferentes inactivas de Crp en ausencia de su activador cAMP es virtualmente idéntica a la observada con NtcA. Ayudas BFU 2008-05021 (MICINN) y Prometeo (Generalitat Valenciana).


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O4.06LINKING FUNCTION TO DYNAMICS IN GLOBULAR, MULTIDOMAIN AND UNSTRUCTURED PROTEINS USING NMR

Santiago Esteban-Martín1, Robert Bryn Fenwick1, Xavier Salvatella1,2

1 Institute for Research in Biomedicine (IRB), Barcelona (Spain)2 ICREA

A detailed understanding of the biological function of macromolecules requires knowledge of both, their three dimensional structure and their time-dependent fluctuations. Methods to determine the structure of proteins are now well established and the static representations that they provide have contributed much to our understanding of the stability and biological function of proteins (structure-function relationship). In contrast, the characterization of structural fluctuations at atomic resolution is still in its infancy, particularly for motions taking place at biologically relevant time scales (dynamics-function relationship). Such information can be derived from residual dipolar couplings (RDCs) measured by nuclear magnetic resonance (NMR). In this communication we present the determination of native ensembles for globular, multi-domain and disordered proteins that explicitly represent their structural heterogeneity in the sub-millisecond time scale. The detailed descriptions of macromolecular dynamics achieved have allowed us to characterize: i) the transfer of structural information across a surface patch in ubiquitin involved in molecular recognition by the proteins that regulate protein degradation [1], ii) the role of inter-domain motions of T4 Lysozyme in enzymatic catalysis [2], and iii) the native (residual) contacts in chemically denatured ubiquitin that initiate the folding of this protein [3].

[1] Fenwick, R.B., et al. Under review.[2] Esteban-Martín, S., et al Under review.[3] Esteban-Martín, S., et al. (2010) J. Am. Chem. Soc. 137, 4626-4632.


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O4.07ANÁLISIS ESTRUCTURAL DEL COLÁGENO TIPO IV Y SUS IMPLICACIONES MOLECULARES EN LOS SÍNDROMES DE ALPORT Y GOODPASTURE

Patricia Casino1, Roberto Gozalbo2, Jesús Rodriguez-Díaz2,3, Javier Cervera2, Vicente Rubio1 y Alberto Marina1. 1 Departamento de Genómica y Proteómica, Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC) y CIBERer. ([email protected]) 2 Molecular Recognition Laboratory, Prince Felipe research centre y CIBERer. ([email protected])3 Laboratorio de Bacterias Lácticas y Probioticos, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC). ([email protected])

El colágeno tipo IV (ColIV) juega un papel fundamental en la integridad estructural de las membranas basales ya que forma la red que sirve de andamiaje de estas membranas. El ColIV está formado por tres cadenas independientes de colágeno, llamadas cadenas α, asociadas en una triple hélice alargada de unos 400 nm. Cada cadena α consta de tres dominios diferenciados: un pequeño dominio N-terminal denominado 7S, un largo dominio intermedio colagenoso desplegado y un dominio C-terminal globular no colagenoso (NC) de unos ~230 aas. Existen seis cadenas α homólogas (α1-α6) que se asocian formando trímeros a través de interacciones no covalentes entre los dominios NC y la formación de la triple hélice por sus dominios colagenosos. [1]. La red de las membranas se realiza mediante la interacción de estos trímeros por sus extremos N y C-terminales, generando esta última interacción heterohexámeros de dominios NC. En los mamíferos, se han encontrado tres tipos de redes; el formado por las cadenas α1 y α2 que dan lugar a la red α1α1α2/α1α1α2, la cual se encuentra distribuida por todos los tejidos, y los formados por las cadenas α3, α4, α5 y α6 que tienen una distribución específica en los tejidos. Las cadenas α3, α4 y α5 forman la red α3α4α5/α3α4α5, la cual se encuentra en el riñón, en pulmón, testículos y cóclea mientras que las cadenas α5 y α6 forman la red α5α5α6/α1α1α2 junto con las cadenas α1 y α2 y se encuentran en el ojo o la piel, músculo liso, esófago y riñón [2]. Los síndromes de Alport y Goodpasture son causados por fallos en estas redes. En Alport mutaciones en las cadenas α3, α4, α5 y α6 conllevan la desorganización de la red y la consiguiente desestructuración de las membranas basales. Por otra parte, Goodpasture es una enfermedad autoinmune que se caracteriza por el ataque inmunológico al dominio NC de la cadena α3 principalmente y en menor medida al NC de α5 que deriva en fallo renal y pulmonar [3, 4]. Este último síndrome ha sido descrito como una “conformeropatía” [4], ya que la aparición de los autoanticuerpos se produce por un cambio conformacional de los dominios NC dando lugar a confórmeros “patológicos”. Para entender las bases estructurales que caracterizan a estas enfermedades hemos abordado la cristalización y resolución de la estructura tridimensional de los heterohexámeros formados por los dominios NC de α1, α3, α4, α5 y α6 producidos a partir de las proteínas producidas en cultivos celulares eucarióticos. Sorprendentemente, los dominios NC de α1, α3 y α5 forman homohexámeros de estructura similar a la observada para el heterohexámero α1α1α2/α1α1α2 purificado de su fuente natural [5, 6]. Este hallazgo rebate datos in vitro que apuntaban a la imposibilidad de formar este tipo de asociaciones y abren la puerta a su posible existencia en la naturaleza. Por otra parte, el dominio NC de α4 no forma este tipo de homohexámeros sino que es monomérico. Este equilibrio hexámero-monómero puede ser explicado por importantes cambios conformacionales con respecto al plegamiento primordial encontrado en todos los dominios NC de α1, α2, α3 y α5 cuyas estructuras se han resuelto formando parte de un hexámero. El análisis y compresión de la naturaleza de estos cambios conformacionales está siendo clave para comprender las bases moleculares de la conformeropatía de Goodpasture. Además, a partir de los dominios NC de las cadenas α5 y α6 hemos resuelto la estructura tridimensional del heterohéxamero α5α6α6/α5α6α6, que discrepa de organización asumida (α5α5α6/α5α5α6) para la combinación de estos NC. En conjunto, la ingente información estructural obtenida nos da una visión general de la organización del ColIV, que en ciertos casos contradice propuestas de asociación aceptadas, y nos está permitiendo comprender las bases moleculares de síndromes en los que esta molécula es clave.

[1] Khoshnoodi, J., Pedchenko, V., Hudson B.G. (2008) Microsc. Res. Tech.71, 357–370. [2] Hudson, B.G., et. al, (2003) N. Engl. J. Med. 348, 2543-2556. [3] Hudson, B.G. (2004) J Am Soc Nephrol 1, 2514–2527.[4] Pedchenko,et. al. (2010). N. Engl. J. Med. 363, 343-54.[5] Sundaramoorthy, M., Meiyappan, M., Todd, P., Hudson, B.G. (2002) J Biol Chem. 277, 31142-53. [6] Than, M.E, et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6607-12


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O4.08RESPUESTA AL ESTRÉS ABIÓTICO EN PLANTAS

Cristina Yunta1, Martín Martínez-Ripoll1, Jian-Kang Zhu2,3, Armando Albert1

1 Departamento de Cristalografía y Biología Estructural, Instituto de Química Física “Rocasolano”, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Serrano 119, Madrid E-28006, Spain.2 Department of Horticulture and Landscape Architecture, Purdue University, W. Lafayette, IN, USA.3 Plant Stress Genomics Research Center, King Abdullah University of Science and Technology, Thuwal 23955-6900, Kingdom of Saudi Arabia

La identificación y caracterización de las especies moleculares implicadas en la respuesta celular de las plantas al estrés abiótico es esencial para comprenderla y controlarla. Este conocimiento posibilita la producción de cultivos mejorados capaces de sobrevivir en condiciones de estrés. Las quinasas de la familia de las SnRK2s (SNF1-related protein kinase) promueven la respuesta celular al estrés mediante la fosforilación de factores de transcripción y canales iónicos [1-3] que conducen a la activación de mecanismos de protección tales como el cierre de los estomas, la acumulación de osmolitos y cambios en la expresión génica [4-6]. SnRK2.6 (OST1) ha sido bien caracterizada a nivel molecular y fisiológico como el efector principal en el control del cierre de los estomas en respuesta al incremento del ácido abscísico (ABA) y al estrés osmótico [7, 8]. Las SnRK2s, las fosfatasas del tipo 2C (PP2Cs) y el receptor de ABA PYR/RCAR decodifican coordinadamente las señales de estrés abiótico mediado por ABA: El balance de interacciones entre estas proteínas regula el estado de fosforilación de OST1 modulando su actividad quinasa. La estructura de una forma inactiva de OST1 muestra que el dominio regulador, situado en el extremo C-terminal de la proteína, la estabiliza en una conformación improductiva. Nuestros resultados permiten comprender el mecanismo de activación/inactivación de la quinasa y sugieren un mecanismo de control dependiente de ABA asociado a la interacción con la fosfatasa.

Referencias[1] Fujii, H., Chinnusamy, V., Rodrigues, A., Rubio, S., Antoni, R., Park, S. Y., Cutler, S. R., Sheen, J., Rodriguez, P. L., Zhu, J. K. (2009) Nature 462:660-664.[2] Vlad, F., Rubio, S., Rodrigues, A., Sirichandra, C., Belin, C., Robert, N., Leung, J., Rodriguez, P. L., Laurière, C., Merlot, S. (2009) Plant Cell 21:3170-3184.[3] Lee, S. C., Lan, W., Buchanan, B. B., Luan, S. (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106:21419-21424.[4] Seki, M., Umezawa, T., Urano, K., Shinozaki, K. (2007) Curr Opin Plant Biol. 10:296-302. [5] Cutler, S. R., Rodriguez, P. L., Finkelstein, R. R., Abrams, S. R. (2010) Annu Rev Plant Biol. 61:651-679. [6] Kim, T. H., Böhmer, M., Hu, H., Nishimura, N., Schroeder, J. I. (2010) Annu Rev Plant Biol. 61:561-591.[7] Yoshida, R., Hobo, T., Ichimura, K., Mizoguchi, T., Takahashi, F., Aronso, J., Ecker, J. R., Shinozaki, K. (2002) Plant Cell Physiol. 43:1473-1483.[8] Mustilli, A. C., Merlot, S., Vavasseur, A., Fenzi, F., Giraudat, J. (2002) Plant Cell 14:3089-3099.


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O5.05DIFFERENTIAL PLASMA MEMBRANE ABUNDANCE OF EPITHELIAL SODIUM CHANNEL δ SUBUNIT SPLICE ISOFORMS

Diana Wesch1,2, Mike Althaus3, Pablo Miranda2, Martin Fronius3, Wolfgang G Clauss3, Diego Alvarez de la Rosa1 and Teresa Giraldez2

1 Department of Physiology and Institute of Biomedical Technologies, University of La Laguna, La Laguna, Spain, 2 Research Division, University Hospital NS Candelaria, S. C. Tenerife, Spain, 3 Institute of Animal Physiology, Justus-Liebig University, Giessen, Germany

The “classical” α, β and γ subunits of the Epithelial Na+ channel (ENaC) form heterotrimeric Na+-selective ion channels with a well-characterized role in Na+ reabsorption across tight epithelia, such as the distal tubule of the kidney. In humans and primates there is a fourth ENaC subunit, named δ, which is expressed in the nervous system and various organs such as pancreas and lung. We have previously shown that the human δ ENaC gene produces at least two splice isoforms (δ1 and δ2) that are differentially expressed in neurons and that differ in their N-terminal intracellular sequence (Giraldez et al, 2007). The function of these ion channels is regulated by neuronal signalling cascades (Wesch et al, 2010). When expressed in Xenopus oocytes, δ1 Na+ transport activity is approximately four-fold higher than δ2, regardless of the presence of accessory β and γ subunits. Single channel analysis and plasma membrane abundance of δ1 and δ2 show that the main difference between isoforms is their steady-state plasma membrane abundance. This difference is independent of PY-motif mediated endocytosis or the presence of additional lysine residues in the N-terminus of δ2. We have delineated two sequence motifs in δ2 responsible for the lower plasma membrane expression. Experiments are underway to determine whether this sequence differentially controls channel insertion, endocytosis or both. Characterization of δ ENaC channels in the nervous system sheds a new light on the atypical roles of ENaC channels, which may be “not-so-epithelial”, after all. Supported by the Spanish Ministry of Science (grants FIS-PS09/00406, Consolider CSD-2008-00005 and HD2008-0025) and the German Academic Exchange Service (DAAD).

1. T. Giraldez, I. Cruz-Muros, D. Afonso-Oramas, V. García-Marín, P. Pagel, T. González-Hernández, D. Alvarez de la Rosa. J Neurochem (2007), 102: 1304-13152. Wesch D, Miranda P, Afonso-Oramas D, Althaus M, Castro-Hernández M, Dominguez J, Morty RE, Clauss W, González-Hernández T, Alvarez de la Rosa D and Giraldez T.. Am J Physiol-Cell Physiol (2010) 299: C779-C790


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O5.06EFECTO FUNCIONAL DE LA ASOCIACIÓN OLIGOMÉRICA DE LAS SUBUNIDADES KCNE SOBRE LOS CANALES KV7.5 (KCNQ5)

Núria Comes1, Laura Solé1, Meritxell Roura-Ferrer1,2, Anna Oliveras1, Albert Vallejo1, Álvaro Villarroel2, Antonio Felipe1. 1 Molecular Physiology Laboratory, Departament de Bioquímica i Biología Molecular, IBUB, Universitat de Barcelona, España. 2 Unidad de Biofísica, CSIC-UPV/EHU, Universidad del País Vasco, España.

Kv7 (KCNQ) forma parte de la familia de canales de potasio dependientes de voltaje que consta de cinco miembros, Kv7.1-Kv7.5. Mientras Kv7.1 es crucial en el corazón, los canales Kv7.1-Kv7.5 son responsables de las corrientes de tipo M en el sistema nervioso. El canal Kv7.5 también se expresa en músculo donde su función no está todavía clara. La asociación de Kv7 con subunidades auxiliares de tipo KCNE (KCNE1-5) incrementa la diversidad de dichos canales. Las proteínas KCNE regulan la expresión en la superficie celular, la dependencia al voltaje, la cinética del mecanismo de apertura y cierre (gating), la conductancia unitaria, la selectividad iónica y la farmacología de distintos canales iónicos. Aunque inicialmente las subunidades reguladoras KCNE se estudiaron en el corazón, su actividad en el cerebro y en otros tejidos está tomando un gran interés. Nuestros estudios demuestran que Kv7.5 y las subunidades KCNE se expresan en mioblastos. Así, las asociaciones oligoméricas podrían inducir cierta diversidad funcional de los canales Kv7.5 en músculo esquelético. La expresión en oocitos de Xenopus y en células HEK-293 ha demostrado que KCNE1 y KCNE3, pero no las otras subunidades KCNE, se asocian al canal Kv7.5. Mientras KCNE1 enlentece la activación del canal y suprime la rectificación de entrada, KCNE3 inhibe las corrientes mediadas por Kv7.5. Además, KCNE1 incrementa la amplitud de corriente de Kv7.5 en células HEK-293. Su localización a membrana también resulta afectada. El aislamiento bioquímico de microdominios de membrana lipid raft ha demostrado que los canales Kv7.5 apenas se localizan en lipid raft mientras que KCNE1 y KCNE3 muestran una localización distinta. Mientras KCNE3 se localiza en rafts, KCNE1 no lo hace. No obstante, la asociación de Kv7.5 con KCNE3 impide la localización de KCNE3 en lipid raft. Estos resultados podrían tener una gran relevancia fisiológica ya que los canales Kv7.5 son abundantes tanto en músculo liso como esquelético y su asociación con las proteínas KCNE podría regular su respuesta a nivel celular


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O5.07ELECTROFORESIS “BLUE-NATIVE” PARA LA CUANTIFICACIÓN DE LA AUTO-ASOCIACIÓN DE KCSA

José Antonio Poveda1, Ana Marcela Giudici1, María Luisa Molina, Lourdes Renart1, José Ayala Torres1, Estefania Montoya1, Asia Fernández-Carvajal1, José Antonio Encinar1, José Manuel González-Ros1

1 Instituto de Biología Moleclular y Celular, Universidad Miguel Hernández, Elche.

La cristalización del canal procariota de potasio KcsA lo ha convertido en una proteína modelo a partir de la que se ha establecido el mecanismo de permeación y selectividad de los canales iónicos. Trabajos anteriores en nuestro laboratorio mediante “patch-clamp” y fluorescencia, indican que este canal se puede auto-asociar dando lugar al llamado “gating acoplado”, por el que la apertura de un canal provoca la apertura concertada de más canales. En este trabajo, se ha desarrollado un ensayo de electroforesis tipo “blue-native” (BN-PAGE) para el estudio rápido y sistemático de la auto-asociación de KcsA en presencia de diferentes sustancias que puedan modular este proceso. En base a la necesidad de utilizar detergentes para la solubilización y purificación del KcsA, y como primera aproximación para validar la técnica, hemos utilizado detergentes para comprobar cómo influye su presencia en el proceso de auto-asociación del canal. Se observa que, tanto para el detergente DDM como para el SDS, hay una concentración óptima para la cual la muestra presenta un patrón de entre 3 y 5 bandas correspondiente a distintos oligómeros del tetrámero de KcsA. Un exceso de detergente provoca la desaparición de las bandas de alto peso molecular, aumentando la banda de menor peso molecular, que asignamos al tetrámero de KcsA. La identidad de esta banda quedó confirmada mediante electroforesis bidimensional, con una primera dimensión en BN-PAGE y una segunda en SDS-PAGE. Finalmente, también hemos observado que los lípidos promueven el proceso de auto-asociación de KcsA, y que éste es dependiente de la

relación lípido a proteína.


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O5.08CONFORMATIONAL STUDIES OF THE M3 ACETYLCHOLINE MUSCARINIC RECEPTOR AND ITS BINDING SITE

Marlet Martínez1,2, Arnau Cordomí1, Pere Garriga2 and Juan J. Pérez1

1 Centre de Biotecnologia Molecular, Dept d´ Enginyeria Química. Universitat Politècnica de Catalunya. Av. Diagonal ,647. 08028 Barcelona,Spain 2 Centre de Biotecnologia Molecular, Dept d´Enginyeria Quimica. Universitat Politècnica de Catalunya. Rambla Sant Nebridi s/n, 08222 Terrassa, Spain.

Muscarinic acetylcholine receptors are integral membrane proteins that belong to the rhodopsin family of G protein coupled receptors and they play a pivotal role in the regulation of many physiological processes. Five muscarinic receptor subtypes (M1R-M5R) have been identified. In the present work, we focus on the M3 acetylcholine muscarinic receptor (M3R) which is involved in modulating neurotransmitter release, temperature homeostasis and food intake in the central nervous system, as well as in the induction of smooth muscle contraction [1]. We undertook a combined approach, involving computational and site-directed mutagenesis techniques in order to get a deeper insight into the specific structural features of residues involved in the binding of the antagonist N-methylscopolamine (NMS) to the orthosteric binding site of this receptor.Our atomic resolution model of the M3R, constructed by homology modeling using the high crystal structure of bovine rhodopsin as template, is compatible with available experimental information (site-directed mutagenesis studies) and it represents a good structural approach for the inactive state of the receptor. This model was refined through molecular dynamics simulations and the effect of the ligand NMS in the orthosteric binding pocket of the receptor was analyzed. Furthermore, the effect of different lipid compositions on the protein conformation was also simulated. Therefore, four 50ns molecular dynamics trajectories were performed in order to analyze these effects and to derive significant conformation information.In the study of the orthosteric binding pocket of NMS, we could detect some residues interacting with this antagonist ligand in a cut-off of 0.35nm. In a detailed search of hydrogen bond formation between the receptor and NMS, we found that residues Asn508, Trp504, Phe222 and Thr235 at M3R participate in hydrogen bonding with the antagonist ligand in the course of the molecular dynamics simulations. In agreement with the literature data, Trp504 has been found to be important for NMS binding [2], whereas N508 is known to interact with the ester oxygen of NMS [3]. From these theoretical results, mutants F222A and T235A were designed and their binding properties were characterized by performing ligand binding assays with [3H]-NMS. Our results suggest that although these residues are not critical for NMS binding they may be part of the neighboring residues that help stabilizing the NMS-M3R complex in order to get optimal conformation of the binding pocket for this antagonist. Furthermore, we could also see that NMS adopted distinct trajectories in different dynamics due to the influence of lipid composition on the receptor structure.

[1] Peretto I., Petrillo P., and Imbimbo B. (2009). Med. Res. Rev. 29, 867-902.[2] Wess J., Navati S., Voger Z and Maggio R. (1993). EMBO J.12, 331-338.[3] Hulme E.C., Lu Z.L and Bee M.S. (2003). Receptor Channels 9, 215-228.


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O6.05A SINGLE-MOLECULE COMPARISON OF THE MECHANICAL PROPERTIES OF DSRNA AND DNA

Elías Herrero-Galán1,2, José María Valpuesta2, José L. Carrascosa2 and J. Ricardo Arias-González1,2.1Instituto Madrileño de Estudios Avanzados IMDEA-Nanociencia, Madrid, Spain.2Centro Nacional de Biotecnología del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CNB-CSIC), Madrid, Spain.

The development of single-molecule techniques has allowed in the last two decades the mechanical characterization of individual DNA molecules, shedding light on their elastic properties and the physical constraints that affect the proteins that interact with them [1]. This knowledge has also enabled the use of DNA for nanotechnological purposes [2]. Very recently, single-molecule studies have as well contributed to a deeper understanding of the structural details of the transition from A to B form [3, 4].Over the past few years, dsRNA has emerged as a far more important ingredient in the life cycle of a cell than previously expected, but the intrinsic difficulty of working with RNA has hindered the development of new tools to study this molecule. We have engineered long dsRNA molecules for their individual characterization by means of optical tweezers [5, 6]. By studying their mechanical properties and comparing them with those of DNA, we aim both to provide a new tool for potential nanotechnological applications and to gain new insight into the basic features of dsRNA-protein interactions. Here, we present the first complete force-extension curves for dsRNA reaching the overstretching transition together with bulk data, and compare the results with the elastic and structural parameters of an equivalent DNA with the same sequence. For the first time, an A-form nucleic acid, as it is the case of dsRNA, is observed by this single-molecule technique, its counterpart DNA serving as a control of B form. Conformational features and biological implications are also addressed.

[1] Bustamante, C., Bryant, Z., and Smith S.B. (2003) Nature 421, 423-427.[2] Seeman, N.C. (2003) Nature 421, 427-431.[3] Hormeño, S., Ibarra, B., Carrascosa, J. L., Valpuesta, J. M., Moreno-Herrero F., and Arias-Gonzalez, J. R.. (2011) Biophys. J. 100, in press.[4] Hormeño, S., Moreno-Herrero, F., Ibarra, B., Carrascosa, J. L., Valpuesta J. M. and Arias-Gonzalez, J. R. (2011) Biophys. J. 100, in press.[5] Smith, S.B., Cui, Y., and Bustamante, C. (2003) Meth. Enzimol. 361, 134-162.[6] Hormeño, S., and Arias-González, J.R. (2006) Biol. Cell 98, 679-695.


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O6.06UNWINDING AND STRAND ANNEALING ACTIVITIES OF T4 PHAGE UVSW PROTEIN: A SINGLE MOLECULE STUDY

Maria Manosas 1,3, Senthil Perumal 2, Steve Benkovic 2, Vincent Croquette 11 Laboratoire de Physique Statistique, Ecole Normale Supérieure, 24 rue Lhomond, 75005 Paris, France.2 Department of Chemistry, Pennsylvania State University, 104 Chemistry Building, University Park, PA 168023 Small Biosystems Lab, Departament de Fisica Fonamental, Facultat de Fisica, Universitat de Barcelona, Diagonal 647, 08028 Barcelona

UvsW protein belongs to the SF2 helicase superfamily and is one of three helicases found in T4 phage. It is a functional analog of the E. coli RecG protein. Recent biochemical studies have demonstrated the ability of Uvsw to unwind stalled replication forks and recombination intermediates. Here we employ magnetic and optical tweezers to examine the unwinding and reannealing properties of Uvsw on a DNA hairpin substrate. Our studies revealed that Uvsw was able to translocate along ssDNA at an extremely fast rate (1500bp/s) by either unwinding dsDNA regions or by forcing the reannealing of two single-stranded DNA (ssDNA) regions. The enzyme clearly presented a preference for reanneling over unwinding activity. The UvsW reannealing activity observed was extremely strong. In particular, Uvsw was able to reanneal complementary ssDNA strands against very high forces (around 20-30 pN) without a reduction in its rate of reannealing. These force measurements gave us some insight on the translocation mechanism of the motor and allowed us to estimate its kinetic step size (1-2 DNA bases). Finally, we also tested at the single-molecule level the ability of UvsW helicase to resolve stalled forked-DNA structures by generating a chicken foot structure. We found that UvsW helicase was capable of performing fast Holliday junction migration.


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O6.07DC-SIGN NANODOMAIN FORMATION REVEALED BY SINGLE MOLECULE FLUORESCENCE MICROSCOPY

Juan A. Torreño-Piña1, Carlo Manzo1, Emilio J. Gualda2, Olga Esteban1, Pablo Loza-Álvarez2, Carl G. Figdor3, Alessandra Cambi3, Maria F. Garcia-Parajo1

1 BioNanoPhotonics group, IBEC-Institute for Bioengineering of Catalonia, Barcelona, Spain.2 ICFO-Institut de Ciències Fotóniques, Mediterranean Technology Park, Av. Canal Olimpic s/n 08860 Castelldefels (Spain). 3 Department of Tumor Immunology, NCMLS, Radboud University Nijmegen Medical Center, Nijmegen, The Netherlands.

DC-SIGN is a C-type lectin that facilitates binding and uptake of several viruses, including HIV-1, on the cell membrane of immature dendritic cells. It has been shown that the formation of DC-SIGN nanoclusters on the cell membrane is essential for efficient antigen binding and capture [1,2]. However, the mechanism by which such DC-SIGN nanoclusters are formed remains unknown. Here we use single-molecule fluorescence approaches combining high spatial and temporal resolution to obtain insight on the dynamic organization of DC-SIGN on the cell membrane. For our studies we constructed and characterized several DC-SIGN mutated forms, each lacking a specific molecular domain. High-resolution nanoimaging (NSOM and STED) and single quantum dot tracking of the different mutants demonstrated that the extracellular neck domain of DC-SIGN is essential for nanoclustering at the cell surface. Since the spatiotemporal organization of DC-SIGN is not affected by the cortical actin cytoskeleton or the presence of lipid rafts, our data suggest that purely protein-protein interactions potentially facilitated by the neck region of DC-SIGN might be responsible not only for its tetramerisation but also for its spatial clustering on the cell surface.

[1] Cambi, A., de Lange, F., Van Maarseveen, N.M., Nijhuis, M., Joosten, B., Van Dijk, E.M.H.P., De Bakker, B., Fransen, J.A.M., Bovee-Geurts, P.H.M., Van Leeuwen, F.N., Van Hulst, N.F., Figdor, C.G. (2006) J. Cell Biol., 164, 145-155.[2] De Bakker, B., De Lange, F., Cambi, A., Korterik, J.P., Van Dijk, E.M.H.P., Van Hulst, N.F., Figdor, C.G., Garcia-Parajo, M.F. (2007) ChemPhysChem, 8, 1473-1480.


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O6.08LA POLIMERASA DE PHI29 PRESENTA UN MECANISMO ACTIVO DE APERTURA DEL ADN

Borja Ibarra1, José A. Morín1, Ricardo J. Arias-González1, José M. Lázaro2, Margarita Salas2, José M. Valpuesta3, José L. Carrascosa3

1 IMDEA Nanociencia, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma Madrid, 28049, Madrid. 2 Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” (CBMSO-CSIC), Universidad Autónoma de Madrid, 28049 Madrid. 3 Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Universidad Autónoma de Madrid, 28049 Madrid.

El proceso de replicación de la doble hélice del ADN implica la apertura mecánica de está molécula para permitir el avance de la maquinaria replicativa. La replicación y apertura del ADN son procesos coordinados, generalmente llevados a cabo por proteínas especializadas, polimerasas y helicasas respectivamente. Algunos virus como el bacteriófago Phi29 han desarrollado polimerasas capaces de desplazar la doble cadena del ADN mientras replican, presentando por tanto una doble actividad ‘polimerasa-helicasa’ dentro de la misma proteína. Para entender y cuantificar el mecanismo físico de apertura del ADN utilizado por la polimerasa de Phi29 hemos utilizando la técnica de las Pinzas Ópticas. Esta técnica nos permite caracterizar el comportamiento de moléculas individuales de polimerasa y su respuesta a fuerzas mecánicas externas y la secuencia del ADN. En nuestros experimentos unimos las cadenas opuestas de un ‘hairpin’ de ADN entre dos bolitas micrométricas, una situada en la trampa óptica y la otra en el extremo de una micropipeta móvil. Desplazando verticalmente la micropipeta con respecto a la trampa óptica podemos aplicar fuerzas crecientes en el ‘hairpin’. Para cada fuerza, la actividad replicativa de una sola polimerasa a través del ‘hairpin’ puede ser seguida en tiempo real midiendo el cambio en distancia entre las bolitas. Esta posibilidad nos permite acceder a las fluctuaciones de la actividad de la proteína mientras trabaja y determinar el efecto de la fuerza mecánica y la secuencia del ADN sobre ella. Nuestros resultados con la proteína silvestre y un mutante afectado específicamente en el proceso de apertura del ADN indican que la polimerasa de Phi29 es capaz de desestabilizar activamente la estructura del ‘hairpin’ de ADN y sugieren un modelo por el cual la proteína induce stress mecánico en una de las cadenas del ADN promoviendo de esta manera la apertura del ‘hairpin’.


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O7.05INSERTION OF HELIX-C OF BACTERIORHODOPSIN INTO THE ER MEMBRANE

Manuel Bañó Polo1, Ismael Mingarro Muñoz1

1 Department of Biochemistry amd Molecular Biology, Universitat de València, Burjassot, Spain

The transmembrane (TM) helix is the basic structural unit of helix-bundle membrane proteins. A fundamental question concerning the biosynthesis of these proteins is whether each TM region can insert independently into the lipid bilayer. It has been proved that peptides derived from helix-C of bacteriorhodpsin (bR) can be soluble at high pH but inserted across a membrane at lower pH [1]. The unique properties of these peptides made them attractive for the biophysical investigation of membrane protein folding in vitro and for the development of peptides for the transport of therapeutic and diagnostic agents [2]. Nevertheless, the biological process of TM helix insertion is carried out by translocon complexes acting in concert with ribosomes. The objective of our study is to use a biological in vitro expression system [3] that permits quantitative assessment of the membrane insertion efficiency of hydrophobic sequences derived from bR helix-C to better understand key properties of this intriguing TM segment, and to identify sequences with useful membrane insertion variations.[1] Reshetnyak YK, Segala M, Andreev OA & Engelman DM (2007) A monomeric membrane peptide that lives in three worlds: in solution, attached to, and inserted across lipid bilayers. Biophys J 93, 2363-2372[2] Andreev OA, Dupuy AD, Segala M, Sandugu S, Serra DA, Chichester CO, Engelman DM & Reshetnyak YK (2007) Mechanism and uses of a membrane peptide that targets tumors and other acidic tissues in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 7893-7898[3] Bano-Polo M, Baldin F, Tamborero S, Marti-Renom MA & Mingarro I (2011) N-glycosylation efficiency is determined by the distance to the C-terminus and the amino acid preceding an Asn-Ser-Thr sequon. Protein Sci 20, 179-186


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O7.06INTERACCIÓN DEL SEGMENTO H1 DE LA PROTEÍNA NS4B DEL HCV EN BIOMEMBRANAS MODELO

Mª Francisca Palomares Jerez1, Henrique de Castro Nemésio1, Lidia Nuño y José Villalaín1. 1 Instituto de Biología Molecular y Celular, Universidad Miguel Hernández, E-03202 Elche (Alicante).

El virus de la Hepatitis C (HCV) tiene un gran impacto en la salud pública, afectando a más de 170 millones de personas en el mundo, ya que es el causante de enfermedades relacionadas con el hígado tales como la hepatitis crónica, la cirrosis y el hepatocarcinoma. El HCV, es un virus con envuelta, se compone de proteínas estructurales (core, E1, E2, y p7) y no estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B), encontrándose estas últimas asociadas a la membrana del retículo endoplásmico. La proteína NS4B es fundamental en el proceso replicativo del HCV, es una proteína muy hidrofóbica y se asocia a la membrana del RE [1]. Recientemente, se ha observado que el extremo C-terminal de la proteína esta palmitoilado y la región N-terminal tiene una potente actividad de polimerización [2]. La expresión de NS4B induce la formación de un entramado membranoso [3], el cual es absolutamente necesario para el complejo de replicación del RNA del HCV. La proteína NS4B es una proteína integral de membrana con cuatro o más dominios transmembrana. La región C-terminal de la NS4B esta constituida por dos hélices α, H1 [4] y H2 [5]; dichos segmentos han sido estudiados como dianas potenciales de la inhibición de la replicación del HCV. Estudios previos de nuestro grupo, en base al estudio del efecto de librerías peptídicas de NS4B sobre la integridad de membranas modelo, nos han permitido proponer la localización de diferentes segmentos en esa proteína y su implicación en la interacción lípido-proteína. Adicionalmente, la región que comprende la zona H1 podría ser un constituyente esencial en la interacción entre la proteína y la membrana. En este trabajo demostramos que péptidos derivados del dominio C-terminal de la proteína NS4B del HCV son capaces de interaccionar con alta afinidad con biomembranas, afectando significativamente a las propiedades biofísicas de éstas y desestabilizándolas. Además existen diferencias en la interacción del péptido dependiendo de la composición lipídica de las membranas estudiadas. Para ello, hemos aplicado técnicas de espectroscopia de fluorescencia, espectroscopia de infrarrojo y calorimetría diferencial de barrido que nos han permitido hacer un estudio biofísico detallado de la interacción del péptido con modelos de biomembranas.

[1] T. Hugle, F. Fehrmann, E. Bieck, M. Kohara, H.G. Krausslich, C.M. Rice, H.E. Blum and D. Moradpour, (2001) Virology, 284, 70–81.[2]G.Y. Yu, K.J. Lee, L. Gao and M.M. Lai. (2006) J. Virol, 80, 6013–6023.[3] D. Egger, B. Wolk, R. Gosert, L. Bianchi, H.E. Blum, D. Moradpour and K. Bienz. (2002) J. Virol, 76, 5974–5984[4] M. Francisca Palomares-Jerez and José Villalaín. (2011) Biochimic Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1808(4), 1219-1229.[5] Guillén J, González-Álvarez A, Villalaín J. (2010) Biochim Biophys Acta, 1798(3), 327-37.


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O7.07DIFERENCIAS Y SEMEJANZAS EN LA UNIÓN A MEMBRANAS DE LOS DOMINIOS C2 DE RABFILINA 3ª

Jaime Guillén1, Ginés Luengo-Gil1, Marta Guerrero-Valero1, Teresa Coronado-Parra1, Juan C. Gómez-Fernández1 y Senena Corbalán-García1.1 Dpto. Bioquímica y Biología Molecular A. Facultad de Veterinaria. Universidad de Murcia, 30100-Murcia, España.

El principal papel de los dominios C2 parece ser el de actuar como dominio de unión a la membrana activado por Ca2+. La estructura 3D de estos dominios C2 comprende 8 láminas β antiparalelas ensambladas en un sandwich β, con bucles flexibles en la parte superior e inferior. Estos dominios C2 muestran dos regiones funcionales: la región de unión a Ca2+ y la región polibásica. Se conoce muy bien el modo de unión a membranas a través de estos dos dominios en muchos dominios C2, como los de sinaptotagmina, PKCs o fosfolipasas, pero existen pocos estudios sobre los dominios C2 de rabfilina-3A. La proteína rabfilina-3A está implicada en el tráfico de vesículas sinápticas y/o fusión de las vesículas sinápticas. Recientemente se ha probado que la rabfilina-3A incrementa el número de vesículas a liberar en la membrana plasmática. Esta proteína posee dos dominios C2 en tándem denominados C2A y C2B. En el presente trabajo hemos caracterizado mediante diversas técnicas biofísicas como calorimetría de titulación isotérmica, espectroscopía de fluorescencia y experimentos de agregación de liposomas, la interacción con distintos lípidos de los dominios C2A y C2B de rabfilina-3A aislados. Comparando así sus similitudes y diferencias en la unión a diferentes lípidos y Ca2+. Los resultados demuestran que los dominios C2A y C2B de rabfilina-3A interaccionan preferentemente con el fosfatidil-4,5-bisfosfato, aunque la fosfatidilserina a través de la unión con Ca2+ también participa en la unión a la membrana. Además mostramos que la interacción con Ca2+ y con membranas estabiliza la estructura de los dos dominios de forma diferente.

Este trabajo ha sido financiado por proyectos de la Fundación Séneca 08700/PI/08 (a S.C.-G.), y Ministerio de Ciencia e Innovación BFU2008-01010 (a J.C.G.-F.). J.G.-C. Pertenece al Programa Juan de la Cierva del Ministerio de Ciencia e Innovación.


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O7.08RECONSTITUTION OF PROTO-RING ELEMENTS (FTSZ AND ZIPA) FROM ESCHERICHIA COLI IN PHOSPHOLIPID BILAYER NANODISCS

Víctor M. Hernández-Rocamora1, Belén Reija2, Carlos Alfonso1, Begoña Monterroso1, Allen P. Minton4, Silvia Zorrilla2, Germán Rivas1, Miguel Vicente3

1 Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Ramiro de Maeztu 9, Madrid.2 Instituto de Química-Física Rocasolano, CSIC, Serrano 119, Madrid3 Centro Nacional de Biotecnología, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Campus de Cantoblanco, c/Darwin 3, 28049 Madrid4 National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892, USA

We have reconstituted ZipA, an essential membrane protein for bacterial cell division, into phospholipid bilayer nanodiscs and studied its interaction with FtsZ either in the presence or absence of GTP. Phospholipid bilayer nanodiscs are novel well-defined model membranes derived from high-density lipoprotein particles that have proven useful to maintain membrane proteins in a native-like monodisperse bilayer, while simultaneously in solution [1]. They enable the performance of biochemical and biophysical assays to study membrane protein behavior and interactions by means of techniques such as analytical ultracentrifugation, light scattering and fluorescence spectroscopy [2]. We are interested in the reconstitution of the multi-protein complex that initiates cell division in E. coli (the proto-ring) onto biomimetic membranes (including nanodiscs). The proto-ring complex is formed by three proteins (the GTPase FtsZ- bacterial ancestors of tubulin, FtsA – an amphitropic protein, ands ZipA – a membrane-bound protein) that assemble at the cytoplasmic membrane forming a structure required for the incorporation of the remaining division proteins [3,4].Here we report the incorporation of ZipA into phospholipid bilayer nanodiscs and the biophysical characterization of nanodiscs by analytical ultracentrifugation, fluorescence correlation spectroscopy and dynamic light scattering. Moreover, interaction experiments with FtsZ (either in the presence or absence of GTP) were carried out using the former techniques plus fluorescence cross-correlation spectroscopy and electron microscopy. These experiments reveal that the interaction between GDP-FtsZ and reconstituted ZipA has a similar affinity as the interaction between the soluble mutant of ZipA (without its transmembrane helix) [5]. This affinity is in the order of 10s of μM. The interaction between the polymeric GTP-FtsZ and ZipA was studied for the first time and affinity was found to be similar to the one between GD-FtsZ and ZipA. Furthermore, complexes of FtsZ polymers and nanodisc-incorporated ZipA were visualized using electron microscopy.The results presented herein not only are invaluable for understanding the essential interaction between ZipA and FtsZ, but also pave the way for the incorporation of more division proteins onto nanodiscs and the study of their interactions with other division ring components.

[1] Bayburt, T.H. & Sligar, S.G. (2010) FEBS Lett. 584, 1721-1727.[2] Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S.G., Duong, F. (2007) EMBO J. 26, 1995-2004.[3] Vicente, M., Rico, A.I., Martínez-Arteaga, R., Mingorance, J. (2006) J. Bacteriol. 188, 19-27.[4] Mingorance, J., Rivas, G., Vélez, M., Gómez-Puertas, P., Vicente, M. Trends Microbiol. (2010) 18, 348-356[5] Martos, A., Alfonso, C., López-Navajas, P., Ahijado-Guzmán, R., Mingorance, J., Minton, A.P., Rivas, G. (2010) Biochemistry 49, 10780-10787.


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O8.05BIOPHYSICAL STUDIES REVEAL DIFFERENT DISRUPTION PATTERNS IN THE ADENOVIRUS CAPSID

Pérez-Berná A. J.1, Ortega-Esteban A.1, 4, Menéndez-Conejero R.1, Condezo G1, Menéndez M. 2, Flint S. J. 3, de Pablo P. J.4, and San Martín C1.1 Departamento de Estructura de Macromoléculas, Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Madrid, Spain2 Instituto de Química Física Rocasolano (IQFR-CSIC), Madrid, Spain3 Department of Molecular Biology, Princeton University, Princeton, NJ 08544, USA4 Departamento de Física de la Materia Condensada, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, 28049 Madrid, Spain.

Human adenovirus (Ad) causes acute respiratory, gastrointestinal, and ocular infections, as well as fulminant infections among immunocompromised individuals. Engineered versions are used for gene therapy, oncolysis, and vaccination. A detailed understanding of the determinants of capsid stability would be of help to design new vectors carrying larger therapeutic genes [1]. The last stage in adenovirus capsid assembly is proteolytic maturation. A thermosensitive mutant, Ad2 ts1, does not package the viral protease and produces capsids containing unprocessed protein precursors, providing a good model to study the behavior of the immature virion. Ad2 ts1 grown at the non-permissive temperature is not infectious due to a defect in uncoating [2]. We have previously described how the precursor proteins act as scaffolding elements hyper stabilizing both the immature capsid and core [3].Here we analyze in detail the stability of mature and immature adenovirus virions under different sources of stress: denaturing agents; changes in pH; temperature, or ionic strength; and mechanical fatigue induced by the atomic force microscope (AFM) tip. Differential scanning calorimetry, extrinsic fluorescence, electron microscopy, and AFM are used to monitor these changes. The immature and mature viruses present large differences in their disassembly behavior. Ad2 ts1 displays higher stability than the wild type virus in all disruption assays, in agreement with its uncoating phenotype. Interestingly, different kinds of stress result in different rupture patterns. In heat disruption experiments, the mature virus completely disassembles following and “all or nothing” process, while ts1 releases pentamers. On the other hand, high ionic strength or low pH result in random capsid fractures across hexameric positions for both mature and immature virus. Thus, our work experimentally reveals two modes of shell bursting for a T=25 icosahedral capsid, consistent with previously proposed models for thermodynamic and mechanical failure [4]. AFM imaging in physiological conditions shows the disruption process of single capsids in real time.

[1] Liu H, Jin L, Koh SB, Atanasov I, Schein S, Wu L, Zhou ZH. Science. 2010 Aug 27;329(5995):1038-43.[2] Weber, J.M. (1999). R.G. Landes, Austin, Tex., U.S.A., pp. 79-83.[3] Pérez-Berná AJ, Marabini R, Scheres SH, Menéndez-Conejero R, Dmitriev IP, Curiel DT, Mangel WF, Flint SJ, San Martín C.J Mol Biol. 2009 Sep 18; 392(2):547-57.[4] Zandi, R. and Reguera, D. (2005) Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys, 72, 021917.


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O8.06LA INTERACCIÓN DE DISCODERMOLIDA Y DOCETAXEL CON TUBULINA. CARACTERIZACIÓN DE LOS SITIOS DE UNIÓN DE LOS AGENTES ESTABILIZANTES DE MICROTÚBULOS MEDIANTE RMN Y MODELADO MOLECULAR

J. Fernando Díaz1, Angeles Canales1,2, Javier Rodríguez-Salarichs1,3, Chiara Trigili1, Lidia Nieto1, Claire Coderch4, José Manuel Andreu1, Ian Paterson5 and Jesús Jiménez-Barbero1.1 Departamento de Biología Físico-Química, Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Ramiro de Maeztu 9, 28040 Madrid, España. 2Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Complutense de Madrid, Avda Complutense s/n 28040 Madrid, España. 3Centro de Estudios Avanzados de Cuba. Carretera San Antonio km 1 1/2, Valle Grande, La Lisa, Ciudad Habana, CP. 17100. Cuba 4Departamento de Farmacología, Universidad de Alcalá, E-28871 Alcalá de Henares, Madrid, España 5 University Chemical Laboratory, University of Cambridge, Lensfield Road, Cambridge, CB2 1EW, Reino Unido.

Una clase especialmente valiosa de compuestos antimitóticos son los agentes estabilizantes de microtúbulos, estos compuestos se unen con mayor afinidad a los microtúbulos que a la tubulina no ensamblada, estabilizando de esta forma el polímero y alterando su dinámica. Sin embargo hasta el momento la interacción de baja afinidad con la especie no ensamblada, aunque esencial para su mecanismo de acción, no había sido observada [1]. En este trabajo, hemos caracterizado la interacción de dos agentes antitumorales dirigidos contra el sitio de paclitaxel, (docetaxel y discodermolido), a heterodímeros deα/ β-tubulina no ensamblada y a microtúbulos utilizando técnicas bioquímicas y de RMN. La discodermolida, mucho más soluble que otros agentes estabilizantes de microtúbulos, ha permitido la detección de la unión de estos compuestos a la forma no ensamblada de la proteína. Mediante TR-NOE RMN, se ha podido determinar las estructuras 3D bioactivas de docetaxel y discodermolido unidos a α/ β-heterodimeros y se las ha podido comparar con las unidas a microtúbulos, encontrándose diferencias significativas entre las conformaciones de docetaxel unido a las dos especies de la proteína. Además la combinación de datos experimentales de TR-NOE y STD NMR con calculos de CORCEMA-STD indica que el docetaxel y la discodermolida se unen (al menos transitoriamente) en su camino al sitio en el lumen descrito por cristalografía de electrones al sitio de unión en el poro de la pared de los microtubulos, sitio previamente descrito para la ciclostreptina y el hexaflutax [2] [3]. La unión a este sitio puede ser considerada como el evento de reconocimiento previo al proceso de internalización de la droga y su interacción con el lumen de los microtubulos [4].

A.-Soluciones halladas para el docking de la molecula de docetxel en el poro tipo I de los microtúbulos. B.- Docking de la molecula de discodermolido en el poro tipo I de los microtúbulos 1. Díaz, J. F., M. Menéndez, and J. M. Andreu. 1993. Biochemistry 32:10067-10077.2. Buey, R. M., E. Calvo, I. Barasoain, O. Pineda, M. C. Edler, R. Matesanz, G. Cerezo, C. D. Vanderwal, B. W. Day, E. J. Sorensen, J. A. Lopez, J. M. Andreu, E. Hamel, and J. F. Díaz. 2007. Nature Chem Biol 3:117-125.3. Barasoain, I., A. M. Garcia-Carril, R. Matesanz, G. Maccari, M. Trigili, M. Mori, J. Z. Shi, W. S. Fang, J. M. Andreu, M. Botta, and J. F. Díaz. 2010. Chem Biol 17:243-253.4. Nogales, E., M. Whittaker, R. A. Milligan, and K. H. Downing. 1999.. Cell 96:79-88.


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O8.07RESISTENCIA MECÁNICA DEL DNA EN LAS PLACAS DE CROMATINAMETAFÁSICA. ESTUDIO DE FRICCIÓN A ESCALA NANOMÉTRICA

Joan-Ramon Daban1, Isaac Gállego1,2, Gerard Oncins3, Xavier Sisquella4,Xavier Fernàndez-Busquets5 1 Departament de Bioquímica i de Biologia Molecular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona.2 Dirección actual: Institut de Recerca Biomèdica, Parc Científic de Barcelona.3 Serveis Científico-Tècnics, Unitat de Tècniques Nanomètriques, Universitat de Barcelona.4 Plataforma de Nanotecnologia, Parc Científic de Barcelona.5 Institut de Bioenginyeria de Catalunya, i Institut de Nanociència i Nanotecnologia, Universitat de Barcelona.

En estudios previos [1-3], se observó que los cromosomas metafásicos están formados por placas delgadas de cromatina. Para estudiar las propiedades mecánicas de estas estructuras planas en medio acuoso a temperatura ambiente, en el presente trabajo hemos aplicado la microscopía de fuerza atómica (AFM) y hemos analizado sus propiedades de fricción a escala nanométrica (nanotribología). Los resultados de microscopía AFM muestran que la presencia de elevadas concentraciones de NaCl o EDTA, y la digestión con enzimas proteolíticos o con nucleasa micrococal, producen la desnaturalización de las placas. Los estudios de nanotribología indican que las placas nativas, en condiciones iónicas estructurantes (Mg2+ 5 mM), tienen un coeficiente de fricción (μ = fuerza de fricción / fuerza vertical) que es relativamente elevado (μ ≈ 0.3). La fricción observada se redujo notablemente cuando se utilizaron concentraciones elevadas de NaCl o EDTA (μ ≈ 0.1). Este efecto lubricante puede interpretarse teniendo en cuenta las repulsiones electrostáticas que existen entre los grupos fosfato del DNA i la punta de la sonda de AFM. La digestión con pronasa provoca un incremento notable del coeficiente de fricción (μ ≈ 0.5), pero el mayor aumento de la fuerza de fricción se observó cuando el DNA fue digerido con nucleasa micrococal (μ ≈ 0.9), lo cual indica que el DNA es el principal elemento estructural de las placas. Mientras que las placas digeridas con nucleasa resultan desnaturalizadas irreversiblemente después del barrido realizado por la punta de la sonda de AFM durante la determinación de la fuerza de fricción, las placas nativas pueden absorber la energía cinética de la sonda sin sufrir ningún tipo de deformación plástica. Estos resultados sugieren que las placas están formadas por una red bidimensional de cromatina, flexible y mecánicamente resistente, que permite almacenar de manera segura el DNA durante la mitosis. La descripción completa de este trabajo se puede encontrar en la referencia [4].

[1] Caravaca, J.M., Caño, S., Gállego, I., and Daban, J.R. (2005) Chromosome Res. 13, 725-743.[2] Gállego, I., Castro-Hartmann, P., Caravaca, J.M., Caño, S., and Daban, J.R. (2009) Eur. Biophys. J. 38, 503-522.[3] Castro-Hartmann, P., Milla, M., and Daban, J.R. (2010) Biochemistry, 49, 4043-4050.[4] Gállego, I., Oncins, G., Sisquella, X., Fernàndez-Busquets, X., and Daban, J.R. (2010) Biophys. J. 99, 3951-3958.


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O8.08BACTERIAL TUBULIN DISTINCT LOOP SEQUENCES AND PRIMITIVE ASSEMBLY PROPERTIES SUPPORT ITS ORIGIN FROM A EUKARYOTIC TUBULIN ANCESTOR

María A. Oliva1, Antonio J. Martin-Galiano1, Laura Sanz,1,2 Anamitra Bhattacharyya3, Marina Serna2, Hugo Yebenes2, Jose M. Valpuesta2 and Jose M. Andreu1

1 Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC. Ramiro de Maeztu, 9. 28040-Madrid2 Centro Nacional de Biotecnología, CSIC. Darwin, 3. 28049-Madrid3 Integrated Genomics, 1749 W. Golf Rd 106. Mount Prospect, IL. 60056-4025, USA

Proteins from the tubulin/FtsZ superfamily of assembling GTPases perform essential cytoskeletal, DNA segregation and cell division functions, both in eukaryotic and prokaryotic cells. These proteins (eukaryotic and bacterial tubulin, FtsZ and TubZ) share a common fold with an N-terminal nucleotide binding domain of the Rosmann fold and a catalytic C-terminal domain, which shows very different C-termini.The crystal structure of bacterial tubulins BtubA/B showed they are strikingly similar to eukaryotic α,β-tubulin but initial biochemical characterization indicated that essential features of folding are closer to the prokaryotic homolog FtsZ rather than to α,β-tubulin [1].We have further investigated BtubA/B properties and its relation with eukaryotic tubulin. A close sequence analysis shows that there is no direct correlation between BtubA-α-tubulin and BtubB-β-tubulin. Instead bacterial tubulins have a mosaic sequences with intertwining features from α or β-tubulin. Moreover the most conserved regions are the nucleotide binding loops, whereas the most divergent sequences correspond to discrete surfaces zones of tubulin involved in folding (direct binding to eukaryotic chaperonin CCT) and lateral interactions during microtubule assembly.We have characterized assembly of wild type, BtubA/B mutants and chimeric bacterial-eukaryotic tubulins proteins. Our results show that BtubA/B assembles cooperatively over a wider range of conditions than α,β-tubulin, forming pairs of protofilaments which coalesce into bundles instead of microtubules. Similarly to eukaryotic tubulin, BtubA/B polymers contain close to one GTP and one GDP bound, but contrary both BtubA and BtubB subunits hydrolyze GTP. However, GTP hydrolysis studies on bacterial tubulin mutants in the tubulin signature motif (BtubA/B-S144G and BtubA-T147G/B) suggest that BtubB is a more active GTPase protein (than BtubA), like β-tubulin. Further we have found that bacterial tubulin lacks the abilities to differentially interact with divalent cations and bind to typical tubulin drugs.Chimeric proteins of BtubA/B including the β-tubulin loops M, H1-S2 and S9-S10 shows equivalent assembly but have reduced GTPase activity. However, introduction of the unique 8-residue insertion from α-tubulin loop S9-S10 (the taxol binding site) into BtubA impaired folding.From all our results we have hypothesized that BtubA/B were acquired shortly after duplication of a spontaneously folding ancestor version of the α- and β- eukaryotic tubulin. Probably there was a horizontal gene transfer from a primitive eukaryotic cell followed by divergent evolution in the prokaryotic environment.

[1] Schlieper, D., Oliva, M.A., Andreu, J.M


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O9.05PHYSICOCHEMICAL CHARACTERISATION OF CATIONIC LIPOSOME-DNA LIPOPLEXES

Alberto Martín-Molina1 Mónica Muñoz-Úbeda,2 Alberto Rodríguez-Pulido,3 Aurora Nogales,4 Oscar Llorca,5 Manuel Quesada-Pérez,6 Emilio Aicart2, Elena Junquera2 1 Grupo de Física de Fluidos y Biocoloides, Departamento de Física Aplicada, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, 18071-Granada, Spain2 Grupo de Química Coloidal y Supramolecular, Departamento de Química Física I, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Complutense de Madrid, 28040-Madrid, Spain 3 Department of Polymer Chemistry, Zernike Institute for Advanced Materials, University of Groningen, Nijenborgh 4, 9747 AG Groningen, The Netherlands.4 Instituto de Estructura de la Materia, CSIC, Serrano 121, 28006-Madrid, Spain5 Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Ramiro de Maeztu 9, 28040-Madrid, Spain6 Departamento de Física, Escuela Politécnica Superior de Linares, Universidad de Jaén, 23700, Linares, Jaén, Spain.

Although viral based DNA carriers are still the most common method for gene delivery, in the last decade there has been an increasing research in developing nonviral vectors. Particularly, cationic liposomes (CL) have shown potential application as transfer vectors due to their low toxicity. Accordingly, the complex formed by liposomes and DNA molecules (lipoplexes) are now a viable alternative to the cloning vectors (or vehicles) to introduce DNA fragments into eukaryotic cells so that they can replicate independently. However, the transmission efficiency of DNA using charged CL varies noticeably depending of the kind of liposome, the presence of helper lipid, the lipid-DNA ratio, or the cells targeted. As a result, the understanding of the CL-DNA interactions is currently an emergent area of research from both experimental and theoretical points of view. The objective of this work is to characterise from a physicochemical standpoint, the compaction process of DNA by means of cationic colloidal aggregates. The colloidal vectors are cationic liposomes constituted by a mixture of a novel cationic lipid, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (DOEPC) and a zwitterionic lipid, the 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine (DOPE). A wide variety of high precision experimental techniques have been used to carry on the analysis: electrophoretic mobility, small-angle X-Ray scattering or SAXS, cryogenic transmission electron microscopy or cryo-TEM and fluorescence spectroscopy (ethidium bromide intercalation assays). On the other hand, a theoretical model that considers the renormalization of charges of both the polyelectrolite and the colloidal aggregates shed light as well on the characteristics of the compaction process.

[1] Rodríguez-Pulido, A., Martín-Molina, A., Rodríguez-Beas, C., Llorca, O., Aicart, E., Junquera,E. (2009) J. Phys. Chem. B, 113, 15648-15661.[2] Muñoz-Ubeda, M., Rodríguez-Pulido, A., Nogales, A., Martín-Molina, A., Aicart, E., Junquera, E.(2010) Biomacromolecules, 11, 3332-3340.[3] Muñoz-Ubeda, M., Rodríguez-Pulido, A., Nogales, Llorca, O., M. Quesada-Pérez., A. Martín-Molina, A., Aicart, E., Junquera, E. Submitted to Soft Matter.


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O9.06REAL TIME FOLDING OF DNA

Guillem Portella1, Modesto Orzoco1,2,3

1 Joint IRB-BSC research program in Computational Biology. Institute for Research in Biomedicine (IRB) Josep Samitier 1-5 Barcelona 08028 and Barcelona Supercomputing Centre (BSC), Jordi Girona 29. Barcelona 08034. Spain2 Departament de Bioquímica i Biología Molecular. Facultat de Biología. Universitat de Barcelona. Avgda Diagonal 645. Barcelona 08028. Spain. 3 National Institute of Bioinformatics. Parc Científic de Barcelona. Josep Samitier 1-5. Barcelona 08028. Spain.

The spontaneous folding of a short DNA hairpin (d(GCGAAGC)) has been characterized by a large series of unrestricted multi-microsecond molecular dynamics simulations, complemented by replica exchange simulations [1]. Folding from an extended conformation can be extremely fast (less than 10 ns), following a downhill folding regime, or quite slow (more than 4 μs) due to trapping in compact conformations. Folding of DNA hairpins is a very complex process where different routes coexist to define the folding funnel. Small atomistic details can bias trajectories towards one or the other mechanism, leading to routes with very different apparent folding times. This complex process is not likely to be well represented by kinetic or phenomenological models based on a small number of significant states. Likewise, concepts such as “folding pathway”, “intermediate” or “molten globule” should be used with caution when describing the folding process of nucleic acids.

[1] Portella, G. & Orozco, M. (2010) Multiple Routes to Characterize the Folding of a Small DNA Hairpin Angewandte Chemie International Edition 49, 7673-7676.


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O9.07UNDERSTANDING RNA / PROTEIN CO-HABITATION IN THE RNA WORLD

Fernando Diez García1, Jorge Pedro López Alonso1, Irene Gómez Pinto1, Avijit Chakrabartty2, Carlos Gonzalez1 & Douglas V. Laurents1

1 Instituto de Química Física “Rocasolano”, CSIC, c/Serrano 119, 28006 Madrid2 Depts. of Medical Biophysics & Biochemistry, University of Toronto, Toronto, ON, MSG-2M9, Canada

The RNA World hypothesis is the most accepted scientific explanation for the origin of life. Amino acids and short peptides could have also formed on the Primitive Earth [1] and ancient ribozymes might have incorporated them to stabilize RNA structures or augment catalytic activity or the catalytic repertoire [2]. We have recently shown that peptides, called KIA7, with the sequence: A+AAAAAI+AIAAII+AGGφ, where + is K or R and φ is H, Y, F or W, can tetramerize to adopt well folded, four-helix bundle structures, in which the C-terminal aromatic group fills a hydrophobic pocket formed between the termini of two helices [3]. The conformational stability increases with the size and hydrophobicity of φ. Interestingly, these molecules, in the presence of Mg++ or Mn++, remarkably enhance the cleavage of RNA hairpins. These findings lead us to propose that RNA and short peptides might have co-inhabited the Primitive Earth and undergone co-evolution [4]. As part of our investigations on putative prebiotic molecular recognition events, we studied the interaction of KIA7 peptides with simple aromatic compounds which were likely present on the Primitive Earth. A KIA7 peptide with a C-terminal Ile, called KIA7I, might have been able to form in a single prebiotic puddle. Structural characterization of KIA7I shows that it is able to adopt a four-helix bundle in highly stabilizing conditions. Utilizing NMR spectroscopy, we find that KIA7I is able to bind benzene, phenol and some other small aromatic compounds. Benzene does not bind exclusively within the hydrophobic pocket where the side chains of H, Y, F and W fit in other KIA7 variants. Indeed, benzene appears to penetrate throughout the hydrophobic core of KIA7I, loosening it in a fashion reminiscent of benzene’s and ethidium bromide’s capacity to intercalate and unwind nucleic acids structures. [1] Matthews, C.N. and Moser, R.E. (1967) Nature 215, 1230-1234.[2] Roth, A. and Breaker, R.R. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2233-2237.[3] López de la Osa, J., Bateman, D.A., Ho, S., González, C., Chakrabartty, A. and Laurents, D.V. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104,14941-14946. [4] López-Alonso, J.P., Pardo-Cea, M.A., Gómez-Pinto, I., Fernández, I., Chakrabartty, A., Pedroso, E., González, C. and Laurents, D.V. (2010) Chemistry 16, 5314-5323.


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O9.08OLIGONUCLEÓTIDOS MODIFICADOS EN NANOTECNOLOGÍA

Álvaro Somoza1, Juan Luís Delgado1, Pierre-Antoine Bouit1, Anna Aviñó2 , Pablo Ares3, Julio Gómez-Herrero3, Félix Zamora4, Ramón Eritja2, Nazario Martín1,5. 1 IMDEA Nanociencia, Campus de Cantoblanco, 28049, Madrid2Instituto de Investigación Biomédica, 08028, Barcelona3 Departamento de Física de la Materia Condensada, Universidad Autónoma de Madrid, Campus de Cantoblanco, 28049 Madrid.4 Departamento de Química Inorgánica, Universidad Autónoma de Madrid, Campus de Cantoblanco, 28049 Madrid.5 Departamento de Química Orgánica, Universidad Complutense de Madrid, Ciudad Universitaria, 28040, Madrid.

Los oligonucleótidos se están mostrando muy versátiles en la organización de estructuras a escala nanométrica. Esto se debe a su reducido tamaño y a las interacciones estabilizantes de las bases nucleicas en hebras complementarias que pueden conducir a una estructura de doble cadena muy estable. Utilizando la interacción entre cadenas complementarias se han ensamblado diversas nanoestructuras como, nanopartículas y nanotubos1. Por otra parte, se han utilizado secuencias de ADN para construir entramados definidos en 2 dimensiones (2D)2, e incluso estructuras en 3 dimensiones3. En esta charla se presentarán los progresos en la generación de diadas formadas por oligonucleótidos modificados con Fulereno (C60) y un derivado del tetratiafulvaleno con conjugación extendida. El sistema obtenido permite estudiar los procesos de transferencia electrónica entre las especies conjugadas a los oligonucleótidos. Además, se comentarán los resultados del trabajo enfocado a la formación de redes 2D usando oligonucleótidos modificados. La estrategia empleada en este caso utiliza modificaciones químicas en puntos clave de la red de ADN con el fin de facilitar su construcción y aumentar la estabilidad.


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O10.05DIRECT MAPPING OF NANOSCALE COMPOSITIONAL CONNECTIVITY ON INTACT CELL MEMBRANES

Thomas S. van Zanten1, Jordi Gómez2, Carlo Manzo1, Alessandra Cambi3, Javier Buceta4, Ramon Reigada2, Maria F. Garcia-Parajo1

1 BioNanoPhotonics group, IBEC-Institute for Bioengineering of Catalonia, Barcelona, Spain.2 Departament de Química-Física, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain.3 Department of Tumor Immunology, NCMLS, Radboud University Nijmegen Medical Center, Nijmegen, The Netherlands.4 Computer Simulation and Modeling (Co.S.Mo.) Lab, Barcelona Science Park, Barcelona, Spain

Lateral segregation of cell membranes is accepted as a primary mechanism for cells to regulate a diversity of cellular functions. In this context, lipid rafts have been conceptualized as organizing principle of biological membranes where underlying cholesterol-mediated selective connectivity must exist even at the resting state. However, such a level of nanoscale compositional connectivity has been challenging to prove. Here we used single-molecule near-field scanning optical microscopy (NSOM) to visualize the nanolandscape of raft ganglioside GM1 after tightening by its ligand cholera toxin (CTxB) on intact cell membranes. We show that CTxB tightening of GM1 is sufficient to initiate a minimal raft coalescence unit, resulting in the formation of cholesterol-dependent GM1 nanodomains <120 nm in size. This particular arrangement appeared independent of cell type and GM1 expression level on the membrane. Simultaneous dual color high-resolution images revealed that GPI anchored- and certain transmembrane proteins were recruited to regions proximal (<150 nm) to CTxB-GM1 nanodomains without physical intermixing. Together with in-silico experiments, our high-resolution data conclusively demonstrate the existence of raft-based interconnectivity at the nanoscale. Such a linked state on resting cell membranes constitutes thus an obligatory step towards the hierarchical evolution of large-scale raft coalescence upon cell activation.


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O10.06ACTIVE MECHANICS OF THE RED BLOOD CELL

Ruddi Rodríguez-García1, Iván López-Montero1, Francisco Monroy1 1 Group of Biological Membranes and Biorheology, Universidad Complutense, Ciudad Universitaria s/n, E28040 Madrid (Spain).

The fluctuation dynamics of the human red blood cell (RBC) membrane has been study for many years [1]. However, the results show quantitative and qualitative discrepancies depending on the techniques used [2-6]. Here, we present a quantitative study on the RBC dynamics using fast video microscopy (1-10 KHz) allowing an accurate study of the membrane fluctuations over a wide frequency range. An adequate account of RBC morphology, structural contributions, cytoskeleton interactions, bilayer asymmetry and internal dissipation within the bilayer allow for a quantitative description of the membrane fluctuations. The results evidence a dynamics dominated by bending elasticity with en emerging component attributed to activity. The fast bending mode is found sub-diffusive while the activity mode relaxes a single exponential with a constant relaxation rate. Sub-diffusivity is interpreted as a consequence of confinement by cytoskeleton network [7]. The active mode is discussed in terms of stochastic mechanics of out-of-equilibrium processes.

[1] F. Brochard, and J. Lennon, Journal de Physique 36, 1035 (1975).[2] Y. K. Park et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 107, 1289 (2010).[3] G. Lenormand et al., Biophysical journal 81, 43 (2001).[4] N. Gov, and S. Safran, Biophysical journal 88, 1859 (2005).[5] J. Evans et al., Biophysical journal 94, 4134 (2008).[6] M. S. Amin et al., Urbana 51, 61801 (2007).[7] N. Gov, A. Zilman, and S. Safran, Physical Review Letters 90, 228101 (2003).


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O10.07Α-SINUCLEÍNA A30P RESCATA TRANSITORIAMENTE LA LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISOR EN LOS TERMINALES MOTORES EN EL RATÓN CSPΑ KO

Rocío Ruiz1, Lucía Tabares1

1 Departamento de Fisiología Médica y Biofísica. Facultad de Medicina. Universidad de Sevilla. Sevilla

Cystein String Protein alpha (CSPα) y α-sinucleína son proteínas localizadas en los terminales nerviosos que participan en la regulación de la función sináptica. Mutaciones en α-sinucleína han sido relacionadas con la enfermedad de Alzheimer y el Parkinson. Por otra parte, la ausencia de CSPα en modelos animales da lugar a un fenotipo de letalidad temprana y un alto grado de neurodegeneración motora y sensorial. Estudios previos realizados en la unión neuromuscular de un ratón nulo para CSPα (CSP KO) han demostrado la presencia de alteraciones en la neurotransmisión espontánea y evocada, además de un defecto en la sensibilidad a calcio de la maquinaria de liberación de neurotransmisor. Sorprendentemente, la sobreexpresión de α-sinucleína transgénica humana en el ratón nulo para la proteína CSPα abole su fenotipo letal, mientras que la ausencia de α-sinucleína acelera el proceso degenerativo en el CSPα KO. Estos hallazgos y otros han llevado a sugerir que ambas proteínas comparten función como co-chaperonas. Para investigar la implicación de una α-sinucleína mutada y de CSPα en la función sináptica hemos estudiado en ratones nulos para CSPα y transgénicos para α-sinucleína A30P (TgA30P) las características de la liberación sináptica en terminales motores, mediante registros electrofisiológicos de los potenciales de placa evocados y espontáneos.Nuestros resultados muestran que: i) la cantidad de neurotransmisor liberada por potencial de acción (contenido cuántico, QC) en los ratones CSP KO TgA30P alcanza niveles similares a los de los ratones controles (silvestres) en presencia de calcio fisiológico, a diferencia de los ratones CSPα KO donde el QC está reducido un 57%, ii) el contingente de vesículas listas para liberar neurotransmisor (RRP) está disminuido en ausencia de CSP, al igual que la probabilidad de liberación (Pr), sin embargo en presencia del transgén la Pr fue similar a la de los controles, y iii) la sensibilidad al calcio de la liberación está alterada en los ratones CSP KO, estando esta alteración disminuida en presencia del transgén. Aunque, la inclusión del transgén mutado (A30P) de sinucleína en ratones CSPα KO previno la aparición de las alteraciones en la neurotransmisión durante el desarrollo y maduración postnatal de los terminales motores, este rescate fue transitorio ya que no se mantuvo en mutantes de más edad lo que puede estar relacionado con la limitada capacidad de la α-sinucleína A30P para llevar a cabo su función fisiológica.Estos datos sugieren la importancia de la sinucleína no mutada para la compensación de algunos procesos neurodegenerativos causados por defectos en otras proteínas.


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O10.08MEMBRANE REMODELING INDUCED BY THE DYNAMIN RELATED PROTEIN DRP1 STIMULATES BAX OLIGOMERIZATION

Oihana Terrones1,5, Sylvie Montessuit1, Syam Prakash Somasekharan1, Safa Lucken-Ardjomande1,7, Sébastien Herzig1, Robert Schwarzenbacher2, Dietmar Manstein3, Ella Bossy-Wetzel4, Gorka Basañez5, Paolo Meda6 and Jean-Claude Martinou1

1 Department of Cell Biology, University of Geneva, Sciences III, 30 quai Ernest Ansermet, 1211 Geneva 4, Switzerland.2 Department of Molecular Biology, University of Salzburg, 5020 Salzburg, Austria.3 Institute for Biophysical Chemistry, and Research Centre for Structure Analysis, Hannover Medical School, Feodor-Lynen-Str. 5, D30623 Hannover, Germany.4 Burnett School of Biomedical Sciences, College of Medicine, University of Central Florida, 4000 Central Florida Blvd., Orlando, FL 32816, USA.5 Present address: Unidad de Biofísica, Centro Mixto Consejo Superior de Investigaciones Cientificas, Universidad del Pais Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea (CSIC/UPV-EHU), 48080 Bilbao, Spain.6 Department of Cell Physiology and Metabolism, Centre Médical Universitaire, 1 rue Michel Servet, 1211 Geneva 4, Switzerland.7 Present address: MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, United Kingdom.

Apoptosis is an essential physiological process required for normal development and maintenance of tissue homeostasis. When misregulated, apoptosis can contribute to various diseases including cancer, autoimmune and neurodegenerative diseases. Although many of the components of the apoptotic machinery have been identified, our understanding of the mechanism of action of some of them is still incomplete. This is particularly true for several apoptosis-regulatory factors acting at the mitochondrial outer membrane (MOM) level, including Bcl-2 family proteins and components of the mitochondrial fission-fusion machinery. Bcl-2 family proteins can be divided into antiapoptotic members (e.g. Bcl-2 and Bcl-XL) and proapototic members, the latter including Bax-type proteins (e.g. Bax and Bak) and BH3-only proteins (e.g. tBid and Bim) [1]. The main function of Bcl-2 family protein is to regulate MOM permeabilization (MOMP). Bax-type proteins are thought to be direct effectors of MOMP. Although the molecular pathway by which Bax becomes activated remains ill defined, it is clear that (i) Bax is amphitropic protein that translocates from the cytosol to the mitochondria during apoptosis, (ii) shifting Bax from monomeric to an oligomeric state. During the past decade, tBID and a mitochondrion specific-lipid cardiolipin (CL) were identified as two critical factors implicated in Bax activation at the MOM-level. Importantly, although tBid and CL can be sufficient for triggering Bax oligomerization under certain in vitro experimental conditions [2], it was also recognized that additional proteins are required to induce efficient Bax oligomerization in vivo [3]. However, the nature of these “missing” Bax-activating factors has remained elusive. Recently, we obtained different lines of evidence supporting a role for the Dynamin-Related Protein 1 (Drp1) as a Bax-activating factor [4]. Previously it was shown that upon apoptotic stimulation Drp1 is recruited to the MOM where it co-localizes with Bax at mitochondrial constriction sites [5] apparently implicated in mitochondrial division, but the connection between these phenomena and Bax-driven MOMP remained obscure. We now show that Drp1 stimulates tBid-induced Bax oligomerization and cytochrome c release by promoting tethering and hemifusion of membranes in vitro. This function of Drp1 is independent of its GTPase activity and relies on arginine 247 and the presence of CL in the membrane. In cells, overexpression of Drp1 R247A/E delays Bax oligomerization and cell death. In summary, our findings reveal a novel function of Drp1 and provide important insight into the mechanism of Bax activation and MOMP induction during apoptosis.


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O11.05INFLUENCIA DE LA PRESIÓN EN LA SIMULACIÓN DEL PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS

Ramiro Perezzan1, Antonio Rey1

1 Depto. Química-Física I, Universidad Complutense de MadridLa influencia de la temperatura en el plegamiento de proteínas ha sido estudiada ampliamente en las últimas décadas. Sin embargo, son pocos los estudios acerca de la influencia de la presión en este tipo de procesos [1].

Utilizando modelos simples de simulación molecular con potenciales aproximados, donde tenemos en cuenta el disolvente de forma implícita, nos proponemos un estudio del plegamiento de proteínas globulares bajo presión hidrostática. Para ello, necesitamos obtener información de tipo termodinámico sobre el efecto de la presión en la transición desde la forma nativa hasta la desnaturalizada, para una cadena polipeptídica.El trabajo que hemos realizado hasta el momento se ha dividido en dos líneas principales: 1º) Comparativa entre el plegamiento de proteínas con estructura nativa conocida a bajas y altas presiones, que hemos recogido del Protein Data Bank. En estos casos, podemos aplicar el mismo tipo de modelo y potencial de interacción desarrollado en nuestro grupo de investigación [2] a una misma proteína, cuya estructura se ha determinado en condiciones de presión diferentes, para analizar las posibles diferencias en su plegamiento. 2º) A partir de la estructura terciaria a presión atmosférica, hemos desarrollado un nuevo tipo de potencial de interacción con distintos parámetros regulables, que estamos optimizando para que simulen el efecto de una presión hidrostática sobre la proteína a estudiar. De esta forma, pretendemos estudiar directamente la desnaturalización provocada conjuntamente por la presión y la temperatura.Nuestro objetivo final es analizar el efecto que ejerce la presión en el proceso de plegamiento y cómo esta puede llegar a influir en sus características más relevantes, así como en la existencia de posibles intermedios termodinámicos a lo largo del mismo.

[1] Meersman, F.,Dobson,C. and Heremans, K., (2006) Chem. Soc. Rev. 35, 908–917[2] Prieto, L., Sancho, D., and Rey, A. (2005) J. Chem. Phys. 123, 154903.


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O11.06MODELOS IMPLÍCITOS PARA EL ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN LÍPIDO-PROTEÍNA

Lidia Prieto1, Yi He1, Themis Lazaridis1

1 Chemistry Department, City College of New York (CUNY).

De todas las proteínas que existen en la célula, entre un 20 y un 30% están asociadas a las membranas biológicas. El estudio de proteínas de membrana presenta importantes dificultades debido a la baja solubilidad de los lípidos en agua. Por ello, la modelización molecular se convierte en una alternativa atractiva para abordar el estudio de estos sistemas. Llevar a cabo simulaciones explícitas, si bien permite un mayor realismo y es lo más correcto en términos estrictos, supone un enorme tiempo de computación y limita enormemente el tipo de sistemas que se pueden estudiar. Los modelos implícitos suponen un punto medio entre estos modelos detallistas y los modelos coarse-grained, en que las moléculas aparecen representadas por un número reducido de centros de interacción. Los modelos implícitos permiten realizar simulaciones de la interacción de péptidos y proteínas con membranas sin perder detalle atómico de las moléculas proteicas. Dentro del estudio de la interacción lípido-proteína, las toxinas formadoras de poro constituyen un sistema modelo. Estas proteínas son segregadas en forma soluble en agua y son capaces de interaccionar con membranas celulares e insertarse en ellas tras sufrir un cambio conformacional. Además, las toxinas formadoras de poro son de gran interés por su capacidad lítica sobre diferentes tipos de células, lo cual sugiere posibles aplicaciones como antibióticos. En este trabajo presentamos nuestros estudios realizados sobre colicinas [1], un tipo de toxinas formadoras de poro, utilizando el modelo implícito de membrana IMM1 [2,3]. Estos estudios nos han permitido aportar información relevante sobre el mecanismo de inserción de estas proteínas en la membrana. Para poder estudiar la subsiguiente formación del poro es necesario realizar extensiones del modelo implícito, las cuales se presentan también en este trabajo.

[1] Prieto, L. y Lazaridis, T. (2011) Proteins, 79:126-141.[2] Lazaridis, T (2003) Proteins, 52:176-192.[3] Lazaridis, T (2005) Proteins, 58:518-527.


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O11.07PORES FROM THE POINT OF VIEW OF THE MEMBRANE: A GENERAL MODEL VALID FOR THE ACTION OF PEPTIDES AND PROTEINS

Jesús Salgado¹,², Gustavo Fuertes¹, Diana Giménez¹, Santi Esteban-Martín³, Orlando L. Sánchez-Muñoz¹¹Instituto de Ciencia Molecular, Universitat de València, Paterna (Valencia).²Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universitat de València, Burjassot (Valencia).³Institute for Research in Biomedicine, Parc Científic, Barcelona.

A number of important coincidences between unassisted pores in membranes and pores induced by peptides and proteins tell us that the lipid bilayer is an active element for the mechanism of pore formation and for configuring the pore structure. In pure lipid membranes, pores are hindered by large activation energies and driven at low probability by thermal fluctuations. Still in the absence of non-lipidic components, pores can be facilitated by defects, or induced by different types of stress. We will show that these pores are clearly connected to pores formed in the presence of membrane active peptides and proteins, up to the point that the latter molecules are best described as inducers of lipid pores. The sealing capacity of biomembranes is mainly due to the background high activation energy for lipidic pore formation, which corresponds to a barrier for nucleation of defects. Defect-prone states, like phase coexistence, and different perturbation factors, including external and internal sources of tension, can lower the barrier and increase pore likelihood. Litster’s pore nucleation theory provides the basis for understanding pore stability. Additionally, the mechanism, structure and dynamics of pores can be described by multiscale MD simulations, which show hydrophobic pre-pore intermediates, first consisting on water files, that grow and convert into a hydrophilic pore lined by lipid headgroups. The same basic framework explains pore induction by polypeptides. They act as a membrane perturbation factor, similar to other surface active molecules, by stretching the membrane after interfacial binding. This corresponds to an internal increase of surface tension which decreases the activation energy for pore opening and can thus be considered a type of catalysis. The presence of membrane active peptides and proteins has the additional effect of displacing the equilibrium towards the pore open state, which is then maintained over long times, and reducing the size of initial individual pores. Thus, the pore formation mechanism, structure and dynamics depend primarily on bilayer properties, and pore-inducing polypeptides, regardless of their sequence and oligomeric organization, can be assigned the roles of increasing the probability of pore formation and stabilizing pores, once they appear.


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O11.08INFLUENCIA DE LOS ENLACES DE HIDRÓGENO EN EL PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS

Marta Enciso1, Antonio Rey1

1 Departamento de Química Física I. Universidad Complutense de Madrid

Desde un punto de vista fundamental, la adquisición de la estructura nativa de las proteínas se produce gracias a la colaboración entre las distintas interacciones estabilizantes presentes en las proteínas, principalmente las interacciones hidrófobas y los enlaces de hidrógeno.

La simulación molecular resulta una herramienta muy interesante a este respecto, puesto que permite describir estos sistemas a través de modelos teóricos de mayor o menor complejidad y comprobar la validez de los mismos por comparación con datos experimentales.

Partiendo de la experiencia del grupo en el diseño y evaluación de potenciales de campo medio para la simulación del plegamiento de proteínas (muy especialmente de potenciales basados en la topología del estado nativo [1], potenciales de enlace de hidrógeno [2] y potenciales hidrófobos [3]), presentamos en esta comunicación diversos ejemplos en los que se pone de manifiesto el papel fundamental del enlace de hidrógeno en el plegamiento de distintas proteínas.

Este tipo de interacción es fundamental a la hora de describir de forma adecuada la estructura nativa de las proteínas, desempeñando también una labor importante en el propio plegamiento. En esta comunicación describiremos la influencia de esta interacción sobre la cooperatividad y los fenómenos de agregación proteica a través de análisis estructurales y termodinámicos.

[1] Prieto, L., De Sancho, D. and Rey, A. (2005) J. Chem. Phys., 123, 154903.[2] Enciso, M. and Rey, A. (2010) J. Chem. Phys., 132, 235102.[3] Larriva, M., Prieto, L., Bruscolini, P. and Rey, A. (2010) Proteins, 78, 73-82.


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O12.05ESTUDIO INFRARROJO DE BHMT POR 2DCOS Y SUPRESIÓN DE BANDA

M. García Pacio, M.A Pajares2, B.Pastrana3 y J.L.R Arrondo11 Unidad de Biofísica (Centro mixto CSIC-UPV/EHU). Apdo. 644, 48080 Bilbao2 Instituto de Investigaciones Biomédicas ‘‘Alberto Sols’’ (CSIC-UAM), Madrid3 Department of Chemistry, University of Puerto Rico, Mayagüez Campus P.O. Box 9019, Mayagüez, PR 00681-9019

La betaína homocisteína S-metiltransferasa (BHMT, EC 2.1.1.5) es una de las dos enzimas que se conocen como capaces de metilar en el hígado homocisteína para generar metionina. Hemos estudiado dicho enzima en su estado salvaje y en un mutante que no tetrameriza, lo que se asocia con situaciones patológicas hepáticas. El esquema aplicado que combina la aplicación habitual con la aproximación que deseamos desarrollar es el siguiente:

Se presentan los resultados tanto en la proteína salvaje como la mutante, lo que nos permite comprobar la mejora que supone el método de remoción (supresión) de bandas.

[1] Arrondo, J. L. R., Muga, A., Castresana, J. & Goñi, F. M. (1993). Quantitative studies of the structure of proteins in solution by Fourier-transform infrared spectroscopy. Prog. Biophys. Mol. Biol. 59, 23-56.[2] Arrondo, J. L. R. & Goñi, F. M. (1999). Structure and dynamics of membrane proteins as studied by infrared spectroscopy. Prog. Biophys. Mol. Biol. 72, 367-405.[3] Pastrana-Rios, B. (2006). Simulation of FT-IR spectra and 2D-COS analysis for the thermal perturbation of apo-centrin q. J. Mol. Structure 799 163–167.


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O12.06UN ESTUDIO 2DCOS DEL EFECTO DE LOS LÍPIDOS EN EL PROCESO DE AMILOIDOGÉNESIS DE LA INSULINA

Nagore Andraka1, Mª Ángeles Frías2 y José Luis R. Arrondo1

1 Unidad de Biofísica (Centro mixto CSIC-UPV/EHU) y Depto. Bioquímica y Biología Molecular, UPV/EHU. Apdo. 644, 48080 Bilbao2 Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, y Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONINCET), Buenos Aires, Argentina

El proceso de amiloidogénesis se produce tras un desequilibrio conformacional en la proteína que conlleva la formación de una estructura extendida, conocida como cross-β y que posee un espectro de infrarrojo característico. El estudio de la formación de estos agregados está mediatizado por la dificultad en aplicarles las técincas biofísicas clásicas. En el caso de la espectroscopia de infrarrojo, al necesitarse concentraciones en torno a 1-5 mg/ml para poder obtener una relación señal/ruido aceptable, en muchos casos la agregación se produce inmediatamente. La existencia de proteínas, como es el caso de la insulina, que aun no formando estructuras amiloides en condiciones fisiológicas son susceptibles de producirlas de forma controlable en el tiempo utilizando para ello pH y temperatura como factores desestabilizantes a fin de desencadenar el proceso de agregación, permite el seguimiento del proceso cinético de formación de la fibra. Un elemento que se ha postulado como posible desestabilizador en los procesos de amiloidogénesis son las bicapas lipídicas que servirían como coadyuvantes, o como se ha sugerido como chaperones negativos, en el proceso dicho proceso de desestabilización previo al de agragación [1]. La espectroscopia de infrarrojo bidimensional de correlación (2DCOS), desarrollada por Noda [2], permite estudiar los cambios en el espectro de infrarrojo producidos por perturbaciones como las que se usan para inducir la amiloidogénesis. En estudios previos, hemos caracterizado por 2DCOS el proceso de agregación de la insulina a pD 2.0 inducido por temperatura. En este proceso veíamos que dicho proceso se producía de una forma bifásica. En la primera fase se desestabilizaban estructuras ordenadas de la proteína hasta llegar a una especie de equilibrio metaestable, a partir del cual se produce el colapso de la estructura en forma de agregado extendido conocido como estructura cross-β. Para estudiar la influencia de los lípidos en el proceso de agregación de la insulina, primero se han medido mezclas de DPPC y DPPC/colesterol a pD 2.0 a fin de ver la posible influencia del pH ácido en la formación de vesículas en nuestras condiciones. Posteriormente, dichas muestras se mezclaron con insulina para su estudio por 2DCOS. Las mezclas se realizaron de dos formas. Por una parte se formaron vesículas a las que se añadió de forma externa la insulina, y por otra se coformaron las vesículas con insulina. Los espectros se han analizado por descomposición de la banda amida I y por espectroscopia 2DCOS. El efecto desestabilizador obtenido es mayor en presencia de colesterol. En la actualidad estamos estudiando el efecto de lípidos cargados negativamente variando el pH, ya que aun cuando la proteína a pD 7.0 no sólo no agrega, sino que la agregación a pD 2.0 puede ser revertida, la presencia de lípidos cargados negativamente parece ser un factor desestabilizador para mantener la agregación.

[1] Alakoskela,J.M.; Jutila,A.; Simonsen,A.C.; Pirneskoski,J.; Pyhajoki,S.; Turunen,R.; Marttila,S.; Mouritsen,O.G.; Goormaghtigh,E.; Kinnunen,P.K. (2006) Biochemistry, 45, 13447-13453.[2] Noda, I; Ozaki, Y (2004) Two-dimensional Correlation Spectroscopy. Wiley, Chichester.


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O12.07ELECTROKINETICS AND THERMODYNAMICS OF THE INTERACTION OF MELITTIN WITH LIPID NANOVESICLES AND LANGMUIR-BLODGETT MONOLAYERS

Orlando L. Sánchez-Muñoz1, Diana Giménez1, Lisa Almonte-García1, Gustavo Fuertes-Vives1, Jesús Salgado1

1 Instituto de Ciencia Molecular, Universidad de Valencia, Catedrático José Beltrán 2, 46980 Paterna, Valencia, España

Important qualitative and quantitative information about peptide-lipid interactions can be obtained from a detailed analysis of vesicle electrokinetic properties and pressure isotherms of lipid monolayers. We present here a detailed study of the interaction of melittin, as a model membrane-active peptide, with lipid nanovesicles and Langmuir-Blodgett lipid monolayers of different composition. Melittin-nanovesicle interactions were investigated using electrokinetic methods. Increasing amounts of peptide cause important changes in the ζ-potential and membrane surface charge density (σ0) of nanovesicles, which can be used to characterize their electric double layer (EDL) and the physical stability based on the DLVO theory. In the absence of cholesterol (Cho) the colloid is less stable and the nanovesicles tend to form clusters. The equilibrium binding constant of melittin to vesicle membranes is determined, with similar results, by applying two alternative methods: the analysis of the stoichiometric binding (Scatchard plots) and using Gouy-Chapman theory [1]. The equilibrium constant is clearly higher for binding to POPC:POPG vesicles than for POPC:POPG:Cho vesicles, in agreement with the reduced pore-forming activity of melittin in Cho-containing membranes. On the other hand, the binding of melittin to lipid monolayes is characterized through pressure isotherms Δπ(c), which are then fit using Miller´s theoretical model [2]. The fits allow obtaining useful parameters that characterize the peptide-monolayer interactions, like the repulsion constant, the adsorption constant at equilibrium and the minimum interfacial area occupied by the peptide molecules. Lipid composition effects were also observed in monolayers. Thus, at the same melittin concentration, the Δπ increments were higher in the presence of Cho. After applying the scaled theory, larger values of y2 for melittin-POPC:POPG:Cho monolayers than for melittin-POPC:POPG monolayers indicate that the peptide molecules present a more compact arrangement in the absence of Cho. This suggest that Cho hampers peptide binding to membranes, which likely has an impact on insertion and pore formation.

[1] Klocek, G.; Schulthess, T.; Shai, Y.; Seelig, J. (2009) Biochemistry 48, 2586-2596.[2] Makievski, A.V.; Fainerman, V.B.; Bree, M.; Wüstneck, R.; Krägel, J.; Miller, R. (1998) J. Phys. Chem. B. 102, 417-425.


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O12.08NANOSCALE FLUORESCENCE CORRELATION SPECTROSCOPY ON INTACT LIVING CELL MEMBRANES WITH NSOM PROBES

Carlo Manzo1,2, Thomas S. van Zanten2, Maria F. Garcia-Parajo2,3

1 ICFO - Institute for Photonics Sciences, Castelldefels (Barcelona), Spain.2 IBEC - Institute for Bioengineering of Catalonia, Barcelona, Spain.3 CIBER-bbn and ICREA - Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats, Barcelona, Spain.

Characterization of molecular dynamics on living cell membranes at the nanoscale level is fundamental to unravel the mechanisms of membrane organization and compartmentalization. We have recently demonstrated the feasibility of fluorescence correlation spectroscopy (FCS) based on the nanometric illumination of near-field scanning optical microscopy (NSOM) probes on intact living cells [1]. NSOM-FCS was applied to study the diffusion of fluorescent lipid analogs on living CHO cells. The experiments allowed to reveal details of the diffusion hidden by larger illumination areas and associated with nanoscale membrane compartmentalization. The technique also offers the unique advantages of straightforward implementation of multiple color excitation, opening the possibility to study nanoscale molecular cross-correlation. Furthermore, the NSOM probe evanescent axial illumination allows to extend diffusion study to the membrane-proximal cytosolic region. As such, NSOM-FCS represents a novel powerful tool to characterize the details of many biological processes in which molecular diffusion plays a relevant role.

[1] Manzo, C., van Zanten, T.S., and Garcia-Parajo, M.F. (2011). Biophys J. 100:L08-L10.


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P1.09DYNAMICS OF NITROTYROSINES IN HAEMPROTEINS

Irene Díaz-Moreno1, Antonio Díaz-Quintana1, José M. García-Heredia1, Miguel Á. De la Rosa1

1 Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sevilla – CSIC.Avda. Américo Vespucio 49. 41092 Sevilla (Spain)

Under nitrooxidative stress conditions, the mitochondrial Reactive Nitrogen/Oxygen Species (RNOS) levels are unbalanced, thereby leading to irreversible cellular damage and further to disease. One of the most oxidant RNOS is peroxynitrite, which reacts with the tyrosine residues of proteins and transform them into nitrotyrosines by adding a –NO2 radical at the ortho position of the phenolic hydroxyl group. Outstanding targets for RNOS in mitochondrial are the five tyrosine residues within the respiratory human cytochrome c (h-Cc), which is a small (ca. 12 kDa) soluble haemprotein shuttling electrons between the membrane-embedded complexes cytochrome bc1 and cytochrome c oxidase. Upon h-Cc nitration, oxidative phosphorylation is drastically impaired [1] but the peroxidase activity of h-Cc is significantly increased [2].Intriguingly, each tyrosine residue of h-Cc exhibits a different dynamic behaviour upon addition of the –NO2 group. Such a difference in dynamics depends on the specific position of each tyrosine at the haemprotein structure, as inferred from NMR spectroscopy and MD simulations.

[1] Rodríguez-Roldán, V., García-Heredia, J.M., Navarro, J.A., De la Rosa, M.A. and Hervás, M. (2008) Biochemistry 47, 12371-12379[2] García-Heredia, J.M., Díaz-Moreno, I., Nieto, P.M., Orzáez, M., Teixeira, M., Pérez-Payá, E., Díaz-Quintana, A., and De la Rosa, M.A. (2010) BBA Bioenergetics 1797, 981-993


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P1.10IMPLICACIÓN DE UNA CISTEÍNA DEL ECTODOMINIO DE LA GLICOPROTEÍNA E2 DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C EN SU OLIGOMERIZACIÓN

Sara Ortega1, Laura Lombana1, Belén Yélamos1, Julián Gómez-Gutiérrez1, Francisco Gavilanes1

1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Facultad de CC. Químicas, Universidad Complutense de Madrid, Madrid. España.

El virus de la Hepatitis C (HCV) es la principal causa de hepatitis aguda, cirrosis y cáncer hepático. Según la Organización Mundial de la Salud, en la actualidad hay 190 millones de personas infectadas por el HCV en el mundo, y cada año aparecen 3 o 4 millones de nuevos casos. No se dispone de una vacuna eficaz frente al HCV y el tratamiento es muy costoso para la mayoría de las personas en los países no desarrollados. El HCV es un virus con envoltura y RNA positivo que pertenece al género Hepacivirus dentro de la familia Flaviviridae. Las glicoproteínas de su envoltura E1 y E2 son las responsables de la unión del virus a la superficie de la célula y de inducir la fusión entre las membranas viral y celular. Empleando el sistema de expresión de baculovirus, hemos conseguido obtener en gran cantidad el ectodominio soluble de la glicoproteína E2 (E2661), que comprende los residuos 384 a 661, observándose que dicha proteína presenta tendencia a agregar formando oligómeros. Con el objetivo de evitar esta tendencia a la agregación y/o comprobar si afecta a la función de la proteína, se ha diseñado un mutante que carece de la Cys 652 (E2C652S). Recientemente se ha descrito que dicha Cys está implicada en la formación de un puente disulfuro intercatenario con la cisteína 677 [1], que no está presente en la proteína recombinante E2661. Así, en la proteína E2661 la Cys 652 queda libre y puede asociarse con otra Cys libre de otra molécula de E2661, formándose oligómeros. Este mutante ha sido expresado en baculovirus y purificado mediante cromatografía de afinidad empleando una columna de Ni-NTA-agarosa. Se ha comprobado, mediante ultracentrifugación analítica y PAGE-SDS en condiciones nativas, que el mutante posee una proporción de monómero muy superior a la de E2661. Posteriormente se ha llevado a cabo su caracterización estructural, mediante técnicas espectroscópicas como dicroísmo circular y fluorescencia, así como su caracterización funcional, mediante ELISA con sueros de pacientes infectados por el HCV y mediante ensayos de interacción lípido-proteína.

[1] Krey, T., d’Alayer, J., Kikuti, CM., Saulnier, A., Damier-Piolle, L., Petitpas, I., Johansson, DX., Tawar, R.G., Baron, B., Robert, B., England, P., Persson, M.A., Martin, A., Rey, F.A. (2010) PLoS Pathogens. Feb19;6(2):e1000762.


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P1.11REPA-WH1 PRIONOID: A SYNTHETIC MODEL FOR LIGAND-PROMOTED PROTEIN AMYLOIDOSIS

Rafael Giraldo1, Fátima Gasset-Rosa1, María Moreno-del Álamo1, Laura Molina-García1, Cristina Fernández1, Ana M. Serrano1, Susana Moreno-Díaz de la Espina2, M. Elena Fernández-Tresguerres1

1 Dept. of Physical & Chemical Biology2 Dept. of Cell Proliferation & DevelopmentCentro de Investigaciones Biológicas – CSIC. C/ Ramiro de Maeztu, 9. 28040 – Madrid, Spain. Tel.: +34 - 91 8373112, Fax: +34 - 91 5360432, email: [email protected]

The intricate complexity, at the molecular and cellular levels, of the processes leading to the development of amyloid proteinopathies is somehow counterbalanced by their common, universal structural basis (the amyloid crossed b-sheets) [1]. This has fueled the quest for disease-unrelated model systems suitable to study protein amyloidosis under quasi-physiological conditions in vitro and in simpler organisms in vivo. Yeast prions have provided several of such model systems, yielding invaluable insights on amyloid structure, dynamics and transmission [2]. However, yeast prions, unlike mammalian PrP, do not elicit any proteinopathy.We have reported that engineering RepA-WH1, a bacterial DNA-toggled protein conformational switch (dWH1 → mWH1) functional in plasmid replication [3], enables DNA-modulated control on protein amyloidogenesis in vitro [4]. RepA-WH1 thus shares some analogies with nucleic acid-promoted replication of the mammalian prion (PrPC → PrPSc) [5]. In a proof of concept for allosteric DNA-promoted amyloidogenesis, we also found small molecules that inhibit amyloid assembly by interfering with DNA binding to RepA-WH1 [6]. Furthermore, RepA-WH1 expression gives way to a non-infectious, vertically-transmissible (from mother to daughter cells, coupled to cell division) amyloid proteinopathy in Escherichia coli: RepA-WH1 amyloid aggregates efficiently promote aging in bacteria, which exhibit a drastic lengthening in generation time, a limited number of division rounds and reduced fitness [7]. The RepA-WH1 prionoid opens direct means to untangle the general pathway(s) for protein amyloidosis in a host with reduced genome and proteome [8], and would make possible a reliable use of amyloid scaffolding in nanotechnology and synthetic biology [9].

[1] Greenwald,J., and Riek,R. (2010) Structure 18, 1244-1260.[2] Wickner,R.B., Edskes,H.K., Shewmaker,F., and Nakayashiki,T. (2007) Nat. Rev. Microbiol. 5, 611-618.[3] Giraldo,R., Fernández-Tornero,C., Evans,P.R., Díaz-Orejas,R., and Romero,A. (2003) Nat. Struct. Biol., 10, 565-571.[4] Giraldo,R. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 17388-17393.[5] Silva,J.L., Lima,L.M., Foguel,D., and Cordeiro,Y. (2008) Trends Biochem. Sci. 33, 132-140.[6] Gasset-Rosa,F., Maté,M.J., Dávila-Fajardo,C., Bravo,J., and Giraldo,R. (2008) Nucl. Acids Res. 36, 2249-2256.[7] Fernández-Tresguerres,M.E., Moreno-Díaz de la Espina,S., Gasset-Rosa,F., and Giraldo,R. (2010) Mol. Microbiol. 77, 1456-1469.[8] Giraldo,R., Moreno-Díaz de la Espina,S., Fernández-Tresguerres,M.E., and Gasset-Rosa,F. (2011) Prion 5(2); DOI: 10.4161/pri.5.2.14913[9] Giraldo,R. (2010) ChemBioChem 11, 2247-2357.


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P1.12MUTAGENESIS ANALYSIS OF THE KINETICS AND THERMODYNAMIC PARAMETERS IN AMYLOID FORMATION OF ALPHA-SPECTRIN-SH3 DOMAIN

David Ruzafa 1, Lorena Varela1, Ana. I Azuaga1, Bertrand Morel1, Francisco Conejero-Lara1

1 Departamento de Química Física e Instituto de Biotecnología, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada, Spain

Our previous studies have proved that the single mutant N47A of the alpha-spectrin SH3 (Spc-SH3) domain can readily form amyloid fibrils [1]. We have found that the WT Spc-SH3 domain and other mutants can also form amyloid fibrils at acidic pH, although at much slower rates [2] when compared to the N47A variant. We have demonstrated that the difference is not due to a thermodynamic destabilization of the native state of the domain, but to an increase in the rate of the conformational processes that conduce to fibril nucleation. In order to complement this study and to bring light into amyloid formation mechanism, we have generated a series of double-mutants using N47A Spc SH3 as reference protein. Mutations were made at selected positions of the polypeptide chain to probe each structural element of the protein. A range of biophysical techniques (circular dichroism, fluorescence (ThT and ANS), dynamic light scattering, transmission electron microscopy) was combined to study the effect of these different modifications in the kinetics of amyloid fibrils formation. In addition the thermal stabilities of the amyloid fibrils formed from these different mutants were determined using differential scanning calorimetry (DSC).The kinetics data obtained from ThT fluorescence at different concentrations of protein were fitted to plausible kinetic mechanisms describing the fibrillation process and were analyzed quantitatively to obtain the apparent rate constants for the amiloidogenic variants of alpha-spc SH3 domain.

Taken all together, this mutagenic analysis clarifies the molecular mechanism of amyloid fibril formation and provides information about which regions of the polypeptide chain are directly involved in the aggregation process.

[1] Morel B., Casares S., Conejero-Lara F. (2006) J. Mol Biol. 356: 453-468[2] Varela, L., Morel, B., Azuaga, A.I., and Conejero-Lara, F. (2009). A single mutation in an SH3 domain increases amyloid aggregation by accelerating nucleation, but not by destabilizing thermodynamically the native state. (2009) FEBS Letters. 583: 801–806.


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P1.13DOMINIOS EXTRACELULARES DEL RECEPTOR DE LDL: CINÉTICA DE UNIÓN DE Ca2+ Y Mg2+ A LR5.

Juan E. Martínez1,2, Xabier Arias-Moreno1,2, Adrián Velazquez-Campoy1 y Javier Sancho1,2

1Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Universidad de Zaragoza, España.2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular, Facultad de Ciencias, Universidad de Zaragoza, España.

El receptor de LDL (r-LDL) desarrolla un papel fundamental en la internalización por parte de las células del colesterol presente en las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Además, se han descrito numerosas mutaciones en el receptor capaces de originar Hipercolesterolemia Familiar, una enfermedad con graves implicaciones y una elevada incidencia poblacional.Atendiendo a la estructura del r-LDL, se han descrito dos dominios como los principales responsables de su interacción con LDL: el dominio de unión y el dominio homólogo a EGF. El dominio de unión consta de siete módulos homólogos (LR1-7) siendo el LR5 fundamental para su actividad.[1]Estudios previos de nuestro grupo [2],[3] y corroborados recientemente [4] nos han permitido proponer un nuevo mecanismo para el proceso de internalización y liberación del colesterol en el endosoma, mediado por el r-LDL.Hemos estudiado la estabilidad de LR5, concluyendo que se encuentra fuertemente estabilizado a pH 7 (extracelular) y en presencia de altas [Ca2+] pero es inherentemente inestable a pH 5,5 (endosomal) y bajas [Ca2+]. El mecanismo que proponemos establece que la liberación de LDL en el endosoma se produce ayudada por el desplegamiento de LR5, debido al bajo pH y baja [Ca2+], posteriormente, el LR5 se une a Mg y se repliega, lo que favorece la formación de un autocomplejo entre el dominio de unión y el dominio homólogo a EGF. La formación de este complejo protege al r-LDL de la degradación y podría favorecer su retorno a la membrana.El estudio cinético de la unión y liberación de Ca2+ y Mg2+ por parte del LR5 (tanto a pH extracelular como pH endosomal) nos ha permitido determinar las constantes cinéticas (Kon y Koff) de estos procesos, así como dar una explicación a la mayor afinidad de LR5 por el Ca2+, respecto al Mg2+, lo que podría deberse fundamentalmente al mayor coste energético de la desolvatación del Mg2+. De esta forma, el estudio de estos procesos aporta datos fundamentales para comprender la evolución de los estados de plegamiento del LR5 durante la internalización y liberación de LDL.

[1] Fisher C, Abdul-Aziz D, Blacklow SC. (2004) Biochemistry 3;43 (4):1037-44. [2] Arias-Moreno X, Velazquez-Campoy A, Rodríguez JC, Pocoví M, Sancho J. (2008) J Biol Chem 15;283 (33):22670-9. [3] Arias-Moreno X, Cuesta-Lopez S, Millet O, Sancho J, Velazquez-Campoy A. (2010) Proteins 78(4):950-61.[4] Zhao Z, Michaely P.(2009) Biochemistry 4;48(30):7313-24.


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P1.14PHOTOINTERMEDIATE STABILITY CHANGES IN RHODOPSIN MUTANTS ASSOCIATED WITH RETINITIS PIGMENTOSA

Eva Ramon1, Laia Bosch-Presegué1, Darwin Toledo1, Arnau Cordomí2, Pere Garriga1

1 Departament d’Enginyeria Química, Centre de Biotecnologia Molecular, Universitat Politècnica de Catalunya, Terrassa, Spain.2 Laboratori de Medicina Computacional, Unitat de Bioestadística, Facultat de Medicina, Universitat Autònoma de Barcelona, Cerdanyola del Vallès, Spain.

The study of G-protein coupled receptors (GPCRs) is of outstanding pharmacological interest because this family of receptors is involved in a wide variety of physiological and pathophysiological processes [1,2]. Rhodopsin is a prototypical member of the GPCRs superfamily and its structural and functional studies provide insights into GPCRs structural motifs which are the structural basis of a proposed common activation mechanism. Rhodopsin is located in the retina and responsible for dim light vision [3,4]. The receptor is constituted by a protein part, opsin and the chromophore, 11-cis-retinal, covalently bound through a protonated Schiff base linkage to opsin Lys296. The initial process of rhodopsin activation is a light induced 11-cis to all-trans isomerization of the chromophore causing the activation of the receptor, through a number of spectroscopically distinguishable photointermediates on a millisecond timescale, and triggering the visual cascade by binding and activating the G-protein transducin [5]. Retinitis pigmentosa (RP) belongs to a group of inherited degenerative retinopathies genetically and clinically heterogeneous [6,7]. The study of rhodopsin mutants associated with retinal diseases, such as RP, provides information about the molecular mechanism of these pathologies. The naturally occurring mutations at Gly51, Gly51Ala and Gly51Val, and Gly89Asp of rhodopsin, associated with RP, were first reported in the early nineties [8]. Here, Gly89Asp and Gly51Val RP mutants and Gly51Ala/Glu134Gln, Gly51Val/Glu134Gln, Val300Gly and Gly51Val/Val300Gly double mutants (in order to study the involvement of the nearby residues Glu134 and Val300) were constructed by site-directed mutagenesis, expressed by COS-1 cells, immunopurified in detergent solution and studied by UV-visible and fluorescence spectroscopies. Our current detailed spectroscopic analysis, together with functional characterization, indicates that these mutations influence the relative stability of the different metarhodopsin photointermediates by altering their equilibria and maintaining the receptor in a non-functional light-induced conformation which may be toxic to photoreceptor cells. We propose that Gly51Val and Gly89Asp shift the equilibrium from metarhodopsin I towards an intermediate recently named as metarhodopsin Ib which is thought to interact with transducin without activating it [9]. This may be one of the causes contributing to the molecular mechanisms underlying cell death associated with some retinitis pigmentosa mutations.

[1] Bockaert J & Pin JP (1999) EMBO J 18, 1723-1729.[2] Marinissen MJ & Gutkind JS (2001) Trends Pharmacol Sci 22, 368-376.[3] Hargrave PA (2001) Invest Ophthalmol Vis Sci 42, 3-9.[4]Sakmar TP, Menon ST, Marin EP & Awad ES (2002) Annu Rev Biophys Biomol Struct 31, 443-484.[5]Scheerer P, Heck M, Goede A, Park JH, Choe HW, Ernst OP, Hofmann KP & Hildebrand PW (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106, 10660-10665.[6] Berson EL (1993) Invest Ophthalmol Vis Sci 34, 1659-1676.[7] Farrar GJ, Kenna PF & Humphries P (2002) EMBO J 21, 857-864.[8] Dryja TP, Hahn LB, Cowley GS, McGee TL & Berson EL (1991) Proc Natl Acad Sci U S A 88, 9370-9374.[9] Bosch-Presegué L, Ramon E, Toledo D, Cordomí A, Garriga P (2011) FEBS Journal, in press.


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P1.15CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA LISOZIMA EN LÍQUIDOS IÓNICOS

Rocío Esquembre1, Jesus Sanz1, J.Gerard Wall2, Francisco del Monte3, M. Luisa Ferrer3, C. Reyes Mateo1

1 Instituto de Biología Molecular y Celular, Universidad Miguel Hernández, Elche. 03202, Alicante, Spain. 2 National University of Ireland Galway (NUIG), Ireland. 3 Instituto de Ciencia de Materiales de Madrid (ICMM), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Cantoblanco, 28049 Madrid, Spain.

Durante la última década, el desarrollo de los líquidos iónicos (ILs) como alternativa “verde” a la utilización de los disolventes orgánicos convencionales, y su aplicación en las reacciones de biocatálisis ha despertado un gran interés. Los IL son sales orgánicas cuyos puntos de fusión son menores de 100ºC, son biodegradables, no reaccionan con el agua y no son volátiles. Los DESs (Deep-eutectic solvents) han sido descritos como una nueva clase de IL obtenidos por la complejación de sales cuaternarias de amonio con donadores de enlaces de hidrógeno y, debido a sus propiedades, han sido también utilizados como disolvente en varios tipos de biotransformaciones enzimáticas. En el presente trabajo se ha estudiado el despegamiento y replegamiento de la lisozima en DES basados en mezclas urea: cloruro de colina (UCCl) y glicerol:cloruro de colina (GCCI) en una relación molar 2:1. La estructura y estabilidad térmica de la lisozima se ha estudiado tanto en los DES puros como en diluciones acuosas concentradas y pseudo-concentradas de los mismos, y se ha comparado con los resultados obtenidos en disoluciones de los componentes aislados y en tampón MES. La dependencia de la estructura de la enzima fue monitorizada siguiendo la fluorescencia intrínseca de los triptófanos y mediante técnicas de dicroísmo circular. Los resultados indican un ligero cambio en la conformación de la proteína en ambos DES y una perdida de cooperatividad en el proceso de desnaturalización térmica, más acentuada en el caso del DES UCCl. Sin embargo, el estado y comportamiento termotrópico se recuperaron tras la diálisis en tampón MES. También se determinó la actividad de la lisozima en el DES de GCCI puro y en las diluciones acuosas del mismo, mediante un ensayo turbidimétrico basado en la ruptura por parte de la lisozima de los enlaces β-1,4 de la pared celular de Micrococcus lysodeikticus. Los resultados muestran que la actividad de la enzima se ralentiza considerablemente en el DES puro y concentrado, aunque este efecto es reversible ya que los niveles de actividad son recuperados tras la dilución de la enzima.

Agradecimientos a los proyectos MAT2008-05670 del MICINN y ACOMP/2010/106 de la Generalitat Valenciana


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P1.16HOW THE COPPER SITE GEOMETRY DETERMINES THE THERMAL STABILITY OF BLUE COPPER PROTEINS

Antonio Díaz-Quintana1, Irene Díaz Moreno1, Miguel A. De la Rosa1, Sofía Díaz Moreno2 and Jesús Chaboy3

1 Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sevilla – CSIC. Avda. Americo Vespucio 49. 41092 Sevilla (Spain)2 Diamond Light Source Ltd. Rutherford Appleton Laboratory, Chilton, Didcot, Oxfordshire OX11 0QX, United Kingdom.3 Instituto de Ciencias de los Materiales. C.S.I.C. y Universidad de Zaragoza, 50009 Zaragoza, Spain.

Identifying the factors that govern the thermal resistance of cupredoxins is essential to expand their current biotechnological applications. The metal cofactor determines their stability, but how the redox state of copper modulates their melting points has remained unknown. The metal coordination environment is highly conserved in cyanobacterial plastocyanins (Pc). However, the oxidised form is more stable than the reduced one in thermophilic Phormidium, but the opposite occurs in mesophilic Synechocystis [1,2]. Molecular dynamics computations indicate that differences between the two proteins lie at loop regions located far from the copper site [2,3]. Specific, neutral amino-acid substitutions at this site confer Phormidium Pc a redox-dependent thermal stability similar to that of the mesophilic plastocyanin, and vice versa. X-ray absorption spectroscopy of Cu K-edge indicates that the mutation in Phormidium Pc makes the electron density distribution at the oxidised copper site shift towards that of Synechocystis Pc [4].Analysis of XANES and the transitions within the Cu K-edge region of the different Pc spectra shows that melting point of the three engineered proteins is closely related to the short-range structure around the copper centre. Specifically, the bond length between Cu and the S atom from the cysteine ligand correlates with the thermal stability of the cupredoxins in both oxidised and reduced states [5].

[1] Feio, M.J., Navarro, J.A., Teixeira, M.S., Harrison, D., Karlsson, B.G. and De la Rosa, M.A. (2004) Biochemistry 43, 14784–14791.[2] Feio, M.J., Díaz-Quintana, A., Navarro, J.A. and De la Rosa, M.A. (2006) Biochemistry 45, 4900–4906. [3] Muñoz-López, F.J., Raugei, S., De la Rosa, M.A., Díaz-Quintana, A. and Carloni, P. (2010) J. Biol. Inorg. Chem.15, 329–338.[4] Muñoz-López, F.J., Frutos-Beltrán, E., Díaz-Moreno, S., Díaz-Moreno, I., Subías, G., De la Rosa, M.A. and Díaz-Quintana, A. (2010) FEBS Lett. 584, 2346-2350.[5] Chaboy Nalda, J., Díaz-Moreno, S., Díaz-Moreno, I., De la Rosa, M.A. and Díaz-Quintana (2011) Chem. Biol. 18, 25-31.


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P1.17INSIGHTS INTO NUCLEOTIDE RECOGNITION BY BACTERIAL CELL DIVISION PROTEIN FTSZ

Laura Ruiz-Avila1, Claudia Schaffner-Barbero1, Sonia Huecas1, Marta Artola2, Pablo Chacón3 and Jose Manuel Andreu1

1 Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid2 Facultad de Ciencias Químicas, UCM, Madrid3 Instituto de Química Física Rocasolano, CSIC, Madrid

FtsZ is a prokaryotic structural homolog of the eukaryotic protein tubulin that plays a central role in bacterial cell-division. Both proteins are self-assembling cytoskeletal GTPases with an N-terminal nucleotide binding domain and a GTPase activating domain. Selective inhibition of the function of FtsZ has been recently identified as a target for antimicrobial therapy. Following the analysis of the energetics and kinetics of the interactions of FtsZ with guanine nucleotides [1], we have developed a homogeneous competition assay, employing the fluorescence anisotropy change of mant-GTP upon binding to nucleotide-free FtsZ from Methanococcus jannaschii, which detects compounds binding to the nucleotide site in FtsZ monomers and measures their affinities [2]. The apparent contribution of the guanine, ribose and the α-β and γ-phosphates to the free energy change of nucleotide binding has been determined through the competition assay and binding free energy calculations.We have found an energetically dominant contribution of the beta-phosphate, comparable to the whole guanosine moiety. This competition method was also used to measure the binding affinities of a series of C-8-substituted analogues of GTP that support tubulin assembly but inhibit FtsZ polymerization [3], for which we have found a linear relationship between the Log Kb and the Log IC50 of polymerization of FtsZ from Escherichia coli and Bacillus subtilis.We are currently employing the mant-GTP method and FtsZ polymerization assays to search for new nucleotide mimetic small molecules, coming from virtual screening and organic synthesis approaches. The challenge is to develop FtsZ inhibitors which have specific antibacterial activity and do not affect tubulin and other GTPases in human cells.

[1] Huecas S, Schaffner-Barbero C, Garcia W, Yébenes H, Díaz JF, Menéndez M., Andreu JM (2007) J. Biol. Chem. 282, 37515.[2] Schaffner-Barbero C., Gil-Redondo R., Ruiz-Avila L.B., Huecas S., Läppchen T., den Blaauwen T., Díaz J.F., Morreale A., Andreu J.M. (2010) Biochemistry 49, 10458-10472. [3] Läppchen T, Pinas VA, Hartog AF, Koomen GJ, Schaffner-Barbero C, Andreu JM, Trambaiolo D, Löwe J, Juhem A, Popov AV, den Blaauwen T. (2008) Chem Biol 15, 189-199


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P1.18ANALYSIS OF THE EQUILIBRIUM AND KINETICS OF THE ANKYRIN REPEAT PROTEIN MYOTROPHIN

Mauro Faccin1, Pierpaolo Bruscolini1, Alessandro Pelizzola2

1 Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI) & Departamento de Física Teórica, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, España2 Dipartimento di Fisica, Centre for Computational Studies, CNISM-Torino, INFN-Torino, Politecnico di Torino, Italia

We apply the Wako-Saito-Muñoz-Eaton model to the study of myotrophin [1], a small ankyrin repeat protein, whose folding equilibrium and kinetics have been recently characterized experimentally [2,3]. The model, which is native-centric with binary variables, provides a finer microscopic detail than the Ising model, recently applied to some different repeat proteins. In partial agreement with the experiments, our results reveal a weakly three-state equilibrium and a two-state-like kinetics of the wild-type protein despite the presence of a nontrivial free-energy profile. These features suggest that the simple behavior observed for repeat proteins is associated to a careful “design” of the free-energy landscape, and indeed mutations can alter this picture, stabilizing some intermediates and changing the position of the rate-limiting step. Also, the experimental findings of two alternative pathways, an N-terminal and a C-terminal one, are qualitatively confirmed. Interestingly, the folding and unfolding pathways appear to be different, even if closely related: a property that is not generally considered in the phenomenological interpretation of the experimental data.

[1] Faccin, M., Bruscolini, P., and Pelizzola, A. (2011) J. Chem. Phys. 134, 075102.[2] Lowe, A. R., and Itzhaki, L. S. (2007) J. Mol. Biol. 365, 1245.[3] Lowe, A. R., and Itzhaki, L. S. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2679.


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P1.19RULES GOVERNING GEMINI SURFACTANT-PROTEIN INTERACTIONS

Razieh Amiri1,2, MªFlor García Mayoral2, Ahmad Reza Khosropour1, Iraj Mohammadpour1, Abdol-Khalegh Bordbar1 and Douglas V. Laurents2

1 Department of Chemistry, University of Isfahan, Isfahan 81746-73441, Iran2 Instituto de Química Física “Rocasolano” CSIC, Serrano 119, Madrid 28006, España

Gemini surfactants have two polar head groups and two long hydrocarbon tails. Like conventional surfactants, Gemini amphiphiles form small globular micelles, but Geminis have much lower (M vs. mM) critical micelle concentrations and possess slower (ms vs. μs) monomer ←→ micelle kinetics. The general structure of the Gemini surfactants studied here is [HOCH2CH2-,CH3-,CH3(CH2)15-N+-(CH2)s-N+-CH3,-CH2CH2OH,-(CH2)15CH3] ·2Br- where s=4, 5 or 6. Our objective has been to reveal the effect of these cationic Gemini surfactants on the structure and stability of four model proteins: Ribonuclease A, Hen Egg White Lysozyme, Ribonuclease Sa and the Aβ1−40 polypeptide, using multiple biophysical techniques. 2D 1H,13C NMR and CD spectroscopies show that the conformation of RNase A and HEWL are unaffected at low to neutral pH where these proteins carry a net positive charge, although the conformational stability of RNase A is lowered by about 1 kcal/mol as revealed by NMR monitored H/D exchange. At alkaline pH, where both these well-folded proteins bear a net negative charge, they do interact with Gemini surfactants and the formation of large aggregates is observed. Consistent results are obtained with Gemini surfactants and RNase Sa except the range of pH where interaction is observed is much broader for this well folded, anionic protein (pI= 4.5). In addition to aggregate formation at high pH, Aβ, whose monomer is an intrinsically disordered polypeptide, also interacts with Gemini surfactants at low pH where both species bear positive charge. On the basis of these results, we conclude that Gemini surfactants interact with well folded proteins via favorable electrostatic interactions can and form large aggregates, and interact with intrinsically disordered polypeptides by both hydrophobic and electrostatic interactions. We advance that these Gemini surfactants, due to their low CMC values, slow monomer/micelle kinetics and non interaction with well folded, cationic proteins, can serve as useful membrane mimetics for the high resolution study of interactions between positively charged proteins and membrane components by NMR.


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P1.20TYROSINE PHOSPHORYLATION TURNS ALKALINE TRANSITION INTO A BIOLOGICALLY RELEVANT PROCESS AND MAKES HUMAN CYTOCHROME C BEHAVE AS AN ANTI-APOPTOTIC SWITCH

Irene Díaz-Moreno1, José M. García-Heredia1, María Salzano1, Mar Orzáez2, Enrique Pérez-Payá2, Miguel Teixeira3, Antonio Díaz-Quintana1, Miguel A. De la Rosa1

1 Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sevilla-CSIC, cicCartuja, Sevilla2 Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia3 Instituto de Tecnología Química e Biológica, Universidad de Nova de Lisboa

Cytochrome c is a key protein in cell life (respiration) and cell death (apoptosis). On one hand, it serves as a mitochondrial redox carrier, so transferring electrons between the membrane-embedded complexes III and IV. On the other hand, it acts as a cytoplasmic apoptosis-triggering agent, so forming the apoptosome with Apaf-1 and activating the caspase cascade. The two functions of cytochrome c are finely tuned by phosphorylation of tyrosines and, in particular, of those located at positions 48 and 97. However, the specific cytochrome c-phosphorylating kinase is still unkown. To study the structural and functional changes induced by tyrosine phosphorylation in cytochrome c, we study here the two phosphomimetic mutants Y48E and Y97E, in which each tyrosine residue is replaced by glutamate. Such substitutions alter both the physicochemical features and function of the mutants as compared with the native protein. Y97E is significantly less stable than the WT species, whereas Y48E does not only exhibit lower values for alkaline transition pKa and midpoint redox potential but also impairs Apaf-1-mediated caspase activation. Altogether, these findings suggest that the specific phosphorylation of Tyr48 makes cytochrome c act as an anti-apoptotic switch.

References:[1] Rodríguez-Roldán V., García-Heredia J.M., Navarro J.A., De la Rosa M.A., Hervás M. (2008) Biochemistry 47, 12371-12379[2] García-Heredia J.M., Díaz-Moreno I., Nieto P.M., Orzáez M., Kocanis S., Teixeira M., Pérez-Payá E., Díaz-Quintana A., De la Rosa M.A. (2010) Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics 1797, 981-993

Acknowledgements:The authors wish to thank the Spanish Ministry of Science and Innovation (BFU2009-07190) and the Andalusian Government (BIO198) for financial support.


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P1.21ESTABILIDAD CONFORMACIONAL DE LA LISOZIMA ENCAPSULADA EN MATRICES SOL-GEL: INFLUENCIA DEL PROTOCOLO DE INMOVILIZACIÓN

Mª José Martínez-Tomé1, Isabel Pastor2, Marisa Ferrer3, Ricardo Mallavia1, Javier Gómez1 y Reyes Mateo1

1 IBMC Universidad Miguel Hernández, Elche (Alicante)2 IQTCUV Universidad de Barcelona, Barcelona3 ICMM CSIC. Madrid

La tecnología sol-gel aplicada a la inmovilización de enzimas ha experimentado un auge espectacular en los últimos 15 años, principalmente como herramienta en el diseño de biosensores ópticos y electroquímicos. El proceso transcurre a temperatura ambiente y permite crear matrices sólidas, porosas y trasparentes, en una amplia gama de formas, en cuyos poros quedan atrapadas las biomoleculas en un ambiente esencialmente acuoso, manteniendo su estructura y actividad. Dependiendo de la ruta de preparación de la matriz, se puede modular el tamaño y la cantidad de poros, así como minimizar la generación de productos secundarios (generalmente alcohol) que pueden dañar la proteína. En la literatura, existen numerosos trabajos que estudian en detalle la actividad enzimática que presentan las proteínas en el interior de estas matrices, así como la variación de su actividad con el tiempo. Sin embargo, existen pocos estudios en los que se analicen las propiedades biofísicas de las proteínas inmovilizadas, especialmente su estabilidad conformacional, y en los que comparen los resultados en función de la ruta de preparación. Esta información resulta de gran importancia por varias razones. Por un lado, puede servir para optimizar el funcionamiento de los enzimas inmovilizados, debido a la estrecha correlación existente entre la estructura y la conformación de las proteínas y su actividad enzimática. Por otro lado, dicha información nos ayuda a conocer como se comporta una determinada proteína en un ambiente confinado. En el presente trabajo hemos utilizado dos protocolos diferentes: el método estándar (Met1) y una ruta libre de alcohol (Met2), para inmovilizar la proteína lisozima en una matriz sol-gel, y hemos explorado su estabilidad conformacional, mediante espectroscopía de fluorescencia y dicroísmo circular. Los resultados muestran que ambas rutas de encapsulación permiten el atrapamiento de la lisozima en sus poros, manteniendo su estructura terciaria prácticamente intacta. El Met2 da lugar a matrices más densas, con un tamaño de poro menor que impide que la proteína escape de la matriz, aunque permite la difusión de pequeñas moléculas a través de ella. Con el Met1, los poros son mayores, perdiéndose parte de la proteína inicialmente encapsulada. Los estudios de desnaturalización química (con cloruro de guanidinio) y térmica permiten concluir que, tras la inmovilización, el desplegamiento de la proteína inmovilizada sigue produciéndose de forma parcialmente reversible, mediante un mecanismo de dos estados similar al que existe en disolución. La inmovilización no parece inducir en la proteína una estabilización térmica, como sugieren otros trabajos, siendo la temperatura de desnaturalización (Tm) de la lisozima encapsulada con el Met2 similar a la encontrada en disolución. El Met1 produce cierta desestabilización, ya que el desplegamiento sucede a temperaturas más bajas (unos 10ºC) que en disolución, posiblemente por la presencia de alcohol residual procedente de la formación de la matriz. Por otro lado, la lisozima no es capaz de desplegarse totalmente cuando se encuentra incorporada en los monolitos fabricados con Met. 2, probablemente porque el tamaño del poro es muy pequeño, mientras que sí que lo hace en los fabricados con Met1. Finalmente, cuando el proceso de desplegamiento térmico se lleva a cabo a altas velocidades de barrido, se observa que la lisozima inmovilizada desplaza ligeramente su Tm hacia valores más altos. Esta estabilización parece meramente cinética y no termodinámica y ser debida a que el proceso de desplegamiento en la matriz es mucho más lento que en disolución, probablemente por la mayor viscosidad del agua confinada. Este trabajo ha sido financiado con los proyectos MAT2008-05670 del MICINN y ACOMP/2010/ 106 de la Generalitat Valenciana


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P1.22A QUANTITATIVE ANALYSIS OF THE EFFECT OF NUCLEOTIDES AND THE M DOMAIN ON THE ASSOCIATION EQUILIBRIUM OF CLPB

Urko del Castillo1, Carlos Alfonso2, Sergio P. Acebrón1, Ariadna Martos2, Fernando Moro1, Germán Rivas2 and Arturo Muga1

1 Unidad de Biofísica (Consejo Superior de Investigaciones Científicas/Universidad del País Vasco-Euskal Herriko Unibertsitatea) and Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, Bilbao 48080, Spain.2 Centro de Investigaciones Biológicas (Consejo Superior de Investigaciones Científicas), Ramiro de Maeztu 9, Madrid 28040, Spain.

ClpB is a hexameric molecular chaperone that, together with the DnaK system, has the ability to disaggregate stress-denatured proteins. The hexamer is a highly dynamic complex, able to reshuffle subunits. To further characterize the biological implications of ClpB oligomerization state, the association equilibrium of the wt protein and of two deletion mutants, which lack part or the whole M domain, was quantitatively analyzed under different experimental conditions, using several biophysical (analytical ultracentrifugation, composition-gradient (CG) static light scattering and circular dichroism) and biochemical (ATPase and chaperone activity) methods. We have found that i) ClpB self-associates from monomers to form hexamers and higher-order oligomers that have been tentatively assigned to dodecamers; ii) oligomer dissociation is not accompanied by modifications of the protein secondary structure; iii) the M domain is engaged in intersubunit interactions that stabilize the protein hexamer; and iv) the nucleotide-induced rearrangement of ClpB affects to the protein oligomeric core, in addition to the proposed radial extension of the M domain. The difference in the stability of the ATP- and ADP-bound states (ΔΔG (ATP-ADP) = -10 kJ/mol) might explain how nucleotide exchange promotes the conformational change of the protein particle that drives its functional cycle.Supported by the Ministerio de Educación y Ciencia (Grants BFU2007-64452 and BIO2008-04478-C03-03 to A.M. and G.R.), and The Gobierno Vasco (Grant IT-358-07). U. del C. and A. M. are recipients of fellowships from Ministerio de Educación y Ciencia, and S.P.A. was a

fellow of the Gobierno Vasco. F.M. is supported by a Ramón y Cajal contract.


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P1.23POLIELECTROLITOS CATIÓNICOS CAPACES DE INHIBIR LA ADSORCIÓN SUPERFICIAL DE PROTEÍNAS SIN AFECTAR A SU ESTRUCTURA O FUNCIONALIDAD

Miriam López1 y Javier Gómez1

1 Instituto de Biología Molecular y Celular. Universidad Miguel Hernández. Avda. de la Universidad s/s. 03202 – Elche.

La adsorción superficial de proteínas y otras macromoléculas biológicas es un fenómeno que se produce de forma espontánea siendo su intensidad y consecuencias fuertemente dependiente tanto de las propiedades fisicoquímicas de la proteína y de la propia superficie como de las condiciones ambientales tales como el pH de la disolución, su temperatura o su fuerza iónica. En ocasiones los procesos de adsorción aumentan la inestabilidad conformacional de las proteínas involucradas, lo que puede traducirse en su mayor propensión a su digestión proteolítica o la estabilización de estados conformacionales parcialmente plegados con alta tendencia a la agregación. En particular, la interacción de un buen número de proteínas con superficies de sílice es bien conocida así como la utilización de estrategias dirigidas a reducir su efecto, mayoritariamente basadas en el aumento de la fuerza iónica de la disolución o la adición de polímeros neutros como el polietilenglicol o el polivinilalcohol. Las superficies de sílice presentan una carga neta negativa a pHs superiores a 2 - 3 (debido a la presencia de grupos SiO-), observándose un aumento de su densidad de carga superficial con el pH de la disolución. El presente trabajo plantea la posibilidad de inhibir la adhesión proteica a superficies de sílice mediante la utilización de polielectrolitos catiónicos que compitan con la proteína por las cargas superficiales del adsorbente. Los estudios han testado la efectividad en la inhibición de la adsorción proteica tanto de poliaminas (polyalilamina, de peso molecular 16 y 56 kD) como de polielectrolitos conteniendo grupos amonio (polidialildimetilamonio, de peso molecular 100 y 500 kD). En ambos casos, se ha demostrado que la tendencia de los polielectrolitos a adherirse a las superficies de sílice es muy superior a la mostradas por las proteínas estudiadas (lisozima y tripsina), aunque en el caso de la poliallilamina este efecto sufre un importante declive a medida que el pH de la disolución se acerca al punto isoeléctrico del polímero (pKa ~8,8). La inhibición completa de la adsorción proteica a la superficie de sílice es fuertemente dependiente del pH de la disolución (o mejor, de su diferencia respecto del punto isoeléctrico de la proteína) aunque requiere de concentraciones de polielectrolito mucho menores que las necesarias para que polímeros neutros consigan el mismo efecto. Aunque estos resultados demuestran que los polielectrolitos catiónicos estudiados pudieran servir para inhibir la adsorción de las proteínas a las superficies de vidrio, resulta necesario conocer el efecto de estos mismos polímeros tanto en la estabilidad conformacional de las proteínas como en su actividad enzimática. Para tal fin, se ha realizado un estudio sistemático del efecto de estos policationes sobre la estructura secundaria y terciaria de dos proteínas modelo (lisozima y tripsina) mediante las técnicas de dicroísmo circular y fluorescencia en estado estacionario, no observándose diferencias espectrales inducidas por la presencia del polielectrolito. Además, la presencia de estos polielectrolitos no parece tener un efecto significativo en la estabilidad conformacional o térmica de ambas proteínas (estudiadas mediante dicroísmo circular, fluorescencia y calorimetría diferencial de barrido). Por su parte, la actividad esterasa de la tripsina resulta ser invariante con la presencia / ausencia de estos polielectrolitos, mientras que la lisozima resulta sufrir un significativo aumento en su actividad hidrolítica de la pared bacteriana, que puede llegar a ser de alrededor de un 20 %. Finalmente, se observa que la presencia de estos polielectrolitos en disolución ofrece una importante protección frente a la agregación que acompaña al desplegamiento térmico de las proteínas.


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P124INHIBICIÓN DE LA AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS CON POLIELECTROLITOS DE ALTA DENSIDAD DE CARGA

Miriam López1 y Javier Gómez1

1 Instituto de Biología Molecular y Celular. Universidad Miguel Hernández. Avda. de la Universidad s/s. 03202 – Elche.

La agregación incontrolada de proteínas es, probablemente, la manifestación más común y problemática de la inestabilidad conformacional de estas macromoléculas biológicas que se manifiesta, además, en prácticamente todas las etapas que llevan a la producción, purificación, almacenamiento y utilización de proteínas. El presente trabajo pone las bases para el desarrollo de estrategias de inhibición de la agregación de proteínas mediante el aumento de la repulsión electrostática derivada de la formación de complejos solubles entre la proteína y polielectrolitos de alta densidad de carga. La solubilidad de una proteína aumenta a medida que el pH de la disolución se aleja de su punto isoeléctrico (pI), debido al aumento en la repulsión electrostática entre las moléculas de proteína a medida que la carga global de la proteína aumenta. De forma análoga, la unión de las moléculas de proteína y las de polielectrolitos (tanto catiónicos –poliaminas- como aniónicos –polisulfonatos-) aumenta la carga global de los complejos formados y, como consecuencia, la repulsión electrostática entre éstos. Cuando una proteína, poblando mayoritariamente un determinado estado conformacional con alta tendencia a agregar, se une a un polímero catiónico o aniónico de alta densidad de carga, la repulsión electrostática entre los complejos compite eficazmente con la atracción (mayoritariamente hidrofóbica) responsable de la agregación. El resultado final depende de un delicado balance entre ambas interacciones llevando, en condiciones favorables, a la inhibición de la agregación proteica. La naturaleza inespecífica, fundamentalmente electrostática, de la interacción entre proteínas y polielectrolitos, hace que las consecuencias tanto estructurales como funcionales de la formación de complejos entre proteínas y polielectrolitos no sean inmediatamente predecibles, siendo fuertemente dependientes de las propiedades fisicoquímicas de la proteína y el polielectrolito individual. Mientras que en algunos casos la formación de complejos provoca la formación de coacervados y la correspondiente separación de fases, especialmente a altas concentraciones (lisozima – polisulfonatos a pH < pI, BSA – polidialildimetilamonio a pH > pI) en otros los complejos resultan ser solubles incluso a concentraciones relativamente altas (> 1 mg/mL) como es el caso de los complejos formados por polisulfonatos con Rnase A, β-lactoglobulina, catalasa, β-tripsina, etc., o los establecidos entre poliaminas y polímeros conteniendo grupos amonio (polidialilamonio) con proteínas tales como lisozima, catalase, Rnase A, β-tripsina, BSA, etc. La formación de los complejos entre estos polielectrolitos y el estado nativo de las proteínas correspondientes no supone, en la mayoría de los casos, un cambio en la estructura secundaria o terciaria de la proteína (como se desprende de los resultados obtenidos de los estudios de dicroísmo circular y fluorescencia). La dependencia de la temperatura de desnaturalización de muchas de estas proteínas con la concentración de polielectrolito es consecuente con la unión del polielectrolito tanto al estado nativo de la proteína como al estado desnaturalizado (parcial o totalmente desplegado). Esto último ha sido demostrado experimentalmente mediante los estudios de calorimetría isoterma de titulación en condiciones nativas y desnaturalizantes (8 – 10 M de urea), observándose una afinidad similar del polielectrolito por cada uno de los dos estados conformaciones. La formación del complejo reduce de forma drástica la tendencia a agregar del estado desnaturalizado, lo cual corrobora la premisa sobre la que se base este estudio acerca del papel de la repulsión electrostática en el proceso global. Finalmente, debido a la diversidad existente en la arquitectura y composición del centro activo de las distintas proteínas analizadas, mientras que la unión del polielectrolito no tiene efecto significativo en la actividad enzimática de algunas proteínas (como en el caso de la catalasa), en otros casos el polielectrolito resulta ser un efectivo inhibidor competitivo del enzima (como lo son los polisulfonatos para la Rnase A), existiendo otras situaciones en las que la formación del complejo tiene un efecto potenciador en la actividad enzimática de la proteína (lisozima).


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P1.25INORGANIC SALT EFFECTS ON THE STABILITY OF THE ACTIVE AND INACTIVE CONFORMATIONS OF THE G-PROTEIN COUPLED RECEPTOR RHODOPSIN

Arfaxad Reyes-Alcaraz1, Marlet Martínez-Archundia1, Pere Garriga1

1 Departament d’Enginyeria Química, Centre de Biotecnologia Molecular, Universitat Politècnica de Catalunya, Terrassa, Spain

Membrane protein stability is a key parameter with very important physiological and biotechnological implications [1]. Inorganic salts affect protein stability but the mechanism of their interactions with membrane proteins is far from being understood. In order to deepen our knowledge on the structural basis of membrane protein stability, we have undertaken the study of a prototypical G protein-coupled receptor (GPCR), the α-helical membrane protein rhodopsin from the vertebrate retina, and explored in detail the effects of different inorganic salt concentrations on its thermal stability. We find that certain salts, like NaCl, significantly increase the stability of rhodopsin by means of an increase in the activation enthalpy change (Δ‡Ho) for thermal bleaching. Furthermore, the melting temperature determined from circular dichroism is increased under these conditions and this effect is confirmed by means of differential scanning calorimetry. Chromophore regeneration kinetics is slower in the presence of NaCl, whereas acid denaturation, in samples containing sodium chloride, ammonium chloride or potassium chloride, clearly affects the formation of a denatured loose bundle state for both the active and inactive conformations of the receptor. Our observed stabilizing effect on rhodopsin could be reflecting that the added salts are indirectly favouring hydrophobic interactions at the rhodopsin transmembrane core. Our results differ with those from a previous study in which the inactive dark conformation of rhodopsin was shown to have lower thermal stability in the presence of high NaCl concentration [2]. In addition, we also find that certain salts cause a destabilizing effect on rhodopsin, stressing the idea of a complex mechanism, underlying membrane protein stability, which presumably involves a role for the anion of the studied salt. These findings suggest that salts are not only involved as modulators of membrane protein stability but could also have relevant importance during the folding of these proteins as well as for potential nanobiotechnological applications. In summary, we find that that some inorganic salts clearly enhance the thermal stability of rhodopsin and that this effect is proportional to its concentration. Specifically, high NaCl concentrations seem to increase the favourable molecular interactions that stabilize the native structure of this GPCR. Furthermore, chromophore regeneration kinetics suggests that the role of salts, particularly of NaCl, on the stability of ground-state dark inactive rhodopsin, and the effects induced by the salt on the aqueous environment, may be closely related.

[1] Reyes-Alcaraz, A., Tzanov, T. and Garriga P. (2008) Stabilization of membrane proteins: the case of G-protein-coupled receptors. Eng. Life Sci. 8, 207-217.[2] Voegel, R. and Siebert, F. (2002) Conformation and stability of α-helical membrane proteins. 2. Influence of pH and salts on stability and unfolding of rhodopsin. Biochemistry 41, 3536-3545.


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P1.26MOLTEN GLOBULE STRUCTURE OF APOFLAVODOXIN OF HELICOBACTER PYLORI

Renzo Torreblanca Gonzáles 1, 2; Javier Sancho 1, 2

1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular, Facultad de Ciencias, Universidad de Zaragoza. Pedro Cerbuna 12, Zaragoza 50009, España. 2 Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos, Universidad de Zaragoza, Mariano Esquillor s/n - Edificio I + D, 50018 Zaragoza, España.

Apoflavodoxin, Flavodoxin lacking the FMN cofactor, is a natural intermediate in biosynthesis of Flavodoxin, and has some structural features in common with the cofactor-containing native state. Unfolding studies of apoflavodoxin have identified a molten globule intermediate at acid pH [2] whose structure is unknown. We have used the Ф-analysis technique [3] to determine a low-resolution three-dimensional structure of this non native intermediate [1]. We have designed tens of mutants, substituting single amino acid residues in the native protein that will broken interactions between secondary structural elements. The mutants have been expressed and analyzed. The dramatic changes in tryptophan emission upon urea denaturation at neutral and acidic pH allow us to determine Ф values to derive a low-resolution structure of the molten globule. The structure shows some tertiary native interactions (some of them weakened) contributing to the packing of α-helices.

[1]. Campos, L., M. Bueno, J. López-Llano, M. Jiménez & J. Sancho (2004). J Mol Biol, 344, 239-55.[2]. Cremades, N., M. Bueno, J. Neira, A. Velázquez-Campoy & J. Sancho (2008). J Biol Chem, 283, 2883-95.[3]. Fersht, A., A. Matouschek & L. Serrano (1992). J Mol Biol, 224, 771-82.


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P2.09CAN BIOACTIVE ALPHA-HYDROXYFATTY ACIDS INDUCE LIPID PHASE SEPARATION?

Francisca Barceló1, Jesús Prades1, Manuel Gómez-Florit1, Bernat Mestres1, Regina Alemany1, Oliver Vögler1

1 Clinical and Translational Research group. University of Balearic Islands. E-07122 Palma de Mallorca, Spain

Raft-based membrane heterogeneity in living cells has been associated to dynamic domain structures involved in regulating membrane-associated processes, among them signal transduction, that participate in the control and modulation of important physiological functions [1]. The functional significance of lipid domain structures has led to studies on the characterization of lipid-lipid and lipid-protein interactions that promote domain lipid segregation. In model membranes, experiments with binary and ternary lipid mixtures, combining Cholesterol (Cho) and saturated and unsaturated phospholipids, have shown a coexistence of Cho-enriched liquid ordered (lo) and Cho-depleted liquid-disordered (ld) phases [2]. The static structure and phase behaviour of liquid immiscible phases has been well characterised, but few studies have analysed the effect of membrane intercalating compounds on these lipid mixtures. The fatty acid 2-hydroxyoleic acid (2OHOA) is a synthetic molecule with hypotensive properties. We demonstrated that short-term administration of 2OHOA decreased blood pressure in animal models by modulating G-protein-mediated cellular signalling, suggesting a role for 2OHOA in signal transduction [3]. The exact molecular mechanism of 2OHOA that underlies these effects is unknown. However, if the membrane structure is involved in cell signalling processes, then structural alterations of the lipid bilayer might regulate the biomembrane properties influencing pathological situations. This hypothesis is consistent with the fact that 2OHOA affect the structural properties of biological and model membranes. Our study addresses the question whether 2OHOA can affect membrane architecture in Cho rich domains and if so how? For this purpose, simple model systems containing Cho and different lipid compositions with gel/fluid and liquid/liquid phases were studied by X-ray diffraction and DSC analysis. Data presented indicate that the interaction of 2OHOA with sphingomyelin solubilises Cho in membranes with model lipid raft composition.

[1] Lingwood D. and Simons K. (2010) Science 46-50.[2] Quinn P.J. and Wolf C. (2010) FEBS Journal 277, 4685-4698. [3] Alemany R., Terés S., Baamonde C., Benet M., Vögler O. and Escribá P.V. (2004) Hypertension 43, 249-254.


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P2.10COMPLEJOS LIPOSOMA-PÉPTIDO COMO VACUNAS: ANÁLISIS DE LAS RESPUESTAS INMUNES INDUCIDAS POR UN PÉPTIDO DERIVADO DEL DOMINIO MPER DE VIH INSERTO EN MEMBRANA.

Aitziber Araujo1, Nerea Huarte1, José L Nieva1.1 Unidad de Biofísica (CSIC-UPV/EHU) y Departamento de Bioquímica, Universidad del País Vasco, Aptdo. 644, 48080 Bilbao, Spain.

El dominio MPER de la proteína de membrana gp41 del VIH contiene los epítopos reconocidos por los anticuerpos neutralizantes de amplio espectro 2F5 y 4E10. Se postula que la presencia de anticuerpos anti-MPER antes del contagio podría prevenir la infección. Por tanto, sería deseable que una potencial vacuna profiláctica contara entre sus componentes con inmunógenos dirigidos contra ese dominio. MPER se asocia de forma espontánea a las membranas, y, en consecuencia, las propiedades específicas de la membrana también determinarán la inmunogenicidad de vacunas liposoma-péptido basadas en este dominio. En concreto, nuestros estudios se encaminan a dilucidar el efecto de las propiedades estructurales y materiales de las bicapas, es decir, grosor, curvatura intrínseca y resistencia a la deformación por torsión o compresión, sobre la inmunogenicidad de 2F5preTM, un péptido que combina los epítopos 2F5 y 4E10. Los datos previos sugieren la posibilidad de generar respuestas anti-2F5 con este sistema.


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P2.11MEMBRANE FLUIDITY AS A MATTER OF FLOW

Gabriel Espinosa1, Iván López-Montero2, Dominique Langevin2 and Francisco Monroy1,2

1Laboratoire de Physique des Solides, Université Paris Sud XI, 91405 Orsay, France2 Mechanics of Biological Membranes and Biorheology, Universidad Complutense, Ciudad Universitaria s/n, E28040 Madrid, Spain.

The concept of membrane fluidity usually refers to a high molecular mobility inside the lipid bilayer which enables lateral diffusion of embedded proteins. Fluids have the ability to flow under an applied shear stress while solids resist shear deformations. Biological membranes require both properties for their function: high lateral fluidity and structural rigidity. Consequently, an adequate account must include, in addition to viscosity, the possibility for a non-zero shear modulus. This knowledge is still lacking as measurements of membrane shear properties have remained incomplete so far. In the present communication we describe recent results on the surface shear rheology study of different lipid monolayers that model distinct biologically relevant situations [1]. The results evidence a large variety of mechanical behavior under lateral shear flow.

[1]G. Espinosa, I. López-Montero, F. Monroy and D. Langevin, Proceedings of the National Academy of Sciences, DOI/10.1073/pnas.1018572108


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P2.12DISTINCT MECHANISMS OF LIPID BILAYER PERTURBATION INDUCED BY PEPTIDES DERIVED FROM THE MEMBRANE-PROXIMAL EXTERNAL REGION OF HIV-1 GP41

Beatriz Apellaniz1, Shlomo Nir2, Ana J. García-Sáez3 and Jose L. Nieva1.1 Unidad de Biofísica, Consejo Superior de Investigaciones Científicas/Universidad del País Vasco and Departamento de Bioquıímica, Universidad del País Vasco, Bilbao, Spain.2 Seagram Center for Soil and Water Sciences, Faculty of Agricultural, Food and Environmental Quality Sciences, The Hebrew University of Jerusalem, Rehovot 76100, Israel.3 Max Planck Institute for Metals Research and German Cancer Research Center, BioQuant, Heidelberg, Germany.

The conserved, membrane-proximal external region (MPER) of the human immunodeficiency virus type-1 envelope glycoprotein 41 subunit is required for fusogenic activity. It has been proposed that MPER functions by disrupting the virion membrane. Supporting its critical role in viral entry as a membrane bound entity, MPER constitutes the target for broadly neutralizing antibodies that have evolved mechanisms to recognize membrane-inserted epitopes. We have analyzed here the molecular mechanisms of membrane permeabilization induced by N-preTM and PreTM-C, two peptides derived from MPER sequences showing a tendency to associate with the bilayer interface or to transfer into the hydrocarbon core, respectively. Both peptides contained the full epitope sequence recognized by the 4E10 monoclonal antibody (MAb4E10), which was subsequently used to probe peptide accessibility from the water phase. Capacities of N-preTM and PreTM-C for associating with vesicles and inducing their permeabilization were comparable. However, MAb4E10 specifically blocked the permeabilization induced by N-preTM but did not appreciably affect that induced by PreTM-C. Supporting the existence of different membrane-bound lytic structures, N-preTM was running as a monomer on SDS-PAGE and induced the graded release of vesicular contents, whereas PreTM-C migrated on SDS-PAGE as dimers and permeabilized vesicles following an all-or-none mechanism, reminiscent of that underlying melittin-induced membrane lysis. These results support the functional segmentation of gp41 membrane regions into hydrophobic subdomains, which might expose neutralizing epitopes and induce membrane-disrupting effects following distinct patterns during the fusion cascade.


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P2.13EFECTO DE LA COEXISTENCIA DE FASES SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA FRAGACEATOXINA C EN MEMBRANAS

Koldo Morante1,2, Augusto Bellomio1,2,+, Jesus Sot1,2, David Gil-Cartón3, Mikel Valle2,3 y Juan Manuel González-Mañas1,2

1 Unidad de Biofísica (UPV/EHU-CSIC), P. O. Box 644, E-48080 Bilbao, España.2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencia y Tecnología,Universidad del País Vasco, P. O. Box 644, E-48080 Bilbao, España. 3Unidad de Biología Estructural, Centro de Investigación Cooperativa en Biociencias, 48160 Derio, España. +Dirección actual: Departamento de Bioquímica de la Nutrición, Instituto Superior de Investigaciones Biológicas, 4000-Tucumán, Argentina.

La fragaceatoxina C (FraC) es una actinoporina capaz de permeabilizar vesículas unilamelares con una composición adecuada [1]. A partir de imagenes de microscopía confocal de muestras de Fra C incubadas con vesículas uniamelares gigantes se ha observado que, en membranas de DOPC:SM:Chol (1:1:1), la inserción de la toxina provoca la desaparición de la fase líquido ordenada. Sin embargo, cuando la membrana carece de colesterol no se observa este fenómeno pero sí se puede apreciar que, con el tiempo, la proteína tiende a acumularse en las zonas de interfase. Por otro lado, a partir de imagenes de microscopía electrónica se ha podido realizar la reconstrucción tridimensional del poro insertado que arroja un valor de 15 Å de diámetro [2]. Con el fin de determinar el tamaño funcional del poro, hemos utilizado sondas fluorescentes hidrosolubles de distinto tamaño y color. De esta manera, se intenta visualizar, en base a los distintos colores, el tamaño límite de las moléculas capaces de acceder al interior de las vesículas permeabilizadas y estimar el tamaño funcional del poro. El valor obtenido está en consonancia con el tamaño observado por microscopía.

[1] Bellomio, A., Morante, K., Barlic, A., Gutierrez-Aguirre, I., Viguera, A.R., and Gonzalez-Manas, J.M. (2009) Toxicon 54, 869–880.[2] Mechaly, A.E., Bellomio, A., Gil-Cartón, D., Morante, K., Valle, M., González-Mañas, J.M., and Guérin, D.M.A. (2011) Structure 19, 181–191.


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P2.14MECHANISM OF VESICLE CONTENTS RELEASE INDUCED BY SPHINGOSINE AND THE EFFECT OF NEGATIVELY CHARGED BILAYERS

Noemi Jiménez- Rojo1, Jesús Sot1, Ana R. Viguera1, Félix M. Goñi1, Alicia Alonso1

1 Unidad de Biofísica (CSIC-UPV/EHU) and Departamento de Bioquímica, Universidad del País Vasco, Barrio Sarriena s/n, 48940 Leioa, Spain

Sphingosine [(2S, 3R, 4E)-2-amino-4-octadecen-1, 3-diol] is the most common sphingoid long chain base in sphingolipids. It is the precursor of important cell signaling molecules, such as ceramides. In the last decade it has been shown to act as a potent metabolic signaling molecule, by activating a number of protein kinases. Moreover, sphingosine has been found to permeabilize phospholipid bilayers, giving rise to vesicle leakage. The present contribution intends to analyze the mechanism by which this bioactive lipid induces vesicle contents release, and the effect of negatively charged bilayers. Fluorescence lifetime measurements and confocal fluorescence microscopy has been applied to observe the mechanism of leakage of sphingosine in large and giant unilamellar vesicles (LUV, GUV). Additionally, stopped-flow kinetics have been used to study the rate of vesicle permeabilization. Since at the physiological pH sphingosine has a net positive charge, its interaction with negatively charged phospholipids (e.g. in bilayers containing phosphatidic acid together with phosphatidylethanolamine and cholesterol) gives rise to a faster release of vesicular contents, than with electrically neutral bilayers.


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P2.15ACTIVE MEMBRANES WITH BOUND F-ACTIN

Silvia Isanta1, Gabriel Espinosa2, Ruddi Rodríguez-García1, Paolo Natale2, Ivan López-Montero1, Dominique Langevin3 and Francisco Monroy*1,2

1 Mechanics of Biological Membranes and Biorheology, Universidad Complutense, 28040 Madrid, Spain e-mail: [email protected] Laboratoire de Physique des Solides, Universite Paris Sud XI, Batiment 510, F91405 Orsay, France3 Centro Nacional de Biotecnologia, CSIC, Campus de Cantoblanco, e-28049 Madrid, Spain

In living cells, the presence of a cytoskeleton cortex based on a mesh of fibrilar proteins, like actin, impinges new mechanical features to the membrane [1]. The polymerization activity of actin fibrils under ATP consumption is efficiently exploited to exert directed forces on the membrane structures where filaments are attached. In addition to the structural impact (essential for the maintenance of cell shape and cell junctions), out-of-equilibrium actin motions must affect special membrane activity features [2, 3]. In this contribution we will present an experimental study on the compression and shear rheology of lipid monolayers where filamentous actin is attached to the lipid-water interfaces [4]. We have investigated two different binding scenarios for the direct coupling of actin to lipid membranes anchors: pure electrostatic through cationic lipids and electrostatic combined with covalent anchoring through functional succinimide groups. At protein concentration below the critical value for filament entangling, the membrane remains fluid (G’≈ 0) independently of the nature of the binding element. In compression, membrane stiffening is observed upon actin binding, as expected from the high intrinsic rigidity of the filaments. However, surface viscosities behave dissimilar in each binding scenario. No impact is detected in the electrostatic case, but a significant decrease is observed when actin is covalently attached to the membrane. This fluidification can be only understood as a dynamical consequence of actin activity.

[1] B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts and P. Walter, Molecular Biology of the Cell, Garland, 4th edn, 2002.[2] A. Renault, P. Lenne, C. Zakri, A. Aradian, C. V_enien-Bryan and F. Amblard, Biophys. J.,1999, 76, 1580.[3] B. Dem_e, D. Hess, M. Tristl, L. Lee and E. Sackmann, Eur. Phys. J. E: Soft Matter Biol. Phys., 2000, 2, 125.[4] S.Isanta, G. Espinosa, R. Rodríguez-García, P. Natale, I. López-Montero, D. Langevin and F. Monroy. Soft Matter, 2011, DOI: 10.1039/c0sm00880j.


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P2.16SCRAMBLASE ACTIVITY MODULATION BY THE LIPID ENVIRONMENT ARCHITECTURE

Itziar D. Martínez, Alicia Alonso, Félix M. GoñiUnidad de Biofísica (CSIC- UPV/EHU), Bilbao, Spain

Human PhosphoLipid SCRamblase 1 (hPLSCR1) is a type II endofacial membrane protein involved in transbilayer phospholipid scrambling. hPLSCR1 is widely expressed in most human tissues and remains inactive under normal conditions. The increase in cytosolic calcium (1000-fold the basal level) in response to cell injury, coagulation, cell activation or apoptosis, activates the protein. This activation induces a rapid transbilayer movement of PE and PS from the inner to the outer membrane leaflet destroying the bilayer asymmetry [1]. When hPLSCR1 is multipalmitoylated, it partitions with flotillin-1 and EGFR into lipid rafts [2].

Previous studies have shown the importance of the lipid environment for the protein activity. Long-chain ceramides, biological lipid second messengers able to promote spontaneous transbilayer diffusion [3] could be able to inhibit the scramblase activity by modulating the physical properties of the membrane. The formation of non-lamellar structures by this sphingolipid would prevent calcium binding or conformational change of the scramblase. Moreover, the products of PLA2 activity in the membrane could somehow enhance protein flip-flop activity.

In this study, we are trying to elucidate the precise effect of the lipid composition on this versatile protein activity, when asymmetrically inserted in one of the layers in model membranes.

[1] Zhou Q, Zhao J, Stout JG, Luhm RA, Wiedmer T, Sims PJ (1997) J. Mol. Biol. 272(29):18240-4[2] Sun J, Zhao Q, Schwartz MA; Wang JY, Wiedmer T, Sims PJ (2001) J. Biol. Chem. 276(31):28984-90[3] Contreras FX, Villar AV, Alonso A, Goñi FM (2009) Methods Mol. Biol. 462: 155-65


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P2.17CD AND DSC STUDIES ON THE STABILITY OF THE PROPEPTIDE NH2-TERMINAL OF PULMONARY SURFACTANT PROTEIN SP-B (SP-BN).

Ángeles Bañares-Hidalgo1, Jesús Pérez-Gil1, Pilar Estrada11 Department of Bioquímica y Biología Molecular I. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Complutense de Madrid

Pulmonary surfactant is a complex mixture of lipids and proteins, synthesized and secreted by type II pneumocytes into the alveolar spaces, where it prevents collapse at expiration. Surfactant contains two hydrophobic proteins, SP-B and SP-C, but only SP-B is strictly necessary for the biophysical function of the complex. This protein is produced as a longer precursor that suffers a proteolytic processing along the pathway that ends assembling the active physiological form of SP-B into surfactant membranes. The NH2-terminal propeptide (SP-BN) of proSP-B is essential to ensure its proper targeting and maturation [1]. This SP-BN domain contains two saposin-like modules, which confer to the protein a large stability against thermal denaturation and cleavage by proteases. We have produced a recombinant form of the human sequence of SP-BN in Escherichia coli, as a fusion protein with the Maltose Binding Protein, from which it is later cleaved and purified [2]. Studies using Circular Dichroism and Differential Scanning Calorimetry of the protein at different ionic strengths were made to characterize the stability of the folding of SP-BN with temperature. The SP-BN propeptide maintains most of its α-helical secondary structure upon heating up to 85 ºC, both at physiological (150 mM NaCl) and higher ionic strength (500 mM NaCl). Upon cooling, the partial unfolding of the protein reverts, and around 90 % of the original structure is recovered at both ionic strengths. Monitorization of the ellipticity of SP-BN at 208 nm ([θ]208) with increasing temperature reveals one single transition at 69 ºC in 150 mM NaCl. However, at 500 mM NaCl, [θ]208 of the propeptide follows three transitions at 47, 63 and 75 ºC. These transitions could be related to the dissociation of SP-BN oligomers and/or to changes in the secondary structure of other protein segments different than the saposin-like ones. In DSC experiments, and at physiological ionic strength, the unfolding of the propeptide present two calorimetric peaks. The first of all, at a transition temperature of 74 ºC, could correspond to the denaturation or the dissociation of the oligomer, being the second peak, with a higher transition temperature (114 ºC) the one likely representing the monomer denaturation. After subsequent consecutive scans, the first peak is maintained but shifted to lower transition temperatures. Meanwhile, the second peak disappears. On the other hand, when the ionic strength is higher, the two peaks are maintained after several scans.

[1] Lin S., Phillips K.S., Wilder M.R., Weaver T.E. (1996) Biochim. Biophys. Acta. 1312, 177-185. [2] Palacios A., González B., Alonso S., Pérez-Gil J., Estrada P. (2006) Enzyme Microb. Technol. 40, 85-92.


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P2.18EFFECT OF HYALURONAN ON PULMONARY SURFACTANT FUNCTION AND STRUCTURE

Elena Lopez-Rodríguez1, Antonio Cruz1, Ralf Richter2, H. William Taeusch3, Jesús Pérez-Gil11 Departament of Biochemistry and Molecular Biology, UCM2 Biosurfaces unit, CIC BiomaGUNE3 Department of Paediatrics, UCSF

Pulmonary surfactant is a complex mixture of lipids and proteins lining the alveolar air-water interface. By lowering the surface tension at the respiratory interface, pulmonary surfactant stabilizes the respiratory epithelium against physical forces tending to collapse. Dysfunction of surfactant in the lungs is associated with respiratory pathologies such as acute respiratory distress syndrome (ARDS) or meconium aspiration syndrome (MAS), where naturally occurring inhibitory agents, such as serum, meconium or cholesterol, reach the lung. We have observed significant differences in the interfacial performance of surfactant preparations in the presence or absence of inhibitory agents in a captive bubble surfactometer (CBS), which determine the importance of surfactant composition and structure on its susceptibility to inactivation. Using this model, we have confirmed the higher resistance to inhibition of preparations combining pulmonary surfactant and polymers such as hyaluronan and the potential use of these additives to design new therapeutic surfactant preparations. In the present study we have analyzed the effect of hyaluronan on the structure and surface behaviour of pulmonary surfactant in order to describe the possible mechanism for reactivation. We have observed significant effects in structural properties such as aggregation of surfactant membranes, or the size, distribution and packing of phase segregated lipid domains, when hyaluronan is present in the bulk phase. Surprisingly, we have detected no apparent direct interaction between surfactant complexes and hyaluronan even though we have observed a 100% of transfer of surfactant complexes into the interface only in the presence of this polymer. We propose that entropy-mediated changes in surfactant structure driven by hyaluronan may enhance surfactant function and thus resistance to inactivation.


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P2.19COMPOSITIONALLY HETEROGENEOUS LAMELLAR GEL (Lß) PHASES IN MODEL MEMBRANES

Jon V. Busto1, Aritz García-Arribas1, Jesús Sot1, Félix Mª Goñ1, Alicia Alonso1

1 Unidad de Biofísica (Centro Mixto CSIC-UPV/EHU), and Departamento de Bioquímica, Universidad del País Vasco (UPV/EHU)

Model lipid membranes containing saturated phospholipids, palmitoyl ceramide (pCer) and cholesterol have been characterized. Based on differential scanning calorimetry (DSC), confocal microscopy and atomic force microscopy (AFM), the presence of stable lamellar gel (Lβ) phases of ternary lipid mixtures has been observed. The mixtures exhibit gel (Lβ) – fluid (Lα) phase transitions in the 55-65 ºC range as observed by DSC of multilamellar vesicles, and give rise to stable micron-sized giant unilamellar vesicles (GUVs). The ternary phases are observed near the phospholipid: (ceramide + cholesterol) (1:1) lipid ratio and they are independent of the presence of dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC) or palmitoyl sphingomyelin (pSM). These phases are partially stabilized by direct hydrogen bonding between ceramide and cholesterol. However, the ternary lamellar gel phase is completely destabilized upon cholesterol substitution by 5-cholesten-3-one. Likewise, pCer substitution by dipalmitoyl glycerol (DPG) has a similar effect in the membrane, preventing the formation of the ternary phase. Moreover, as observed by force spectroscopy studies on supported planar bilayers, the compositionally heterogeneous gel phases present intermediate properties between those of the pure DPPC and/or pSM lamellar gel (Lß) and the pCer-rich gel-like phases in phospholipid:pCer mixtures. The present data becomes significant in the context of sphingolipid signaling and membrane platform formation, and especially in the ceramide- and/or cholesterol-mediated lipid displacement proposed within raft-like structures.


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P2.20DETECTION AND CHARACTERIZATION OF NATIVE PROTEIN COMPLEXES OF PULMONARY SURFACTANT SOLUBILISED WITH DETERGENTS

Bárbara Olmeda (1), Begoña García Álvarez (1), Manuel J. Gómez Rodríguez (2), Antonio Cruz, Jesús Pérez Gil (1). 1 Dpto. Bioquímica y Biología Molecular I, Fac. Biología, Universidad Complutense de Madrid, 28040, Madrid, SPAIN. 1,2 Centro de Astrobiología, INTA-CSIC, 28850, Madrid, SPAIN

Pulmonary surfactant is a specialized lipid-protein complex, which essential function is to stabilize the gas exchange surface of the respiratory epithelium against physical forces tending to its collapse. Hydrophobic surfactant proteins SP-B and SP-C are critical to promote very rapid adsorption of phospholipids into the interface and to stabilize the surface active film along the compression-expansion respiratory cycles. The mature SP-B is a homodimeric protein of approximately 18kDa (two 79 amino-acid polypeptides), while SP-C is an apparently monomeric lipopeptide of 35 residues (3.7kDa).To date, the classic method to extract and purify these proteins from the surfactant membranes has involved the use of organic solvents. This method can disrupt the native protein complexes. We have optimized the purification of surfactant membranes proteins through the use of the zwitterionic detergent CHAPS. Different fractions have been separated from the solubilised material by gradient ultracentrifugation and exclusion-size chromatography, showing the presence of two types of protein complexes in terms of size and density, heterogeneously composed of different oligomeric states of surfactant proteins.An ionic-exchange chromatography was also performed with the solubilised surfactant, yielding cationic complexes consisting mainly of SP-B. Their structural characterization by circular dichroism and fluorescence emission spectroscopies revealed a structure similar to SP-B purified in organic solvents. We also observed the presence of oligomers by blue-native electrophoresis, analytical centrifugation and electron microscopy. Images obtained by electron microscopy reveals that SP-B forms oligomers with a defined size and shape, and shows a double superposed annular structure. Preliminary results show that each ring is composed by 5 or 6 subunits around a central pore. The functional competence of these SP-B complexes have been also characterized in a captive bubble surfactometer (CBS), showing a surface active behaviour similar to SP-B purified using the classic organic solvent-based method.


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P2.21APPLICATION OF THE FLUORESCENT PROBE LAURDAN FOR THE STUDY OF PHOSPHOLIPID PACKING AND HYDRATION IN PULMONARY SURFACTANT MEMBRANES AND LAMELLAR BODY-LIKE PARTICLES

Alejandro Cerrada1, Thomas Haller2 and Jesús Pérez-Gil11 Department of Biochemistry, Faculty of Biology, Complutense University, Madrid, Spain.2 Department of. Physiology, Innsbruck Medical University, Innsbruck, Austria.

Pulmonary surfactant is a lipid-protein complex in charge of reducing surface tension at the air-liquid interface in the alveoli of the lungs and so preventing alveolar collapse at the end of expiration. This essential system is synthesized and secreted to the respiratory surface by alveolar type II cells (AT II cells). Prior to exocytosis, lung surfactant is stored in special organelles of AT II cells called lamellar bodies (LBs). Material secreted from LBs maintains a densely packed structure in the form of lamellar body-like particles (LBPs), which disintegrate in a very cooperative way once they reach the air-liquid interface to form the surface active film. The formation of highly packed films at the respiratory surface is critical to maintain the alveolar architecture. In the present study we have compared the packing and hydration properties of lung surfactant membranes as isolated from porcine bronchoalveolar lavage and of LBPs from rat AT II cell primary cultures taking advantage of the spectral properties of the fluorescent probe LAURDAN (1-[6-(dimethylamino)-2-naphtyl]dodecan-1-one). This probe can be used for monitoring packing and hydration in membrane environments. Fluorescence emission of LAURDAN is blue in ordered, packed and highly dehydrated phases (gel, liquid ordered) while it shifts to green in more hydrated disordered phases (liquid-crystalline, liquid disordered). Generalized polarization function (GPF) calculated from LAURDAN emission quantifies the emission spectral changes and is sensitive to the extent of water dipolar relaxation processes in lipid bilayers. Comparison of the thermotropic profiles of LAURDAN GP in native surfactant and LBPs reveals relevant differences. Native surfactant membranes exhibit a typical broaden phase transition as sensed by the probe, from an ordered (blue emission) to a disordered state (green emission), ending slightly above 37ºC. LAURDAN-doped LBPs exhibit a less pronounced GP change upon the same thermal treatment, indicating the possible existence of additional levels of structural complexity in LBPs that could impose restrictions to temperature-dependent hydration as associated with potential phase transitions in membranes. Experiments exposing LBPs to different agents (urea, proteases) are being carried out to discern the nature of the elements implicated in the maintenance of the packed and dehydrated conformation of LBP membranes. As very little is known about the factors triggering unravelling of LBPs once they reach the alveolar interface, the present results could shed light on this key event in the mechanisms of surfactant action.


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P3.09STUDY OF THE DNA INFUENCE ON BACTERIOPHAGE T7 STRUCTURE BY FORCE SPECTROSCOPY.

M. Hernando-Pérez1, E. Pascual2, J.Gómez-Herrero1 J. L. Carrascosa2, J.R Castón2, P. J. de Pablo1

1 Department of Physics of Condensate Matter, Universidad Autónoma de Madrid, 28049 Madrid, Spain.2 Department of Structure of Macromolecules, Centro Nacional de Biotecnología, CSIC. Campus UAM, 28049 Madrid, Spain.

Bacteriophage T7 belongs to the Podoviridae family and is the genus representative. It contains a 40 kb dsDNA genome and the mature head has icosahedra symmetry, presenting a diameter of 60 nm and a thickness wall of 2.5 nm [1]. By using Atomic Force Microscopy Jumping Mode in buffer conditions we have imaged T7 mature capsids, virions and prohead. The topographies show the protineaceous features of symmetries 5, 3 and 2-fold up to 3.5 nm resolution. Afterwards, we performed nanoindentation experiments to study the mechanical properties of these structures. [2] [3] [4]. Preliminary experiments indicate that virions and prohead present different stiffness than empty capsids. The virion stiffness increase suggests that the DNA play an important role and provokes mechanical and structural reinforcement.

[1] Agirrezabala, X et al. (2007) Structure, 15, 461 [2] Carrasco, C et al. PNAS. (2008). 105.4150 [3] Carrasco. C et al. PNAS. (2007).103, 13706 [4] Ivanoska. I et al..PNAS. (2004) 101, 7600


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P4.09DISTINCT UBIQUITIN BINDING MODES EXHIBITED BY THE SH3 DOMAINS OF CD2AP. MOLECULAR DETERMINANTS AND FUNCTIONAL IMPLICATIONS

Ana I. Azuaga1, Jose L. Ortega-Roldan1, Salvador Casares1, Pedro Luis Mateo Alarcón1, Malene Ringkjobing-Jensen2, Martin Blackledge2, & Nico A.J. van Nuland3,4

1 Departamento de Química Física e Instituto de Biotecnología, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Fuentenueva s/n, 18071 Granada, Spain2 Protein Dynamics and Flexibility by NMR, Institut de Biologie Structurale Jean-Pierre Ebel, CEA, CNRS, UJF UMR 5075, 41 Rue Jules Horowitz, Grenoble 38027, France3 Structural Biology Brussels, Vrije Universiteit Brussel, Pleinlaan 2, 1050 Brussels, Belgium4 Department of Molecular and Cellular Interactions, VIB, Pleinlaan 2, 1050 Brussels, Belgium

SH3 domains form a highly conserved family of protein domains, but their amino acid composition varies at a few key sites, allowing for a wide range of molecular targets. Similar to SH3 domains, ubiquitin-binding domains (UBDs) are found in proteins with different biological function. Structures of many complexes between UBDs and ubiquitin have been determined either by X-ray crystallography or high-resolution NMR [1]. Recently, SH3 domains were identified as a new class of UBDs [2]. Since then, several low- and high-resolution structural studies have raised a significant number of unanswered questions on the determinants of the specificity of the interaction between SH3 domains and ubiquitin. Moreover, several mechanistic differences have been proposed for ubiquitin binding to SH3 domains involved in the immune signalling pathway. A key affinity and specificity determinant has been appointed to Phe409 in Sla1 SH3-3 and the three SH3 domains of CIN85. We previously showed that the third SH3 domain (SH3-C) of CD2 associated protein (CD2AP), which possesses the key phenylalanine residues (Phe324), indeed binds to ubiquitin [3], but in an alternative orientation that does not coincide with the binding surface found for the Sla1 SH3-3 domain or the CIN85 SH3-C domain [4]. In the current work, we have performed structural and mutational analysis of the three SH3 domains of CD2AP and the third SH3 domain of CIN85. We present a RDC-based structural model of the complex between the first SH3 domain of CD2AP and ubiquitin. We show that the first and second SH3 domains of CD2AP binds ubiquitin in a similar orientation that Sla1 SH3-3 and CIN85 SH3-C despite of their high sequence homology with the SH3-C domain of CD2AP. Both structures, in combination with a mutational analysis, have allowed us to decipher the determinants of the SH3-C binding mode to ubiquitin, pointing at the length and charge of the n-Src loop. We have also shown that SH3 domains displaying this different ubiquitin binding mode interact with higher affinity to ubiquitin molecules with extended C-terminus. We propose a different biological role for the interaction mode between the CD2AP SH3-C domain and ubiquitin, where the SH3 domain is able to interact with ubiquitin molecules covalently attached to CD2AP via its C-terminus, blocking this protein for further polyubiquitination as it has been observed previously [5]. We conclude that the CD2AP SH3-C interaction with ubiquitin constitutes a new ubiquitin binding mode involved in a different cellular function, thus changing the previously established mechanism of EGF-dependent CD2AP/CIN85 monoubiquitination.

[1] Hicke, L., Schubert, H.L., and Hill, C.P. (2005). Nat Rev Mol Cell Biol 6, 610-621.[2] Stamenova, S.D., French, M.E., He, Y., Francis, S.A., Kramer, Z.B., and Hicke, L. (2007). Mol Cell 25, 273-284.[3] Ortega-Roldan, J.L., Jensen, M.R., Brutscher, B., Azuaga, A.I., Blackledge, M., and van Nuland, N.A. (2009). Nucleic Acids Research 37, e70.[4] Bezsonova, I., Bruce, M.C., Wiesner, S., Lin, H., Rotin, D., and Forman-Kay, J.D. (2008). Biochemistry 47, 8937-8949.[5] Dikic, I. (2002). FEBS Lett 529, 110-115.


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P4.10LA ESTRUCTURA DE LA REGIÓN DE INTERACCIÓN CON SNX6 Y SEÑAL DE EXPORTACIÓN NUCLEAR DE LA PROTEÍNA BRMS1 REVELA UN HEXÁMERO FORMADO POR COILED COILS ANTIPARALELOS

Mercedes Spínola-Amilibia1, José Rivera2, Miguel Ortiz-Lombardía3, Antonio Romero4, José L. Neira5,6, Jerónimo Bravo1

1 Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Calle Jaime Roig 11, 46010 Valencia Spain.2 Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III, C/ Melchor Fernández Almagro 3, E-28029 Madrid, Spain.3 Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques, UMR6098, CNRS, Universités d’Aix-Marseille I & II, Case 932, 163 Avenue de Luminy, 13288 Marseille cedex 9,France.4 Departamento de Biología Físico-Química, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, Spain.5 Instituto de Biología Molecular y Celular, Universidad Miguel Hernández, Elche, Spain.6 Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos, Zaragoza, Spain.

En el presente estudio, mostramos los primeros datos estructurales de la proteína supresora de metástasis de cáncer de mama 1 (BRMS1), miembro del grupo de supresores de metástasis, que recientemente han cobrado gran interés científico ya que suprimen metástasis sin afectar al crecimiento del tumor primario ([1]). La relevancia de la región localizada en el extremo amino terminal de BRMS1, predicha como motivo de cadenas alfa-hélices enrolladas entre sí en forma de bucle (en inglés motivos “coiled coil”) en interacciones con diversas proteínas relevantes en cáncer ([2, 3]), así como suparticipación en la localización celular ([4]) y en las funciones biológicas de BRMS1, tales como la represión de transcripción ([3]), nos llevó a caracterizar su estructura tridimensional mediante Cristalografía de Rayos-X.

La estructura de la región N-terminal de BRMS1 revela que los residuos 51 a 98 forman un motivo “coiled coil” antiparalelo, y que tiene capacidad de homo-oligomerizar en una conformación hexamérica, mediante la formación de un trímero de dímeros de “coiled coil”. También hemos realizado experimentos hidrodinámicos que apoyan firmemente la prevalencia de esta estructura cuaternaria de BRMS151-98 en solución.

Este trabajo explora las características estructurales de la región amino terminal de BRMS1 para ayudar a esclarecer el papel de dicha región en el contexto de la proteína completa. Los resultados cristalográficos y biofísicos aquí presentados sugieren que la función biológica de BRMS1 puede basarse en su capacidad para promover la agrupación molecular a través del motivo “coiled coil” localizado en su región N-terminal.

[1] Rinker-Schaeffer, C. W., O’Keefe, J. P., Welch, D. R. and Theodorescu, D. (2006). Clin. Cancer Res. 12, 3882-3889.[2] Hurst, D. R., Xie, Y., Vaidya, K. S., Mehta, A., Moore, B. P., Accavitti-Loper, M. A., Samant, R.S., Saxena, R., Silveira, A. C. and Welch, D. R. (2008). J. Biol. Chem. 283, 7438-7444.[3] Rivera, J., Megías, D. and Bravo, J. (2010). J. Cell. Biochem. 111:1464-72.


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P4.11ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE LA BETA-LACTAMASA OXA-24 Y ESTUDIO DE SU INTERACCIÓN CON INHIBIDORES DEL TIPO SULFONAS PENÉMICAS.

Elena Santillana 1, Alejandro Beceiro 2, John D. Buynak 3, Germán Bou 2, Antonio Romero 3

1 Centro de Investigaciones Biológicas (CIB-CSIC), Madrid.2 Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña (INIBIC), Complejo Hospitalario Universitario A Coruña.3 Department of Chemistry, Southern Methodist University, Dallas.

OXA-24 es una β-lactamasa de clase D aislada de una cepa clínica multirresistente de Acinetobacter baumannii y representa a una nueva familia de oxacilinasas que, a diferencia de las oxacilinasas tradicionales, han adquirido la capacidad de degradar antibióticos carbapenémicos. Este grupo de oxacilinasas con actividad carbapenemasa aparece cada vez con más frecuencia en patógenos multirresistentes (Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa) responsables de graves infecciones hospitalarias. Dado que los antibióticos carbapenémicos constituyen uno de los últimos recursos para combatir estas infecciones y que los inhibidores β-lactámicos comerciales resultan ineficaces frente a este tipo de β-lactamasas, resulta cada vez más necesario desarrollar nuevos compuestos que aporten una solución frente a las dificultades terapéuticas que la aparición de estas oxacilinasas con actividad carbapenemasa está originando.La estructura cristalográfica de OXA-24 [1] fue la primera estructura resuelta de este tipo de enzima y permitió establecer las bases moleculares que explicaban la adquisición de la especificidad por antibióticos carbapenémicos. A pesar de que OXA-24 conserva un plegamiento muy similar al de otras oxacilinasas de clase D sin actividad carbepenemasa, el estudio de la estructura permitió identificar que la interacción entre los residuos Tyr 112 y Met 223 genera una barrera hidrofóbica que bloquea parcialmente la entrada al centro activo, formándose un túnel cuyo tamaño y carácter hidrofóbico determina la especificidad que presenta OXA-24 por los carbapenémicos. Los ensayos funcionales realizados con mutantes en los que ambos residuos han sido sustituidos por alanina demuestran que la ausencia de la barrera que forman la Tyr 112 y la Met 223 hace que OXA-24 pierda su selectividad por antibióticos carbapenémicos. La comprensión de los mecanismos mediante los cuales estas carbapenemasas de clase D han modificado su forma de reconocer y anclar el antibiótico al centro activo y han adquirido la capacidad de hidrolizar carbapenemas constituyó un punto de partida clave para el desarrollo de inhibidores.El estudio mediante cristalografía de rayos X de los complejos formados por OXA-24 con cinco compuestos del tipo penema sulfónica (penemas sulfónicas 6-alquiliden-2´-sustituidas) [2] revela la formación de un enlace covalente entre la serina catalítica de la enzima y el compuesto, dando lugar a un acil-intermedio estable que bloquea el centro activo. La interacción con la enzima provoca una reorganización química de estas penemas sulfónicas, dando lugar a la formación de un anillo de indolizina que estabiliza la unión entre la proteína y el inhibidor. La efectividad de estos compuestos como inhibidores de OXA-24 se comprobó sobre la cepa JC7/04 de A. baumannii transformada con el plásmido pAT-RA, portador del gen blaOXA-24. Para estudiar si la presencia de los inhibidores conseguía revertir la resistencia a carbapenémicos de esta cepa portadora de OXA-24 se realizaron ensayos de determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMIs), utilizando los antibióticos carbapenémicos comerciales Imipenem y Meropenem en presencia de estos 5 compuestos. La notable disminución de los valores de CMIs (que alcanzan niveles compatibles con susceptibilidad a carbapenémicos) en presencia de las penemas sulfónicas, valida el carácter inhibitorio de estos compuestos frente a OXA-24.Los datos estructurales, apoyados por ensayos cinéticos y de inhibición, convierten a las penemas sulfónicas en importantes candidatos para su utilización como inhibidores frente a oxacilinasas con actividad carbapenemasa y aportan nuevos datos con los que abordar un diseño racional de otros inhibidores.

[1] Santillana, E., A. Beceiro, et al. (2007). Proc Natl Acad Sci U S A 104(13), 5354-9.[2] Bou, G., E. Santillana, et al.(2010) J Am Chem Soc 132(38), 13320-31.


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P4.12ANÁLISIS CRISTALOGRÁFICO A RESOLUCIÓN ATÓMICA DEL MÓDULO LECTINA N-TERMINAL DE LA PROTEÍNA LBL DE LACCARIA BICOLOR

Iván Acebrón1, Blanca de las Rivas2, Rosario Muñoz2 y José Miguel Mancheño1

1 Departamento de Cristalografía y Biología Estructural. Instituto de Química Física “Rocasolano” (CSIC). C/ Serrano, 119. 28006 Madrid. España.2 Grupo de Biotecnología Bacteriana. Departamento de Procesos. ICTAN (CSIC). C/ Juan de la Cierva, 3. 28006 Madrid. España.

Actualmente, la expresión y purificación de proteínas recombinantes puede suponer en algunos casos un cuello de botella a la hora de afrontar estudios tanto de carácter funcional como estructural. Con el fin de desarrollar protocolos generales que sobre todo aumenten la solubilidad de las proteínas e incrementen el rendimiento de su producción, hemos demostrado que se pueden utilizar lectinas (proteínas que unen específicamente azúcares) como etiquetas de fusión para diseñar sistemas eficaces de expresión-purificación. Gracias a la secuenciación del genoma del hongo Laccaria bicolor [1], hemos identificado el gen 318163 (gen lacc) que codifica una proteína cuya región N-terminal (152 aminoácidos) presenta un alto porcentaje de identidad de secuencia con el módulo lectina de la proteína LSLa del hongo Laetiporus sulphureus, que ya hemos empleado para desarrollar una potente etiqueta de fusión (Patente: WO 2009/121994 (CSIC) 8.10.2009). De esta manera, partiendo de una biblioteca de cDNA, se han clonado el gen completo y el fragmento correspondiente al hipotético módulo lectina. Ambas proteínas se han sobreexpresado y purificado en un único paso mediante cromatografía de afinidad, usando una columna de Sepharose® 4B, lo que revela que efectivamente la proteína codificada por el gen lacc es una lectina que nosotros hemos denominado LBL. Aunque la proteína completa no se ha logrado producir en E. coli puesto que se proteoliza, el módulo lectina (LBL152) se ha producido con un rendimiento muy alto, obteniéndose 100 mg de proteína por cada litro de cultivo. Los ensayos de cristalización llevados a cabo con LBL152 a 24 mg/mL en presencia de 0,2 M lactosa han rendido cristales de muy buena calidad en diversas condiciones, siendo los mejores los obtenidos en 20% (w/v) PEG 6.000, 0,2 M cloruro amónico, 0,1 M acetato sódico pH 5,0. Estos cristales han sido medidos en la línea ID23-2 del ESRF (Grenoble, Francia), obteniéndose datos de difracción hasta una resolución de 1,00 Å, una resolución muy alta dentro del campo de la Biología Estructural. El análisis de los datos de difracción indica que los cristales pertenecen al grupo espacial P21212 con una celda unidad de parámetros a=52,53 Å, b=61,27 Å y c=44,79 Å, consistente con la presencia de una única molécula de LBL152 en la unidad asimétrica. La estructura ha sido resuelta mediante reemplazo molecular, utilizando como modelo la estructura de LSL150 (módulo lectina de la proteína LSLa) [2], confirmándose así que LBL152 forma parte del grupo de lectinas con estructura tipo β-trébol.

[1] Martin, F. et al. (2008) Nature 452: 88-93. [2] Mancheño, J. M. et al. (2005). J. Biol. Chem. 280(17): 17.251-17.259.


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P4.13PHOSPHOLIPIDS AS SPECIFIC SUBSTRATES FOR A PROKARYOTIC LIPOXYGENASE

Albert Garreta1, Queralt García-Fernández2, Silvana Pompeia do Val de Moraes1, Montserrat Busquets1, Àngels Manresa1, Betty Jane Gaffney3, Ignasi Fita2, Xavier Carpena2

1 Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain.2 Institute of Research in Biomedicine (IRB-Barcelona) and Institut de Biologia Molecular (IBMB-CSIC), Barcelona, Spain.3 Florida State University, Tallahassee, FL, USA.

Lipoxygenases are non-heme iron enzymes essential in eukaryotes [1], where they catalyze formation of the fatty acid hydroperoxides that are required by diverse biological (and also pathological) processes [2]. In prokaryotes, most of them totally lacking of polyunsaturated fatty acids, the possible biological roles of lipoxygenases have remained obscure.To date, the available structures of lipoxygenases were only of eukaryotic origin. Here we report the first crystal structure of a prokaryotic lipoxygenase, from Pseudomonas aeruginosa (Pa_LOX), at 1.75Å resolution. The structure shows major differences with respect to the eukaryotic enzymes, while retaining much of the overall lipoxygenase fold. The most striking difference is an insertion in the catalytic domain of a pair of long antiparallel alpha-helices, contributing to an enlarged binding pocket in Pa_LOX containing a bound phospholipid: a phosphatidylethanolamine with well defined chains of 18 and 14 carbons in length. The insertion acts as a lid that apparently needs to be opened to allow entrance of the phospholipid into the substrate-binding pocket. This idea is supported by the variability observed for this two-helix motif in a second crystal form and by the flexibility of the residues linking the motif to the protein. The mobility of the two-helix motif, together with the specific interactions observed between the phospholipid polar head and the protein residues, suggest a mechanism by which the enzymatic activity of secreted Pa_LOX can be exerted directly on target cell membranes.Five carbons of the 18-carbon chain approach the active center iron in a manner suggesting that the catalytic pentadienyl radical intermediate is stabilized by stacking on the His377 and His382 ligands to iron. Pa_LOX iron in the ferric form was examined by EPR spectroscopy. There are two EPR subspectra with the same zero field splitting parameters as for other LOX enzymes [3], but unlike the others the Pa_LOX more rhombic form is stabilized. Overall, the specificity of Pa_LOX for phospholipids also suggests that the role of lipoxygenases in prokaryotes be reformulated to include host-pathogen interactions wherein the substrate is host-derived.

References:[1] Funk CD (2001) Science 294: 1871-1875. [2] Pidgeon GP, et al. (2007) Cancer Metastasis Rev 26: 503-524.[3] Gaffney BJ, et al. (1993) Biophys J 64: 773-783.


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P4.14PRELIMINARY STUDY ON THE CLONNING AND EXPRESSION OF STRUCTURAL AND NON-ESTRUCTURAL TRV VIRAL PROTEINS

Sánchez Eugenia R.1,2, Sánchez L.1,2, Agirre J.1,2, Marti, G.A.3, Ferrer-Orta C.4, Verdaguer N.4, Viguera R.1, and Guérin, D.M.A.1,2,5

1 Unidad de Biofísica (CSIC-UPV/EHU) Bº Sarriena S/N, 48940 Leioa, Vizcaya, Spain. 2 The University of the Vasque Country (EHU), Bº Sarriena s/n, 48940 Leioa, Vizcaya, Spain. 3 Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores (CEPAVE-CCT-La Plata-CONICET-UNLP) 2#584, 1900 La Plata, Argentina.4 Institut de Biología Molecular de Barcelona (CSIC), Parc Cientific de Barcelona, Josep Samitier 1-5, E-08028, Barcelona, Spain. 5 Fundación Biofísica Bizkaia. Bº Sarriena S/N, 48940 Leioa, Vizcaya, Spain.

Triatoma virus (TrV) is a spherical, non-enveloped, +ssRNA picorna-like virus that infects gastrointestinal tract cells of T. infestans (Muscio et al., 1987. J. Invertebr. Pathol. 9:218-220), and belongs to the Dicistroviridae family. The crystallographic structure of TrV (RCSB PDB code 3NAP) shows icosahedral T=1 (P=3) pseudo T-3 symmetry, and is very similar to the structure of the family genus type Cricket Paralysis virus. Natural RNA-full TrV particles are composed of 60 copies of the three major capsid proteins VP1 (37 kDa), VP2 (39 kDa), VP3 (33 kDa), the unstructured small protein VP4 (5.5 kDa), and a minor polypeptide VP0 (45 kDa). VP0 is the precursor of VP3 and VP4 proteins, and is thought to be cleaved upon RNA encapsidation.

In this communication we summarize the current advances in the cloning and expression of TrV structural proteins (VP1-VP4 and the precursor protein P1) and the non-structural RNA dependent RNA polimerase (RdRP). The goal of this study is to in vitro reproduce the assembly and maturation of the TrV virus capsid, and also to determine the crystallographic structure of the RdRP.


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P5.09EFECTO DE PÉPTIDOS “ANTI-CLUSTER” SOBRE EL CANAL DE POTASIO KCSA.

José Ayala Torres1, Marcela Giudici1, José Antonio Poveda-Larrosa1, Estefania Montoya1, Lourdes Renart1, Maria Luisa Molina1, Asia Fernández-Carvajal1, José Manuel González-Ros1, José Antonio Encinar1 1 Instituto de Biología Molecular y Celular, Universidad Miguel Hernández, Elche, 03202 Alicante, España.

El canal de potasio KcsA de Streptomyces lividans fue el primer canal iónico cuya estructura se resolvió a partir de datos de difracción de rayos X [1]. Su estructura muestra un homotetrámero con subunidades de 160 aminoácidos, cada una de las cuales posee un extremo N- y otro C-terminal citoplásmicos, además de dos hélices transmembrana conectadas por otra hélice corta y el llamado fragmento del poro, que contiene una secuencia característica muy conservada en toda la familia de canales de potasio, y que define el filtro de selectividad. Nuestro grupo ha descrito que el canal KcsA se autoasocia in vitro [2]. Esta autoasociación o “clustering” ocurre tanto en muestras solubilizadas en detergente como y, principalmente, en membranas reconstituidas. Además, hemos descrito dos patrones de actividad diferentes según su probabilidad de apertura, que hemos relacionado con que el canal se encuentre aislado o formando “clusters”. En base a modelos estructurales de “docking”, hemos diseñado varios péptidos para que compitan con los sitios de interacción proteína-proteína. Mediante estudios de FTIR y “Blue Native-PAGE” hemos determinado los cambios de estabilidad térmica del canal inducidos por la presencia de estos péptidos, así como los cambios en los patrones de bandas en los geles. Ciertos péptidos compiten por las interacciones canal-canal y alteran el grado de autoasociación del canal.Este trabajo se ha realizado con la financiación de los proyectos BFU2008-00602/BMC y CSD2008-00005 del MICINN.

[1] Doyle, D. A., Morais, C. J., Pfuetzner, R. A., Kuo, A., Gulbis, J. M., Cohen, S. L., Chait, B. T., and MacKinnon, R. (1998) Science 280, 69-77.[2] Molina M.L., Barrera F.N., Fernández A.M., Poveda J.A., Renart M.L., Encinar J.A., Riquelme G., González-Ros J.M. (2006) J. Biol. Chem. 281(27), 18837-18848.


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P5.10DINÁMICA DE Ca2+ MITOCONDRIAL EN EL RANGO MILIMOLAR MEDIDA CON RHOD-5N

Sergio de la Fuente1, Rosalba Fonteriz1, Mayte Montero1 y Javier Alvarez1

1 Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología, Instituto de Biología y Genética Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Valladolid, C/Ramón y Cajal 7, 47005 Valladolid

La gran capacidad y velocidad de acumulación de Ca2+ de la mitocondria le permite a este orgánulo acumular transitoriamente gran parte del Ca2+ que entra en la célula o se libera desde depósitos intracelulares durante la estimulación celular. De esta manera, actuando como amortiguadores de los niveles de Ca2+, las mitocondrias son capaces de modular el tamaño de los picos de [Ca2+] citosólicos y los fenómenos fisiológicos asociados a los mismos. Sin embargo, existe considerable controversia sobre los niveles de Ca2+ que se alcanzan dentro de la mitocondria tanto en condiciones fisiológicas de actividad celular como en mitocondrias aisladas sometidas a perfusión con medios controlados. Utilizando colorantes fluorescentes, algunos autores han sugerido que la [Ca2+] mitocondrial ([Ca2+]M) sólo es capaz de alcanzar el rango micromolar bajo, generando ya a esos niveles precipitación con fosfato intramitocondrial [1,2]. Otros autores, utilizando proteínas fluorescentes o luminiscentes dirigidas, hemos descrito en cambio que los niveles de [Ca2+]M pueden elevarse mucho más, incluso hasta el rango milimolar [3-6]. Esta diferencia tiene implicaciones muy importantes para la capacidad de las mitocondrias de acumular Ca2+ de forma reversible. En este trabajo hemos utilizado un colorante sensible a Ca2+ de muy baja afinidad, el rhod-5N, para medir la dinámica de [Ca2+]M. La calibración in situ de este colorante mostró una Kd de unión a Ca2+ cercana a 0.5mM, por tanto ideal para medir cambios de [Ca2+] en ese rango. La adición de tampones de Ca2+ variables entre 3,5 y 10μM a células permeabilizadas cargadas con este colorante dio lugar a aumentos de [Ca2+]M hasta valores estables cercanos a 1mM. Tras la sobrecarga de Ca2+, la eliminación del Ca2+ del medio indujo una salida de Ca2+ de la mitocondria fuertemente dependiente de Na+, mediada por el intercambiador Na+/Ca2+ mitocondrial. Estos aumentos fueron independientes de la presencia de fosfato en los medios y por tanto de la precipitación de complejos de fosfato cálcico. Finalmente, la adición del agonista histamina en células HeLa intactas cargadas con rhod-5N indujo aumentos transitorios de [Ca2+]M en el rango 20-50μM, incrementados en presencia de activadores del uniportador de Ca2+ mitocondrial. El estudio de la respuesta a histamina a nivel celular y subcelular muestra que existe una variabilidad intercelular significativa en la respuesta de la [Ca2+]M a histamina, pero hay en cambio escasa variabilidad a nivel subcelular entre distintas regiones de una misma célula. Nuestros datos muestran que los valores de [Ca2+]M obtenidos con rhod-5N son consistentes con los obtenidos previamente con aequorina, y que este colorante permite realizar medidas de [Ca2+]M en células intactas en estos rangos de concentración y estudiar la respuesta a nivel celular y subcelular.

[1] Collins, T.J., Lipp, P., Berridge, M.J. and Bootman, M.D. (2001) J. Biol. Chem. 276, 26411–26420.[2] Chalmers, S. and Nicholls, D.G. (2003) J. Biol. Chem. 278, 19062–19070.[3] Montero, M. et al. (2000) Nat. Cell Biol. 2, 57–61.[4] Arnaudeau, S. eta l. (2001) J. Biol. Chem. 276, 29430–29439.[5] Filippin, L. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 39224–39234.[6] Vay, L. et al. (2009) Cell Calcium 45, 243–250.


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P5.11CHARACTERIZATION OF THE KV7.2 POTASSIUM CHANNEL CALMODULIN BINDING SITE

Alessandro Alaimo1, Oscar Millet2, Pilar Areso3 and Álvaro Villarroel11 Unidad de Biofísica, CSIC-UPV/EHU, Universidad del País Vasco, 48940 Leioa, Spain.2 CIC bioGUNE, Structural Biology Unit, Parque Tecnológico de Bizkaia, 48160 Derio, Spain.3 Dpt. Farmacología, UPV/EHU, Universidad del País Vasco, 48940 Leioa, Spain.

KCNQ genes encode five Kv7 potassium channel subunits (Kv7.1-Kv7.5). Kv7.2 and Kv7.3 are expressed in the nervous system, being the principal molecular components of the slow voltage gated M-channel, which exert a strong control in neuronal excitability. Like all Kv channels, the Kv7 α subunits share a common core structure of six transmembrane segments with a voltage-sensing domain (S1-S4), a pore domain (S5-S6) and intracellular N- and C-terminal regions. The C-terminus harbours four regions that present a high probability of adopting an alpha helix configuration (helices A-D). This region binds some lipids and several proteins, including the ubiquitous calcium binding protein calmodulin (CaM). Structurally, CaM has two highly homologous domains (N and C); each domain has two EF-hand sites that bind calcium cooperatively (EF1-4). CaM mediates Ca2+-dependent inhibition of Kv7 channels and is required for the channels to exit the endoplasmic reticulum. However, the molecular details of how Ca2+ trigger the reduction of M-current and channel trafficking are unknown.The aim of this study was to explore the molecular events triggered by Ca2+. We present results obtained using two complementary approaches. In one, we have performed a fluorimetric assay using dansylated calmodulin (D-CaM) to characterize the interaction of individual lobes to the Kv7.2 CaM binding site. The association of the Kv7.2 with CaM was also explored using NMR spectroscopy, employing 15N-labeled CaM as a reporter. Our data show interdependency of the N- and C-lobes in the interaction and suggest that Ca2+ competes directly with binding to channel, causing CaM to pivot between EF-1 and EF-4. As far as we know, a direct competition with the Ca2+ binding pocket represents a novel scenario for the increasing diverse configurations for binding to its target that this amazingly versatile protein can adopt.


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P5.12SODIUM INFLUENCE ON ENERGY TRANSDUCTION BY BACTERIAL COMPLEXES I/ Ana P. Batista1, Bruno C. Marreiros1, Manuela M. Pereira1

1 Instituto de Tecnologia Química e Biológica, Universidade Nova de Lisboa, Av. da República (EAN), 2781-901 Oeiras, Portugal

Complex I of respiratory chains is an energy transducing enzyme present in most bacteria and in all mitochondria. It is the least understood complex of the aerobic respiratory chain, even though the crystallographic α-helical structures of bacterial and mitochondrial complexes have been recently determined [1-2]. This complex catalyses the oxidation of NADH and the reduction of quinone, coupled to cation translocation across the membrane.Rhodothermus marinus complex I, our main model system, is a NADH:menaquinone oxidoreductase and has been extensively characterized. We have made an exhaustive study in order to identify all the subunits present in the complex [3]. The nature of the coupling charge of R. marinus complex I was investigated using inside-out membrane vesicles, which were active with respect to NADH oxidation and capable of creating and maintain an NADH-driven membrane potential (ΔΨ) positive inside. It was observed that this bacterial complex I is able of H+ and Na+ transport, although to opposite directions. The coupling ion of the system was shown to be the H+ being transported to the periplasm, contributing in this way to the establishment of the electrochemical potential difference, while Na+ is translocated to the cytoplasm [4]. The sodium ion extrusion from the membrane vesicles was due to the activity of complex I, since it was sensitive to its inhibitor rotenone, and it was still observed when the complex I segment of the respiratory chain was isolated by the simultaneous presence of cyanide and external quinones. Additional studies have shown that although neither the catalytic reaction nor the establishment of the ΔpH requires the presence of Na+, the presence of this ion increased the proton transport. Combining all these results, a model for the coupling mechanism of complex I was proposed, suggesting the presence of two different energy coupling sites, one that works only as a proton pump (Na+ independent), and the other functioning as a Na+/H+ antiporter (Na+ dependent) [4]. This model was reinforced by further studies performed in the presence of the Na+/H+ antiporter inhibitor, 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride (EIPA) [5]. A deeper inside into the coupling mechanism of this enzyme was provided by studying the influence of sodium ions on energy transduction by complexes I from Escherichia coli and Paracoccus denitrificans. It was observed that the Na+/H+ antiporter activity is not exclusive of R. marinus complex I, since the E. coli enzyme is also capable of such a transport, but is not a general property given that the P. denitrificans enzyme does not performed sodium translocation [6]. Due to the fact that R. marinus and E. coli enzymes reduce menaquinone while P. denitrificans complex I reduce ubiquinone, it is suggested that the Na+/H+ antiporter activity may be correlated with the type of quinone used as substrate.

[1] Efremov, R.G., Baradaran, R. and Sazanov, L.A. (2010) Nature 465(7297) 441-5.[2] Hunte, C., Zickermann, V. and Brandt, U. (2010) Science 329(5990) 448-51.[3] Batista, A.P., et al., (2010) Anal. Biochem. 407(1) 104-10.[4] Batista, A.P., et al., (2010) Biochim Biophys Acta, 1797(4) 509-15. [5] Batista, A.P., Marreiros, B.C. and Pereira, M.M. (2011) ACS Chem Biol DOI: 10.1021/cb100380y[6] Batista, A.P. and Pereira, M.M. (2011) Biochim Biophys Acta 1807(3) 286-92.


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P5.13ROLE OF THE CONFORMATION OF SELECTIVITY FILTER IN KCSA STABILITY AND FUNCTION

Estefanía Montoya1, M. Lourdes Renart1, Asia Fernández1, M. Luisa Molina1, José L. Ayala1, José A. Encinar1, José A. Poveda1, José M. González-Ros1

1 Instituto de Biología Molecular y Celular, Universidad Miguel Hernández, Elche, 03202 Alicante, España.

The potassium channel KcsA is an integral membrane protein from S.lividans. Since its atomic structure was solved by X-ray diffraction, it has been used as a model system for studies on ion channel and oligomeric membrane proteins. This channel is able to permeate K+ at high rate and it is blocked by Na+. Fluorescence, circular dichroism and Fourier transform infrared experiments carried out in our laboratory demonstrated that K+ and Na+ are able to bind to KcsA in a competitive manner [1]. This binding is indeed associated with conformational changes, which seem to be related to the permeation and blockade processes. To further investigate the impact of the selectivity filter conformation on the structure, stability and function of KcsA, we performed studies on two different mutants with altered permeability/selectivity properties. KcsA E71A showed a high opening probability (Po), in contrast to the very low Po of the wild-type channel. Also, thermal stability is diminished in the mutant channel and, in fact, presence of Na+ does not suffice to hold the channel subunits together, thus, causing dissociation. Some changes in tertiary structure were detected by fluorescence spectroscopy.On the other hand, although the crystallographic structure of KcsA M96V [2] suggests a non-conductive state, this mutant channel conduct K+ and even Na+, both at very low Po. Structural characterization of the M96V mutant showed that both secondary and tertiary structures are very similar in the presence of K+ or Na+, in agreement with functional behaviour.

This work was supported by grants from the Ministry of Science and Innovation BFU2008-0062 and CONSOLIDER-INGENIO 2010 CSD2008-00005 to JMGR.

[1] Renart, M.L., Triano, I., Poveda, J.A., Encinar, J.A., Fernández, A.M., Ferrer-Montiel, A.V., Gómez, J., González Ros, J.M. (2010) Biochemistry 49, 9480–9487

[2] Lockless, S.W., Zhou, M., MacKinnon, R. (2007) PLOS Biology 5 (5), 1079-1088


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P6.09CORRELATION ANALYSIS OF THE SEQUENCE DEPENDENT UNWINDING RATE OF THE PHI29 DNA POLYMERASE

José A. Morín1,2, Borja Ibarra1,2, Francisco J. Cao3, J. Ricardo Arias-González1, 2, Margarita Salas4, José M. Valpuesta2, José L. Carrascosa2. 1 Imdea Nanociencia. Canto Blanco, Madrid 28049, Spain. 2 Centro Nacional de Biotecnología (C.S.I.C.), Canto Blanco, Madrid 28049, Spain.3 Dpto. Física Atómica, Molecular y Nuclear, Facultad de Ciencias Físicas. Universidad Complutense, Madrid, 28040, Spain4Centro de Biología Molecular, ‘Severo Ochoa’ (C.S.I.C.-U.A.M.), Canto Blanco, Madrid 28049, Spain.

During DNA replication the mechanical unwinding of the double-stranded DNA (dsDNA) helix is required to separate the two complementary strands which are used by the DNA polymerases to replicate the DNA. In the bacteriophage Phi29 these two processes (replication and unwinding) are tightly coupled within the same protein. The Phi29 DNA polymerase unwinds the dsDNA as it replicates in a processive manner one of the strands, working as a polymerase and as a helicase at the same time [1].

Using Optical Tweezers [2] we have developed a single-molecule mechanical assay to elucidate the physical mechanism by which this polymerase opens the DNA helix and the basis for the tight coupling between replication and unwinding. The active or passive character of the polymerase unwinding mechanism would determine the response of the protein unwinding activity to increasing aiding forces on the replication fork and to the hairpin sequence [3, 4]. To determine the effect of sequence on the unwinding reaction we first performed mechanical unzipping experiments to extract the effective base pair energies of GC and AT base pairs in our experimental conditions [5]. Then we tracked the instantaneous primer extension and strand displacement rates along the DNA hairpin which presents GC clusters of increasing length at known positions. We found a strong correlation between the instantaneous velocity and the GC composition of the fork. The unwinding rate decreases as the CG content increases. This correlation is lost at the highest aiding forces (14 pN), indicating an effective decrease in the energetic barrier imposed by the GC base pairs.

Our results indicate that the Phi29 DNA polymerase presents a partially active DNA unwinding mechanism able to fully destabilizing AT bases while only partially destabilizing GC base pairs.

[1] Blanco L, Salas M. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. Oct; 82(19):6404-8. [2] Smith, S.B., Cui, Y. and Bustamante, C. (2003) Methods Enzymol. 361, 134–162.[3] Betterton M. D. and Jullicher F. (2005) Phys. Rev. E 71, 011904 [4] Cheng W., Dumont S., Tinoco I. Jr, and Bustamante C. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci 104(35):13954-13959 [5] Hugueta J. M., Bizarro C. V., Forns N., Smith S. B., Bustamante C. and Ritort F. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. 107(35):15431–15436


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P6.10START-UP OF A CUSTOMIZED OPTICAL TWEEZERS TO STUDY DNA REPAIR AT THE SINGLE-MOLECULE LEVEL

Benjamin Gollnick1, Mark S. Dillingham2, Fernando Moreno-Herrero1

1 Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, c/ Darwin 3, Campus de Cantoblanco, 28049 Madrid, Spain.2 DNA: protein Interactions Unit, School of Biochemistry, Medical Sciences Building, University of Bristol, University Walk, Bristol BS8 1TD, UK

Double-stranded DNA breaks are a frequently occurring and potentially catastrophic form of DNA damage that can lead to cell death, premature ageing or cancer. In bacteria, DNA repair by homologous recombination is initiated by a class of enzymes called helicase-nucleases. The prototypical member of this class in the model organism Bacillus subtilis is the ATP-dependent protein complex AddAB. It processes a double-stranded DNA end to a 3’-terminated single-stranded DNA overhang, thus creating a substrate for the subsequent steps of recombinational repair [1, 2].In order to study the mechanics and dynamics involved in the complex process of DNA repair initiation, we have set up and characterized a tailor-made single-beam Optical Tweezers adapted from a published design [3]. Our apparatus, which includes both commercial and custom-designed components, combines a high-power infrared laser with a single high-numerical-aperture microscope objective, creating a stable optical trap in three dimensions. The positions of trapped microspheres are detected by high-speed video microscopy (temporal resolution 3 – 10 ms) as well as quadrant detector measurements of backscattered laser light (temporal resolution 0.1 ms). We have determined a spatial resolution of the experimental system of at least 5 nm, depending on the applied laser power. Trap stiffness calibration has been performed using the viscous drag method, which defines an effective range of measurable forces from 0.2 to 100 pN.Our novel instrumentation will provide us with the means to investigate the real-time dynamics of DNA repair processes catalyzed by the molecular motor AddAB, providing information inaccessible to traditional bulk techniques. So far, proof-of-principle pulling experiments of DNA molecules are in progress, using a glass micropipette as a fixed anchor point. Next, we aim at measuring the stalling force of AddAB. These experiments and future improvements of the Optical Tweezers device will be discussed in detail.

[1] Chedin, F., Ehrlich, S.D. and Kowalczykowski, S.C. (2000) J. Mol. Biol. 298, 7-20.[2] Yeeles, J.T.P. and Dillingham, M.S. (2007) J. Mol. Biol. 371, 66-78.(3) Keyser, U.F., Van der Does, C.; Dekker, C. and C. and Dekker N.H. (2006) Rev. Sci. Instrum. 77,

105105.


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P6.11TRANSITION STATE SUSCEPTIBILITY IN SINGLE MOLECULE FORCE SPECTROSCOPY

Anna Alemany1, Félix Ritort1,2, 1 Departament de Física Fonamental, Universitat de Barcelona, Diagonal 647, 08028 Barcelona, Spain2 CIBER-BBN de Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina, Instituto de Sanidad Carlos III, Madrid, Spain

Single molecule experiments allow to investigate with unprecedented detail the kinetics of biomolecules, such as DNA, RNA and proteins. Short DNA hairpins (a few tens of bases) show an apparent two-states behavior when a mechanical force is applied to their ends, switching between their native and denaturalized-stretched conformation. In this project we use dual-beam optical tweezers to study kinetics of folding/unfolding in DNA hairpins pulled by mechanical forces. In the context of Kramers’ theory (see [1]), we study the force-dependence of the kinetic barrier and we find that deviations from exponential kinetics are observed in small ranges of forces, in both folding and unfolding processes. These are related to a competition between different transition states that implies an abrupt change in the location of the kinetic barrier along the reaction coordinate, in this case the molecular extension. We show that even in one-dimensional systems where only one reaction pathway is possible, unfolding and folding can be mediated by different transition states. To conclude, we define the transition state susceptibiliy as a measurable magnitude that allows the identification of force regimes where these changes in the location of the kinetic barrier take place.

[1] Manosas, M., Collin, D., Ritort, F. (2006) Phys. Rev. Let. 92, 218301 (4).


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P6.12EFFECT OF NICKS ON SINGLE TRANSLOCATION ACTIVITY OF THE ADDAB MOLECULAR MOTOR STUDIED BY MAGNETIC TWEEZERS

Carolina Carrasco1, Joseph T. Yeeles2, Mark S. Dillingham2, Fernando Moreno-Herrero1

1 Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Campus UAM, Darwin 3, 28049, Cantoblanco, Madrid, Spain2 Dept. of Biochemistry, School of Medical Sciences, University of Bristol, University Walk, Bristol, BS8 1TD, UK

Unrepaired DNA breaks can lead to genomic instability or cell death. In Bacillus subtilis, broken DNA ends are first processed to a 3′-ssDNA overhang terminated at a recombination hotspot (Chi) sequence. This reaction is catalysed by the AddAB helicase-nuclease; a complex molecular motor protein that unwinds the DNA duplex and degrades the nascent single-strands in a Chi-regulated manner [1]. Single-molecule manipulation and imaging techniques offer high potential to investigate DNA break repair reactions in new ways, providing information that is inaccessible to conventional ensemble experiments [2]. We have used Magnetic Tweezers to follow in real time AddAB translocation at the single molecule level. By linking streptavidin-coated paramagnetic beads to biotynilated AddAB we were able to apply a force against the action of the motor protein. We have measured AddAB translocation rate as a function of the applied force for Chi-containing and Chi-free DNA molecules at saturating ATP. AddAB translocation traces showed a complex appearance with the presence of constant-velocity fragments punctuated by stochastic pauses. Mean pause duration followed a single exponential decay function with a decay constant of 0.64±0.05 s and 0.67±0.02 s for Chi-free and Chi-containing DNA molecules, respectively. The molecular basis of the pauses is not clear and is currently under evaluation. Firstly, we have investigated if the pauses observed in the translocation traces are a consequence of the presence of nicks in the DNA track. To explore this possibility we have fabricated DNA substrates with the possibility to induce a nick in a specific position by using the restriction enzyme BbvCI. Magnetic Tweezers experiments have been performed on these nicked substrates for Chi-free and Chi-containing DNA molecules. We have not seen any pause associated to the position of the nick induced by the BbvCI enzyme. It means that the AddAB motors can overcome nicks when they translocate along nicked strands. Analysis of other hypotheses for the pause origin, including pseudo Chi recognition, inhibition by DNA damage, or simply an intrinsic property of the AddAB motor, are ongoing and will be also discussed. Interestingly, we found that the presence of Chi sequences increases the frequency of AddAB pausing and reduces AddAB translocation rate.

[1] Yeeles, J.T. and M.S. Dillingham, A dual-nuclease mechanism for DNA break processing by AddAB-type helicase-nucleases. (2007) J Mol Biol. 371, 66-78.[2] Abbondanzieri, E.A., et al., Direct observation of base-pair stepping by RNA polymerase. (2005) Nature. 438, 460-5.


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P6.13FORCE SPECTROSCOPY ANALYSIS OF EXTENDED SINGLE DNA MOLECULES IN A NOVEL DUAL TRAP OPTICAL TWEEZER SETUP

M. Ribezzi Crivellari, J.M. Huguet and F. RitortSeveral important achievements in the field of single-molecule biophysics have been obtained using Double Trap Optical Tweezers (DTOT).

The great success of this setup is due, among others, to two peculiar features. On the one hand the possibility of manipulating single molecules by all optical means guarantees an exceptional isolation from ambient noise, allowing unprecedented resolutions. In 2005 this led to the measurement of single base pair stepping of RNA polymerases and paved the way for polymerase based sequencing.On the other hand, in many experimental situations, the use of cross correlations between the signals coming from the two traps allows to overcome the resolution limit due to the stiffness of the traps.We present a novel DTOT setup which uses counterpropagating laser beams and can measure forces by direct detection of changes in light momentum. We employ this set up to measure the end to end fluctuations in double stranded DNA polymers of different lengths.By a careful statistical mechanical analysis of the spectrum of the fluctuations, we show how it is possible to distinguish and characterize both longitudinal and transverse fluctuations in the molecule.


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P7.09CARACTERIZACIÓN DE LA INTERACCIÓN DEL DOMINIO C1B DE LA PKC TETA CON MEMBRANAS MODELO

Antonio Egea-Jiménez1, Senena Corbalán-García1 y Juan Carmelo Gómez-Fernández1

1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular (A). Facultad de Veterinaria. Universidad de Murcia

Las Proteínas Quinasas C (PKC) constituyen un grupo de enzimas con actividad fosfotransferasa, que fosforilan específicamente residuos de serina y treonina de sus proteínas sustrato.Por sus características estructurales y requerimientos para su activación, las isoenzimas de la PKC se clasifican tradicionalmente en tres clases: PKC clásicas, también denominadas convencionales (PKCc); PKC nuevas (PKCn) y PKC atípicas (PKCa).Las isoenzimas nuevas y clásicas de la PKC contienen dos dedos de zinc designados como dominios C1A y C1B que ejercen una función muy importante en el anclaje de la proteína a la membrana. Estos dominios actúan como módulos de reconocimiento para el segundo mensajero, el diacilglicerol, y para agentes exógenos como los ésteres de forbol.Las interacciones con la membrana son también facilitadas por un anillo de cargas positivas localizado en la mitad del dominio, sitio potencial de unión a fosfatidilserina y a otros lípidos negativos.El objetivo de este trabajo es caracterizar la afinidad de unión del dominio C1B de la proteina quinasa C teta (PKCθ) para distintos fosfolípidos aniónicos: 1-palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfato (POPA); 1-palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (POPS): 1-palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (POPG); y a diferentes concentraciones de 1,2-sn-dioleilglicerol (DOG), ya que a pesar de que los dominios C1B de las distintas isoenzimas de PKC poseen una gran homología en sus secuencias, se desconoce la afinidad diferencial que pueden presentar estos dominios por diferentes lípidos negativos.Para su realización expresamos el dominio C1Bθ fusionado a la Proteína Cyan Fluorescente (CFP) en células de mamífero HEK293 siguiendo el protocolo de precipitación de fosfato cálcico. Los lisados celulares se utilizaron en la técnica de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) donde la CFP actuó como fluoróforo donante, y como fluoróforo aceptor la sonda Oregon Green incorporada a las vesículas lipídicas unilamelares pequeñas. La fluorescencia de la proteína CFP se determina utilizando una longitud de onda de excitación de 433nm (λex) y se recoge la emisión de fluorescencia a 473nm (λem).Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la afinidad en la unión de la proteína a la membrana aumenta cuando la concentración de fosfolípidos negativo en las vesículas lipídicas incrementa, llegando a obtener para el POPA una KA ~2 veces superior que la observada en presencia de POPS y ~3 veces superior cuando de POPG se trata.


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P7.10ESTRUCTURA Y ORIENTACIÓN DEL DOMINIO C2 DE LA PKC-ε UNIDO A MEMBRANAS: UN ESTUDIO DE ESPECTROCOPÍA DE INFRARROJO

Alessio Ausili1, Senena Corbalán-García1, Juan Carmelo Gómez-Fernández1

1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular A, Universidad de Murcia, 30100-Murcia, España.

El isoenzima proteína quinasa Cε (PKCε) pertenece al grupo de nuevas PKCs y está relacionada con la regulación de varios procesos biológicos como la diferenciación neuronal, la resistencia antiviral, la secreción de hormonas, la regulación de trasportadores y la señalización dependiente de integrinas. La parte reguladora de la PKCε está constituida por un dominio C1 que se une a diacilgliceroles y ésteres de forbol, y un dominio C2 localizado en la región N-terminal que se une a las membranas sin necesidad de la presencia de Ca2+. La estructura tridimensional del dominio C2 de la PKCε ha sido determinada por cristalografía y se trata principalmente de 8 hojas beta antiparalelas dispuestas en una conformación β-sandwich. Se ha utilizado la técnica de espectroscopía de infrarrojo por trasformada de Fourier (FTIR) para determinar si se producen cambios en la estructura secundaria del dominio C2 al interaccionar con membranas modelo. También se ha comprobado en qué medida la estructura se ve afectada por la composición lipídica de estas bicapas. Este estudio se completa estableciendo la orientación del β-sandwich cuando el dominio está unido a diferentes tipos de membranas, empleando la espectroscopía ATR-FTIR con luz polarizada.La composición lipídica de las vesículas modelo fue: POPA, POPC/POPA (50:50), POPC/POPS/POPA (65:25:10), POPC/POPE/CL (43:36:21) y POPC/POPG/POPA (65:25:10).Los resultados obtenidos muestran que la interacción con las membranas no afecta a la estructura secundaria del dominio de una manera acusada. Sólo se aprecian pequeños cambios cuando el dominio se une a membranas modelo de POPC/POPA y POPC/POPG/POPA. En este caso, el porcentaje de estructuras beta del dominio C2 aumenta en comparación con la estructura secundaria del dominio en ausencia de vesículas. En lo que concierne a la orientación del β-sandwich, cuando el dominio se une a membranas de POPC/POPG/POPA forma un ángulo mayor con la superficie de la bicapa lipídica, en contraposición con lo

observado al interaccionar con vesículas de POPC/POPA y POPC/POPS/POPA.


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P7.11LA ACTIVIDAD ANTI-AMILOIDE DEL DOMINIO BRICHOS DE LA PRO-SPC REQUIERE SU INSERCIÓN EN LA MEMBRANA

Alejandra Saenz1, Hanna Willander2, Jan Johansson2, Cristina Casals1

1 Department of Biochemistry and Molecular Biology I & CIBER Enfermedades Respiratorias, Complutense University of Madrid, Spain.2 Department of anatomy, physiology and Biochemistry, SLU, The Biomedical Centre, Uppsala, Sweden.

Brichos es un dominio de aproximadamente 100 aminoácidos que se encuentra en proteínas asociadas a demencia, distrés respiratorio y cáncer. En varias de estas proteínas, Brichos se encuentra en la región propeptídica de la proteína y es liberado por ruptura proteolítica durante el procesamiento intracelular. En el caso de la proteína del surfactante pulmonar SP-C, este dominio se encuentra en el segmento C-terminal la pro-SP-C (CTC) localizado en el lumen del retículo endoplasmático (RE). Se cree que este dominio podría actuar como un chaperón intramolecular evitando el cambio conformacional α-hélice/lamina β del segmento transmembrana del precursor de la SP-C (que se corresponde con el segmento transmembrana de la SP-C madura). La conversión en lámina β da lugar a la agregación de la proteína, acumulación en RE y potencial formación de fibras amiloides. La mayor parte de las mutaciones encontradas en la pro-SP-C humana se encuentran en el dominio Brichos y se correlacionan con la enfermedad pulmonar intersticial crónica (ILD). Previamente hemos demostrado que CTC interacciona con residuos hidrofóbicos del segmento transmembrana (V, L, I o F) cuando éste presenta una conformación no helicoidal. Nuestra hipótesis es que para que CTC lleve a cabo su actividad anti-amiloide es necesaria su inserción en la membrana del RE. El principal objetivo de este estudio ha sido investigar si la CTC recombinante humana y CTC con una mutación asociada al ILD (L188Q) se une e inserta en membranas biológicas. Los resultados obtenidos muestran que la CTC recombinante humana se inserta en membranas fluidas de fosfatidilcolina (POPC) o en membranas que presenten una coexistencia de dominios ordenados/desordenados con un valor de presión de inserción máxima (MIP) de 40-43 mN/m, que es mayor que la presión lateral estimada para biomembranas (30-35 mN/m). El hecho de que el mutante CTC (L188Q) sea capaz de unirse, pero no de insertarse en membranas (MIP entre 23-28 mN/m) sugiere que la actividad anti- amiloide del dominio CTC podría estar relacionada con la capacidad de la CTC para insertarse en membranas biológicas. De esta forma, podría interaccionar con residuos hidrofóbicos presentes en segmentos no helicoidales impidiendo la formación de fibras amiloides.


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P7.12PROPIEDADES INTERFACIALES DE DOMINIOS ACTIVOS MÍNIMOS DERIVADOS DE PROTEÍNAS DE LA FAMILIA BCL-2

Diana Giménez1; Gustavo Fuertes1; Santi Esteban-Martín1; Orlando L. Sánchez-Muñoz1 y Jesús Salgado1

1 Instituto de Ciencia Molecular-Universidad de Valencia. C/Catedrático José Beltrán 2, 46980 Paterna (Valencia), España.

Bax, Bcl y Bid son miembros clave de la familia de la proteínas B-cell linfoma 2 (Bcl2), que actúan como reguladores de la apoptosis controlando la liberación de factores apoptogénicos a través de poros en la membrana externa mitocondrial. La formación y propiedades de estos poros por parte de proteínas de la familia Bcl-2 depende en gran medida de su actividad interfacial. Sin embargo, tal actividad no ha sido aún estudiada con detalle, debido en parte a una falta de desarrollo de métodos experimentales y teóricos adecuados. En este trabajo hemos abordado una caracterización básica y detallada del comportamiento y las propiedades de dominios activos mínimos [1, 2] de proteínas de la familia Bcl-2 en interfases aire-agua. El estudio se ha llevado a cabo mediante el uso combinado de un sistema de monocapas de Langmuir y un Microscopio de Angulo de Brewster (BAM), lo que permite el registro simultáneo de isotermas de presión superficial (π) vs área molecular (Amol) e imágenes de la morfología de las monocapas en cada punto. Si bien todos los péptidos estudiados son capaces de formar nonocapas estables en la interfase aire/agua, como corresponde a su anfipaticidad, hemos encontrado diferencias significativas en su comportamiento. Los derivados de Bax, Baxα5 y Baxα6 poseen isotermas similares, con una zona de coexistencia LE-LC característica a baja presión (0-2 mN/m2). En esas condiciones, la imágenes BAM sugieren ya la existencia de una red de fase condensada, donde se da una fuerte tendencia a la nucleación del péptido en agregados densos en torno a los vértices, dando lugar a estructuras en forma de anillo. Al aumentar la presión, los anillos se funden y crecen en diámetro, y finalmente colapsan al completarse la transición LE-LC. Bcl-xLα5 sigue un proceso similar, si bien los agregados nuclean en las regiones compactas donde forman islas que coexisten con regiones expandidas libres de agregación. Finalmente Bidα6 ofrece un comportamiento intermedio, y Bcl-xLα6 es el único caso en el que no se observa agregación alguna ni coexistencia aparente de fases durante la transición LE a LC, similar al caso de otros péptidos anfipáticos como melitina [3].Por otro lado, un estudio cuantitativo de experimentos de adsorción desde la subfase a diferentes concentraciones peptídicas nos ha permitido evaluar la afinidad intrínseca de los péptidos por la interfase aire/agua. Tal análisis se ha llevado a cabo mediante la teoría descrita por R. Miller y colaboradores [4], que permite obtener parámetros termodinámicos característicos de la adsorción interfacial de proteínas. También obtenemos expresiones teóricas del área molar parcial en función de la presión superficial, las cuales son perfectamente comparables con las curvas experimentales de π vs Amol. Finalmente obtenemos isotermas de adsorción Г (fracción de moléculas adsorbidas por unidad de área interfacial) vs C0 (concentración en la subfase), de cuya interpretación se consigue evaluar la energía libre de Gibbs.Las propiedades aquí descritas definen el comportamiento interfacial íntrinseco las los dominios activos derivados de proteínas Bcl-2, y permiten entender con mayor claridad el comportamiento de estas moléculas en interfases lipídicas. Por otro lado, el marco teórico utilizado para el análisis de dichas propiedades es válido también para estudiar la interacción de los mismos dominios con monocapas lipídicas. Dicho estudio se encuentra actualmente en desarrollo, e incluye observaciones mediante microscipía de fluorescencia y análisis estructural mediante espectroscopa de infrarrojos.

[1] García-Sáez, AJ.; Coraiola, M.; Dalla Serra, M.; Mingarro, I.; Menestrina, G.; Salgado, J.; (2005) Biophys J., 3976-3990.[2] Sanchez García-Sáez, AJ.; Coraiola, M.; Serra, MD.; Mingarro, I.; Müller, P.; Salgado, J.; (2006) FEBS J., 971-981. [3] Gevod, V.; Birdi, K.; (1984) Biophys. J., 1079–1083[4] Makievski, A.V.; Fainerman, V.B.; Wüstneck, R.; Kräguel, J., Miller, R. (1998) J. Phys. Chem. B. 102, 417-425.


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P7.13INTERACCIÓN DE UN TREALOSALÍPIDO BIOTENSIOACTIVO CON PROTEÍNAS MODELO

Ana Zaragoza1, Francisco J. Aranda1, J.A. Teruel1 y Antonio Ortiz1

1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, E-30100 Murcia

Se ha aislado un trealosalípido bacteriano (TL), secretado por Rhodococcus sp, el cual se comporta como un tensioactivo. Se ha estudiado la interacción de este glicolípido con proteínas modelo mediante FTIR y DSC. Mioglobina (MG) y ribonucleasa (RNasa) se eligieron como proteínas modelo debido a que poseen estructuras secundarias muy distintas. Mientras que MG contiene principalmente hélices α (74%) y carece de hojas β, RNasa tiene una proporción de hojas β mayor (50%) en comparación con las hélices α (13%). La adición de TL a RNasa a concentraciones por debajo de su cmc (0.3 mM), no afecta a la temperatura de desnaturalización térmica de la proteína. Los datos de FTIR indican que la presencia de TL no afecta a la estructura secundaria de RNasa nativa ni desnaturalizada en presencia del tensioactivo. En el caso de MG, los experimentos de FTIR muestran que la presencia de TL (5 mM) no afecta a la proteína nativa, pero la protege de la desnaturalización térmica, principalmente manteniendo las hélices α y disminuyendo la formación de agregados β. Sin embargo, la calorimetría muestra que la adición de TL a concentraciones por debajo de su cmc provoca un cambio en la temperatura de desnaturalización de la proteína hacia valores más bajos indicando que facilita la desnaturalización térmica de la proteína. Esto podría deberse a la formación de agregados de TL en la superficie de la proteína. Estos resultados sugieren que la presencia de TL afecta de forma diferente, según se encuentre en forma monomérica o micelar, y que el TL interacciona con dominios específicos en una proteína dada.

Subvencionado por el MCINN (Proyecto CTQ2007-66244 a A.O.)


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P7.14CARACTERIZACIÓN DE REGIONES MEMBRANOACTIVAS DE LAS PROTEÍNAS C Y E DEL VIRUS DEL DENGUE (DENV)

Henrique de Castro Nemésio1, Mª Francisca Palomares Jerez1, Lidia Nuño1 y José Villalaín1. 1 Instituto de Biología Molecular y Celular, Universidad Miguel Hernández. E-03202 Elche (Alicante).

Todos los años más de 50 millones de personas son infectadas por el virus del dengue (DENV), transmitido por un mosquito, Aedes aegypti. Este virus con envuelta de la familia Flaviviridae tiene cuatro serotipos distintos y una cadena sencilla de RNA de polaridad positiva que codifica una poliproteína, que después de ser procesada por enzimas virales y del huésped, origina 3 proteínas estructurales (C, E y prM) y 7 proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5) [1]. La superficie de la partícula viral inmadura está formada por heterodímeros de las proteínas prM y E que se organizan en heterodímeros que se extienden hacia fuera de la superficie [2]. Todo indica que el virus DENV penetra en la célula por endocitosis mediada por receptores, los cuales no se han descrito todavía. Una vez dentro de la célula, el medio ácido de la vesícula endocítica da lugar a que la proteína E sufra una trimerización irreversible que induce la liberación de la nucleocápsida (formada por varias copias de la proteína C asociadas a moléculas de RNA viral) hacia el interior de la célula, iniciando entonces el proceso de infección, en la que la poliproteína es traducida y procesada, originando todas las proteínas virales. De las proteínas estructurales, las proteínas C y E son fundamentales para el proceso de infección viral. La proteína C tiene una zona de posible interacción con membranas por su elevada hidrofobicidad, y una zona de posible interacción con el RNA viral (región C-terminal) [3]. El péptido de fusión, fundamental para el proceso de infección, parece estar contenido en la proteína E. Además, los dominios de conexión a los receptores están también localizados en esta proteína, lo que implica una gran importancia dentro del proceso viral. En este trabajo se describe la determinación de las zonas membranoactivas de las proteínas C y E de DENV. Se ha encontrado una zona que muestra una fuerte capacidad de rotura de membranas en la proteína C y cuatro zonas con la misma capacidad en la proteína E. Para obtener dichos resultados se llevaron a cabo experimentos de espectroscopia de fluorescencia utilizando una sonda fluorescente encapsulada en sistemas modelo de membrana y experimentos de calorimetría diferencial de barrido [4]. Este es el primer trabajo donde se describen las posibles zonas de interacción con membranas de las proteínas C y E.

[1] Mukhopaday, S., Kuhn, R.J., and Rossmann, M.G. (2005) Nat. Rev.Microbiol. 3, 13-22.[2] Qi, R.F., Zhang, L., and Chi, C.W. (2008) Acta Biochim. Biophys. 40(2), 91-101.[3] Ma, L., Jones, C.T., Groesch, T.D., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(10), 3414-3419.[4] Guillén, J., Pérez-Berná, A.J., Moreno, M.R., Villalaín, J. (2005) J Virol. 79(3), 1743-1752.


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P7.15THE INTERACTION OF C2 DOMAINS OF PROTEIN KINASE C ALPHA WITH LUV AS SEEN THROUGH LIPID FLUORESCENCE AND LIGHT SCATTERING

Ángel Pérez-Lara1, Senena Corbalán-García1 y Juan C. Gómez-Fernández1

1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular A, Universidad de Murcia, 30100-Murcia, España.

Protein kinase C alpha (PKCα) is a member of a family of Ser/Thr protein kinases that possess two regulatory domains, C1 and C2, which are the targets of different second messengers.The main role of C2 domain in PKCα is to act as the Ca2+-activated membrane-targeting motif.This C2 domain displays 2 functional regions: the Ca2+-binding region and the polybasic cluster. The former is located in the flexible top loops, binds 2 or 3 Ca2+ ions, depending on the isoenzyme, and interacts with 1,2-diacyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine] (Ptd-Ser) .The second region is a polybasic cluster that is located at the concave surface of the C2 domain formed by strands β3 and β4. Recent studies indicate that this region might bind specifically to 1,2-diacyl-sn-glycero-3-[phosphoinositol-4,5-bisphosphate] (PtdIns(4,5)P2) in a Ca2+-dependent manner.This work aims to assess the effect of C2 domain on the clustering of Ptd-Ser and PtdIns(4,5)P2 in lipid bilayer using 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine-N-7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl (NBD-POPS) and 1-oleoyl-2-{6-[4-(dipyrrometheneborondifluoride)butanoyl]amino}hexanoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol-4,5-bisphosphate (TopFluor-PIP2). The aggregation of the vesicles was followed through light scattering. We have found that C2 domains develop aggregation of LUVs and Pt-Ser and PtdIns(4,5)P2 clustering in a Ca2+-dependent manner.


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P7.16MECANISMOS DE UNIÓN A MEMBRANA DE LOS DOMINIOS C2A Y C2B DE SINAPTOTAGMINA-1.

Teresa Coronado-Parra1, Jaime Guillén1, Ginés Luengo-Gil1, Marta Guerrero-Valero1, Juan C. Gómez-Fernández1 y Senena Corbalán-García1

1 Dpto. Bioquímica y Biología Molecular A. Facultad de Veterinaria. Universidad de Murcia, 30100-Murcia, España.

Los dominios C2 son módulos independientes de plegamiento de unos 130 residuos. Se han identificado dominios C2 aislados y múltiples en cientos de proteínas de señalización en eucariotas implicadas en transducción de señales, tráfico de membranas, inflamación y muchos otros procesos. Los dominios C2 pueden unir una gran variedad de ligandos como Ca2+, fosfolípidos, poliinositolfosfatos y proteínas intracelulares. La proteína de las vesículas sinápticas sinaptotagmina-1 actúa como un sensor de Ca2+ en el proceso de liberación de neurotransmisores. La región citoplasmática de esta proteína está formada por dos dominios C2, conocidos como dominio C2A y C2B, que adoptan una estructura en β-sandwich y unen tres y dos iones de Ca2+, respectivamente. Muchos estudios han mostrado diferentes y contradictorios resultados sobre las diferentes propiedades de unión a membranas de los dominios C2A y C2B de sinaptotagmina-1. Mientras se describió que el dominio C2A aislado no une vesículas de PC/PIP2, pero si vesículas de PC/PS, el dominio C2B si que unía vesículas formadas por PC/PIP2, pero no de PC/PS. Con el fin de esclarecer estos resultados realizamos experimentos de calorimetría de titulación isotérmica, espectroscopía de fluorescencia y agregación de liposomas con los diferentes dominios C2A y C2B de sinaptotagmina-1 y un mutante de un residuo acidico conservado en las láminas β del dominio C2A. Los resultados demuestran que solamente la unión a membranas del C2B es significativa y que al recobrar la lisina perdida por el dominio C2A, éste recupera su capacidad de unión a membranas. Mostramos también que el dominio C2B es capaz de producir agregación de membranas en presencia de PIP2, en cambio ni el dominio C2A ni el C2A mutante son capaces de agregar liposomas, por lo que la mutación no consigue recobrar totalmente la función del dominio C2B. Por último analizamos la especificidad de unión a membranas con diferentes fosfoinosítidos.

Este trabajo ha sido financiado por proyectos de la Fundación Séneca 08700/PI/08 (a S.C.-G.), y Ministerio de Ciencia e Innovación BFU2008-01010 (a J.C.G.-F.). J.G.-C. pertenece al Programa Juan de la Cierva del Ministerio de Ciencia e Innovación.


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P7.17RECONSTITUTION OF PROAPOPTOTIC BAK FUNCTION IN LIPOSOMES REVEALS A DUAL ROLE FOR MITOCHONDRIAL LIPIDS IN THE BAK-DRIVEN MEMBRANE PERMEABILIZATION PROCESS

Ane Landajuela1, Itsasne Bustillo1, Olatz Landeta1, David Gil2, Stefka Taneva1,3, Carmelo Diprimo 4, Begoña Sot 5, Mikel Valle2, Vadim Frolov1, Gorka Basañez1

1 Unidad de Biofísica (Centro Mixto Consejo Superior de Investigaciones Cientificas–Universidad del Pais Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea), P.O. Box 644, 48080 Bilbao, Spain,2 CIC-BIOGUNE Structural Biology Unit, Parque Tecnologico Zamudio, Bizkaia, SPAIN, 3 Visiting scientist on leave from the institute of Biophysics, Bulgarian Academy of Sciences, Sofia, 4Université De Bordeaux, INSERM U869, Institut Europeén de Chimie et de Biologie, Pessac, FRANCE, 5MRCCentre for Protein Engineering and MRC Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge,CB2 0QH, UK.

BAK is a key effector of mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP) whose molecular mechanism of action remains to be fully dissected in intact cells, mainly due to the inherent complexity of the intracellular apoptotic machinery. Here, we show that core features of the BAK-driven MOMP pathway can be reproduced in a highly simplified in vitro system consisting of recombinant human BAK lacking the carboxyl-terminal 21 residues (BAKΔC) and tBID in combination with liposomes bearing an appropriate lipid environment. Using this minimalist reconstituted system we established that tBID suffices to trigger BAKΔC membrane insertion, oligomerization and pore formation. Furthermore, we demonstrate that tBID-activated BAKΔC permeabilizes the membrane by forming structurally dynamic pores rather than a large proteinaceous channel of fixed size. We also identified two distinct roles played by mitochondrial lipids along the molecular pathway of BAKΔC-induced membrane permeabilization. First, using several independent approaches we showed that cardiolipin (CL) directly interacts with BAKΔC leading to a localized structural rearrangement in the protein which primes BAKΔC for interaction with tBID. Second, we provide evidence that selected curvature-inducing lipids present in mitochondrial membranes specifically modulate the energetic expenditure required to create the BAKΔC pore. Collectively, our results support the notion that BAK functions as a direct effector of MOMP akin to BAX, and also add significantly to the growing number of evidence indicating that mitochondrial membrane lipids are actively implicated in BCL-2 protein family function.


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P7.18THE INFLUENCE PLANT EXTRACT ON THE LIPID SIGNALING IN DEPEND OF MONO- AND BI-VALENT IONS

Sukiasyan A.R.11 UNESCO Chair - Life Sciences International Educational Center,Acharian 35, 0040 Yerevan, Republic of Armenia

The basic structural element of cell membranes is the lipid bilayer. The lipid bilayer plays a pivotal role in signal transduction. It is known that most physiological activities involve some kind of lipid-based receptor-ligand contact interactions. In this work the influence of plant extracts of Hypericum perforatum on some electrical properties of lipid bilayers was investigated. Lipid bilayers were formed with total phospholipids from cow brain. After forming a “black lipid film” in membrane washing solution, the plant extract was added. For our experiments the membrane washing solutions were 0.1M KCl, NaCl, and CaCl2. Plant extracts were prepared on base to those solutions. The electrical properties of the lipid bilayers were evaluated both by specific membrane resistance (gm= 10-9 Ω cm-2) and membrane breaking potential (Ubp=mV). After adding the plant extract in KCl, NaCl, or CaCl2 membrane washing solutions, the value of gm changed by two, four, or one order of magnitude respectively. During those processes the value of Ubp increased by 13% and 19% in monovalent areas (K+, Na+) and decreased on 5% in bivalent areas (Ca2+). The presence of Hypericum perforatum extract affected the electroporation of the lipid bilayer by changing its mechanical properties. Transport of ions such as K+, Na+, and Ca2+ through lipid bilayer pores discharged the membrane potential and duration, tending to cause a dielectric breakdown of the lipid bilayer in presence of the plant extract. Our results are of current interest for biomedical research and for clinical electrotherapy using Hypericum perforatum as an anti-inflammatory drug.


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P7.19INFLUENCE ON MODELING OXIDIZING PROCESSES OF THE EXTRACT OF ARTEMISIA ABSINTHIUM L.

Armen Kirakosyan1, Armen Hambardzumyan1

1 State Engineering University of Armenia, Department of Chemical Technology and Environmental Engineering, 105, Teryan Str., 0009 Yerevan, Armenia

The major aim of the present study was to investigate the role of the Artemisia absinthium L. plant extract as natural antioxidant in model oxidative stress. Oxidative stress plays an important role in the pathogenesis of various diseases. It is known that most physiological activities involve some kind of lipid-based receptor-ligand contact interactions. Here we present our results on the influence of plant extracts from Artemisia absinthium L. on some electrical properties of lipid membranes (BLM), products of lipid peroxidation (LPO) and peroxidase activity of extract. The dose and thermal-dependent effects of our samples were determined. All results were presented relative to the total protein of the samples. The inhibition activity of both plant extracts as related to products of LPO testifies about changes in a free radical process during oxidative stress. Not thermally treated extract has a low antioxidant activity, high value of specific membrane resistance (gm = 10-9 Ω cm-2) and membrane breaking potential (Ubp=mV), and high peroxidase activity. These findings are very important for antioxidant therapy. Our results suggest that the antioxidant status of Artemisia absinthium L. presents a correlation with both the dose and the thermal method of preparation of extracts. These results were statistical processed with a special computer program MatLab, and can be useful in clinical evaluation of drug plant extracts for antioxidant therapy. Our results are of current interest for biomedical research using Artemisia absinthium as an anti-inflammatory drug. These investigations were supported by ANSEF grant 07-NS-

biochem-1440.


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P7.20PORE FORMING DOMAIN OF COLICIN A: A MODEL TO STUDY LIPID-PROTEIN INTERACTIONS.

Iván Bermejo1, Alain Ibañez1 and Ana Rosa Viguera1 1 Unidad de Biofísica (UPV/EHU-CSIC), Leioa.Vizcaya (Spain)

Pore forming domain of colicin A is being used as a model polypeptide in an attempt to obtain thermodynamic data on lipid-protein interactions. Interactions with lipid derivatives and detergents have been proben by several techniques. Polyamino acid variants of the domain are analysed at the level of stability and lipid affinity. The interaction of wild type domain with model membranes is electrostatically driven and global unfolding of the polypeptide is mandatory. Mutants are already unfolded and interaction with lipid are several orders of magnitude faster in the forward reaction. The inserted form of the mutants is similar to the one obtained for the wild type domain. Protein solubilization or extraction from the lipidic complexes is under study. Oligomeric species are obtained after the incubation with some of the detergents. It is to be established to what extend these are physiologically relevant forms.


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P7.21EFFECT OF ORITAVANCIN IN S. AUREUS BACTERIA. A BIOPHYSICAL APPROACH.

Carme Suárez-Germà1,2, M. Teresa Montero1,2, Jordi Hernández-Borrell1,2, Òscar Domènech1,2

1 Physical Chemistry Department, Faculty of Pharmacy, University of Barcelona, Avda. Joan XXIII s/n, 08028 Barcelona.2 IN2UB, Institute of Nanoscience and Nanotechnology from the University of Barcelona.

The advent of Staphylococcus aureus strains that are resistant to virtually all antibiotics has increased the need for new antibacteriall agents. An example of new therapeutic potential is oritavancin. Oritavancin is an amphiphilic derivative of vancomycin showing fast and extensive killing activities against multi-resistant (including vancomycin insusceptible) Gram-positive organisms with no marked toxicity towards eukaryotic cells. Studies of membrane permeability demonstrated that oritavancin induced destabilization in synthetic membranes as well as in membranes formed with lipids extracted from the bacteria, having a preferential action on membranes containing cardiolipin. This destabilizing effect was observed by atomic force microscopy (AFM) showing a preferential action on cardiolipin in synthetic bilayers and pore formation in bilayers formed with lipids extracted from the bacteria.Similarly, it was studied the permeability on living bacteria. It was found less membrane destabilization in bacteria susceptible to vancomycin than in the wild type. On the other hand, S. aureus bacteria were trapped in polycarbonate filters and analyzed by AFM. In this case, it was studied the degradation of the bacterial peptidoglycan cell wall due to the addition of lysostaphin. This work shows how AFM and biophysical methods can help in the characterization of antibiotic-membrane interactions and sheds more light on the mode of action of oritavancin.


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P7.22EFECTO DEL TREALOSALÍPIDO SOBRE LAS PROPIEDADES FUNCIONALES Y ESTRUCTURALES DE LA CALCIO ATPASA DE RETÍCULO SARCOPLÁSMICO.

Scheherezade García1, Antonio Ortiz1, Francisco J. Aranda1 y J. A. Teruel11 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, E-30100 Murcia, Spain.

Debido a su baja toxicidad, carácter biodegradable y efectividad a temperaturas extremas y valores de pH, hay un interés creciente en considerar a los biotensioactivos como una alternativa potencial a los compuestos sintetizados químicamente [1-4].Debido a estas actividades, es de gran interés profundizar en el mecanismo molecular de la interacción del trealosalípido (TL), glucolípido biotensioactivo secretado por Rhodococcus sp, sobre los componentes de las membranas celulares. En este trabajo nos centramos en el efecto del TL sobre las propiedades estructurales y funcionales de la calcio ATPasa de retículo sarcoplásmico. Para ver el efecto del biotensioactivo sobre la estructura de la proteína se llevaron a cabo estudios de espectroscopía de infrarrojo a distintas temperaturas, observándose cambios conformacionales en todo el rango de temperatura estudiado, principalmente una disminución en el contenido de hojas β y en un aumento de la agregación de la proteína y estructura desordenada. Estos resultados sugieren una desestabilización térmica de la proteína en presencia de TL, produciendo un descenso en la temperatura de desnaturalización. Para el estudio de las propiedades funcionales de la proteína se realizaron medidas de la actividad de hidrólisis de la calcio ATPasa. En presencia de TL a concentraciones por debajo de la CMC, se observó una inhibición de la actividad del 50%.Mediante el uso de análogos del ATP, como el TNP-AMP, se determinaron las propiedades de unión de nucleótidos a la calcio ATPasa, observando una inhibición de un 40% de la unión en presencia del biotensioactivo.Se propone que el TL podría inducir cambios conformacionales en la proteína que podrían estar afectando a la zona de unión de nucleótidos, constituida principalmente por lamina β, contribuyendo a la desestabilización térmica de la proteína.

[1] Cameotra, S.S., Makkar, R.S. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 50:520-529[2] Desai, J.D., Banat, I.M. (1997) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61:47-64.[3] Rodrigues, L., Banat, I.M., Teixeira, J., Oliveira, R. (2006). J. Antimicrob.Chemother. 57:609-618.[4] Singh, P., Cameotra, S.S. (2004). 22:142-146.

Subvencionado por el MCINN (Proyecto CTQ2007-66244a A.O)


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P7.23RECONSTITUTION OF E. COLI PROTO-RING ELEMENTS IN GIANT UNILAMELLAR VESICLES

Elisa J. Cabré1, Ariadna Martos1,2, Ana Raso-Alonso1, Miguel Vicente3, Germán Rivas1, Mercedes Jiménez1

1 Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid (SP)2 Biophysics-BIOTEC TU Dresden (D)3 Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Madrid (SP)

Our goal is to reconstitute the multi-protein complex that initiates bacterial cell division (the proto-ring) onto biomimetic membranes under controlled physicochemical conditions that reproduce the crowded intracellular environment and the surface effects found in the bacterial cell. In Escherichia coli, the proto-ring formed by FtsZ (a GTPase-bacterial ancestor of tubulin), FtsA (an amphitropic protein) and ZipA (a membrane protein) that assemble at the cytoplasmatic membrane forming a structure required for the incorporation of the remaining division proteins [1]. In this work, we study the activity, interactions and assembly properties of FtsZ in reconstructions of the proto-ring structured as giant vesicles (GUVs) which are a very useful model membrane system in reconstitution experiments. They are closed lipid bilayers with diameters well above the optical resolution limit, from several to hundreds of micrometers. Due to their large size, they are perfectly suited to investigations by optical microscopy and the behavior of macromolecules trapped in its interior (in our case divisome elements) can be studied by micro-spectroscopy techniques [2].We have incorporated, for the first time, FtsZ and FtsA onto giant vesicles obtained from bacterial inner membranes (GUIMVs). We have used confocal microscopy to determine the structural organization and spatial distribution of fluorescently labelled FtsZ and FtsA inside the vesicles. While isolated FtsA is found adsorbed to the inner face of GUIMVs, the addition of FtsZ together with GTP analogues results in its dislodgement and its association to the FtsZ fibers in the lumen, suggesting that the FtsA-membrane interaction can be modulated by FtsZ polymers [3]. We are currently extending these studies to optimize the control of FtsZ assembly triggering inside the giant vesicles, and to determine the impact of crowding and nucleoid-like structures on the behavior of the proto-ring elements in the vesicle lumen. Finally, reconstitution and biochemical/biophysical studies using large and giant vesicles with inside-out proto-ring elements are being done in parallel to help to determine the biological significance of our findings.


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P8.09MODULACIÓN DE LAS INTERACCIONES ENTRE PROTOFILAMENTOS DE LOS MICROTÚBULOS POR TAXANOS MODIFICADOS.

Ruth Matesanz1, Javier Rodríguez-Salarichs1,2, Benet Pera1, Ángeles Canales1,3, José Manuel Andreu1, Jesús Jiménez-Barbero1, Wim Bras4, Aurora Nogales5, Wei-Shuo Fang6, José Fernando Díaz1

1 Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Ramiro de Maeztu 9, 28040 Madrid.2 Centro de Estudios Avanzados de Cuba. Carretera San Antonio km 1,5, Valle Grande, La Lisa, Ciudad Habana, CP. 17100 Cuba3 Departamento de Química Orgánica I, Fac. Ciencias Químicas, Universidad Complutense de Madrid, Avd. Complutense s/n, 28040 Madrid.4 Nederlandse Organisatie voor Wetenshappelijk Onderzoek (NWO), DUBBLE CRG/ESRF BP 220 F38043 Grenoble Cedex, Francia.5 Instituto de la Materia. Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Serrano 121, 28006 Madrid.6 Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences, 1 Xian Nong Tan Street, Beijing 100050, China.

Los compuestos antitumorales estabilizadores de microtúbulos como el paclitaxel o el docetaxel modifican la asociación entre moléculas de αβ-tubulina promoviendo su ensamblaje en microtúbulos. Los microtúbulos ensamblados en presencia de cada uno de estos compuestos tienen diferentes números de protofilamentos. Esta modificación en la estructura de los microtúbulos, que ocurre a través de un mecanismo aún sin caracterizar, está probablemente relacionada con los cambios en las interacciones tubulina-tubulina responsables de la actividad estabilizadora. Hemos caracterizado los efectos que provocan en la estructura de los microtúbulos diferentes taxanos modificados en las posiciones C2, C7, C10 y C13 usando medidas de dispersión de rayos X a bajo ángulo (SAXS). Las modificaciones en las posiciones C7, C10 y C2 provocan cambios en el ángulo entre los protofilamentos y por ello alteraciones en la estructura del microtúbulo, mientras que las modificaciones en la posición C13 no tienen influencia. Los efectos observados se han explicado usando docking ayudado de datos de RMN y simulaciones de dinámica molecular. Los resultados del modelado indican que las posiciones C7 y C10 influyen en la conformación de tres elementos clave en las interacciones laterales del microtúbulo (el lazo M, S3 y H3) que modulan los contactos entre protofilamentos adyacentes, mientras que los cambios en C2 recolocan ligeramente el ligando en el sitio de unión modificando la interacción de la posición C7 con el lazo M. Aunque estrictamente no es posible aislar los efectos individuales provenientes de la unión del ligando en los sitios interno o del poro, las simulaciones de dinámica molecular indican que el proceso de unión influye fuertemente en las interacciones en tres regiones de la tubulina con elementos de estructuras secundarias diferentes bien definidas. De hecho estas regiones, el lazo M (entre S7 y H9), la hélice H3 y S3 (figura), se han descrito como elementos clave para las interacciones entre protofilamentos [1].

Esquema de la interacción del ligando a los sitios interno y del poro con los elementos estructurales responsables de la interacción entre protofilamentos. Microtúbulo visto desde el extremo positivo.

[1] Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R.A., Downing, K.H. (1999) Cell 96, 79-88


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P8.10ZAMPANOLIDA, UN NOVEDOSO AGENTE ESTABILIZADOR DE MICROTÚBULOS QUE UNE COVALENTEMENTE AL SITIO DEL PACLITAXEL.

Jessica Field1,2*, Benet Pera3*, Enrique Calvo4*, Angeles Canales6*, Didier Zuwerra5, Chiara Trigili3, Arun Kanakkanthara1,2, St. John Wakefield7, A. Jonathan Singh8, Jesús Jiménez-Barbero3, Peter Northcote1,2,8, John Miller1,2, José Antonio López4, Ernest Hamel9, Isabel Barasoain3, Karl-Heiz Altmann5 and José Fernando Díaz3.1 Centre for Biodiscovery and 2 Schools of Biological Sciences and 8 Chemical and Physical Sciences, Victoria University of Wellington, Wellington, New Zealand. 3 Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones Cientfícas, Madrid, Spain. 4 Unidad de Proteómica, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, Madrid, Spain. 5 Institute of Pharmaceutical Sciences, Swiss Federal Institute of Technology, Zürich, Switzerland. 6 Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, Spain.7 Department of Pathology, Wellington School of Medicine and Health Sciences, Wellington, New Zealand.9 National Cancer Institute at Frederick, National Institutes of Health, Frederick, USA.* Estos autores han contribuido por igual en la elaboración del presente estudio.

La zampanolida (Figura 1) es una potente molécula citotóxica aislada originalmente de extractos crudos de la esponja Fasciospongia rimosa colectada en Okinawa [1]. Dicha molécula posee un anillo macrólido altamente insaturado de 20 miembros y una cadena lateral de N-acil hemiaminal. Posteriormente, la zampanolida se identificó y aisló también en extractos crudos de la esponja Cacospongia mycofijiensis colectada en Tonga, y se desveló su capacidad estabilizante de microtúbulos siendo similar a la ejercida por el paclitaxel. La zampanolida promueve el ensamblaje de tubulina en microtúbulos, lo que produce una parada de las células en la fase G2/M del ciclo celular que conduce a un proceso de muerte celular por apoptosis [2]. En el presente trabajo hemos caracterizado y descrito un nuevo patrón químico de agentes estabilizantes de microtúbulos, el de la zampanolida, estudiando también el análogo sintético (-)-dactilolida (Figura 1) el cual carece de cadena lateral. Dichos compuestos compiten con el paclitaxel y sus biomiméticos por el sitio de unión en la tubulina e inducen su ensamblaje de un modo dependiente de magnesio a microtúbulos estables al frío y a altas concentraciones de calcio. Este mecanismo de acción de la zampanolida y la dactilolida implica la unión covalente a residuos cercanos al poro tipo I del microtúbulo, aunque se aprecian diferencias en el modo de unión de los compuestos estudiados debidas a la ausencia de la cadena lateral en la dactilolida. Mediante técnicas de resonancia magnética nuclear, hemos determinado la conformación de la dactilolida unida y libre mediante estudios de TR-NOESY, así como los epítopos de unión realizando estudios de STD. La identificación de los residuos de la tubulina a los que la zampanolida une covalentemente, se ha llevado a cabo mediante técnicas de espectrometría de masas. El residuo marcado por la zampanolida resulta ser Asn-228. Dicho residuo localiza en el sitio interno del paclitaxel y, al igual que la ciclostreptina [3], la zampanolida une covalentemente a él ejerciendo su actividad estabilizante de microtúbulos.

Figura 1: Estructuras de la zampanolida y de la dactilodida.

[1] Tanaka, J., and Higa, T. (1996) Tetrahedron Letters 37, 5535-5538.[2] Field, J.J., Singh, A.J., Kanakkanthara, A., Halafihi, T., Northcote, P.T., and Miller, J.H. (2009) J. Med.Chem. 22, 7328-7332.[3] Buey, R. M., Calvo, E., Barasoain, .I, Pineda, O., Edler, M. C., Matesanz, R., Cerezo, G., Vanderwal, C. D., Day, B. W., Sorensen, E. J., López, J. A., Andreu, J. M., Hamel, E., and Díaz, J. F. (2007) Nat. Chem. Biol. 2, 117-125.


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P8.11MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS MACRÓLIDOS CITOTÓXICOS AMPHIDINOLIDAS X Y J.

Chiara Trigili1, Benet Pera1, Marion Barbazanges2, Janine Cossy2, Christophe Meyer2, Oriol Pineda3, Carles Rodríguez-Escrich3, Fèlix Urpí3, Jaume Vilarrasa3, J. Fernando Díaz1, and Isabel Barasoain1.1 Departamento de Biología Físico-Química, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, España.2 Laboratoire de Chimie Organique, ESPCI, CNRS, Paris, Francia.3 Departamento de Química Orgánica, Universitat de Barcelona, Facultad de Química, Barcelona, España.

Los microtúbulos y los filamentos de actina desempeñan importantes funciones biológicas relacionadas con la mitosis, citocinesis, señalización celular, transporte intracelular y motilidad celular de las células eucariotas. Por ello, los compuestos dirigidos contra estas proteínas de citoesqueleto pueden ser utilizados como antitumorales o agentes anti-HIV. Existen varios medicamentos, que tienen como diana la proteína mayoritaria de los microtúbulos (α,β-tubulina), que actúan estabilizando (como paclitaxel) o desestabilizando (como vinca o colchicina) estas estructuras celulares. Sin embargo aun no existe ningún compuesto en fase clínica que tenga como diana la actina.Las Amphidinolidas, aisladas de dinoflagelados Amphidinium sp. [1,2], representan una serie de macrólidos citotóxicos estructuralmente diferentes entre ellos. Sus mecanismos de acción son desconocidos, con excepción de la amphidinolide H (Figura 1). Este compuesto, el de mayor tamaño en la estructura del anillo, muestra una citotoxicidad in vivo en el rango de nM contra varias líneas de carcinoma [3] y una deformación irreversible de las fibras de actina en las células tratadas con el [4] mientras que in vitro estabiliza los filamentos de actina (F-actina), estimulando su polimerización [5,6]. Por el otro lado, la mayoría de las amphidinolidas más pequeñas son citotóxicas en el rango de μM contra células de leucemia linfocítica L1210 [7,8,9]. Dado que estos últimos compuestos (1, 2, 3 y 4 (Figura 1)) son más fáciles de sintetizar, nos ha parecido conveniente estudiar su comportamiento desde un punto de vista biológico y bioquímico. Hemos examinado sus efectos sobre la proliferación de las líneas celulares A2780 (carcinoma de ovario humano) y LoVo (carcinoma de colon humano), así como sobre las proteínas del citoesqueleto (tubulina, actina y filamentos intermedios) en las células de carcinoma de pulmón A549 y epiteliales de riñón de rata-canguro Ptk2. También hemos estudiado el efecto in vitro sobre la polimerización de actina.

Nuestros resultados indican que el citoesqueleto de microfilamentos de actina, y no los microtúbulos, es la diana biológica de estos ligandos. También indican que éste puede ser el caso de otros macrólidos pequeños de la familia amphidinolida. El efecto de los compuestos en el ensamblaje de actina in vitro es coherente con la despolimerización observada en las células tratadas (A549 y Ptk2). In vitro observamos una inhibición del ensamblaje de G-actina a F-actina, pero no el desensamblaje de la F-actina polimerizada.

[1] Usui, T. (2007) Biosci. Biotech. Biochem. 71, 300–308.[2] Kobayashi, J., Shimbo, K., Sato, M., Shiro, M., Tsuda, M. (2000) Org. Lett. 2, 2805–2807.[3] Kobayashi, J., Shimbo, K., Sato, M., Tsuda, M. (2002) J. Org. Chem. 67, 6585–6592.[4] Usui, T., Kazami, S., Dohmae, N., Mashimo, Y., Kondo, H., Tsuda, M., Terasaki, A.G., Ohashi, K., Kobayashi, J., Osada, H. (2004) Chem. & Biol. 11, 1269–1277.[5] Oda, T., Namba, K., Maeda, Y. (2005) Biophys. J. 88, 2727–2736.[6] Saito, S., Feng, J., Kira, A., Kobayashi, J., Ohizumi, Y. (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun.320, 961–965.[7] Tsuda, M., Izui, N., Shimbo, K., Sato, M., Fukushi, E., Kawabata, J., Katsumata, K., Horiguchi, T., Kobayashi, J. (2003) J. Org. Chem. 68, 5339–5345.[8] Kobayashi, J., Sato, M., Ishibashi, M. (1993) J. Org. Chem. 58, 2645–2646.[9] Kobayashi, J., Kubota, T. (2007) J. Nat. Prod. 70, 451–460


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P8.12RECONSTITUTION OF DIVISOME ELEMENTS IN FUNCTIONALIZED MICRO-BEADS

Begoña Monterroso,1 Ariadna Martos,1 Rubén Ahijado,1 Belén Reija,2 Mercedes Jiménez,1 Silvia Zorrilla,2 Germán Rivas.11 Centro de Investigaciones Biológicas (CIB), CSIC. Ramiro de Maeztu, 9. 28040 Madrid, Spain.2 Instituto de Química Física Rocasolano (IQFR), CSIC. Serrano, 117. 28006 Madrid, Spain.

Elements of the multi-protein complex that initiates bacterial cell division in E. coli (the proto-ring) have been reconstructed onto biomimetic membranes under controlled physicochemical conditions mimicking the intracellular environment where they work in vivo. The proto-ring is formed by three proteins (the GTPase FtsZ, FtsA- an amphitropic protein, and ZipA- a membrane protein) that assemble at the cytoplasmic membrane forming a structure required for the incorporation of the remaining division proteins [1]. Micro-beads have been functionalized by coating them with either natural inner membrane or E. coli lipids. Co-sedimentation assays monitored by fluorescence measurements of the protein content after micro-beads pelleting were performed to characterize the binding affinity of FtsA for E. coli lipids reconstituted onto microbeads. Parallel measurements have allowed assessing the interaction of amphitropic FtsA with the natural inner membrane that being more complex than artificial lipid membranes, maintain a composition and distribution of proteins and lipids resembling more closely the native membranes. The interaction of FtsA with the natural inner membrane is stronger than with the E. coli lipids, suggesting a more favorable interaction with the lipids within the natural membrane environment and/or a net contribution from the native membrane proteins. The interaction of FtsZ, whose GTP dependent assembly/disassembly cycle is essential for the formation of the septal ring in vivo [1,2], with functionalized beads has been measured using either E. coli membrane or lipids doped with increasing amounts of ZipA. Preliminary results on FtsZ binding show a weak affinity for the membrane, in agreement with the results derived from a previous characterization of the interaction between ZipA and FtsZ in solution [3] and in accordance with what could be expected for a dynamic process. The characterization of the activity, interactions with companion division proteins and assembly properties of FtsZ under these reconstructions mimicking the boundary conditions that determine cellular behavior may be crucial for the understanding of bacterial division, as an approach within the quantitative synthetic biology field aimed to simplify studies in the cell [4,5].

[1] Vicente, M., Rico, A. I., Martínez-Arteaga, R., and Mingorance, J. (2006) J. Bacteriol. 188, 19-27.[2] Adams, D. W., and Errington, J. (2009) Nature Rev. Microbiol. 7, 642-653. [3] Martos, A., Alfonso, C., López-Navajas, P., Ahijado-Guzmán, R., Mingorance, J., Minton, A.P., and Rivas, G. (2010) Biochemistry 49, 10780-10787[4] Liu, A. P., and Fletcher, D. A. (2009) Nature Rev. Mol. Cell Biol. 10, 644-650.

[5] Noireaux, V., Maeda, Y. T., and Libchaeber, A. (2011) PNAS 108, 3473-3480.


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P9.09RNA SILENCING SUPPRESSOR P19 BINDS TRINUCLEOTIDE REPEATS CONTAINING G-U MISMATCHES

Jevgenia Tamjar1, Alexander Popov2 and Lucy Malinina1

1Structural Biology Unit, CICbioGUNE, Technology Park of Bizkaia, Derio, 48160, Spain2European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble, 38043, France

Expanded tracts of repeated CNG-triplet sequences in DNA cause many human diseases ([1,2]). We think ([3]) that repeats cause diseases through RNA silencing pathway (RNAi) due to formation of the double helical RNAs, containing mismatches at each third position. To be recognized by RNAi machinery, such RNAs have to be structurally similar to the canonic A-RNA helix. We are using X-ray crystallographic approaches to study CNG-repeating RNAs in complex with RNA silencing suppressor (RSS) p19, which recognizes them by length and overall helical structure ([4,5]). This work deals with CGG•CUG repeat, which contains mismatched base pair G•U. Here, we present three newly solved crystal structures: (i) RNA [p(CGG)3C(CUG)3]x2 studied at 1.46 Å resolution, which has 12 bp helical pitch and does not form complexes with p19, (ii) RNA [pGG(CGG)3(CUG)2CC]x2 at 1.86 Å resolution, which forms A-RNA duplex with 11 bp per turn and can be bound to p19, and (iii) p19, complexed with the same RNA at 1.99 Å resolution. Comparative structural analysis of RNA [pGG(CGG)3(CUG)2CC]x2 in p19-bound and p19- free forms shows some distinctions in RNA double-helical structure: (i) duplex bending is changed to fit the protein shape in the complex, and (ii) G•U base pairs are altered, apparently, to support this fitting. In case of free RNA, there takes place a formation of typical Wobble G•U base pairs, stabilized by two hydrogen bonds N1•••O2 and O6•••N3 between guanine and uridine, respectively. In contrast, G•U base pairs are slightly skewed, when complexed with p19, and form different H-bonds, namely: N1•••O2 and N2•••O2 between guanine and uridine, respectively. Such a shift causes some distortions in the neighboring Watson-Crick G•C base pairs, including the increase in the propeller-twist and weakening of pairing. In summary, our data indicate that G•U containing double-helical RNA structure is sequence-dependable. In particular, the presence of a C•C mismatch alters the canonical duplex structure, hence preventing the RNA from binding with p19. Once the proper duplex is formed, it can be recognized and bound by p19, despite the presence of G•U base pairs in every third position of the RNA sequence.

[1] Gatchel J.R., Zoghbi H.Y. (2005) Nat. Rev. Genet., 6, 743-55.[2] Mirkin S.M. (2007) Nature., 447, 932-40.[3] Malinina L. (2005) J. Biol. Structure & Dynamics, 23, 233-6.[4] Ye K., Malinina L., and Patel D.J. (2003) Nature, 426, 874-878. [5] Vargason J.M., Szittya G., Burgyan J., and Tanaka Hall T.M. (2003) Cell, 115, 799-811.


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P9.10INTERACCIÓN DE CARBOHIDRATOS CON CÚADRUPLEX DE GUANINAS

E. Vengut2, I. Gómez-Pinto1, R. Lucas2, A. Aviñó3, J. J. Reina2, R. Eritja3, C. González1, J. C. Morales2 1 Instituto de Química-Física Rocasolano, CSIC. Serrano 119, 28006 Madrid, Spain2 Department of Bioorganic Chemistry, Instituto de Investigaciones Químicas, CSIC - Universidad de Sevilla3 Instituto de Investigación Biomédica de Barcelona, IQAC, CSIC, CIBER - BBN Networking Centre on Bioengineering, Biomaterials and Nanomedicine.

Las interacciones carbohidrato-ácido nucleicos son fundamentales en muchos procesos de reconocimiento DNA-ligando y RNA-ligando. Aunque este tipo de interacciones ocurren predominantemente a través del surco menor del DNA, recientemente hemos demostrado que también se pueden dar interacciones de apilamiento entre el carbohidrato y los pares de bases terminales de un dúplex de DNA. Esta interacción se ha caracterizado mediante el uso de carbohidratos unidos covalentemente al extremo 5’- de un oligonucleótido [1].Como extensión de este trabajo, estamos llevando a cabo estudios de la posible interacción de carbohidratos con tétradas de guanina. La formación de estas tétradas da lugar al DNA tetracatenario (o cuádruplex). Los cuádruplex de guaninas parecen estar implicados en diversos procesos biológicos, como el mantenimiento de los telómeros, y se ha propuesto su formación en regiones promotoras del DNA. También son estructuras muy atractivas en el campo de la química supramolecular y nanotecnología.En esta comunicación describimos nuestros estudios por RMN y otras técnicas biofísicas de carbohidratos unidos covalentemente en el extremo 5’ de oligonucleótidos ricos en guaninas, capaces de formar cuadruplexes. Estos estudios se han llevado a cabo con dos tipos de cuádruplex modelo: el TBA (“thrombin binding aptamer”) y diversas variantes de la secuencia telomérica humana. En el primer caso, el oligonucleótido no modificado adopta una estructura monomérica de cuádruplex antiparalelo. En el segundo caso, el oligonucleótido adopta dos conformaciones, que se encuentran en equilibrio en disolución (cuádruplex paralelo y antiparalelo). La presencia del carbohidrato unido al extremo 5’, provoca cambios conformacionales en ambos casos, siendo especialmente dramáticos en el caso de la secuencia telómerica humana, donde el equilibrio se ve desplazado hacia un cuádruplex paralelo tipo “propeller”.

[1] R. Lucas, I. Gómez-Pinto, A. Aviñó, J. Reina, R. Eritja, C. González, and J.C. Morales. (2011) J. Am. Chem. Soc. 133, 1909–1916


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P10.09LAS INTERACCIONES PROTEÍNA-PROTEÍNA DE LA PKCα CONTROLAN EL ENSAMBLAJE DEL CITOESQUELETO EN CÉLULAS PC12 DIFERENCIADAS CON NGF Y ATP.

Marta Guerrero-Valero1, Consuelo Marín-Vicente2, Teresa Coronado-Parra1, Juan C. Gómez-Fernández1, Roman A. Zubarev2 y Senena Corbalán García1.1 Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, Apdo. 4021, E-30100 Murcia, España.2 Department of Medical Biochemistry and Biophysics. Karolinska Institutet, SE-171 77 Stockholm, Sweden

El dominio C2 de la PKCα es un módulo de unión a la membrana plasmática que depende de la presencia de Ca2+ en el medio y que está implicado en la localización de este isoenzima en la membrana plasmática. Estudios biofísicos han mostrado que la región rica en lisinas de este dominio participa en la activación del enzima dependiendo de la presencia de PtdIns (4,5)P2. Experimentos realizados in vivo han demostrado que en células PC12 diferenciadas con NGF, la PKCα se activa en presencia de un flujo de Ca2+ procedente del medio extracelular que se produce en respuesta a la estimulación con ATP. Esto desencadena la locación del enzima en la membrana plasmática donde se une a PtdIns (4,5)P2 a través de la región rica en lisinas de su dominio C2. La diferenciación de estas células con NGF y ATP desencadena un fenotipo neuronal donde la PKCα juega un papel muy importante, pero muchas de las etapas intermedias en su ruta de actuación están aún por dilucidar.Para estudiar las interacciones proteína-proteína establecidas por la PKCα en este contexto celular, se realizaron coinmunoprecipitaciones con la enzima en células PC12 diferenciadas con NGF y ATP y se compararon con las obtenidas con NGF y medio de crecimiento. Las proteínas que interaccionaban con la PKCα se identificaron por espectrometría de masas en tándem, acoplada a cromatografía líquida LC-MS/MS. Este análisis mostró que varias proteínas, como plectina y β-actina, interaccionan específicamente con la PKCα cuando las células PC12 se diferencian con NGF y ATP. Dicha interacción fue validada mediante doble inmunofluorescencia y análisis de colocalización de las proteínas endógenas en las mismas células. Se detectó un aumento en la colocalización de la PKCα y plectina cuando las células estaban diferenciadas con NGF y ATP. Además, el silenciamiento génico de la PKCα mediante el uso de siRNA produjo un efecto muy drástico en el ensamblaje del citoesqueleto, sugiriendo que esta enzima participa en el ensamblaje de los filamentos intermedios durante la diferenciación neuronal a través de plectina. Asimismo, la remodelación de la actina cortical asociada con la migración celular cesó al disminuir la síntesis de PKCα, lo que indica que esta enzima está implicada en la dinámica de reorganización del citoesqueleto de actina durante este proceso. En conjunto, estos datos identifican a la plectina y β-actina como nuevas dianas funcionales de la señalización por PKCα dependiente de ATP y sugieren que esta enzima podría controlar el desarrollo neuronal a diferentes niveles mediante su interacción con varios componentes del citoesqueleto


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P10.10INTERACCIÓN DE NANOPARTICULAS DE ÁCIDO POLI (LÁCTICO-CO-GLICÓLICO) CON COMPONENTES DEL FLUIDO ALVEOLAR

Olga Cañadas1,2, Christian Ruge3, Uli F. Schaefer3, Claus-Michael Lehr3, Cristina Casals1,2 1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad Complutense de Madrid, 28040-Madrid, España2 CIBER Enfermedades Respiratorias,3 Department of Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, Saarland University, D-66123 Saarbrücken, Alemania

Los sistemas de administración de fármacos basados en nanopartículas son muy prometedores para la administración de fármacos por vía inhalatoria. Las nanopartículas inhaladas podrían interaccionar con los lípidos y proteínas del surfactante pulmonar al alcanzar el fluido alveolar, En este sentido, la proteína mayoritaria del fluido alveolar, SP-A, podría asociarse con las nanopartículas, recubriendo su superficie. En este trabajo hemos caracterizado la interacción de SP-A con nanopartículas de ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA-NP). Utilizando nanopartículas etiquetadas con una sonda fluorescente hemos determinado que SP-A se une a PLGA-NP con gran afinidad (KD = 0.57 nM). Medidas de dispersión de luz dinámica indican que la unión de la proteína a PLGA-NP no produce la aglomeración de las nanopartículas, lo que indica que la interacción de la proteína con PLGA-NP no alteraría la capacidad de las nanoparticulas de atravesar la barrera alveolo-capilar y/o ser capturadas por el epitelio alveolar por endocitosis. Además hemos estudiado la influencia de otros componentes presentes en el fluido alveolar (membranas del surfactante y calcio) en el comportamiento de PLGA-NP como vehículos de fármacos en el pulmón.


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P11.09CÁLCULO DE PROPIEDADES EN DISOLUCIÓN DE BIOMACROMOLÉCULAS RÍGIDAS A PARTIR DE MODELOS CON DETALLE A NIVEL ATÓMICO O DE RESIDUO. METODOLOGÍAS Y APLICACIONES.

D. Amorós1, A. Ortega1 y J. García de la Torre1

1. Departamento de Química-Física, Facultad de Química. Universidad de Murcia.. 30100. Murcia

El cálculo de propiedades hidrodinámicas y de propiedades derivadas de técnicas de dispersión de luz, tales como coeficientes de difusión, sedimentación, viscosidad intrínseca o radio de giro, de proteínas y otras macromoléculas biológicas que se comportan como partículas rígidas en disolución puede realizarse computacionalmente mediante el conocido como modelo de esferas. Gracias a esta metodología, y puesto que son conocidas las propiedades mencionadas en una partícula esférica y aplicando la teoría hidrodinámica, que incluye el efecto conocido de interacción hidrodinámica es posible evaluar la hidrodinámica de una partícula globular rígida cuya forma y topología puede ser modelada mediante esferas de un determinado radio. Para el cálculo directo de estas propiedades, se desarrollaron los programas de la serie HYDRO, que incluyen HYDRO [1] e HYDROPRO [2]. Mientras el primero implementa la metodología del modelo de esferas en sentido estricto y el usuario ha de proporcionar la posición y el número de esferas que componen el modelo, el segundo utiliza el conocido como modelo de concha, siendo las coordenadas del modelo inicial las de los átomos que componen su estructura, obtenida de cristalografía de rayos X, o técnicas análogas.En este estudio realizamos una comparación de los métodos empleados por HYDRO e HYDROPRO, y proponemos el empleo de un modelo de una esfera por residuo (en el caso concreto de proteínas globulares), para calcular las propiedades hidrodinámicas con un nivel de precisión prácticamente idéntico al modelo atómico. Esto resulta muy útil en los casos en los que sólo se dispone de las coordenadas del carbono alfa de la secuencia proteica y muestra además la posibilidad de modelar proteínas con estructura terciaria conocida mediante el modelo de esferas en sentido estricto. Demostramos cómo las propiedades calculadas mediante estas metodologías no superan el 4% de error respecto a las propiedades experimentales, cubriéndose todo el rango de tamaños moleculares de proteínas, desde 6100 Da (proteína BPTI) hasta los 2500 kDa del ribosoma 70S de E. coli. Asimismo mostramos aquí que la diferencia en la precisión del cálculo de propiedades no se ve prácticamente afectada por la utilización del nuevo modelo de una esfera por residuo. Mediante un amplio conjunto de propiedades experimentales de proteínas globulares de un elevado rango de tamaños y pesos moleculares, evaluamos los radios óptimos de las esferas que componen el modelo para los casos de HYDRO e HYDROPRO (en los modelos atómicos y de una esfera por residuo) aplicando los nuevos conceptos de los radios equivalentes [3].

[1] J. García de la Torre, S. Navarro, M.C. López Martínez, F.G. Díaz and J.J. López Cascales (1994). Biophysical Journal 67, 530-531. [2] J. García de la Torre, M.L. Huertas and B. Carrasco (2000). Biophysical Journal 78, 719-730.[3] A. Ortega, J. García de la Torre (2007), Biomacromolecules 8, 2464-2475.


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P11.10ESTUDIO POR ULTRACENTRIGACIÓN ANALÍTICA DE SISTEMAS BIOMACROMOLECULARES HETEROGÉNEOS. PREDICCIÓN Y ANÁLISIS DE DATOS EXPERIMENTALES.

A.I. Díez1, A. Ortega1 y J. García de la Torre1

1. Departamento de Química-Física, Facultad de Química. Universidad de Murcia.. 30100. Murcia

La ultracentrifugación analítica (AUC) ha sido clásicamente, y recientemente ha resurgido gracias a extraordinarios desarrollos instrumentales y de software, una de las herramientas más versátiles para la caracterización de la hidrodinámica y la termodinámica (interacciones, agregación, etc) de macromoléculas en disolución. La determinación de su tamaño y forma es una de las primeras aplicaciones de esta técnica, la cual se puede dividir según sus dos metodologías fundamentales: velocidad de sedimentación (SV) y equilibrio de sedimentación (SE). [1]Mientras SV permite, gracias a la separación producida por la fuerza centrífuga, determinar coeficientes de sedimentación y, en la mayoría de los casos, incluso coeficientes de difusión y pesos moleculares de los diferentes componentes en una disolución, SE es un método muy preciso, basado en fundamentos básicos, para determinar el peso molecular promedio en peso, y obtener a partir de él, parámetros de auto-asociación e interacciones heterogéneas entre las macromoléculas en disolución.Se encuentra disponible hoy en día una gran variedad de herramientas computacionales para el análisis de datos de ultracentrifugación analítica, implementando las últimas teorías desarrolladas para extraer la información de los experimentos de sedimentación. Se han logrado grandes avances en el estudio de proteínas, complejos proteicos y sistemas principalmente monodispersos, sin embargo en el campo de los biopolímeros, que incluye micelas, polielectrolitos, etc un parámetro muy importante es el de la polidispersidad, y es en este concepto donde más desarrollo es necesario dentro de la ultracentrifugación análitica, son necesarias herramientas que permitan alcanzar el nivel de precisión logrado en sistemas monodispersos. [2]Mostramos en este estudio los últimos avances que hemos realizado en el desarrollo de la caracterización experimental y análisis de datos de muestras polidispersas mediante ultracentrifugación analítica, tanto velocidad como equilibrio de sedimentación. La capacidad de extraer los parámetros que describen la polidispersidad y las distribuciones de masa y de tamaño de la muestra mediante métodos directos expande las posibilidades de la técnica de AUC, y ayuda especialmente a extender su importancia a otros campos de la biofísica, como polisacáridos o complejos de polisacáridos y otros biopolímeros.[3]

[1] Lebowitz J, Lewis MS, Schuck P (2002). Protein Science, 11, 2067-2079.[2] Harding SE, Abdelhameed, AS, Morris, GA (2010). Macromol. Biosci., 10, 714-720.[3] Diez AI, Ortega A, Garcia de la Torre, J (2011). BMC Biophysics. 4, 6.


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P11.11ESTUDIO ESTOCÁSTICO DE UN MODELO PROTOMETABÓLICO SIMPLE CON CIERRE METABÓLICO

Gabriel Piedrafita1, Federico Morán1, Athel Cornish-Bowden2, Francisco Montero1 1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid.2 Unité de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines, Centre National de la Recherche Scientifique, 13402 Marseille Cedex 20, France.

Un hecho fundamental en el desarrollo y mantenimiento de los primeros sistemas proto-biológicos debió ser la formación de algún tipo de organización metabólica “cerrada”. Concretamente, tal como sugiere la teoría de los sistemas M,R (Metabolism, Repair-systems) [1] las organizaciones biológicas presentan cierre a causas eficientes, i.e. todos los catalizadores (enzimas) implicados en el metabolismo deben ser producidos por el propio organismo para compensar la continua degradación a la que están sometidos. Recientemente, se ha propuesto un modelo de sistema metabólico simple que cumple con dichos requerimientos [2,3]. Un primer análisis determinista demuestra que el sistema es capaz, en un amplio rango de parámetros cinéticos, de reponer los catalizadores a pesar de su continua degradación, alcanzando así un régimen auto-mantenido robusto [4]. No obstante, para analizar su relevancia como posible modelo proto-metabólico, es necesario considerar otra serie de factores. Probablemente los sistemas proto-biológicos se desarrollaron confinados en volúmenes pequeños [5], y por tanto debieron estar sujetos a grandes fluctuaciones en las concentraciones. Por este motivo, se ha planteado una segunda aproximación estocástica para estudiar el efecto de las fluctuaciones derivadas del ruido interno en el comportamiento del sistema.El análisis dinámico revela que el sistema es capaz de alcanzar de nuevo un régimen auto-mantenido (en este caso, un estado cuasi-estacionario) para un amplio rango de valores de las constantes cinéticas. No obstante, el ruido interno, y por tanto el volumen del sistema, juegan un papel esencial en la evolución del sistema hacia la recuperación o la extinción. Si bien la respuesta frente a perturbaciones o concentraciones críticas de los intermediarios es más rápida para volúmenes menores del sistema, volúmenes demasiado pequeños son incompatibles con el régimen auto-mantenido y suponen irrevocablemente el colapso del sistema. Existe por tanto una transición de fase inducida por ruido para un cierto volumen crítico del sistema.Este estudio corrobora el interés de los sistemas simples de organización cerrada para comprender el desarrollo de los primeros sistemas proto-biológicos. Al mismo tiempo, impone una serie de requisitos espacio-temporales en los posibles escenarios de evolución prebiótica.

[1] Rosen, R. (1991) Life itself: a comprehensive inquiry into the nature origin and fabrication of life. New York: Columbia University Press.[2] Morán, F., Moreno, A., Minch, E., and Montero, F. (1996) In Langton, C.G., Shimohara, K., editors, Artificial Life V, 255-263. MIT Press, Cambridge, Massachusetts.[3] Letelier, J.C., Soto-Andrade, J., Guíñez Abarzúa, F., Cornish-Bowden, A., and Cárdenas, M.L. (2006) J Theor Biol 238:949-961.[4] Piedrafita, G., Montero, F., Morán, F., Cárdenas, M.L., and Cornish-Bowden, A. (2010) PLoS Comput Biol 6(8): e1000872.[5] Martin, W., Russell, M.J. (2003) Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 358(1429):59-85.


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P11.12APROXIMACIÓN PREDICTIVA IN SILICO: ANÁLISIS METABOLÓMICO PARA LA ELUCIDACIÓN DE LOS MECANISMOS DE ENFERMEDADES

Francisco Torrens1, Gloria Castellano2 1 Institut Universitari de Ciència Molecular, Universitat de València, Edifici d’Instituts de Paterna, A. C. No. 22085, 46071 València2 Cátedra Energesis de Tecnología Interdisciplinar, Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Guillem de Castro 94, 46003 València

Se presenta un estudio mediante Biología de Sistemas de una aproximación predictiva in silico, el cual se aplica al análisis de metabolitos (glucosa, colesterol y L treosina) para la elucidación del mecanismo de enfermedad en neoplasia de próstata [1]. El objetivo del presente informe es llegar a determinar un perfil metabólico capaz de diferenciar entre mecanismos de enfermedad en neoplasia de próstata [2]. Se siguen las conclusiones provisionales. (1) Hay un aliento de retos de cara a la Metabolómica, e.g., identificación del compuesto, alcance del metaboloma, intervalo biodinámico, índice de falsos descubrimientos y reproducibilidad analítica. La metabolómica aporta soluciones a muchos problemas rutinariamente encontrados: desconocidos mecanismo de acción del fármaco y toxicología, complicaciones del bioprocesado, necesidad de biomarcadores del estado de la enfermedad, etc. Sin embargo, si los estudios no se pueden ejecutar rápidamente y con la más alta atención a la calidad, hay un peligro de que el campo no se utilice a su más completo potencial. La plataforma permitió la rápida terminación de los estudios metabolómicos, mientras mantuvo todavía la calidad analítica y la reproducibilidad. Mucha velocidad y eficiencia asociadas a la plataforma fueron a causa de la habilidad para identificar rápidamente las pequeñas moléculas detectadas vía la extensa biblioteca. La plataforma representa una aproximación al análisis metabolómico no dirigido, la cual permite que los compuestos sean identificados rápidamente y con un alto grado de confianza, no precisamente los que varían estadísticamente, y la cual se esfuerza por mejorar la calidad de los datos y reducir falsas cabezas de serie para simplificar por último y ayudar la biointerpretación. (2) El modelado y simulación exitosos de la complejidad inherente a la psicología humana se hace posible, vía el uso de una aproximación predictiva in silico a la Biología de Sistemas. (3) Se mostró que varios caminos metabólicos se alteraron por la dieta. (4) La agresividad de la neoplasia de próstata se clasificó en benigna, localizada y metastática vía un estudio de cientos de miles de características iónicas. El logicial metabólico mostró que la sarcosina modula la invasividad.

Agradecimiento. F. T. agradece ayuda económica al Ministerio de Ciencia e Innovación (Proyecto No. BFU2010-19118).[1] Torrens, F. (2005) Partition of solvents and co solvents of nanotubes: Proteins and cyclopyranoses, in: Frontiers in Drug Design and Discovery, Caldwell, G.W., Atta-ur-Rahman, and Springer, B.A. (Eds.), Bentham, Hilversum (Holland), Vol. 1, pp. 231-266.[2] Torrens, F., and Castellano, G. (2009) Chem. Central J. 3(Suppl. I), 75–1-1.


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P12.09EFECTO DEL PH SOBRE EL PAPEL AMILOIDOGÉNICO DE LOS LÍPIDOS

Ana Salvador1, Mª Ángeles Frías2 Jon Ander Nieto1 y José Luís R. Arrondo1

1 Unidad de Biofísica (Centro mixto CSIC-UPV/EHU) y Depto. Bioquímica y Biología Molecular, UPV/EHU; Apdo. 644, 48080 Bilbao2 Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires y Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Buenos Aires, Argentina

El proceso de amiloidogénesis implica una perturbación en la proteína que le conduce a un proceso de agregación en vez de a una estructura tridimensional activa. Además, el proceso de amiloidogénesis debe ser transmitido a otras células a fin de que se bloqueen sus actividades. Se ha postulado que un factor amiloidogénico podrían ser los lípidos, ya que inducirían a los protómeros liberados de células transformadas a producir nuevos amiloides en otras células. El papel de los lípidos como agentes desencadenantes del proceso de transformación en amiloides no está todavía claro, y menos el tipo de lípidos o su polaridad.El estudio de la amiloidogénesis por espectroscopia de infrarrojo se ve favorecido porque esta técnica no se ve afectada por la turbidez de las muestras, bien sea debida a agregación o a la presencia de lípido. Ello permite el seguir de un modo temporal, e incluso cinético, el proceso de agregación.Se ha postulado que prácticamente todas las proteínas son capaces de formar fibras, siempre que se consiga la desestabilización previa, independientemente de que esta formación de fibras se produzca en condiciones fisiológicas. Este hecho nos permite usar sistemas modelo en los que se puede controlar de forma precisa el proceso de formación de fibras. El caso más común es el de la insulina, una pequeña proteína con enlaces disulfuro que se mantienen al formarse la fibra a pH 2.0 y temperatura de 70 ºC. En estas condiciones en unos 30 minutos se produce la formación de lo que se supone que es el protómero que posteriormente dará lugar a la fibra madura.Al estudiar el efecto de los lípidos sobre el proceso de amiloidogénesis inducido en insulina, y favorecido por los lípidos, no se ha tenido en cuenta las variaciones que se pueden producir en los lípidos por efecto del cambio de pH.En el presente trabajo, estudiamos en primer lugar la diferente cinética de lípidos con transición de fase (DPPC) a pDs de 2.0 y 7.0. Este estudio no solo implica la clásica representación de número de onda vs temperatura, sino que también se realiza por 2DCOS.Posteriormente, vemos el efecto de usar lípidos a diferente pH sobre el proceso de amiloidogénesis. Este estudio puede tener una cierta relevancia fisiológica, ya que es bien sabido que existen orgánulos celulares con pHs bajos.La conclusión de los estudios con lípidos no cargados, es que si bien en los lípidos puros no parece existir un efecto directo del pH, sí hay una cierta influencia cuando se estudia el proceso de amiloidogénesis.


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P12.10INMOVILIZACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LIPOSOMAS Y PROTEOLIPOSOMAS EN MATRICES SOL-GEL: UN ESTUDIO COMBINADO DE ESPECTROSCOPÍA Y MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA UTILIZANDO LA SONDA FLUORESCENTE LAURDAN

C. Reyes Mateo1, Sandra Pinto2, Lourdes Renart1, José M. González-Ros1, Manuel Prieto2, José A. Poveda1 y Rocío Esquembre1.1 IBMC, Universidad Miguel Hernández, Elche, Alicante2 Centro de Química-Física Molecular, IST. Lisboa

La inmovilización de membranas lipídicas se ha convertido en los últimos años en un área de gran interés debido a su potencial uso en biotecnología, agroalimentación y medio ambiente, fundamentalmente en el desarrollo de nuevas tecnologías analíticas, tales como biosensores y dispositivos para la detección e identificación de moléculas de interés clínico y agentes contaminantes. La posibilidad de incorporar en la membrana peptidos y proteínas amplía las posibles aplicaciones de estos sistemas cuya estabilidad se basa, fundamentalmente, en el éxito del método de inmovilización, tanto de la membrana como de sus componentes. Durante los últimos años se han desarrollado diferentes estrategias de inmovilización, entre las cuales se encuentra la tecnología sol-gel. Este método ha sido fundamentalmente utilizado con proteínas solubles, sin embargo, su aplicación en la inmovilización de membranas y proteínas de membrana ha sido limitada, y no se conocen en profundidad los posibles efectos que causa el proceso sol-gel sobre las propiedades físicas de las membranas inmovilizadas.El Laurdan es una sonda fluorescente de membrana perteneciente a la familia del prodan, formada por derivados de naftaleno con un elevado momento dipolar en el estado excitado, lo que le hace susceptible de sufrir efectos de relajación dipolar. Esta propiedad le habilita para detectar cambios en la concentración y movilidad de las moléculas de agua próximas a la superficie de la membrana. Dado que dichos parámetros están directamente relacionados con el espaciado interlipídico, la sonda puede ser utilizada para detectar alteraciones en el empaquetamiento lipídico. En este trabajo se han utilizado las propiedades del Laurdan para explorar el efecto de la inmovilización, en matrices sol-gel de sílice, de diversos sistemas lipídicos. En concreto, se han inmovilizado vesículas lipídicas de distinto tamaño (LUVs y GUVs) compuestas por lípidos con diferente carga (zwitterionicos o aniónicos), así como proteoliposomas conteniendo gramicidina o el canal iónico KcsA. Los experimentos se han llevado a cabo mediante la utilización de técnicas de microscopía de fluoresccencia multifotónica y espectroscopía de fluorescencia en estado estacionario. Los resultados muestran que el proceso de inmovilización perturba ligeramente la forma y tamaño de las vesículas lipídicas, las cuales presentan una pequeña pérdida de esfericidad y, además, parece modificar el grado de hidratación o empaquetamiento lipídico, especialmente cuando el liposoma se encuentra en fase fluida. Por otro lado, se ha demostrado que la inmovilización de liposomas compuestos por fosfolípidos zwitterionicos o mezclas de lípidos predominantemente zwiteriónicos en matrices sol-gel produce una estabilización de las fases ordenadas, mientras que parece no afectar de manera perceptible al estado físico de la bicapa en liposomas aniónicos. La incorporación del péptido gramicidina en una relacición 1/50 en sistemas compuestos por lípidos aniónicos o zwitteriónicos no afecta las propiedades de hidratación de la bicapa ni varía los efectos producidos por la inmovilización. La presencia en membranas del canal de potasio KcsA (en relación 1/500, proteína/lípido) produce una disminución de la concentración y dinámica de las moléculas de agua en la interfase lipídica que se incrementa aún más cuando el proteoliposoma se encapsula en matrices sol-gel. Todos estos resultados han sido discutidos en función de las posibles interacciones existentes entre las paredes del poro de la matriz sol-gel (cargadas negativamente) y las cabezas polares de los fosfolípidos, así como de los cambios de presión, tanto hidrostática como osmótica, que tienen lugar durante el confinamiento de la vesícula en el interior del poro.Este trabajo ha sido financiado con los proyectos MAT2008-05670 del MICINN y ACOMP/2010/ 106 de la Generalitat Valenciana


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P12.11FLUORESCENCE MICRO-SPECTROSCOPY ANALYSIS OF BACTERIAL DIVISION PROTEIN INTERACTIONS.

Belén Reija1, Begoña Monterroso2, Rubén Ahijado-Guzmán2, Carlos Alfonso2 Germán Rivas2, and Silvia Zorrilla1

1 Instituto de Química Física “Rocasolano”. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. E-28006, Madrid, Spain.2 Centro de Investigaciones Biológicas. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. E-28040, Madrid, Spain.

Fluorescence micro-spectroscopy methods are new and emerging approaches very well suited to study the energetic and dynamic parameters underlying biomolecular interactions in solution as well as in cytomimetic conditions. One of such methods, fluorescence correlation spectroscopy (FCS) has been proven to be very useful to extract information on the size and shape of biological complexes and on the strength of the interactions between biomolecules [1]. This single molecule fluorescence approach is particularly useful to analyze complexes considerably larger than their isolated elements through determination of their respective translational diffusion mobilities. We are currently applying this method in combination with other fluorescence approaches to characterize the homologous and heterologous interactions among the bacterial proto-ring elements in solution and under biomimetic conditions. Cytokinesis is accomplished by the formation of the proto-ring to which the other components of the divisome are added to form the division ring at midcell. In E. coli the proto-ring is formed by three proteins, FtsZ, FtsA, and ZipA [2]. We have developed two-photon FCS based assays to monitor and measure the interactions of these three proteins. Using this approach in parallel with other powerful tools like analytical ultracentrifugation and light scattering we are thoroughly analyzing the influence of ionic strength, primary and secondary cations and nucleotides on these assembly reactions. Given the rapidity, low sample consumption and sensitivity of fluorescence spectroscopy based procedures the developed, assays may be adapted to the screening of compounds interfering with the interactions between proto-ring elements, which can lead to new antimicrobials. On a broader level this work is contributing to the understanding of the molecular mechanisms of an essential biological process, the bacterial division.

[1] Kim, S.A., Heinze, K.G., Schwille, P. (2007) Nature Methods, 4 (11), 963-973.[2] Vicente, M., Rico, A.I., Martínez-Arteaga, R., and Mingorance, J. (2006) J. Bacteriol., 188 (1) 19-27.


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COMUNICACIONES RECIBIDAS FUERA DE PLAZO


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P12.12LIGHT-DEPENDENT GENE REGULATION BY A NOVEL, VITAMIN B12-BASED PHOTORECEPTOR PROTEIN FAMILY

S. Padmanabhan1, Juan Manuel Ortiz-Guerrero 1,2, María del Carmen Polanco2, Pablo Palazón-Riquelme2, Francisco J. Murillo2, Montserrat Elías-Arnanz2

1 Departamento de Espectroscopía y Estructura Molecular, Instituto de Química Física “Rocasolano”, Madrid, Spain 2 Departamento de Genética y Microbiología, Universidad de Murcia, Spain

Vitamin B12 (cobalamin), essential in humans and other animals and the only vitamin synthesized exclusively by microorganisms, typically functions as an enzyme cofactor but can also regulate gene expression via RNA-based riboswitches. B12-directed gene regulatory mechanisms via protein factors have, however, remained elusive. We had previously shown that B12 was essential in the downregulation of a light-inducible promoter in the bacterium Myxococcus xanthus by a transcriptional repressor CarH, whereas CarA, a paralog that also has a canonical B12-binding motif like CarH, did not require B12 for activity [1]. Why CarH, but not CarA, requires B12, what B12 form is employed, and how a response to light is linked to B12, and the molecular mechanism for this light-dependent, B12-based gene regulation were all unknown. The answers to these questions, which we deciphered recently [2], are presented here. Our studies in vitro and in vivo show that coenzyme B12 (5´-deoxyadenosylcobalamin, AdoB12), specifically dictates CarH function in the dark and on exposure to light. In the dark, AdoB12 binds to the autonomous domain containing the B12-binding motif to induce repressor tetramerization and markedly enhance operator-binding to block transcription. Light, at various wavelengths where AdoB12 absorbs, dismantles active repressor tetramers by photolysing the bound AdoB12 and this diminishes effective repressor-operator binding to allow transcription. By contrast, AdoB12 alters neither CarA oligomerization nor operator-binding, thus accounting for its B12-independent activity. These findings reveal a new functional facet of AdoB12, where it serves as the chromophore of a novel photoreceptor protein class acting in light-dependent gene regulation. Given the prevalence of similar proteins of unknown function in microbial genomes this unprecedented B12-based molecular mechanism for photoregulation that we have discovered may be widely employed in bacteria. The ability to sense and respond to light by known photoreceptor proteins in nature relies on a very limited group of small molecule chromophores such as retinal (found in the photoreceptors of human eye and in other animals), flavin mononucleotide, flavin adenine dinucleotide, p-coumaric acid, and linear tetrapyrroles (bilins and biliverdins). Our study shows that B12 can be added to this select list. Also, we demonstrate that the B12-dependent light-sensing is determined by an autonomous protein module that can be readily transplanted, and so would be apt in designing novel, synthetic, proteins directed at specific functions that can be triggered by light.

1. Pérez-Marín, M.C., Padmanabhan, S., Polanco, M.C., Murillo, F.J., and Elías-Arnanz M. (2008) Mol. Microbiol. 67, 804-819.2. Ortiz-Guerrero, J.M., Polanco, M.C., Murillo, F.J., Padmanabhan, S., and Elías-Arnanz M. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 7565-7570.


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P12.13MEMBRANE DYNAMICS: FROM EXPERIMENT TO NUMERICAL SIMULATION

Michael Mell and Francisco MonroyMechanics of Biological Membranes and Biorheology, Universidad Complutense, Ciudad Universitaria s/n, E28040 Madrid, Spain.

The dynamics of biomembranes is still of fundamental interest in biophysics today. Different methods exist for the numerical simulation of these dynamics in order to gain a better understanding and compare them with experiments. These range from molecular dynamics to coarse grain methods as well as continuum mechanics simulations.

Aside from their different detail of description ranging down to the molecular level, these methods differ substantially in the length- and time-scales, which they are capable of accessing due to computational constraints.

Recently we published data [RGMLMM11] from flicker spectroscopy experiments performed on polymersomes that exibit an unexpected relaxation dynamics, which deviates from the purely exponential behavior observed in lipid bilayer membranes.

Here we report on a modified continuum mechanics simulations based on those by Lin et al. [LB05,LB06] using a modified Canham-Helfrich Hamiltonian as reported by Seifert et al. [SL93]. This simulation method enables us to access the time- and length-scales of our measurements and has potential for explaining our experimental observations.

References[LB05] Lawrence C.-L. Lin and Frank L. H. Brown, Dynamic simulations of membranes with cytoskeletal interactions, Phys. Rev. E72 (2005), no. 1, 011910-.

[LB06] Lawrence C.-L. Lin and Frank L. H. Brown, Simulating membrane dynamics in nonhomogeneous hydrodynamic environments, Journal of Chemical Theory and Computation 2 (2006), no. 3, 472-483.

[RGMLMM11] Ruddi Rodrguez-Garca, Michael Mell, Ivan Lopez-Montero, and Francisco Monroy, Subdiffusive fluctuation dynamics of rigid membranes as resolved by ultrafast videomicroscopy, EPL (Europhysics Letters) 94 (2011), 28009p1-28009p5.

[SL93] U. Seifert and S. A. Langer, Viscous modes of fluid bilayer membranes, EPL (Europhysics Letters) 23 (1993), no. 1, 71.


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P12.14HIGH THROUGHPUT VIRTUAL SCREENING AGAINST FLEXIBLE PROTEIN RECEPTORS; IMPLEMENTATION ON GPUS AND APPLICATION TO THE DISCOVERY OF NOVEL SCAFFOLDS FOR THE MODULATION OF ANTITHROMBIN ANTICOAGULANT ACTIVITY

Horacio Pérez-Sánchez1, Ginés D. Guerrero1, Irene Sánchez-Linares1, José M. Cecilia1, José M. García1, Irene Martínez-Martínez2, José Navarro-Fernández2, Vicente Vicente-García2, Javier Corral2, Irene Meliciani3 and Wolfgang Wenzel31 Computer Engineering Department, University of Murcia (Murcia, SPAIN)2 Department of Internal Medicine, Centro Regional de Hemodonación, University of Murcia (Murcia, SPAIN)3 Institute of Nanotechnology, Karlsruhe Institute of Technology (Karlsruhe, GERMANY

The discovery of new drugs is a complicated process that can enormously benefit, in the first stages, from the use of High-Throughput Virtual Screening (HTVS) methods. The limitations of VS predictions are directly related to a lack of computational resources. However, the emergent massively parallel architectures, such as Graphics Processing Units (GPU), are continuously demonstrating great performances in a wide variety of applications and, particularly, in such simulations methods [1]. We report in this ongoing work our parallelization efforts of the HTVS program FlexScreen [2], that efficiently includes flexibility on both receptor and ligand using an all-atom biophysical based scoring function. We obtain for the most computationally demanding kernels (electrostatics and van der Waals) sustained speedups of up to 260 times [3]. We also show its application to the discovery (prediction and experimental validation) of novel scaffolds for the modulation of the anticoagulant activity of Antithrombin, important protein involved in several blood diseases [4].

[1] Pérez-Sánchez, H.E., Wenzel,W.: “Optimization methods for Virtual Screening on novel com putational architectures”. Curr. Comput. Aided. Drug. Des., 7, 1–17 (2011)[2] Kokh, D.B., Wenzel. W.: “Flexible side chain models improve enrichment rates in in silico screening”. J. Med. Chem., 51, 5919-5931 (2008).[3] Guerrero, G.D., Pérez-Sánchez, H.E., Wenzel, W., Cecilia, J.M., García, J.M., “Effective Parallelization of Non-bonded Interactions Kernel for Virtual Screening on GPUs”. In Rocha, M., et al. (eds), 5th International Conference on Practical Applications of Computational Biology & Bioinformatics (PACBB 2011). Springer Berlin / Heidelberg, pp. 63-69 (2011).[4] Martínez-Martínez I, Ordóñez A, Navarro-Fernández J, Pérez-Lara A, Gutiérrez-Gallego R, Giraldo R, Martínez C, Llop E, Vicente V, Corral J. “Antithrombin Murcia (K241E) causing antithrombin deficiency: a possible role for altered glycosylation”. Haematologica, 95, 1358-65 (2010).


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P12.15CERAMIDE AND CHOLESTEROL EFFECTS ON PHOSPHOLIPID-BASED SUPPORTED PLANAR BILAYERS: AN AFM STUDY

García-Arribas A.B., Busto J.V., Alonso A., Goñi F.M.Unidad de Biofísica (Centro Mixto CSIC-UPV/EHU), and Departamento de Bioquímica, Universidad del País Vasco (UPV/EHU)

Atomic force microscopy (AFM) has been applied to the characterization of ceramide and cholesterol incorporation into dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC) or palmitoyl sphingomyelin (pSM) supported planar bilayers (SPBs) at 22 ºC. Membranes containing the different mixtures were prepared by the vesicle adsorption or the spin-coating procedures and analyzed with a combination of AFM imaging and force spectroscopy. This study was aimed at characterizing changes in the membrane biophysical properties upon ceramide and/or cholesterol incorporation, in the form of: i) lateral domain segregation and, ii) bilayer mechanical resistance to deformation. Pure DPPC and pSM vesicles adsorbed onto mica substrates gave rise to homogeneous bilayers in a lamellar (Lß) gel phase. When cholesterol (Chol) was added to each of them, they displayed a different pattern in their mechanical resistance to AFM tip rupture, as a result of the appearance of the liquid-ordered phase (Lo). Furthermore, the presence of palmitoyl ceramide (pCer) in both DPPC and pSM bilayers resulted in the generation of a new phase of high intermolecular packing with increased mechanical resistance. The introduction of both pCer and cholesterol in the mixtures at a phospholipid:pCer:Chol ratio close to 2:1:1, gave rise to a new lamellar phase with intermediate properties between those of the phospholipid:Chol and the phospholipid:pCer mixtures. Interestingly, at those relatively high pCer and Chol concentrations no displacement was observed between them. The data becomes relevant in the context of sphingolipid signaling and membrane platform formation.


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ÍNDICES


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Ponencias PlenariasPP1S. STRUCTURAL MECHANISMS OF ACTIVATION AND INHIBITION OF PHOSPHOINOSITIDE 3-KINASESRoger Williams

PP2. THE PHYSICAL BASIS FOR PRESSURE EFFECTS ON PROTEIN STABILITYCatherine Royer

PP3. DESIGNED PEPTIDES AS MODELS FOR INTRINSIC MEMBRANE PROTEINSAntoinette Killian

PP4. SUPER RESOLUTION MICROSCOPY AND NANOSCOPY WITHIN LINEAR AND NON LINEAR REGIMESAlberto Diaspro

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PREMIO BRUKER:Ignacio Fita

PREMIO SBE IZASA-BEKMAN-COULTER:Teresa Giráldez

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Premiados


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Ponencias en Sesiones Temáticas1.01/ INTRAFACES PROTEICAS EN ESTABILIDAD Y DINÁMICA DE PROTEÍNASJavier Sancho1.02/ LAS MUREIN HIDROLASAS DE NEUMOCOCO: ¿UN MECANO VERSÁTIL DE MÓDULOS Y BISAGRAS? Margarita Menéndez1.03/ CONTRIBUCIÓN DE LOS PUENTES DISULFURO A LA ESTABILIDAD, PLEGAMIENTO Y AGREGACIÓN DEL DOMINIO SH3Salvador Ventura-Zamora1.04/ MODELOS DE SIMULACIÓN SIMPLES PARA PROBLEMAS DE PLEGAMIENTO COMPLEJOSAntonio Rey Gayo2.01/ SYNTHETIC COMPOUNDS THAT MIMIC MEMBRANE LIPIDS ACT AS HIV-1 ENTRY INHIBITORS POSSIBLY BY CHANGING MEMBRANE STRUCTUREMaier Lorizate2.02/ NOVEL TOOLS TO MANIPULATE AND INTERROGATE SUPPORTED LIPID BILAYERS: DYNAMIC MODULATION OF THEIR GLYCOLIPID CONTENT AND LABEL-FREE DETECTION OF CLUSTERING OF MEMBRANE-BOUND PROTEINSRalph Richter2.03/ GEL AND FLUID MEMBRANE DOMAINS IN INTERACTION WITH PROTEINS: MEMBRANE MORPHOLOGICAL ALTERATIONS AND AMYLOID-LIKE FIBER FORMATIOManuel Prieto2.04/ IMPORTANCE OF ORDERED/ DISORDERED PHASE COEXISTENCE IN LUNG SURFACTANT MEMBRANESCristina Casals3.01/ BACTERIAL FTSZ POLYMERS ON SURFACES: UNDERSTANDING AND CONTROLLING THEIR SHAPEMarisela Vélez3.02/ ABNORMAL TISSUE HARDENING IN LUNG FIBROSIS AND CANCERJordi Alcaraz3.03/ FROM BIOPHYSICS TO ANIMAL SOCIETIESGonzalo de Polavieja3.04/ FÍSICA VIROLÓGICAPedro J. de Pablo4.01/ REDESIGN OF SELECTIVITY AND LIPID CHAIN ENCAPSULATION IN HUMAN GLTPLucy Malinina4.02/ CATCHING A VIRUS IN THE ACT OF RNA RELEASE: A. RHINOVIRUS UNCOATING INTERMEDIATE CHARACTERIZED BY X-RAY CRYSTALLOGRAPHYNuria Verdaguer4.03/ SMAD PHOSPHOSERINE CODE BROKEN BY W W DOMAIN CONTAINING PROTEINSMaría J. Macías4.04/ STRUCTURAL BIOLOGY OF REMODELLING BACTERIAL CELL WALL MACHINESJuan Hermoso5.01/ DINÁMICA DEL Ca2+ EN LA MITOCONDRIAJavier Alvarez5.02/ DETERMINANTES MOLECULARES DEL ACOPLAMIENTO ALOSTÉRICO EN TERMORECEPTORES.Antonio V. Ferrer Montiel5.03/ CALCIUM SENSING OF THE ACIDIC STORES IN HUMAN PLATELETSJuan Antonio Rosado5.04/ TRÁFICO DE CANALES KV7 A LA MEMBRANA PLASMÁTICAAlvaro Villaroel6.01/ UNRAVELING NUCLEIC ACIDS INTERACTIONS BY UNZIPPINGFelix Ritort6.02/ SINGLE-MOLECULE APPROACHES TO STUDY THE ADDAB HELICASE-NUCLEASEFernando Moreno Herrero6.03/ EXPLORING MECHANICAL PROPERTIES OF BIOMATERIALS WITH ATOMIC FORCE MICROSCOPYJosé Luis Toca-Herrera6.04/ CONFORMATIONAL DYNAMICS OF SINGLE PROTEINS UNDER FORCESergi Garcia Manyes7.01/ TREALOSALÍPIDOS BIOTENSIOACTIVOS: LA INTERACCIÓN CON MEMBRANAS BASE DE SU ACCIÓN BIOLÓGICAAntonio Ortiz7.02/ INTERACCIÓN VIRUS-CÉLULA A NIVEL DE MEMBRANAS: UN ASUNTO ENTRE PROTEÍNAS, PERO TAMBIÉN LÍPIDOSEnrique Villar7.03/ LA PROTEÍNA NS4B DEL VIRUS HCV. UN TERRITORIO INEXPLORADOJosé Villalaín7.04/ SELECTIVIDAD LIPÍDICA Y DISTRIBUCIÓN DE LACTOSA PERMEASA DE E.COLI EN BICAPAS. ESTUDIOS DE AFM Y FRETJordi Hernández-Borrel8.01/ ENSAMBLAJE DE FTSZ Y NUEVOS ANTIBIÓTICOSJosé Manuel Andreu8.02/ RECONSTITUCIÓN DE DIVISOMAS MÍNIMOS DE E.COLI EN SISTEMAS BIOMIMÉTICOS DE MEMBRANAGermán Rivas Caballero8.03/ CAMBIOS CONFORMACIONALES DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDA DE T7 LIGADOS A LA MADURACIÓN VIRALJosé López Carrascosa

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Ponencias en Sesiones Temáticas8.04/ LA ESTRUCTURA A ALTA RESOLUCIÓN DE LA CHAPERONINA CCT EN COMPLEJO CON SU SUSTRATO TUBULINAJosé Mª Valpuesta9.01/ STRUCTURAL STUDIES ON MODIFIED NUCLEIC ACIDSCarlos González9.02/ STUDIES ON THE MOLECULAR RECOGNITION OF AMINOGLYCOSIDE ANTIBIOTICS BY RNA AND RESISTENCE ENZYMESJuan Luis Asensio9.03/ BIDIMENSIONAL ASSEMBLIES OF DNARamón Eritja9.04/ EXPLORATION OF BIOLOGICALLY RELEVANT BINDING MOTIFS USING CARBOHYDRATE OLIGONUCLEOTIDE CONJUGATESJuan Carlos Morales10.01/ ORGANIZACIÓN FUNCIONAL DE LAS VESÍCULAS SINÁPTICAS EN NEURONAS DE HIPOCAMPOGuillermo Álvarez de Toledo10.02/ LA ORGANIZACIÓN DE LA MAQUINARIA SECRETORA EN EL MODELO DE LA CÉLULA CROMAFÍNLuis Miguel Gutiérrez10.03/ OPTICAL CONTROL OF NEUROSECRETIONPau Gorostiza10.04/ SPONTANEOUS ACTIVITY IN NEURONAL CULTURES: EXPERIMENTS AND MODELJordi Soriano11.01/ METODOLOGÍAS PARA LA SIMULACIÓN DE PROTEÍNAS GLOBULARES, DESNATURALIZADAS E INTRÍNSECAMENTE DESORDENADAS EN DISOLUCIÓN DILUÍDAJosé García de la Torre11.02/ ESTUDIO MEDIANTE DINÁMICA MOLECULAR DEL COMPORTAMIENTO MECÁNICO Y TERMODINÁMICO ASOCIADO A LA INSERCIÓN DE ANESTESIA EN UNA MEMBRANA CELULARJavier López Cascales11.03/ VARIABILIDAD EN REDES METABÓLICAS DE SÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS ESENCIALES EN ENDOSIMBIONTES BACTERIANOS. ANÁLISIS ESTEQUIOMÉTRICOFederico Morán11.04/ IDENTIFICACIÓN MEDIANTE METABOLÓMICA DE DIANAS TERAPÉUTICAS Y BIOMARCADORES EN ENFERMEDADES MULTIFACTORIALESMarta Cascante12.01/ PROTEOMIC TOOLS FOR VENOMIC ANALYSISJuan José Calvete12.02/ NANO-DEVICES FOR IN CELL DELIVERY OF APOTOSIS INHIBITORSEnrique Pérez-Payá12.03/ ICP-ESPECTROMETRÍA DE MASAS: UNA TÉCNICA REVOLUCIONARIA PARA PROTEÓMICA GUIADA POR HETEROÁTOMOSAlfredo Sanz-Medel12.04/ FLUORESCENCE FLUCTUATION SPECTROSCOPY AS A TOOL TO CHARACTERIZE BIOMOLECULAR COMPLEXESSilvia Zorrilla

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Comunicaciones OralesO1.05/ LIGAND-INDUCED DISORDER-TO-ORDER TRANSITION: STUDY OF THE CALCIUM-DEPENDENT FOLDING OF THE RTX (REPEAT IN TOXIN) PROTEINS. Sotomayor Pérez,A.C./Ladant,D./Chenal,A./O1.06/ HALOPHILIC ENZYME ACTVATION INDUCED BY SALTSOrtega Quintanilla,G./Laín Torre,A./Tadeo Campillo,X./López Méndez,B./Millet Aguilar-Galindo,O./O1.07/ OBSERVACIÓN DIRECTA DE ISOMERIZACIÓN DE PUENTES DISULFURO EN UNA PROTEÍNA INDIVIDUALAlegre Cebollada,J./Rivas-Pardo,J.A./Fernández,J.M./O1.08/ CARACTERIZACIÓN DE LOS PROCESOS MICROSCÓPICOS DETERMINANTES EN LA FORMACIÓN DE FIBRAS AMILOIDESCremadesCasasín,N./Cohen,S.I.A./Chen,A.Y./Orte,A./Knowles,T.P.J./Dobson,C.M./Klenerman,D./Sandal,M./Clarke,R.W./Dunne,P./Aprile,F.A./Bertoncini,C.W./O2.05/ PORE FORMATION BY BAXα5 IN NUMBERS: COUNTING SINGLE PORES AND SINGLE BAXα5 PEPTIDESFuertes Vives,G./García Sáez,A.J./Esteban Martín,S./Giménez Ibáñez,D./Sánchez Muñoz,O.L./Schwille,P./Salgado Benito,J./O2.06/ HYDROPHOBIC PULMONARY SURFACTANT PROTEINS SP-B AND SP-C INDUCE PORE FORMATION IN PLANAR LIPID MEMBRANES: EVIDENCE FOR PROTEOLIPID PORESParra Ortiz,E./Alcaraz González,A./Cruz Rodríguez,A./Aguilella Fernández,V.M./Pérez-Gil,J./O2.07/ ESTUDIO EN MONOCAPAS DEL COMPORTAMIENTO DE FASES DE UNA MEZCLA LIPÍDICA QUE IMITA LA MEMBRANA DEL VIH. DEPENDENCIA DEL COLESTEROL Y EFECTOS DE PÉPTIDOS DERIVADOS DEL DOMINIO MPERHuarte Arrayago,N./Cruz Rodríguez,A./Pérez-Gil,J./Nieva Escandón,J.L./O2.08/ MECHANICS OF MEMBRANES WITH LIPID DOMAINSLópez Montero,I./Rodriguez Arriaga,L./Monroy Muñoz,F./O3.05/ INTERACTION OF A VIRAL ATPASE WITH NUCLEOTIDES MEASURED WITH A MICROCANTILEVERIbarra Daudén,M./Mertens,J./Tamayo,J./López Carrascosa,J./O3.06/ USING DNA AS A MOLECULAR MARKER TO DETERMINE PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS WITH ATOMIC FORCE MICROSCOPYFuentes Pérez,M.E./Longman,E.J./Dillingham,M.S./Moreno Herrero,F./O3.07/ PERFORMANCE OF PULMONARY SURFACTANT EXPOSED TO GOLD NPSBouzas Olaso,V./Pastoriza,I./Liz-Marzán,L.M./Echaide,M./Pérez-Gil,J./O3.08/DIFFUSION IN MACROMOLECULAR CROWDED MEDIA. MONTE CARLO SIMULATION OF OBSTRUCTED DIFFUSION VS. FRAP EXPERIMENTSMas Pujadas,F./Vilaseca,E./Pastor,I./Isvoran,A./Madurga,S./Garcés,J.L./O4.05/ DESCIFRANDO ESTRUCTURALMENTE LA REGULACIÓN GÉNICA POR LA PROTEÍNA SEÑALIZADORA PII EN EL SISTEMA QUE INVOLUCRA AL REGULADOR GLOBAL DE NITRÓGENO NTCA. INFERENCIAS PARA LA SUPERFAMILIA DE REGULADORES TRANSCRIPCIONALES CRP-FNRLlácer Guerri,J.L./Espinosa,J./Castells,M.A./Contreras,A./Forchhammer,K./Rubio,V./O4.06/ LINKING FUNCTION TO DYNAMICS IN GLOBULAR, MULTIDOMAIN AND UNSTRUCTURED PROTEINS USING NMREsteban Martín,S./Fenwick,R.B./Salvatella,X./O4.07/ ANÁLISIS ESTRUCTURAL DEL COLÁGENO TIPO IV Y SUS IMPLICACIONES MOLECULARES EN LOS SÍNDROMES DE ALPORT Y GOODPASTURECasino Ferrando,P./Gozalbo Rovira,R./Rodríguez Díaz,J./Cervera Miralles,J./Rubio Zamora,V./Marina Moreno,A./O4.08/ RESPUESTA AL ESTRÉS ABIÓTICO EN PLANTASYunta Yanes,C./Martinez-Ripoll,M./Zhu,J.K./Albert de la Cruz,A./O5.05/ DIFFERENTIAL PLASMA MEMBRANE ABUNDANCE OF EPITHELIAL SODIUM CHANNEL δ SUBUNIT SPLICE ISOFORMSWesch,D./Althaus,M./Miranda,P./Fronius,M./Clauss,W.G./Alvarez de la Rosa,D./Giraldez Fernández,T./O5.06/ EFECTO FUNCIONAL DE LA ASOCIACIÓN OLIGOMÉRICA DE LAS SUBUNIDADES KCNE SOBRE LOS CANALES KV7.5 (KCNQ5)Comes Beltrán,N./Solé Codina,L./Roura-Ferrer,M./Oliveras Martínez,A./Vallejo Gracía,A./Villarroel Muñoz,A./Felipe Campo,A./O5.07/ ELECTROFORESIS “BLUE-NATIVE” PARA LA CUANTIFICACIÓN DE LA AUTO-ASOCIACIÓN DE KCSAPoveda Larrosa,J.A./Giudici,A.M./Molina Gallego,M.L./Renart Pérez,M.L./Ayala Torres,J.L./Montoya Díaz,E./Fernández Carvajal,M.A./Encinar Hidalgo,J.A./González-Ros,J.M./O5.08/ CONFORMATIONAL STUDIES OF THE M3 ACETYLCHOLINE MUSCARINIC RECEPTOR AND ITS BINDING SITEMartínez Archundía,M./Cordomí Montoya,A./Garriga Solé,P./Pérez González,J.J./O6.05/ A SINGLE-MOLECULE COMPARISON OF THE MECHANICAL PROPERTIES OF DSRNA AND DNAHerrero Galán,E./Valpuesta Moralejo,J.M./López Carrascosa,J./Arias-González,J.R./O6.06/ UNWINDING AND STRAND ANNEALING ACTIVITIES OF T4 PHAGE UVSW PROTEIN: A SINGLE MOLECULE STUDYManosas Castejón,M./Perumal,S.K./Benkovic,S.J./Croquette,V./O6.07/ DC-SIGN NANODOMAIN FORMATION REVEALED BY SINGLE MOLECULE FLUORESCENCE MICROSCOPYTorreño Piña,J.A./Manzo,C./Gualda,E.J./Esteban,O./Cambi,A./García Parajo,M.F./O6.08/ LA POLIMERASA DE PHI29 PRESENTA UN MECANISMO ACTIVO DE APERTURA DEL ADNIbarra Urruela,B./Morín,J./Arias-González,J.R./Lázaro,J.M./Salas,M./Valpuesta Moralejo,J.M./López Carrascosa,J./

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O7.05/ SELECTIVIDAD LIPÍDICA Y DISTRIBUCIÓN DE LACTOSA PERMEASA DE E.COLI EN BICAPAS. ESTUDIOS DE AFM Y FRETBañó Polo,M./Mingarro Muñoz,I./O7.06/INSERTION OF HELIX-C OF BACTERIORHODOPSIN INTO THE ER MEMBRANEPalomares Jerez,M.F./de Castro Nemésio,H./Nuño Sánchez,L./Villalaín Boullón,J./O707/ INTERACCIÓN DEL SEGMENTO H1 DE LA PROTEÍNA NS4B DEL HCV CON BIOMEMBRANAS MODELOGuillén Casas,J./Luengo Gil,G./Guerrero Valero,M./Coronado Parra,T./Gómez Fernández,J.C./Corbalan Garcia,S./O7.08/ RECONSTITUTION OF PROTO-RING ELEMENTS (FTSZ AND ZIPA) FROM ESCHERICHI. COLI IN PHOSPHOLIPID BILAYER NANODICSHernandez Rocamora,V.M./Reija,B./Alfonso,C./Monterroso Marco,B./Minton,A.P./Zorrilla López,S./Vicente,M./Rivas,G./O8.05/ BIOPHYSICAL STUDIES REVEAL DIFFERENT DISRUPTION PATTERNS IN THE ADENOVIRUS CAPSIDPérez Berna,A.J./Ortega-Esteban,A./Menéndez-Conejero,R./Condezo,G./Menéndez Fernández,M./de Pablo,P.J./San Martín,C./O8.06/ LA INTERACCIÓN DE DISCODERMOLIDA Y DOCETAXEL CON TUBULINA. CARACTERIZACIÓN DE LOS SITIOS DE UNIÓN DE LOS AGENTES ESTABILIZANTES DE MICROTÚBULOS MEDIANTE RMN Y MODELADO MOLECULARDíaz Pereira,J.F./Canales,A./Rodríguez-Salarisch,J./Trigili,C./Coderch,C./Paterson,I./Jiménez Barbero,J./O8.07/ RESISTENCIA MECÁNICA DEL DNA EN LAS PLACAS DE CROMATINA METAFÁSICA. ESTUDIO DE FRICCIÓN A ESCALA NANOMÉTRICADaban Balaña,J.R./Gállego,I./Oncins,G./Sisquella,X./Fernández-Busquets,X./O8.08/ BACTERIAL TUBULIN DISTINCT LOOP SEQUENCES AND PRIMITIVE ASSEMBLY PROPERTIES SUPPORT ITS ORIGIN FROM A EUKARYOTIC TUBULIN ANCESTOROliva Blanco,M.A./Martín Galiano,A.J./Sanz,L./Bhattacharyya,A./Yebenes,H./Valpuesta Moralejo,J.M./Andreu Morales,J.M./O9.05/ PHYSICOCHEMICAL CHARACTERISATION OF CATIONIC LIPOSOME-DNA LIPOPLEXEMartín Molina,A./Muñoz Úbeda,M./Rodríguez Pulido,A./Llorca Blanco,O./Nogales,A./Quesada Pérez,M./Aicart,E./Junquera,E./O9.06/ REAL TIME FOLDING OF DNAPortella Carbó,G./Orozco Lopez,M./O9.07/ UNDERSTANDING RNA / PROTEIN CO-HABITATION IN THE RNA WORLDDiez García,F./López Alonso,J.P./Gómez Pinto,I./Chakrabartty,A./González Ibáñez,C./Laurents,D.V./O9.08/ OLIGONUCLEÓTIDOS MODIFICADOS EN NANOTECNOLOGÍASomoza Calatrava,A./Delgado,J.L./Bouit,P.A./Aviñó,A./Ares,P./Gómez Herrero,J./Zamora,F./Eritja Casadellá,R./Martín,N./O10.05/ DIRECT MAPPING OF NANOSCALE COMPOSITIONAL CONNECTIVITY ON INTACT CELL MEMBRANESVan Zanten,T.S./Gómez,J./Manzo,C./Cambi,A./Buceta,J./Reigada,R./García-Parajo,M.F./O10.06/ ACTIVE MECHANICS OF THE RED BLOOD CELLRodriguez Garcia,R./Monroy Muñoz,F./O10.07/ Α-SINUCLEÍNA A30P RESCATA TRANSITORIAMENTE LA LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISOR EN LOS TERMINALES MOTORES EN EL RATÓN CSPΑ KORuiz Laza,R./Tabares Domínguez,L./O10.08/ MEMBRANE REMODELING INDUCED BY THE DYNAMIN RELATED PROTEIN DRP1 STIMULATES BAX OLIGOMERIZATIONTerrones Urio,O./Montessuit,S./Prakash Somasekharan,S./Lucken Ardjomande,S./Herzig,S./Basañez Asua,G./Martinou,J.C./O11.05/ INFLUENCIA DE LA PRESIÓN EN LA SIMULACIÓN DEL PLEGAMIENTO DE PROTEÍNASPerezzan Rodríguez,R./Rey Gayo,A./O11.06/ MODELOS IMPLÍCITOS PARA EL ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN LÍPIDO-PROTEÍNAPrieto Frías,L./He,Y./Lazaridis,T./O11.07/ PORES FROM THE POINT OF VIEW OF THE MEMBRANE: A GENERAL MODEL VALID FOR THE ACTION OF PEPTIDES AND PROTEINSSalgado Benito,J./Guertes Vives,G./Giménez Ibáñez,D./Esteban Matín,S./Sánchez Muñoz,O.L./O11.08/ INFLUENCIA DE LOS ENLACES DE HIDRÓGENO EN EL PLEGAMIENTO DE PROTEÍNASEnciso Carrasco,M./Rey Gayo,A./O12.05/ ESTUDIO INFRARROJO DE BHMT POR 2DCOS Y SUPRESIÓN DE BANDAGarcía Pacios,M./Pajares,M.A./Pastrana,B./Rodríguez Arrondo,J.L./O12.06/ UN ESTUDIO 2DCOS DEL EFECTO DE LOS LÍPIDOS EN EL PROCESO DE AMILOIDOGÉNESIS DE LA INSULINAAndraka Rueda,N./Frías,M.A./Rodríguez Arrondo,J.L./O12.07/ ELECTROKINETICS AND THERMODYNAMICS OF THE INTERACTION OF MELITTIN WITH LIPID NANOVESICLES AND LANGMUIR-BLODGETT MONOLAYERSSánchez Muñoz,O.L./Giménez Ibáñez,D./Almonte García,L./Fuertes Vives,G./Salgado Benito,J./O12.08/ NANOSCALE FLUORESCENCE CORRELATION SPECTROSCOPY ON INTACT LIVING CELL MEMBRANES WITH NSOM PROBESManzo,C./van Zanten,T.S./García-Parajo,M.F./

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Comunicaciones Orales


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Comunicaciones en forma de cartelesP1.09/ DYNAMICS OF NITROTYROSINES IN HAEMPROTEINSDiaz Moreno,I./Díaz Quintana,A./García Heredia,J.M./De la Rosa Acosta,M.A./P1.10/ IMPLICACIÓN DE UNA CISTEÍNA DEL ECTODOMINIO DE LA GLICOPROTEÍNA E2 DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C EN SU OLIGOMERIZACIÓNOrtega Atienza,S./Lombana Sacristán,L./Yélamos López,B./Gómez,J./Gavilanes Franco,F./P1.11/ REPA-WH1 PRIONOID: A SYNTHETIC MODEL FOR LIGAND-PROMOTED PROTEIN AMYLOIDOSISGiraldo Suárez,R./Gasset Rosa,F./Moreno del Álamo,M./Molina García,L./Fernández Fernández,C./Serrano López,A./Moreno Díaz de la Espina,S./P1.12/ MUTAGENESIS ANALYSIS OF THE KINETICS AND THERMODYNAMIC PARAMETERS IN AMYLOID FORMATION OF ALPHA-SPECTRIN-SH3 DOMAINRuzafa Ruiz,D./Varela Álvarez,L./Azuaga Fortes,A.I./Morel,B./Conejero Lara,F./P1.13/ DOMINIOS EXTRACELULARES DEL RECEPTOR DE LDL: CINÉTICA DE UNIÓN DE Ca2+ Y Mg2+ A LR5Martinez Oliván,J./Arias Moreno,X./Velazquez Campoy,A./Sancho Sanz,J./P1.14/ PHOTOINTERMEDIATE STABILITY CHANGES IN RHODOPSIN MUTANTS ASSOCIATED WITH RETINITIS PIGMENTOSARamón Portés,E./Bosch Presegué,L./Toledo González,D./Cordomí Montoya,A./Garriga Solé,P./P1.15/ CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA LISOZIMA EN LÍQUIDOS IÓNICOSEsquembre Tomé,R./Sanz Morales,J.M./Wall,J.G./del Monte Muñoz de la Peña,F./Ferrer Pla,M.L./Mateo Martínez,C.R./P1.16/ HOW THE COPPER SITE GEOMETRY DETERMINES THE THERMAL STABILITY OF BLUE COPPER PROTEINSDíaz Quintana,A./Diaz Moreno,I./De la Rosa Acosta,M.A./Díaz Moreno,S./Chaboy Nalda,J./P1.17/ INSIGHTS INTO NUCLEOTIDE RECOGNITION BY BACTERIAL CELL DIVISION PROTEIN FTSZRuiz Avila,L./Schaffner Barbero,C./Huecas,S./Artola,M./Chacón Montes,P./Andreu Morales,J.M./P1.18/ ANALYSIS OF THE EQUILIBRIUM AND KINETICS OF THE ANKYRIN REPEAT PROTEIN MYOTROPHINBruscolini,P./Faccin,M./Pelizzola,A./P1.19/ RULES GOVERNING GEMINI SURFACTANT-PROTEIN INTERACTIONSAmiri,R./García-Mayoral,M.F./Khosropour,A.R./Mohammadpour,I./Bordbar,A.K./Laurents,D.VP1.20/ TYROSINE PHOSPHORYLATION TURNS ALKALINE TRANSITION INTO A BIOLOGICALLY RELEVANT PROCESS AND MAKES HUMAN CYTOCHROME C BEHAVE AS AN ANTI-APOPTOTIC SWITCHDiaz Moreno,I./García-Heredia,J.M./Salzano,M./Pérez Payá,E./Teixeira,M./Diaz-Quintana,A./De la Rosa Acosta,M.A./P121/ ESTABILIDAD CONFORMACIONAL DE LA LISOZIMA ENCAPSULADA EN MATRICES SOL-GEL: INFLUENCIA DEL PROTOCOLO DE INMOVILIZACIÓNMartínez Tomé,M.J./Pastor,I./Ferrer,M./Mallavía,R./Gómez,J./Mateo,R./P1.22/ A QUANTITATIVE ANALYSIS OF THE EFFECT OF NUCLEOTIDES AND THE M DOMAIN ON THE ASSOCIATION EQUILIBRIUM OF CLPBdel Castillo Rojo,U./Alfonso,C./Acebrón,S.P./Martos,A./Moro Pérez,F./Rivas,G./Muga Villate,A./P1.23/ POLIELECTROLITOS CATIÓNICOS CAPACES DE INHIBIR LA ADSORCIÓN SUPERFICIAL DE PROTEÍNAS SIN AFECTAR A SU ESTRUCTURA O FUNCIONALIDADLópez Pérez,M./Gómez Pérez,F.J./P1.24/ INHIBICIÓN DE LA AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS CON POLIELECTROLITOS DE ALTA DENSIDAD DE CARGAGómez Pérez,F.J./López Pérez,M./P1.25/ INORGANIC SALT EFFECTS ON THE STABILITY OF THE ACTIVE AND INACTIVE CONFORMATIONS OF THE G-PROTEIN COUPLED RECEPTOR RHODOPSINReyes Alcaraz,A./Martínez Archundía,M./Garriga Solé,P./P1.26/ MOLTEN GLOBULE STRUCTURE OF APOFLAVODOXIN OF HELICOBACTER PYLORITorreblanca González,R.E./Sancho Sanz,J./P2.09/ CAN BIOACTIVE ALPHA-HYDROXYFATTY ACIDS INDUCE LIPID PHASE SEPARATION?Barceló Mairata,M.F./Prades,J./Gómez-Florit,M./Mestres,B./Alemany,R./Vögler,O./P2.10/ COMPLEJOS LIPOSOMA-PÉPTIDO COMO VACUNAS: ANÁLISIS DE LAS RESPUESTAS INMUNES INDUCIDAS POR UN PÉPTIDO DERIVADO DEL DOMINIO MPER DE VIH INSERTO EN MEMBRANAAraujo Pasarín,A./Huarte Arrayago,N./Nieva Escandón,J.L./P2.11/ MEMBRANE FLUIDITY AS A MATTER OF FLOWEspinosa,G./Langevin,D./Monroy Muñoz,F./P2.12/ DISTINCT MECHANISMS OF LIPID BILAYER PERTURBATION INDUCED BY PEPTIDES DERIVED FROM THE MEMBRANE-PROXIMAL EXTERNAL REGION OF HIV-1 GP41Apellániz Unzalu,B./Nieva Escandón,J.L./Nir,S./García Sáez,A.J./P2.13/ EFECTO DE LA COEXISTENCIA DE FASES SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA FRAGACEATOXINA C EN MEMBRANASMorante Sagasti,K./Bellomio,A./Sot,J./Gil Cartón,D./Valle Rodríguez,M./Gonzalez Mañas,J.M./P2.14/ MECHANISM OF VESICLE CONTENTS RELEASE INDUCED BY SPHINGOSINE AND THE EFFECT OF NEGATIVELY CHARGED BILAYERSJiménez Rojo,N./Sot Sanz,J./Viguera Rincón,A.R./Goñi Urcelay,F.M./Alonso Izquierdo,A./P2.15/ ACTIVE MEMBRANES WITH BOUND F-ACTINIsanta Amela,S./Espinosa,G./Rodríguez-García,R./Natale,P./López-Montero,I./Langevin,D./Monroy Muñoz,F./P2.16/ SCRAMBLASE ACTIVITY MODULATION BY THE LIPID ENVIRONMENT ARCHITECTUREMartínez Domínguez,I./Alonso Izquierdo,A./Goñi Urcelay,F.M./P2.17/ CD AND DSC STUDIES ON THE STABILITY OF THE PROPEPTIDE NH2-TERMINAL OF PULMONARY SURFACTANT PROTEIN SP-B (SP-BN)Bañares Hidalgo,A./Pérez-Gil,J./Estrada,P./

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P2.18/ EFFECT OF HYALURONAN ON PULMONARY SURFACTANT FUNCTION AND STRUCTURLópez Rodríguez,E./Cruz Rodríguez,A./Richter,R./Taeusch,H.W./Pérez-Gil,J./P2.19/ COMPOSITIONALLY HETEROGENEOUS LAMELLAR GEL (Lß) PHASES IN MODEL MEMBRANESBusto Vega,J./García-Arribas,A.B./Sot,J./Goñi Urcelay,F.M./Alonso Izquierdo,A./P2.20/ DETECTION AND CHARACTERIZATION OF NATIVE PROTEIN COMPLEXES OF PULMONARY SURFACTANT SOLUBILISED WITH DETERGENTSOlmeda Lozano,B./García-Álvarez,B./Cruz Rodríguez,A./Pérez-Gil,J./P2.21/ APPLICATION OF THE FLUORESCENT PROBE LAURDAN FOR THE STUDY OF PHOSPHOLIPID PACKING AND HYDRATION IN PULMONARY SURFACTANT MEMBRANES AND LAMELLAR BODY-LIKE PARTICLESCerrada de Dueñas,A./Haller,T./Pérez-Gil,J./P3.09/STUDY OF THE DNA INFUENCE ON BACTERIOPHAGE T7 STRUCTURE BY FORCE SPECTROSCOPYHernando Pérez,M./Pascual Vega,E./Gómez Herrero,J./López Carrascosa,J./Caston,J.R./de Pablo Gómez,P.J./P4.09/ DISTINCT UBIQUITIN BINDING MODES EXHIBITED BY THE SH3 DOMAINS OF CD2AP. MOLECULAR DETERMINANTS AND FUNCTIONAL IMPLICATIONSAzuaga Fortes,A.I./Ortega Roldán,J.L./Casares Atienza,S./Mateo Alarcón,P.L./Ringkjobing-Jensen,M./Blackledge,M./van Nuland,N./P4.10/ LA ESTRUCTURA DE LA REGIÓN DE INTERACCIÓN CON SNX6 Y SEÑAL DE EXPORTACIÓN NUCLEAR DE LA PROTEÍNA BRMS1 REVELA UN HEXÁMERO FORMADO POR COILED COILS ANTIPARALELOSSpínola Amilibia,M./Rivera,J./Ortiz Lombardía,M./Romero Garrido,A./Neira,J.L./Bravo Sicilia,J./P4.11/ ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE LA BETA-LACTAMASA OXA-24 Y ESTUDIO DE SU INTERACCIÓN CON INHIBIDORES DEL TIPO SULFONAS PENÉMICASSantillana Heras,E./Romero Garrido,A./Beceiro,A./Bou,G./Buynak,J.D./P4.12/ ANÁLISIS CRISTALOGRÁFICO A RESOLUCIÓN ATÓMICA DEL MÓDULO LECTINA N-TERMINAL DE LA PROTEÍNA LBL DE LACCARIA BICOLORAcebrón Ávalos,I./de las Rivas,B./Muñoz,R./Mancheño Gómez,J.M./P4.13/ PHOSPHOLIPIDS AS SPECIFIC SUBSTRATES FOR A PROKARYOTIC LIPOXYGENASEGarreta Gambús,A./García,M.Q./Val de Moraes,S.P./Busquets,M./Manresa,A./Gaffney,B.J./Carpena,X./Fita Rodríguez,I./P4.14/ PRELIMINARY STUDY ON THE CLONNING AND EXPRESSION OF STRUCTURAL AND NON-ESTRUCTURAL TRV VIRAL PROTEINSSánchez Eugenia,R./Sánchez Magraner,L./Agirre Hernández,J./Ferrer Orta,C./Verdaguer Massana,N./Viguera Rincón,A.R./Guérin Aguilar,D.M./P5.09/ EFECTO DE PÉPTIDOS “ANTI-CLUSTER” SOBRE EL CANAL DE POTASIO KCSAAyala Torres,J.L./Giudici,A.M./Poveda Larrosa,J.A./Montoya Díaz,E./Renart Pérez,M.L./Molina Gallego,M.L./Fernández Carvajal,M.A./P5.10/ DINÁMICA DE Ca2+ MITOCONDRIAL EN EL RANGO MILIMOLAR MEDIDA CON RHOD-5NDe la Fuente Pérez,S./Fonteriz García,R.I./Montero Zoccola,M.T./Alvarez Martín,J./P5.11/ CHARACTERIZATION OF THE KV7.2 POTASSIUM CHANNEL CALMODULIN BINDING SITEAlaimo,A./Millet,O./Areso,P./Villarroel Muñoz,A./P5.12/ SODIUM INFLUENCE ON ENERGY TRANSDUCTION BY BACTERIAL COMPLEXES I/Batista,A.P./Marreiros,B.C./Pereira,M.M./P5.13/ ROLE OF THE CONFORMATION OF SELECTIVITY FILTER IN KCSA STABILITY AND FUNCTIONMontoya Díaz,E./Renart Pérez,M.L./Fernández Carvajal,M.A./Molina Gallego,M.L./Encinar Hidalgo,J.A./Poveda Larrosa,J.A./González Ros,J.M./P6.09/ CORRELATION ANALYSIS OF THE SEQUENCE DEPENDENT UNWINDING RATE OF THE PHI29 DNA POLYMERASEMorín Lantero,J.A./Ibarra Urruela,B./Cao,F.J./Arias-González,J.R./Salas,M./Valpuesta Moralejo,J.M./López Carrascosa,J./P6.10/ START-UP OF A CUSTOMIZED OPTICAL TWEEZERS TO STUDY DNA REPAIR AT THE SINGLE-MOLECULE LEVELGollnick,B./Dillingham,M.S./Moreno Herrero,F./P6.11/ TRANSITION STATE SUSCEPTIBILITY IN SINGLE MOLECULE FORCE SPECTROSCOPYAlemany Arias,A./Ritort Farran,F./P6.12/ EFFECT OF NICKS ON SINGLE TRANSLOCATION ACTIVITY OF THE ADDAB MOLECULAR MOTOR STUDIED BY MAGNETIC TWEEZERSCarrasco Pulido,C./Yeeles,J.T./Dillingham,M.S./Moreno-Herrero,F./P6.13/ FORCE SPECTROSCOPY ANALYSIS OF EXTENDED SINGLE DNA MOLECULES IN A NOVEL DUAL TRAP OPTICAL TWEEZER SETUPRibezzi Crivellari,M./Huguet,J.M./Ritort,F./P7.09/ CARACTERIZACIÓN DE LA INTERACCIÓN DEL DOMINIO C1B DE LA PKC TETA CON MEMBRANAS MODELOEgea Jiménez,A.L./Corbalan Garcia,S./Gómez Fernández,J.C./P7.10/ ESTRUCTURA Y ORIENTACIÓN DEL DOMINIO C2 DE LA PKC-epsilon UNIDO A MEMBRANAS: UN ESTUDIO DE ESPECTROCOPÍA DE INFRARROJOAusuli, A.; Corbalán García, S. ; Gómez Fernández, J.C.P7.11/ LA ACTIVIDAD ANTI-AMILOIDE DEL DOMINIO BRICHOS DE LA PRO-SPC REQUIERE SU INSERCIÓN EN LA MEMBRANASaenz Martínez,A./Willander,H./Johansson,J./Casals Carro,C./P7.12/ PROPIEDADES INTERFACIALES DE DOMINIOS ACTIVOS MÍNIMOS DERIVADOS DE PROTEÍNAS DE LA FAMILIA BCL-2Giménez Ibáñez,D./Fuertes Vives,G./Esteban Martín,S./Sánchez Muñoz,O.L./Salgado Benito,J./

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P7.13/ INTERACCIÓN DE UN TREALOSALÍPIDO BIOTENSIOACTIVO CON PROTEÍNAS MODELOZaragoza Martínez,A./Aranda Martínez,F.J./Teruel Puche,J.A./Ortiz López,A./P7.14/ CARACTERIZACIÓN DE REGIONES MEMBRANOACTIVAS DE LAS PROTEÍNAS C Y E DEL VIRUS DEL DENGUE (DENV)de Castro Nemésio,H./Palomares Jerez,M.F./Nuño Sánchez,L./Villalaín Boullón,J./P7.15/ THE INTERACTION OF C2 DOMAINS OF PROTEIN KINASE C ALPHA WITH LUV AS SEEN THROUGH LIPID FLUORESCENCE AND LIGHT SCATTERINGPérez Lara,F.A./Corbalan Garcia,S./Gómez Fernández,J.C./P7.16/ MECANISMOS DE UNIÓN A MEMBRANA DE LOS DOMINIOS C2A Y C2B DE SINAPTOTAGMINA-1Coronado Parra,T./Guillén Casas,J./Luengo Gil,G./Guerrero Valero,M./Gómez Fernández,J.C./Corbalan Garcia,S./P7.17/ RECONSTITUTION OF PROAPOPTOTIC BAK FUNCTION IN LIPOSOMES REVEALS A DUAL ROLE FOR MITOCHONDRIAL LIPIDS IN THE BAK-DRIVEN MEMBRANE PERMEABILIZATION PROCESSLandajuela Larma,A./Bustillo Zabalbeitia,I./Landeta Diaz,O./Basañez Asua,G./P7.18/ THE INFLUENCE PLANT EXTRACT ON THE LIPID SIGNALING IN DEPEND OF MONO- AND BI-VALENT IONSSukiasyan,A./P7.19/ INFLUENCE ON MODELING OXIDIZING PROCESSES OF THE EXTRACT OF ARTEMISIA ABSINTHIUM LKirakosyan,A./Hambardzumyan,A./P7.20/ PORE FORMING DOMAIN OF COLICIN A: A MODEL TO STUDY LIPID-PROTEIN INTERACTIONSBermejo Luhia,I./Viguera Rincón,A.R./Ibáñez de Opakua,A./P7.21/EFFECT OF ORITAVANCIN IN S. AUREUS BACTERIA. A BIOPHYSICAL APPROACHDomènech Cabrera,O./Suárez-Germà,C./Montero Barrientos,M.T./Hernández-Borrell,J./P7.22/ EFECTO DEL TREALOSALÍPIDO SOBRE LAS PROPIEDADES FUNCIONALES Y ESTRUCTURALES DE LA CALCIO ATPASA DE RETÍCULO SARCOPLÁSMICOScheherezade García/ Ortiz, Francisco, A./ Aranda J./ Teruel, J.A.P7.23/ RECONSTITUTION OF E. COLI PROTO-RING ELEMENTS IN GIANT UNILAMELLAR VESICLESCabré E.J./ MartosA./ Raso-Alonso, A./ Vicente, M./ Rivas, G./ Jiménez, M.P8.09/ MODULACIÓN DE LAS INTERACCIONES ENTRE PROTOFILAMENTOS DE LOS MICROTÚBULOS POR TAXANOS MODIFICADOSMatesanz Rodríguez,R./Rodríguez-Salarisch,J./Pera,B./Canales,A./Jiménez Barbero,J./Díaz Pereira,J.F./Nogales,A./P8.10/ ZAMPANOLIDA, UN NOVEDOSO AGENTE ESTABILIZADOR DE MICROTÚBULOS QUE UNE COVALENTEMENTE AL SITIO DEL POROPera Gresely,B./Field,J.J./Calvo,E./Canales,A./Zuwuerra,D./Trigili,C./Kanakkanthara,A./P8.11/ MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS MACRÓLIDOS CITOTÓXICOS AMPHIDINOLIDAS X Y JTrigili,C./Pera,B./Cossy,J./Pineda,O./Villarasa,J./Díaz Pereira,J.F./Barasoaín,I./P8.12/ RECONSTITUTION OF DIVISOME ELEMENTS IN FUNCTIONALIZED MICRO-BEADSMonterroso Marco,B./Martos,A./Ahijado,R./Reija,B./Jiménez,M./Zorrilla López,S./Rivas,G./P9.09/ RNA SILENCING SUPPRESSOR P19 BINDS TRINUCLEOTIDE REPEATS CONTAINING G-U MISMATCHESTamjar,J./Popov,A./Malinina,L./P9.10/ INTERACCIÓN DE CARBOHIDRATOS CON CÚADRUPLEX DE GUANINASVengut Climent,E./Gómez Pinto,I./Lucas,R./Aviñó,A./Eritja Casadellá,R./González,C./Morales Sánchez,J.C./P10.09/ LAS INTERACCIONES PROTEÍNA-PROTEÍNA DE LA PKCα CONTROLAN EL ENSAMBLAJE DEL CITOESQUELETO EN CÉLULAS PC12 DIFERENCIADAS CON NGF Y ATPGuerrero-Valero1, M./ Marín-Vicente, C.2; Coronado-Parra, T.1/Gómez-Fernández, J.C.1/Zubarev, R.A.2 / Corbalán García, S.1P10.10/ INTERACCIÓN DE NANOPARTICULAS DE ÁCIDO POLI (LÁCTICO-CO-GLICÓLICO) CON COMPONENTES DEL FLUIDO ALVEOLARCañadas, O./ Ruge, C./ Schaefer, Uli F./ Lehr, Claus-Michael/ Casals, C.P11.09/CÁLCULO DE PROPIEDADES EN DISOLUCIÓN DE BIOMACROMOLÉCULAS RÍGIDAS A PARTIR DE MODELOS CON DETALLE A NIVEL ATÓMICO O DE RESIDUO. METODOLOGÍAS Y APLICACIONESAmorós, D./ Ortega, A./ García de la Torre, J.P11.10/ESTUDIO POR ULTRACENTRIGACIÓN ANALÍTICA DE SISTEMAS BIOMACROMOLECULARES HETEROGÉNEOS. PREDICCIÓN Y ANÁLISIS DE DATOS EXPERIMENTALESDíez, A.I. /A. Ortega/ García de la Torre, J.P11.11/ESTUDIO ESTOCÁSTICO DE UN MODELO PROTOMETABÓLICO SIMPLE CON CIERRE METABÓLICOPiedrafita, G./ Morán, F./ Athel Cornish-Bowden/ Montero, F.P11.12/ APROXIMACIÓN PREDICTIVA IN SILICO: ANÁLISIS METABOLÓMICO PARA LA ELUCIDACIÓN DE LOS MECANISMOS DE ENFERMEDADESTorrens, F./ Castellano, G.P12.09/EFECTO DEL PH SOBRE EL PAPEL AMILOIDOGÉNICO DE LOS LÍPIDOSSalvador, A./ Frías, M.A./ Nieto, J.A./ R. Arrondo, J.L.P12.10/ INMOVILIZACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LIPOSOMAS Y PROTEOLIPOSOMAS EN MATRICES SOL-GEL: UN ESTUDIO COMBINADO DE ESPECTROSCOPÍA Y MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA UTILIZANDO LA SONDA FLUORESCENTE LAURDANReyes Mateo, C./ Pinto, S./ Renart, L./ Gonzalez-Ros, J.M./ Prieto, M./ Poveda, J.A./ Esquembre, R.P12.11/ FLUORESCENCE MICRO-SPECTROSCOPY ANALYSIS OF BACTERIAL DIVISION PROTEIN INTERACTIONSReija, B.; Monterroso, B.; Ahijado-Guzmán, R.; Alfonso, C./ Rivas, G./ Zorrilla, S.

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Acebrón Ávalos,I. P412 170Acebrón,S.P. P123 149Agirre Hernández,J. P414 172Aguilella Fernández,V.M. O206 90Ahijado Guzmán,R. P1211 212Ahijado,R. P812 201Aicart,E. O905 117Alaimo,A. P511 175Albert de la Cruz,A. O408 100Alcaraz González,A. 3.02, O206 44/90Alcarraz-Viza, G. 11.04 78Alegre Cebollada,J. O107 87Alemany Arias,A. P611 180Alemany,R. P209 153Alfonso Botello,C. P1211 212Alfonso,C. O708,P123 112,149Almonte García,L. O1207 131Alonso Izquierdo,A. P214,P216,P219 158, 160, 163Althaus,M. O505 101Alvarez de la Rosa,D. O505 101Álvarez de Tolego, G. 10.01 71Álvarez-Lacalle, E. 10.04 74Álvarez Martín,J. 5.01, P510 51,174Amiri,R. P119 145Amorós Cerdan,D. 11.01, P1109 75, 206Andraka Rueda,N. O1206 130Andreu Morales,J.M. 8.01, O808,P117 63, 116, 143Apellániz Unzalu,B. P212 156Aprile,F.A. O108 88Aragón, E. 4.03 49Aranda Martínez,F.J. P713, P722 187, 196Araujo Pasarín,A. P210 154Ares,P. O908 120Areso,P. P511 175Arias Moreno,X. P113 139Arias-González,J.R. O608,O605,P609 108, 105, 109Artola,M. P117 143Asensio, J.L. 9.02 68Ausili,A. P710 184Aviñó,A. 9.01, 9.04, O908,P910 67, 70, 120, 203Ayala Torres,J.L. P509,O507 173, 111Ayllon, J. 7.02 60Azuaga Fortes,A.I. P409,P112 167, 138

AUTOR Nº DE COMUNICACIÓN PÁGINA


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Bañares Hidalgo,A. P217 161Bañó Polo,M. O705 109Barasoaín,I. P811 200Barceló Mairata,M.F. P209 153Basañez Asua,G. P717,O1008 191, 124Bastida, A. 9.02 68Batista,A.P. P512 176Beceiro,A. P411 169Beloso, A. 8.04 66Bellomio,A. P213 157Benito, A. 11.04 78Benkovic,S.J. O606 106Bermejo Luhia,I. P720 194Bertoncini,C.W. O108 88Bhattacharyya,A. O808 116Blackledge,M. P409 167Bragado-Nilsson, E. 8.04 66Bordbar,A.K. P119 145Bosch Presegué,L. P114 140Bou,G. P411 169Bouit,P.A. O908 120Bouzas Olaso,V. O307 95Bravo Sicilia,J. P410 168Brisson, A.R. 2.02 40Brown, R.E. 4.01 47Bruscolini,P. P118 144Buceta,J. O1005 121Busquets,M. P413 171Bustamante, N. 1.02 36Bustillo Zabalbeitia,I. P717 191Busto Vega,J. P219 163Buynak,J.D. P411 169Cabo- Bilbao, A. 4.01 47Calvete, J.J. 12.01 79Calvo,E. P810 199Cambi,A. O1005,O607 121, 107Cañadas Benito,O. P1010 205Canales,A. O806,P809,P810 114, 198, 199Cao,F.J. P609 178Carpena,X. P413 171Carrasco Pulido,C. P612 181Carrascosa, J.L. 8.03 65Cartón, I. 2.02 40



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Cascante Serratosa, M. 11.04 78Casemunt, J. 10.04 74Casals Carro,C. P711,P1010 185, 205Casañas, A. Premio Bruker 26Casares Atienza,S. P409 167Casino Ferrando,P. O407 99Castellano Estornell,G.M. P1112 209Castells,M.A. O405 97Caston,J.R. 8.03, P309 65, 166Centelles, J. 11.04 78Cerrada de Dueñas,A. P221 165Cervera Miralles,J. O407 99Chaboy Nalda,J. P116 142Chacón Montes,P. P117 143Chakrabartty,A. O907 119Chen,A.Y. O108 88Chenal,A. O105 85Clarke,R.W. O108 88Clauss,W.G. O505 101Coderch,C. O806 114Cohen,S.I.A. O108 88Comes Beltrán,N. O506 102Condezo,G. O805 113Conejero Lara,F. P112 138Contreras,A. O405 97Corbalan Garcia,S. P709,P710,P715,

O707,P1009,P716183, 184, 189,111, 204, 190

Cordomí Montoya,A. P114,O508 140, 104Cornish-Bowden,A. P1111 208Coronado Parra,T. O707,P1009,P716 111, 204, 190Coutinho, A. 2.03 41Cossy,J. P811 200Cremades Casasín,N. O108 88Croquette,V. O606 106Cruz Rodriguez,A. O206,P218,P220,O207 90, 162, 164, 91Cuervo, A. 8.03 65Dabán Balañá,J.R. O807 115Damha, M. 9.01 67de Atauri, P. 11.04 78de Carcer, G. 8.04 66de Castro Nemesio,H. 7.03, O706, P714 61, 110, 188de la Fuente Pérez,S. 5.01, P510 51, 174De la Rosa Acosta,M.A. P109,P116,P120,P122 135, 142, 146, 148



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de las Rivas,B. P412 170de Pablo Gómez,P.J. P309 166de Pablo,P.J. O805 113de Polavieja, G. 3.03 45del Castillo Rojo,U. P123 149del Monte Muñoz de la Peña,F.

P115 141

Delgado,J.L. O908 120,Delgado, S. 11.03 77Diaspro, A. PP4 24Diaz, F. 1.02 36Diaz- Moralli, A. 11.04 78Diaz Moreno,I. P120,P109,P116,P122 146, 135, 142, 148Díaz Moreno,S. P116 142Díaz Pereira,J.F. O806,P809,P811 114, 198, 200Díaz Quintana,A. P109,P116,P122 135, 142, 148Diaz-Quintana,A. P120 146Diez García,F. O907 119Diez Peña,A.I. P1110 207Dillingham,M.S. O306,P610,P612 94, 179, 181Dinshaw, J.R. 4.01 47Dobson,C.M. O108 88Domènech Cabrera,O. P721 195Dunne,P. O108 88Echaide,M. O307 95Egea Jiménez,A.L. P709 183Encinar del Pozo, M. 3.01 43Encinar Hidalgo,J.A. P513,O507 177, 103Enciso Carrasco,M. O1108 128Eritja Casadellá,R. 9.01, 9.03, 9.04, O908,P910 67, 69, 70, 120, 203Espinosa,G. P211,P215 155, 159Espinosa,J. O405 97Esquembre Tomé,R. P115,P1210 141, 211Esteban Martín,S. O406,P712,O205 98, 186, 89Esteban Matin,S. O1107 127Esteban,O. O607 107Estrada,P. P217 161Faccin,M. P118 144Felipe Campo,A. O506 102Fenwick,R.B. O406 98Fernández Carvajal,M.A. 5.02, P509,O507,P513 52, 173,103, 177 Fernández Fernández,C. P111 137Fernández,J.M. 6.04, O107 58, 87



236

Fernandez Ballester, G. 5.02 52Fernández-Busquets,X. O807 115Ferrer Montiel, A. 5.02 52Ferrer Orta,C. P414 172Ferrer Pla,M.L. P115 141Ferrer,M. P121 147Field,J.J. P810 199Fita Rodríguez,I. Premio Bruker, P413 26, 171Fonteriz García,R.I. 5.01, P510 51, 174Forchhammer,K. O405 97Frías,M.A. O1206,P1209 130, 210Fronius,M. O505 101Frolov, V. 7.02 60Fuentes Pérez,M.E. O306 94Fuertes Vives,G. P712,O205,O1207 186, 89, 131Gabasa, M. 3.02 44Gaffney,B.J. P413 171Galgoczy, R. 3.02 44Gallego, C. 1.02 36Gállego,I. 9.03, O807 69, 115Garcés,J.L. O308 96García, P. 1.02 36García Carrillo,S. P722 196Garcia de la Torre,J. 11.01, P1110,P1109 75, 207, 206García Heredia,J.M. P109,P122 135, 148García-Manyes, S. 6.04 58García Pacios,M. O1205 129García Parajo,M.F. O607 107García Sáez,A.J. P212,O205 156,89García,M.Q. P413 171García-Álvarez,B. P220 164García-Arribas,A.B. P219 163García-Heredia,J.M. P120 146García-Mayoral,M.F. P119 145García-Parajo,M.F. O1005,O1208 121, 132Garibotti, A. 9.03 69Garreta Gambús,A. P413 171Garriga, D. 4.02 48Garriga Solé,P. P114,O508,P126 140, 104, 152Gascón, P. 3.02 44Gasset Rosa,F. P111 137Gavilanes Franco,F. P110 136Gil Cartón,D. P213 157



237

Gimenez, A. 3.02 44Gimenez Ibáñez,D. O1107,P712,O205,O1207 127, 186, 89, 131Giraldez Fernández,T. Premio SBE Izasa- Bekman-Coulter,

O50527, 101

Giraldo Suárez,R. P111 137Giudici,A.M. P509,O507 173, 103Gollnick,B. P610 179Gómez Fernández,J.C. P709,P710,P715,O707,P1009,P716 183, 184, 189, 111, 204,

190Gómez Herrero,J. O908,P309 120, 166Gómez Pérez,F.J. P124,P125 150, 151Gómez Pinto,I. 9.01, 9.04, O907,P910 67, 70, 119, 203Gómez,J. P110,O1005,P121 136, 121, 147Gómez-Florit,M. P209 153Goñi Urcelay,F.M. P214,P216,P219 158, 160, 163González Ibáñez,C. O907 119Gonzalez Mañas,J.M. P213 157González Ros,J.M. 5.02, P513 52, 177González,C. 9.01, 9.04, P910 67, 70, 203González-Ros,J.M. P1210,O507 211, 103Gorostiza, P. 10.03 73Gozalbo Rovira,R. O407 99Gregorio Teruel, L. 5.02 52Gualda,E.J. O607 107Guérin Aguilar,D.M. P414 172Guerrero Valero,M. O707,P1009,P716 111, 204, 190Guertes Vives,G. O1107 127Guillén Casas,J. O707,P716 111, 190Gutiérrez Pérez, J.M. 10.02 72Haller,T. P221 165Hambardzumyan,A. P719 193He,Y. O1106 126Hermoso, J.A. 4.04 50Hernández Rocamora,V.M. O708 112Hernández-Borrell,J. 7.04, P721 62, 195Hernando Pérez,M. P309 166Herrero Galán,E. O605 105Herzig,S. O1008 124Higuera, C. 11.03 77Holguera, J. 7.02 60Huarte Arrayago,N. P210,O207 154, 91Huecas,S. P117 143Huguet,J.M. P613 182



238

Ibáñez de Opakua,A. P720 194Ibarra Daudén,M. O305 93Ibarra Urruela,B. O608,P609 108, 178Ionel, A. 8.03 65Isanta Amela,S. P215 159Isvoran,A. O308 96Izquierdo- Serra, M. 10.03 73Jardín, I. 5.03 53Jemal. I. 10-01 71Jiménez Barbero,J. O806,P809 114, 202Jimenez Cabré,E. P723 197Jiménez Rojo,N. P214 158Jiménez Sarmiento,M. P723 197Jiménez,M. P812 201Johansson,J. P711 185Junquera,E. O905 118Kanakkanthara,A. P810 199Khosropour,A.R. P119 145Killian, A. PP3 23Kirakosyan,A. P719 193Klenerman,D. O108 88Knowles,T.P.J. O108 88Ladant,D. O105 85Lagartera, L. 1.02 36Laín Torre,A. O106 86Landajuela Larma,A. P717 191Landeta Diaz,O. P717 191Langevin,D. P211,P215 155, 159Larriva, M. 1.04 38Latorre, A. 11.03 77Laurents,D.V. P119,O907 145, 119Lazaridis,T. O1106 126Lázaro,J.M. O608 108Lehr,C.M. P1010 205Liz-Marzán,L.M. O307 95Llácer Guerri,J.L. O405 97Llobet, A. 10.03 73Llorca Blanco,O. O905 117Lobatón, C.D. 5.01 51Lombana Sacristán,L. P110 136Longman,E.J. O306 94López Alonso,J.P. O907 119López Carrascosa,J. O608,O605,O305,P609,P309 108, 109, 93, 109, 166



239

López Méndez,B. O106 86López Montero,I. O208,P211,O1006 92, 155, 122Lopez Perez,M. P125,P124 151, 150López Rodríguez,E. P218 162López-Montero,I. P215 159Lorizate, M. 1.05 39Loura, L.M.S. 1.05 39Lucas,R. 9.04, P910 70, 203Lucken Ardjomande,S. O1008 124Luengo Gil,G. O707,P716 111, 190Lugo, R. 3.02 44Luque, D. 4.02, 8.03 48,65Madurga,S. O308 96Malinina,L. 2.02, 4.01, P909 40, 47, 202Mallavía,R. P121 147Malumbres, M. 8.04 66Mancheño Gómez,J.M. P412 170Manning, B. 9.03 69Manosas Castejón,M. O606 106Manresa,A. P413 171Manzo,C. O1005,O1208,O607 121, 132, 107Marín, S. 11.04 78Marín Vicente,C. P1009 204Marina Moreno,A. O407 99Marquez, I. 3.01 43Marreiros,B.C. P512 176Martín, J.J. 7.02 60Martín-Benito, J. 8.03 65Martín Galiano,A.J. O808 116Martín Molina,A. O905 117Martín-Pintado, N. 9.01 67Martín,N. O908 120Martínez Archundia,M. P126,O508 152, 104Martínez-Buey, R. 1.02 36Martínez Domínguez,I. P216 160Martínez-Máñez, R. 12.02 80Martinez Oliván,J. P113 139Martínez Tomé,M.J. P121 147Martinez-Ripoll,M. O408 100Martinou,J.C. O1008 124Martos Sánchez,A. P723 197



240

Martos,A. P812,P123 201, 149Mas Pujadas,F. O308 96Mateo Alarcón,P.L. P409 167Mateo Martínez,C.R. P115,P1210 141, 211Mateo,R. P121 147Mateos-Gil, P. 3.01 43Matesanz Rodríguez,R. P809 198Melo, A. 2.03 41Menéndez Fernández,M. 1.02, O805 36, 113Menéndez-Conejero,R. O805 113Mertens,J. O305 93Mesa, P. 8.04 66Mestres,B. P209 153Millet Aguilar-Galindo,O. O106 86Millet,O. P511 175Mingarro Muñoz,I. O705 109Minton,A.P. O708 112Miranda, A. 11.04 78Miranda,P. O505 101Mohammadpour,I. P119 145Molina Gallego,M.L. P509,O507,P513 173, 103, 177Molina García,L. P111 137Mondragón, L. 12.02 80Monroy Muñoz,F. O208,P211,O1006,P215 92, 155, 122, 159Montero, F. 11.03 77Montero Barrientos,M.T. 5.01, P721 51, 195Montero Carnerero,F. P1111 208Montero Zoccola,M.T. P510 174Montenegro, P. 5.01 51Monterroso Marco,B. O708,P812,P1211 112, 201, 212Montes, M.A. 10.01 71Montessuit,S. O1008 124Montoya, G. 8.04 66Montoya Díaz,E. P509,O507,P513 173, 103, 177Morales Sánchez,J.C. 9.04, P910 70, 203Morán Abad,F. 11.03, P1111 77, 208Morante Sagasti,K. P213 157Morel,B. P112 138Moreno del Álamo,M. P111 137Moreno Díaz de la Espina,S. P111 137Moreno, A. 5.01 51Moreno Herrero,F. 6.02, O306,P610 56, 94, 179



241

Moreno-Herrero,F. P612 181Morín Lantero,J.A. P609 178Morín,J. O608 108Moro Pérez,F. P123 149Moses, E. 10.04 74Muga Villate,A. P123 149Muñoz Barroso, I. 7.02 60Muñoz Úbeda,M. O905 117Muñoz, I.G. 8.04 66Muñoz,R. P412 170Natale,P. P215 159Navajas, D. 3.02 44Neira,J.L. P410 168Nieto Garay,J.A. P1209 210Nieva Escandon,J.L. P210,P212,O207 154, 156, 91Nir,S. P212 156Nogales,A. P809,O905 198, 117Nuño Sánchez,L. 7.03, P714, O706 61, 188, 110Ochoa-Lizarrete, B. 4.01 47Oliva Blanco,M.A. O808 116Oliveira Costa, S.D. 11.02 76Oliveras Martínez,A. O506 102Olmeda Lozano,B. P220 164Oncins,G. O807 115Orlandi, J.G. 10.04 74Orozco Lopez,M. O906 118Orte,A. O108 88Ortega, A. P110 136Ortega Atienza,S. P110 136Ortega Quintanilla,G. O106 86Ortega Retuerta,A. P1110,P1109 207, 206Ortega Roldán,J.L. P409 167Ortega-Esteban,A. O805 113Ortiz Lombardía,M. P410 168Ortiz López,A. 7.01, P713, P722 59, 187, 196Orzáez, M. 12.02 80Pajares,M.A. O1205 129Palomares Jerez,M.F. 7.03, P714,O706 61, 188, 110Parra Ortiz,E. O206 90Pascual Vega,E. P309 166Pastor,I. P121,O308 147, 96


242

Pastoriza,I. O307 95Pastrana,B. O1205 129Paterson,I. O806 114Pelizzola,A. P118 144Pera Gresely,B. P810 199Pera,B. P809,P811 198, 200Pereira,M.M. P512 176Peretó, J. 11.03 77Pérez Berna,A.J. O805 113Pérez González,J.J. O508 104Perez Lara,F.A. P715 189Pérez Payá,E. 12.02, P120 80,146Pérez Rentero, S. 9.03 69Pérez-Gil,J. O206,P217,P218,P221,O307,P220

,O20790, 161, 162 , 165, 95, 164, 91

Perezzan Rodríguez,R. O1105 125Perumal,S.K. O606 106Pikl-Herk, A. 4.02 48Piedrafita,G. P1111 208Pierluigi Valente 5.02 52Pineda,O. P811 200Pinto,S. 4.01, P1210 47, 211Ponce, M. 11.03 77Popov,A. P909 202Portella Carbó,G. O906 118Poveda Larrosa,J.A. P509,P1210,O507,P513 173, 211, 103, 177Prades,J. P209 153Prakash Somasekharan,S. O1008 124Prieto Frías,L. O1106 126Prieto,M. 2.03, P1210 41, 211Puig, M. 3.02 44Quesada Pérez,M. O905 117Ramón Portés,E. P114 140Raso Alonso,A. P723 197Reguart, N. 3.02 44Reigada,R. O1005 121Reija Otero,B. P1211 212Reija,B. O708,P812 112, 201Reina, J.J. 9.04 70Renart Pérez,M.L. P509,P1210,O507,P513 173, 211, 103, 177Revuelta, J. 9.02 68Rey Gayo,A. 1.04, O1108,O1105 38, 128, 125


243

Reyes Alcaraz,A. P126 152Ribezzi Crivellari,M. 2.02, P613 40, 182Richter,R. P218 162Ringkjobing-Jensen,M. P409 167Ritort Farran,F. P611 180Ritort,F. 6.01, P613 55, 182Rivas Caballero,G. P1211, P723 212, 197Rivas,G. 8.02, O708,P812,P123 64, 112, 201, 149Rivas-Pardo,J.A. O107 87Rivera,J. P410 168Robinson, C.V. 8.04 66Rodríguez Arriaga,L. O208 92Rodríguez Arrondo,J.L. O1205,O1206,P1209 129, 130, 210Rodríguez Díaz,J. O407 99Rodríguez García,R. O1006 122Rodríguez Pulido,A. O905 117Rodríguez-García,R. P215 159Rodríguez-Salarisch,J. O806,P809 114, 198Romero Garrido,A. P410,P411 168, 169Rosado, J.A. 5.03 53Roura-Ferrer,M. O506 102Royer, C. PP2 22Rubio Zamora,V. O407 99Rubio,V. O405 97Ruge,C. P1010 205Ruiz Avila,L. P117 143Ruiz Laza,R. O1007 123Ruzafa Ruiz,D. P112 138Saenz Martínez,A. P711 185Salas,M. O608,P609 109, 109Salgado Benito,J. O1107,P712,O205,O1207 127, 186, 89, 131Salido, G.M. 5.03 53Salvador Ibáñez,A.M. P1209 210Salvatella,X. O406 98Salzano,M. P120 146Samygina, V. 4.01 47San Martín,C. O805 113Sancenón, F. 12.02 80Sánchez Eugenia,R. P414 172Sánchez Magraner,L. 7.02, P414 60, 172Sánchez Muñoz,O.L. O1107,P712,O205,O1207 127, 186, 89, 131Sánchez-Tena, S. 11.04 78


244

Sancho Sanz,J. 1.01, P126,P113 35, 152, 139Sandal,M. O108 88Santillana Heras,E. P411 169Sanz Medel, A. 12.03 81Sanz Morales,J.M. P115 141Sanz,L. O808 116Schaefer,U.F. P1010 205Schaffner Barbero,C. P117 143Schwille,P. O205 89Selivanov, V. 11.04 78Serna, M. 8.04 66Serrano López,A. P111 137Shnyrova, A. 7.02 60Sisquella,X. O807 115Solé Codina,L. O506 102Somoza Calatrava,A. O908 120Soriano, J. 10.04 74Sot Sanz,J. P214 158Sot,J. P213,P219 157, 163Sotomayor Pérez,A.C. O105 85Spínola Amilibia,M. P410 168Suárez-Germà,C. P721 195Sukiasyan,A. P718 192Tabares Domínguez,L. O1007 127Taberner, F. 5.02 52Tadeo Campillo,X. O106 86Taeusch,H.W. P218 162Tamayo,J. O305 93Tamjar,J. P909 202Teixeira,M. P120 146Teller, S. 10.04 74Terrones Urio,O. O1008 124Teruel Puche,J.A. P713, P722 187, 196Toca-Herrera, J.L. 6.03 57Toledo González,D. P114 140Torreblanca González,R.E. P126 152Torreño Piña,J.A. O607 107Torrens Zaragozá,F. P1112 209Trauner, D. 10.03 73Trigili,C. O806,P811,P810 114, 200, 199Val de Moraes,S.P. P413 171Valle Rodriguez,M. P213 157


245

Vallejo Gracía,A. O506 102Valpuesta Moralejo,J.M. 8.03, 8.04, O608,O605,P609,O808 65, 66, 108, 105, 178, 116van Nuland,N. P409 167van Zanten,T.S. O1005,O1208 121, 132Varela Álvarez,L. P112 138Vazquez, S. 11.03 73Velázquez Campoy,A. P113 139Velázquez Muriel, J.A. 8.03 65Vélez, M. 3.01 43Vengut Climent,E. 9.04, P910 70, 203Verdaguer Massana,N. Premio Bruker, 4.02, P414 26, 48, 172Ventura Zamora, S. 1.03 37Vicent, M.J. 12.02 80Vicente,M. O708, P723 112, 197Viguera Rincón,A.R. P214,P414,P720 158, 172, 194Vilaseca,E. O308 96Villar, E. 7.02 60Villalaín Boullón,J. 7.03, P714,O706 61, 188, 110Villarasa,J. P811 200Villarroel Muñoz,A. 5.04, P511,O506 54, 175, 102Vladimir Espinosa 1.01 35Vögler,O. P209 153Wall,J.G. P115 141 Wesch,D. O505 101Willander,H. P711 185Williams, R. PP1 21Woodard, G.E. 5.03 53Xaubet, A. 3.02 44Yebenes,H. 8.04, O808 66, 116Yeeles,J.T. P612 181Yélamos López,B. P110 136Yunta Yanes,C. O408 100Young Park, A. 8.04 66Zamora,F. O908 120Zaragoza Martínez,A. P713 187Zbidi, H. 5.03 53Zhai, X. 4.01 47Zhou, M. 8.04 66Zhu,J.K. O408 100Zorrilla López,S. 12.04, O708,P812,P1211 82, 112, 201, 212Zubarev,R.A. P1009 204Zuwuerra,D. P810 199


246


247

LISTADO DE ASISTENTES


248


249

Acebrón Ávalos,I.Alaimo,A.Albert de la Cruz,A.Alcáraz Casademunt,J.Alegre Cebollada,J.Alemany Arias,A.Alonso Izquierdo,A.Alvarez de Toledo Naranjo,G.Alvarez Martín,J.Amorós Cerdan,D.Andraca Rueda,N.Andreu Morales,J.M.Apellániz Unzalu,B.Aranda Martínez,F.J.Araujo Pasarín,A.Asensio Alvarez,J.L.Ausili,A.Ayala Torres,J.L.Azuaga Fortes,A.I.Bañares Hidalgo,A.Bañó Polo,M.Barceló Mairata,M.F.Bermejo Luhia,I.Bouzas Olaso,V.Bustillo Zabalbeitia,I.Busto Vega,J.Calvete Chornet,J.J.Cañadas Benito,O.Carrasco Pulido,C.Casals Carro,C.Cascante Serratosa, M.Casino Ferrando,P.Cerrada de Dueñas,A.Chacón Montes,P.Comes Beltrán, N.Coronado Parra, M.T.Cortijo Mérida, M.Cremades Casasín, N.Cruz Rodríguez,A.Daban Balaña,J.R.Daura Ribera,X.de Castro Nemésio,H.

NOMBRE COMPLETO


250

NOMBRE COMPLETO De la Fuente Pérez,S.De la Rosa Acosta, M.A.De Pablo Gómez, P.J.Diaspro, A.Diaz Baños, F.G.Díaz Pereira,J.F.Diaz Moreno, I.Díaz Quintana, A.Diez Peña,A.I.Domenech Cabrera, O.Egea Jiménez,A.L.Enciso Carrasco,M.Eritja Casadellá,R.Esquembre Tomé,R.Esteban Martín,S.Ferrer Montiel, A.Field,J.J.Fita Rodríguez,I.Fuentes Pérez,M.E.Fuertes Vives,G.G. de Plavieja, G.García Alvarez,B.García Arribas,A.García de la Torre,J.García Mayoral,M.F.García Montañes, C.García Pacios,M.García,ShereGarcía-Manyes, S.Garreta Gambús, A.Garriga Solé,P.Gavilanes Franco,F.Giménez Ibáñez,D.Giraldez Fernández,T.Giraldo Suárez,R.Gollnick,B.Gómez Fernández,J.C.Gómez Pérez,F.J.Goñi Urcelay,F.M.González Ibáñez,C.Gorostiza,P.Guerrero Valero,M.


251

Guillén Casas,J.Gutiérrez Lete,M.Gutiérrez Pérez,L.M.Hermoso Domínguez,J.A.Hernández Borrell,J.Hernandez Rocamora,V.M.Hernando Pérez, M.Herrero Galán,E.Huarte Arrayago,N.Ibarra Daudén,M.I.Ibarra Urruela,B.Isanta Imela, S.Jimenez Cabré,E.Jiménez Rojo,N.Killian,J.A.Landajuela Larma,A.Laurents,D.V.Llácer Guerri,J.L.Lombana Sacristán,L.López Carrascosa,J.López Cascales,J.J.López Martínez,M.C.López Montero, I.López Pérez,M.López Rodríguez,E.Lorenzo Ros, S.Lorizate Nogales,M.Luengo Gil, G.Macías Hernández, M.J.Malinina,L.Mancheño Gómez,J.M.Manosas Castejón,M.Manzo,C.Martín Molina,A.Martínez Archundía,M.Martínez Domínguez,I.Martinez Oliván,J.Martínez Tomé,M.J.Mas Pujadas, F.Mateo Alarcón,P.L.Mateo Martínez,C.R.Matesanz Rodríguez,R.

NOMBRE COMPLETO


252

Mell, M.Menéndez Fernández,M.Mertens. J.Millet Aguilar-Galindo,O.Monroy Muñoz, F.Monterroso Marco,B.Montoya Díaz,E.Morales Sánchez,J.C.Morán Aban, F.Morante Sagasti,K.Moreno Herrero,F.Morín Lantero,J.A.Moro Pérez,F.Muga Villate,A.Oliva Blanco,M.A.Olmeda Lozano,B.Ortega Atienza,S.Ortega Quintanilla,G.Ortega Retuerta,A.Ortiz López,A.Padmanabhan Iyer, S.Palomares Jerez,M.F.Parra Ortiz,E.Pera Gresely,B.Pereira,M.M.Pérez Berna,A.J.Pérez Gil, J.Pérez Lara, F.A.Pérez Payá,E.Pérez Sánchez, H.E.Perezzan Rodríguez,R.Portella Carbó, G.Poveda Larrosa,J.A.Prieto Frías,L.Prieto,M.Ramón Portés,E.Reija Otero,B.Rey Gayo,A.Ribezzi Crivellari, M.Richter,R.Ritort Farrán, F.

NOMBRE COMPLETO


253

Rivas Caballero,G.Rodríguez Arrondo,J.L.Rodriguez García, R.Rosado Dionisio,J.A.Royer,C.Ruiz Avila,L.Ruiz Laza,R.Ruzafa Ruiz,D.Saenz Martínez,A.Salgado Benito,J.Salvador Ibáñez,A.M.Sánchez Eugenia,R.Sánchez Muñoz,O.L.Sancho Sanz,J.Santillana Heras,E.Sanz Medel, A.Somoza Calatrava,A.Soria Escoms, S.Soriano Fradera,J.Sotomayor Pérez,A.C.Spínola Amilibia,M.Subirana Torrent,J.A.Tabares Domínguez,L.Tamjar,J.Terrones Urio,O.Teruel Puche,J.A.Toca-Herrera,J.L.Torreblanca González,R.E.Torreño Piña, J.A.Torrens Zaragozá,F.Trigili,C.Valpuesta Moralejo,J.M.Van Zanten,T.S.Vélez Tirado, M.Vengut Climent, E.Ventura Zamora, S.Verdaguer Massana,N.Villalaín Boullón,J.Villar Ledesma,E.Villarroel Muñoz,A.


254

Williams, R.Yunta Yanes,C.Zaragoza,A.Zorrilla López,S.

Programa del Congreso

Miércoles, 1 de Junio

Jueves, 2 de Junio

Viernes, 3 de Junio

Viernes, 3 de Junio

Sábado, 4 de Junio

16.00h Inscripción y Recogida de Documentación

18.30h ACTO INAUGURAL, ACTUACIÓN MUSICAL Y CONFERENCIA INAUGURAL. Roger Williams, Cambridge (U.K.) (Salón de Actos)

20.15h. Recepción de Bienvenida

9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 1-ESTABILIDAD DE PROTEÍNAS, PLEGAMIENTO Y DINÁMICA.Javier Sancho, Zaragoza (Salón de Actos)

9.00h. Javier Sancho, Zaragoza9.30h. Margarita Menéndez, Madrid10.00h Salvador Ventura-Zamora, Barcelona10.30h Antonio Rey Gayo, Madrid9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 2-DINÁMICA Y ORGANIZACIÓN DE MEMBRANAS. Alicia

Alonso, Lejona. (Sala Multiusos)9.00h. Maier Lorizate, Heidelberg9.30h. Ralph Richter, San Sebastián10.00h Manuel Prieto, Lisboa10.30h Cristina Casals, Madrid9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 3-FÍSICA BIOLÓGICA. Marisela Vélez, Madrid

(Sala Didáctica)9.00h. Marisela Vélez, Madrid9.30h. Jordi Alcaraz, Barcelona10.00h Gonzalo de Polavieja, Madrid10.30h Pedro J. de Pablo, Madrid


11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 1 (CONTINUACIÓN)- COMUNICACIONES ORALES (Salón de Actos)

11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 2 (CONTINUACIÓN)- COMUNICACIONES ORALES (Sala Multiusos)

11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 3 (CONTINUACIÓN)- COMUNICACIONES ORALES (Sala Didáctica)

12.30h. SESIÓN PLENARIA 1 Catherine Royer, Montpellier, Francia. (Salón de Actos)

13.00h. SESIÓN PLENARIA 2 Antoinette Killian, Utrecht, The Netherlands. Patroci-nada por el Comité Español IUPAB (Salón de Actos)

13.45h. Almuerzo (Restaurante)15.15h. SESIÓN DE CARTELES

(Correspondientes a Sesiones Temáticas 1, 2, 3 , 4 y 5).15.30h. SEMINARIO TÉCNICO A CARGO DE TA INSTRUMENTS. (Sala didáctica)16.45h. DESCANSO: Café (Restaurante)17.15h. MESA REDONDA CONMEMORATIVA DE LOS XXV AÑOS DE LA SBE: Pasado

presente y futuro de la Sociedad de Biofísica de España. Patrocinada por el Comité Español IUPAB (Salón de Actos)

18.45h. ASAMBLEA GENERAL DE LA SBE. (Salón de Actos)19.30h. BIOFÍSICA PARA TODOS: CONFERENCIA DE DIVULGACIÓN. ”Contribución

de la Biofisica y la Fisiologia Celular al Diagnostico y Tratamiento de la Diabetes Mellitus” Bernat Soria. (Aula de Cultura de Cajamurcia, Calle Gran Vía)

9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 4 -ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS. Ignacio Fita, Barcelona. (Salón de Actos)

9.00h. Lucy Malinina, Derio (Vizcaya)9.30h. Nuria Verdaguer, Barcelona10.00h María J. Macías, Barcelona10.30h Juan Hermoso, Madrid9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 5- CANALES IÓNICOS Y TRANSPORTADORES.

Javier Alvarez, Valladolid. (Sala Multiusos)9.00h. Javier Alvarez, Valladolid9.30h. Antonio V. Ferrer Montiel, Elche10.00h Juan Antonio Rosado, Cáceres10.30h Alvaro Villarroel, Lejona (Vizcaya)9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 6- ESTUDIOS BIOFÍSICOS DE MOLÉCULA INDIVIDUAL.

Félix Ritort, Barcelona (Sala Didáctica)9.00h. Felix Ritort, Barcelona9.30h. Fernando Moreno Herrero, Madrid10.00h José Luis Toca-Herrera, Viena10.30h Sergi García Manyes, Londres11.00h. DESCANSO: Café (Restaurante)

9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 10-BIOFÍSICA CELULAR. Guillermo Álvarez de Toledo, Sevilla (Salón de Actos)

9.00h. Guillermo Álvarez de Toledo, Sevilla9.30h. Luis Miguel Gutiérrez, Alicante 10.00h Pau Gorostiza, Barcelona10.30h Jordi Soriano, Barcelona9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 11- AVANCES EN BIOFÍSICA TEÓRICA Y

BIOCOMPUTACIÓN. José García de la Torre, Murcia (Sala Multiusos)9.00h. José García de la Torre, Murcia9.30h. Javier López Cascales, Cartagena10.00h Federico Morán, Madrid10.30h Marta Cascante, Barcelona9.00h. SESIÓN TEMÁTICA 12-AVANCES EN MÉTODOS EXPERIMENTALES BIOFÍSICOS.

Juan José Calvete, Valencia. (Sala Didáctica)9.00h. Juan José Calvete, Valencia9.30h. Enrique Pérez-Payá, Valencia.10.00h Alfredo Sanz-Medel, Oviedo.10.30h Silvia Zorrilla, Madrid11.00h. Descanso: Café (Restaurante)11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 10 (CONTINUACIÓN) Y COMUNICACIONES ORALES

(Salón de Actos)11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 11 (CONTINUACIÓN) Y COMUNICACIONES ORALES (Sala

Multiusos)11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 12 (CONTINUACIÓN) Y COMUNICACIONES ORALES (Sala

Didáctica)12:30h. CONFERENCIA DE CLAUSURA (Salón de Actos)

Alberto Diaspro, Génova, Italia13.30h. SESIÓN DE CLAUSURA Y ENTREGA DE PREMIOS A

LOS MEJORES CARTELES (Salón de Actos)

16.30h. SESIÓN TEMÁTICA 7- INTERACCIONES MOLECULARES EN MEMBRANAS. Antonio Ortiz, Murcia (Salón de Actos)

16.30h. Antonio Ortiz, Murcia17.00h. Enrique Villar, Salamanca16.30h. SESIÓN TEMÁTICA 8- BIOFÍSICA DE COMPLEJOS MACROMOLECULARES.

José López Carrascosa, Madrid (Sala Multiusos)16.30h. José Manuel Andreu, Madrid17.00h. Germán Rivas Caballero, Madrid16.30h. SESIÓN TEMÁTICA 9- BIOFÍSICA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.

Carlos González, Madrid (Sala Didáctica)16.30h. Carlos González, Madrid17.00h. Juan Luis Asensio, Madrid17.30h. DESCANSO: Café (Restaurante)18.00h. SESIÓN TEMÁTICA 7 (CONTINUACIÓN) Y COMUNICACIONES ORALES (Salón

de Actos)18.00h. José Villalaín, Elche18.30h. Jordi Hernández-Borrell, Barcelona19.00h. - 20.00h.


18.00h. SESIÓN TEMÁTICA 8 (CONTINUACIÓN) Y COMUNICACIONES ORALES (Sala Multiusos)

18.00h. José López Carrascosa, Madrid18.30h. José Mª Valpuesta, Madrid19.00h. - 20.00h.


18.00h. SESIÓN TEMÁTICA 9 (CONTINUACIÓN) Y COMUNICACIONES ORALES (Sala Didáctica)

18.00h. Ramón Eritja, Barcelona18.30h. Juan Carlos Morales, Sevilla19.00h. - 20.00h.


11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 4 (CONTINUACIÓN) -COMUNICACIONES ORALES (Salón de Actos)

11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 5 (CONTINUACIÓN) -COMUNICACIONES ORALES (Sala Multiusos)

11.30h. SESIÓN TEMÁTICA 6 (CONTINUACIÓN) -COMUNICACIONES ORALES (Sala Didáctica)

12:30h. PREMIO BRUKER 2011: Ignacio Fita , BarcelonaPREMIO SBE IZASA-BECKMAN-COULTER-2011:Teresa Giráldez, Tenerife

13.30h. Almuerzo (Restaurante)15.00h. SESIÓN DE CARTELES 2

(correspondientes a las Sesiones Temáticas 6 a 12)

libro de resúmenes book of abstracts - digital...

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