lição de biocatálise - técnico lisboa · tabela – classificação, nomenclatura e constante...
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4. Actividade e Estabilidade de Enzimas
Lição de Biocatálise
DEQB
ESTRUTURA DE ENZIMAS DEQB
Lição de Biocatálise
ENZIMA – Entidade de natureza proteica e de origem biológica que levam a cabo in vivo as inúmeras transformações químicas e bioquímicas necessárias à vida dos seres vivos.
Os enzimas, tal como as proteínas, são polímeros complexos constituídos por sequências de aminoácidos, as unidades estruturais básicas, ligadas entre si por uma ligação peptídica.
O homem procura utilizar os ENZIMAS para levarem a cabo in vitro
inúmeras transformações químicas e bioquímicas do qual resultam produtos de alto valor acrescentado.
O Cα O- Cα
C N C N+
Cα H Cα H
ESTRUTURA DE ENZIMAS
H3N+C
H
COO -
R
Os aminoácidos constituintes das proteínas são constituídos por 4 grupos diferentes ligados a um carbono central (Cα):
- um grupo amino (NH3+);
- um grupo carboxílico (COO-);- um átomo de hidrogénio (H);- um grupo variável (R);- um átomo de carbono (carbono-α, Cα), a que se ligam os quatro grupos anteriores.
DEQB
Lição de Biocatálise
α
As propriedades físico-químicas dos aminoácidos estão associadas ao grupo R variável do amínoácido
H3N+C
H
COO -
R
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Lição de Biocatálise
- Têm propriedades ácidas e básicas semelhantes, à excepção da prolina.
- As cadeias laterais têm uma enorme variedade de propriedades funcionais (carga eléctrica, polaridade, hidrofobicidade, reactividade química) e estruturais, conferindo aos aminoácidos a respectiva individualidade.
- O grupo α-amino de um aminoácido pode reagir com o grupo β-carboxilo de outro, com formação de cadeias polipeptídicas.
- Podem sintetizar-se quimicamente polipéptidos com uma sequência pre-determinada.
- A sequência de aminoácidos numa cadeia pode ser determinada por hidrólise da cadeiaem fragmentos (péptidos) e análise sequencial da composição dos péptidos a partir de um dos extremos da cadeia.
Tabela – Classificação, nomenclatura e constante de dissociação das cadeias laterais R dos aminoácidos
Classificação Nome Abreviatura de 3 letras
Abreviatura de 1 letra
pKR da cadeia lateral
Alanina Ala A ---- Valina Val V ---- Leucina Leu L ----
Grupo I Isoleucina Ile I ---- Aminoácidos Metionina Met M ----
Apolares Prolina Pro P ---- Fenilalanina Phe F ---- Triptofano Trp W ---- Glicina Gly G Serina Ser S ~ 13
Grupo II Treonina Tre T ~ 13 Aminoácidos Cisteína Cis C 8.33
Polares Tirosina Tyr Y 10.13 Asparagina Asn N Glutamina Gln Q Lisina Lys K 10.79
Grupo III Arginina Arg R 12.48 Aminoácidos Histidina His H 6.04
Com Grupos R Ácido Aspártico Asp D 3.90 Carregados Ácido Glutâmico Glu E 4.07
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Lição de Biocatálise
Estrutura química da cadeia lateral (R) de aminoácidos
O grupo R variável
H3N+C
H
COO -
R
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Aminoácidos
pKa ~ 3.9
pKa ~ 4.1
pKa ~ 10.8
pKa ~ 12.5
pKa ~ 6.0
Alif
átic
osH
idro
lixad
os
Dic
arbo
xilic
osB
ásic
ospKa ~ 13.0
pKa ~ 13.0
CH
CH3
CH3
CH2
CHCH3
CH3
CH3
H
CH
CH3
CH2
CH3
CH2
OH
CH
CH3
OH
CH2
C
O
O-
CH2
C
O
NH2
CH2
CH2
C
O
O-
CH2
CH2
C
O
NH2
CH2
CH2
CH2
CH2
NH3+
CH2
CH2
CH2
Glicina
NH
Ácido aspártico
C
Valina
N+H2
Alanina
NH2
Leucina
Isoleucina
CH2
Serina
C
Treonina
HC
N NH
CH
Asparagina
Ácido glutâmico
Glutamina
Lisina
Arginina
Histidina
O grupo R variável
H3N+C
H
COO -
R
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Lição de Biocatálise
pKa ~ 10.1
pKa ~ 8.3
+NH2HC
H2C CH2
CH2
C CH2
C
HC
O
O-
NH
Prolina Triptofano
Cisteina
CH2
SH
Fenilalanina
CH2
Metionina Tirosina
CH2
CH2
S CH3 CH2
OH
Sul
fura
dos
Aro
mát
icos
CH 2
CHC
N NH
CH
Histidina Heterocíclicos
Efeito do pH na Reacção Enzimática
DEQB vpH óptimo
pH
Tabela 2-1 - Exemplos de aminoácidos envolvidos no centro activo de enzimas e respectivos valores de pKa.
Enzima Resíduo pKa Lisozima
Acetoacetato descarboxilase Quimotripsina
Papaína
Glu-35 Lys
α-NH3 (Ile-16) His-159
6,5 5,9
10,0 3,4
Lição de Biocatálise
As modificações químicas mais comuns de alguns resíduos dos aminoácidos durante ou após a sua biossíntese são:
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Lição de Biocatálise
- Acetilação do grupo N-terminal.- Carboxilação (Asp e Glu).- Fosforilação (Ser, Thr, Tyr e His).- Formação de pontes dissulfureto (Cys).- Glicosilação (Asn: pontes N-glicosídicas; Ser e Thr: ligações O-glicosídicas).- Metilação (Lys e Glu).- Ligação covalente:
. De grupos prostéticos (grupos de natureza não proteica que se ligam covalentemente (irreversível) ou não-covalentemente (reversível) àproteína na sua forma tridimensional, (p.ex. grupos hemo do citocromo).
. Substituição/modificação de grupos funcionais das cadeias laterais (p.ex. –NH2), alterando assim as propriedades de carga, polaridade ou hidrofobia desse aminoácido. A modificação química específica de alguns resíduos (p.ex. lisinas) é um dos métodos possíveis para melhorar a actividade e estabilidade enzimáticas.
Estrutura Primária e Secundária de proteínas
Hélice αααα Folha ββββ
13 Å
R-CH
HC-R
O=C
R-CH
HC-R
HN
H N
H N
C O
C O
R-CH
HC-R
O=C
R-CH
HC-R
HN
H N
H N
C O
C O
A) B)
R-CH
HC-R
O=C
R-CH
HC-R R-CH
HC-R
R-CH
N-H
HC-R
H N
HN
H N
H N
C O
O C
CO
CO
H NC O
14 Å
Folha ββββ Paralela Folha ββββ Antiparalela
Figura 2-1 – A) Representação esquemática dos dois tipos de estrutura secundária mais frequentemente encontrados em proteínas e enzimas: hélice a e folha β. B) A folha β paralela e antiparalela, com indicação do
avanço por cada dois aminoácidos.
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Estrutura Terciária de proteínas
H 188
S 120
D 175
Figura 2-1– Representação esquemática da estrutura terciária da cutinase de Fusarium solani pisi, com indicação de alguns resíduos que limitam o centro activo, e, em particular, da tríade catalítica (Ser120-His188-Asp175).
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Ligações covalentes
- S – S -
Interacções electrostáticas
Pontes de Hidrogénio
Interacções hidrófobas
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Estrutura Quaternária de proteínas
Pode-se observar em enzimas multiméricos, i.e., enzimas compostos por duas ou
mais cadeias polipeptídicas associadas entre si, por exemplo, penicillin V acylase
de B. sphaericus.
Domínio αααα
Domínio ββββ
� Monomeric enzyme
� Prosthetic group - heme
� 2 calcium ions
� Glycoprotein – 8 specific sites
� Molecular weight - 44 kDa
� Isoelectric point - 7.5
� Catalyses the oxidation of several compounds by the H2O2, e.g. phenols,aromatic amines such as phenolsulfonicacid (PSA) and 4-aminoantipyrine (4-AAP)
DEQB
Horseradish peroxidase - HRP
FUNÇÃO DOS ENZIMAS
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Os enzimas (catalisadores biológicos ou biocatalisadores) catalisam reacções bioquímicas, aumentando a sua velocidade, por exemplo:
Em termos de propriedades gerais, comuns aos catalisadores químicos, os biocatalisadores caracterizam-se por:
i) baixarem a energia de activação para que a reacção que catalisam ocorra;
ii) não serem destruídos pelo efeito da reacção;
iii) não alterarem o equilíbrio químico das reacções em que participam.
______________________________________________________________________CATALISADOR Ea (kJ/mol) Velocidade reacção
(Relativa)SEM CATALISADOR 75,4 1,0PLATINA (INORGÂNICO) 50,2 2x104
CATALASE (ENZIMA) 8,4 3x1011
______________________________________________________________________
2H2O2 —> 2H2O + O2
FUNÇÃO DOS ENZIMAS
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Lição de Biocatálise
Por outro lado, os biocatalisadores em relação aos catalisadores químicos são:
- Muitíssimo específicos:
- tipo de reacção que catalisam,
- tipo(s) substrato(s) que reconhecem,
- ligação química em que actuam,
- bem como à estereo-especificidade dos átomos ou grupo de átomos no substrato.
- especificidade absoluta em relação a único substrato
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Lição de Biocatálise
Elevada especificidade em relação ao tipo de reacção que catalisam,
DEQB
Lição de Biocatálise
Elevada especificidade em relação ao tipo de substrato que catalisam,
Sacarose Maltose
Lactose
DEQB
Lição de Biocatálise
Elevada especificidade em relação ao tipo de substrato que catalisam,
Maltose
Lactose
SacaroseTrehalose
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Lição de Biocatálise
Elevada especificidade em relação ao tipo de ligação química em que actuam,
DEQB
Lição de Biocatálise
Elevada especificidade em relação ao tipo da estereoespecificidadedo substrato em que actuam,
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Lição de Biocatálise
Elevada especificidade em relação ao comportamento dos compostos do tipo Cx1x2yz nas reacções enzimáticas
Estes compostos Cx1x2yz são do ponto de vista da química orgânica substâncias simétricas em solução (pois possuem um plano de simetria) mas comportam-se assimétricas enquanto substratos de certas reacções enzimáticas (quer dizer que x1 pode ser preferencialmente atacado em relação ao x2 apesar de serem grupos funcionais iguais)
FUNÇÃO DOS ENZIMAS
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Lição de Biocatálise
Por outro lado, os biocatalisadores em relação aos catalisadores químicos são:
- A actividade catalítica regulável,
- Mas devido à sua natureza proteica são lábeis e inactivados por efeito da temperatura, pH, ou na presença de alguns compostos (designados por agentes desnaturantes).
Características do centro activo
O centro activo corresponde geralmente a uma fenda ou cavidade existente na estrutura da molécula proteica onde se localiza o centro catalítico (centro activo) e locais de reconhecimento do substrato (centro de ligação do substrato) e caracteriza-se por:
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Lição de Biocatálise
- Ocupa uma parte relativamente pequena do volume total de um enzima;
- É uma entidade tridimensional formada por grupos que pertencem a partes distintas da sequência linear de aminoácidos;
- Os substratos ligam-se às enzimas através de atracções fracas múltiplas (electrostáticas, de van der Waals, hidrófobas, ligações de hidrogénio);
- A especificidade da ligação do substrato depende do arranjo dos átomos no centro activo (modelo da chave e fechadura - E. Fischer, 1890; modelo do ajuste induzido - D. Koshland, 1958).
+
substrato enzima complexoenzima - substrato
a)
+
substrato enzima complexoenzima - substrato
b)
Figura 2-1– a) Modelo chave-fechadura; b) Modelo do ajuste induzido
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Características do centro activo
Características do centro activo
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Muitas vezes os enzimas exigem pequenas moléculas ou iões (ex: Zn, Fe, Cu, Ca…) para exercerem uma actividade catalítica; a essas espécies chama-se co-factores. Ao enzima sem cofactor chama-se apoenzima, e ao enzima activo intacto (enzima + cofactor) chama-se holoenzima.
- Quando os co-factores são moléculas orgânicas (ex: vitaminas B) ou de natureza nucleotídica (ex: nicotinamida-adenina-dinucleótido - NAD e NAD fosfato - NADP) denominam-se co-enzimas.
NAD NADP
Características do centro activo
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Lição de Biocatálise
- Quando são necessários co-factores os enzimas têm que conter centros de ligação adicionais.
- A catálise enzimática pode portanto fazer intervir, não só um número limitado de grupos funcionais que se encontram em cadeias laterais de resíduos de aminoácidos (His, Ser, Tyr, Cys, Lys, Glu, Asp), mas também co-enzimas e catiões metálicos.
FeIII
N
N
NN
NN
HOOH
H2O
FeIV
N
N
NN
NN
+ �
O
FeIV
N
N
NN
NN
O
AHA�
H+
AH
�A H2O+
HRP
Compound ICompound II
PSA + 4-AAP + 2H2O2 →→→→ Quinoneimine + H2O + NaHSO4λ = 490 nm
Reacções de síntese acoplada à hidrólise de 1 molécula de ATP
Ligases ou sintetases
6
Reacções de isomerizaçãoIsomerases5
Remoção de um grupo de uma molécula (sem ser por hidrólise)
Liases4
Reacções de hidróliseHidrolases3
Transferência de 1 átomo ou grupo entre moléculas
Transferases2
Reacções de oxidação-reduçãoOxido-redutases1
Tipo de reacção catalisadaClasse da enzima1º dígito
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Classificação de EnzimasNOMENCLATURA:
- Nomes empíricos (ex: tripsina, pepsina, quimotripsina).- 1ª designação normalizada: nome do substrato + sufixo ase (ex: urease, amilase).- 2ª designação normalizada: nome do substrato + tipo de reacção que catalisam
(ex: malato desidrogenase).- Enzyme Comission EC: nome de acordo com tipo de reacção + substrato + o tipo de aceitador do hidrogénio (ex: malato-NAD-óxido-redutase).
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Lição de Biocatálise
• Nomenclatura e Classificação de Enzimas
Assim, cada enzima recebeu,
NOME CURTO (NOME RECOMENDADO),
NOME SISTEMÁTICO (IDENTIFICA A REACÇÃO QUE O ENZIMA CATALISA)
NÚMERO CLASSIFICACÃO
EXEMPLO: ATP + CREATINA < ------ > ADP + FOSFOCREATINA
NOME CURTO: CREATINA CINASE
NOME SISTEMÁTICO: ATP CREATINA FOSFOTRANSFERASE
NÚMERO CLASSIFICAÇÃO: E.C. 2.7.3.2
2. GRUPO das Transferases7. TRANSFERE GRUPOS FOSFATOS3. GRUPO AZOTO COMO ACEITADOR2. Nº DE ORDEM
Tabela 1-1- Subclassificação das hidrolases
ÉsterGlicosilo
ÉterPeptidica
C-N, não peptidicaÁcido anidro
C-CHaleto, C-X
P-NS-NC-P
3.13.23.33.43.53.63.73.83.9
3.103.11
Tipo de ligaçãoClassificação EC
XAE
k
OH
EAX
k
k
AXE ++→↔+
− 2
2
1
1
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Quimosina (EC 3.4.23.4)
Lição de Biocatálise
Nomenclatura e Classificação de Enzimas
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Nomenclatura e Classificação de Enzimas
GOx
β-D-glucose + oxygen D-glucono-1,5-lactone + hydrogen peroxide
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Óxido-redutases
L-aspartate + 2-oxoglutarate oxaloacetate + L-glutamate
Aminotransferase
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• Nomenclatura e Classificação de Enzimas
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Transferases
Hidrolase (quimosina ou renina)
κ-casein + water para-κ-casein + caseino macropeptide
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• Nomenclatura e Classificação de Enzimas
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Hidrolases
L-histidine urocanate + ammonia
Liase (L-histidina amónia-liase ou histidase)DEQB
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• Nomenclatura e Classificação de Enzimas
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Liases
α-D-glucopyranose α-D-fructofuranose
glucose isomeraseDEQB
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• Nomenclatura e Classificação de Enzimas
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Isomerases
Ligase (glutathione sintetase)
γ-L-glutamyl-L-cysteine + ATP + glycine glutathione + ADP + phosphate
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• Nomenclatura e Classificação de Enzimas
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Ligases ou sintetases
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Medição da actividade enzimática
Os enzimas como catalisadores são testados em condições reaccionais padrão correspondentes, em geral, aos óptimos de pHe concentração do substrato e co-factores (não limitante), de forma que a velocidade da reacção medida seja máxima, isto é, de ordem zero em relação ao substrato.
Por exemplo, o método mais simples de medir a velocidade da reacção efectuada pelo enzima ou determinar a sua actividade émedir ao longo do tempo o aparecimento de um produto da reacção ou desaparecimento de um substrato.
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Hidrólise da ureia pela urease
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Medição da actividade enzimática
Unidade de actividade enzimática (U): é definida pela quantidade de enzima que a transformação do substrato em produto e produz 1 µmole de produto por minuto nas condições óptimas da reacção.
U = 1 µmole/min (T=25°C)
KATAL- Quantidade de actividade enzimática que transforma 1 mole de substrato por segundo.
KAT = l mole/s U = l µmole/min 1U=16,67x10-3 KAT
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Lição de Biocatálise
Pureza da preparação enzimática
(ACTesp) Actividade específica (U/mg) exprime o número de unidades de actividade enzimática expresso por miligrama de proteína da preparação enzimática.
Esta grandeza permite medir a pureza da preparação enzimáticaquando se compara o seu valor com o do enzima puro e assim permite avaliar o grau de pureza obtido num passo de isolamento ou purificação durante a produção do enzima.
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Medir concentrações por espectrofotometria
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Medição da actividade de desidrogenases
α-D-galactose + NAD+ D-galactono-1,4-lactona + NADH + H+
β-D-galactose dehidrogenase
Desidrogenases + Co-factor
Lição de Biocatálise
Analito 1st Enzima 2nd Enzima Co-factor e detecção
Alcoóis - Alcool dehidrogenase NAD+ -λλλλ340nmFormaldeído Formaldeído dehidrogenase NAD
+ -λλλλ340nm
D-Fructose - Fructose dehidrogenase Azul Prússia -λλλλ660nmD-Glucose / ATP Glucose quinase Glucose fosfat
dehidrogenaseNAD+ -λλλλ340nm
D-Glucose - Glucose dehidrogenase NAD+ -λλλλ340nmGlicerol / ATP Glicerol quinase Glicerol fosfato
dehidrogenaseNAD+ -λλλλ340nm
Glicerol - Glycerol dehydrogenase NAD+ -λλλλ340nmGlutamate - Glutamato
dehidrogenaseNADPH -λλλλ340nm
D-hidróxiibutirato - D-hidroxibutiratodehidrogenase
NAD+ -λλλλ340nm
Malato - Malato dehidrogenase NAD+ -λλλλ340nmLactato / Piruvato - Lactato dehidrogenase NAD
+-λλλλ340nm
Sarcosina/ creatinina / creatina - Sarcosina dehidrogenase NAD+ -λλλλ340nm
-
DEQB
DEQB
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Reacções com desidrogenases
Eléctrodos enzimáticos
Membrana de teflon, permeável à glucose e ao O2,
e-
e-
+-
Ácido Glucónico + H2O2 Glucose + O2
Cátodo Pt (-600mV) O2 + 4H+ + 4e- 2H2O
Ánodo 4Ag + 4Cl- 4AgCl + 4e-
Glucose + FAD + H2O Ácido glucónico + FADH2
FADH2 + O2 FAD + H2O2
GOx
Reacções electroquímicas
Reacções enzimáticas
Ag
Cl-
Pt
Clark electrode
Lição de Biocatálise
DEQB
Actividade da Glucose Oxidase (GOx)
pelo consumo de O2
Act = - d[% O2]dis / dt
DEQB
Lição de Biocatálise
Actividade da Glucose Oxidase (GOx)
pela formação de H2O2DEQB
Lição de Biocatálise
Os ensaios de determinação da actividade da GOx pela formação de H2O2. Glucose + FAD + H2O Ácido glucónico + FADH2
FADH2 + O2 FAD + H2O2
Pela combinação com a HRP que oxida por sua vez compostos fenólicos e percursores de um corante (quinoneimine λmax = 490-520nm) com ε490nm = 5,56 mM-1 cm-1.
Actividade da Glucose Oxidase (GOx)
pela formação de H2O2DEQB
Lição de Biocatálise
Neste caso, a actividade de glucose oxidase é definida como número de micromole de H2O2 formados por minuto determinado indirectamente pela medição do aparecimento da cor a 490nm devido á formação do corante (quinoneimine).
Neste caso, a mistura reaccional contêm 0,4mM de 4-AAP, 25mM de PSA e 2 U/ml de HRP em tampão fosfato 0,1M pH 7,0. Caso típico émedir a actividade da GOx pela adição de 25µl da amostra da preparação enzimática a 950 µl da mistura reaccional ao qual foi adicionado previamente 25µl de uma solução de glucose a 10% em água.
Actividade de esterases pela hidrólise de
substratos sintéticosDEQB
Lição de Biocatálise
O p-nitrofenol absorve a 400 nm (cor intensa amarela), o que permite quantificar a quantidade de produto presente na mistura reaccional.
Actividade da cutinase pela hidrólise de
substratos sintéticosDEQB
Lição de Biocatálise
Os ensaios de determinação da actividade da cutinase são efectuados a partir da hidrólise do p-nitrofenilbutirato (pNPB) em p-nitrofenol (pNP).
CutinasepNPB + H2O pNP + ácido butírico
Quando efectuado em descontínuo, numa cuvette de 1 ml, o ensaio caracteriza-se pela adição de 20µl de amostra da preparação de enzima a 980µl de mistura reaccional e a reacção enzimática deve ocorrer à temperatura ~ 22ºC.
Actividade da cutinase pela hidrólise de
substratos sintéticosDEQB
Lição de Biocatálise
A actividade enzimática na mistura reaccional é calculada a partir da derivação da lei de Beer-Lambert em ordem ao tempo, de acordo com a seguinte equação:
( ) [ ] ( ) 3101400
min. ×××
×=×=
=
ee V
V
ldt
nmdAbs
V
V
dt
pNPdml
molml
Uml
UActε
µ
Em que:- U é a unidade de actividade enzimática definida como a
concentração de enzima necessário para produzir um µmole de pNP por minuto;
- [pNP] é a concentração milimolar de p-nitrofenol;- V é o volume reaccional em ml;- Ve é o volume do extracto enzimático em ml;- Abs(400nm) é a absorvância a 400 nm;- ε é o coeficiente de extinção molar (ε=1,84x104 M.cm-1);- l é a espessura da célula (l=1cm).Este método é válido para variações de absorvância (dAbs/dt) entre
0.1 e 0.9 min-1.