licenta ciurdariu sergiu-ioan
TRANSCRIPT
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca
Facultatea de Medicină
LUCRARE DE LICENŢĂ Îndrumator ştiinţific: Conf. Dr. Alina Elena Parvu Conf. Dr. Alexandru Irimie
Absolvent: Ciurdariu Sergiu-Ioan
2010
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca
Facultatea de Medicină
LUCRARE DE LICENŢĂ “EVALUAREA SINTEZEI DE OXID
NITRIC ȘI A STRESULUI OXIDATIV ÎN TUMORILE RECTALE”
Îndrumator ştiinţific: Conf. Dr. Alina Elena Parvu Conf. Dr. Alexandru Irimie
Absolvent: Ciurdariu Sergiu-Ioan
2010
I
Cuprins
ITRODUCERE 1
CAPITOLUL 1 1.Fiziopatologia neoplaziilor 2 1.1Etiopatogeneza neoplaziilor. 3
1.2Teorii patogenetice în neoplazii. 6
1.2.1 Factorul genetic în apariţia neoplaziilor. 6
1.2.2 Ereditatea în patogeneza cancerelor. 7
1.2.3 Agenţi carcinogeni chimici. 8
1.2.4 Efectele radiaţiilor ionizante. 9
1.2.5 Virusurile oncogenice. 9
1.2.6 Implicarea sistemului imunitar în oncogeneză 10
1.3 Fiziopatologia cancerului de colon 11
CAPITOLUL 2
2.Oxidul nitric 13
2.1Sinteza oxidului nitric. 14
2.2 Acțiunea NOS. 14
2.2.1Structura NOS. 14
2.2.2 NO-sintetazele(NOS). 15
2.3 Efecte fiziologice ale oxidului nitric. 18
2.3.1 Rolul imunitar al NO. 18
2.3.2 Acţiunea asupra musculaturii netede. 18
2.3.3 Oxidul nitric şi inflamaţia 19
2.3.4 NO şi efetele sale asupra sistemului nervos. 19
2.3.5 Importanţa NO în uciderea germenilor patogeni. 20
2.3.6 NO şi longevitatea. 20
2.4 Implicarea oxidului nitric în fiziopatologia neoplaziilor. 21
II
CAPITOLUL 3
3.Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale 24
3.1 Scopul studiului 25
3.2 Materiale şi metode 25
3.2.1 Grupurile de studiu 25
3.2.2 Reactivii folosiţi. 26
3.2.3 Determinarea nitriţilor 27
3.2.4 Determinarea răspunsului antioxidativ total (TAR). 28
3.2.5 Determinarea statusului oxidativ total . 30
3.2.6 Indicele de stres oxidativ. 31
3.2.7 Analiza statistică. 31
3.3 Rezultate 32
3.3.1 Analiza demografică a pacienților. 32
3.3.2 Analiza generală a lotului de studiu. 32
3.3.3 Analiza sublotului de femei 35
3.3.4 Analiza sublotului de bărbați 38
3.3.5 Analiza pe grupe de vârstă 41
3.4 Discuții 51
Concluzii 58
Bibliografie 60
Introducere
1
Introducere
Cancerul colorectal se află pe primele locuri în lista incidenței cancerelor în lume.Din
acest motiv,anual se revizuiesc metodele de screening și recomandările de diagnostic și
tratament
.Proporțional cu incidența cancerului colorectal s-au dezvoltat și studiile referitoare la
mecanismele celulare și moleculare implicate în patogeneza acestui tip de cancer.
Se știe că diverși factori pot să influențeze incidența cancerului colorectal.Printre
aceștia cei mai frecvent menționați sunt obezitatea,antecedentele familiale,vârsta,inactivitatea
fizică,consumul de alcool și alimentația.
Studiile efectuate în ultimii ani au pus în evidență diverși factori de risc
moleculari.Printre cei mai studiați factori de risc implicați la nivel molecular se găsesc cei
implicați în stresul oxidativ.
Având în vedere aceste aspecte,studiul de față și-a propus evaluarea unor parametrii ai
stresului oxidativ în tratamentul cancerului colorectal,respectiv după tratamentul chirurgical
și înainte și după tratamentul combinat radioterapie și chimioterapie.
Alegerea acestor etape terapeutice ca și momente de studiu s-a făcut pornind de la
constatarea că stresul oxidativ acționează diferit în diferite etape ale canncerogenezei,ceea ce
obligă la descrierea unor indicatori care să fie adaptați pentru fiecare stadiu evolutiv al bolii.
În urma studiului se dorește a se evalua posibilitatea ca acești parametri ai stresului
oxidativ urmăriți să fie în viitor folosiți ca șă parametri de screening în evaluarea
postchirurgicală a pacienților cu cancer colorectal operat.
2
Capitolul 1
Fiziopatologia neoplaziilor
Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor
3
1.1Etiopatogeneza neoplaziilor.
Neoplaziile reprezintă o problemă de o covârşitoare importanţă in sănătatea mondială
la momentul actual.De aceea cunoaşterea etiopatogenezei acestui tip de afecţiuni este
esenţială[2,3].
Neoplaziile rezultă din alterări ale proceselor de creştere şi diferenţiere celulară,din
acestea rezultând ţesutul canceros.Acesta creşte în mod necontrolat şi autonom datorită lipsei
regulatorilor creşterii şi dezvoltării celulare în ţesutul neoplazic[1].
Există o varietate deosebită a a proceselor de cancerogeneză în funcţie de localizarea
neoplaziei,însă multe din caracterele acestora sunt totuşi comune.Principalele trăsaturi
comune sunt legate de multiplicarea factorilor care intervin în oncogeneză şi de trecere unei
perioade lungi de timp între prima influenţă şi apariţia bolii propriu-zise.Se disting factori
interni şi externi[4].
La început,rezultatul acţiunii factorilor externi şi interni este apariţia prin transformare
sau mutaţie a unei celule care are potenţialul de a deveni canceroasă.Acesta este faza de
iniţiere a oncogenezei.Sunt necesare intervenţii suplimentare pentru a-i permite acestei celule
să se modifice şi să se multiplice pentru a forma o clonă cu potenţial canceros.Aceasta este
faza de promoţie.Factorii care favorizează prima fază a oncogenezei sunt numiţi iniţiatori iar
cei care o favorizează pe cea de-a doua sunt numiţi promotori.Oncogeneza are o evoluţie de
lungă durată,începând cu influenţa exercitată de factorii cancerigeni si apariţia primei celule
canceroase,care se multiplică apoi excesiv.Pentru început avem de-a face cu o fază
asimptomatică,faza preclinică.Când tumora va atinge greutatea de un gram,care corespunde
existenţei unui miliard de celule neoplazice ea va deveni decelabilă[6,8]].
Celulele canceroase apar ca şi rezultat al mutaţiilor care au ,loc în timpul procesului de
diferenţiere celulară.Când mutaţia apare la începutul procesului de diferenţiere avem de-a face
cu o tumoră slab diferenţiată şi cu malignitate crescută,în timp ce în cazul apariţiei mutaţiei
mai târziu in acelaşi proces tumora este mai bine diferenţiată şi cu o malignitate de nivel mai
scăzut.Lipsa unei bune diferenţieri celulare în ţesutul neoplazic este denumită prin termenul
anaplazie.Celulelor canceroase le lipseşte funcţionalitatea normală,şi de asemenea nu mor la
acelaşi termen cu celulele normal diferenţiate ale aceluiaşi organ sau sistem.Apar modificări
ale funcţionalităţii şi caracteristicilor acestor celule,cum ar fi alterări ale inhibiţiei de
contact,lipsa adeziunii celulare,defecte ale comunicării intercelulare,exprimarea unor antigeni
tisulari modificaţi sau elaborarea de enzime care facilitează şi participă la procesele de invazie
şi metastazare[2,3].
Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor
4
Inhibiţia de contact reprezintă oprirea procesului de creştere celulară când două celule
de tipuri diferite intră în contact.Aceasta nu se aplică insă şi la celulele neoplazice,care cresc
indiferente la contactul cu ţesuturile înconjurătoare sănătoase.Celulele tumorale produc
antigeni care nu sunt sintetizaţi în mod normal de către celulele corpului uman,aceşti antigeni
putând fii folosiţi ca şi markeri tumorali.În cadrul tumorilor se produc anumite enzime(în
special proteaze şi glicozidaze) care au rolul de a degrada matricea extracelulară şi de a o
dezorganiza favorizând astfel procesul de invazie tumorală[1,5].
Tumorile maligne au proprietatea de a creşte prin infiltrarea şi invazia ţesuturilor
înconjurătoare.Datorită lipsei unei clare demarcaţii între tumoră şi ţesuturile sănătoase
înconjurătoare extirparea lor prin metode chirurgicale este mult îngreunată[22].
Prin termenul de metastază se înţelege dezvoltarea unei tumori secundare la distanţă
de tumora primară.Metastaza prezintă multe din caracteristicile tumorii în care şi-a avut
originea.Este astefel posibil să determinăm localizarea tumorii primare prin intermediul
caracteristicilor celulare ale metastazelor date de aceasta.Metastazarea are loc prin intermediul
circulaţiei limfatice şi sanguine.Astfel,în cazul în care metastazarea are loc prin intermediul
căii limfatice celulele tumorale invadează la început ganglionii limfatici situaţi proximal de
localizarea primară.O dată ajunse în circulaţie unele celule canceroase se ataşează la elemente
figurate sanguine din fluxul sanguin,formănd emboli tumorali.După aceea celulele trebuie să
părăsească sistemul circulator,să strabată matricea extracelulară pentru a pătrunde în ţesutul
ţintă.O dată ajunse în ţesutul ţintă celulele neoplazice secretă factorul angiogenetic tumoral
care ajută la apariţia vaselor de neoformaţie în tumoră[2,6,9].
Rata creşterii atât în ţesuturile normale cât şi în cele canceroase depinde de numărul de
celule care trec prin ciclul celular sau se divid la un moment dat,durata ciclului celular şi
numărul de celule care sunt pierdute prin moarte celulară comparativ cu cele care sunt
produse.Numărul celulelor tumorale angajate la un moment dat în ciclul celular este de obicei
foarte mare comparativ cu situaţia celulelor normale.Durata ciclului celular la celulele
canceroase nu este sesizabil mai scăzută decăt la celulele obişnuite,însă moartea celulelor
canceroase nu are loc programat.Există un procentaj foarte mare de celule neoplazice care
sunt active în cadrul ciclului celular,celulelor tumorale lipsidu-le factorul de creştere care le-
ar opri în faza de repaos a ciclului celular(G0)[3,5].
Fracţia de creştere într-un ţesut reprezintă numărul celulelor în diviziune supra
numărul celulelor în stare de rapaos.Timpul de dublare reprezintă perioada de timp necesară
dublării numărului de celule din respectivul ţesut.Cu cât este fracţia de creştere mai mare cu
atât mai scurt este timpul de dublare.În momentul în care celulele normale ating vârsta adultă
Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor
5
este atins un echilibru între naşterea şi moartea celulară.În schimb celulele canceroase îşi
continuă diviziunea până când creşterea le este inhibată de lipsa unei circulaţii
corespunzătoare şi a nutrienţilor.O tumoră este de obicei imposibil de detectat până când nu
îşi dublează volumul de 30 de ori şi conţine mai mult de un miliard de celule.După 35 de
dublări de volum populaţia de celule tumorale atinge 1 trilion,număr în general suficient
pentru a ucide organismul gazdă[9].
Din punct de vedere clinic,manifestările iniţiale ale cancerului se referă la locaţia
primară a afectiunii.Creşterea tumorală afectează vasele sanguine cauzând apariţia de
ulceraţii,necroze,sângerări care pot evolua până la hemoraguii.De exemplu în cancerul
colorectal un prim semnal de alarmă este apariţia scaunelor sanguinolente.În celulele
canceroase se produc adeseori toxine şi enzime care au proprietatea de a distruge ţesuturile
din jur,afectând de asemenea şi procesele de vindecare tisulară[1].
Prin invazia structurilor înconjurătoare şi prin creşterea lor necontrolată,tumorile
comprimă adesea structurile adiacente,ca de exemplu diferite viscere sau vase sanguine.În
stadiile avansate cancerele devin dureroase,managmentul durerii fiind o problemă esenţială în
terapia formelor incurabile şi terminale de neoplazii[21].
De-alungul creşterii şi dezvoltării tumorale apar tulburări ale metabolismului
glucidic,lipidic şi proteic.Astfel,în multe tipuri de neoplazii apare caşexia,adică scăderea
accentuată în greutate ce apare însoţita de pierderi ale ţesutului grăsos şi scădere a nivelului
proteinelor din organism.Caşexia nu poate fi explicată doar prin reducerea poftei de mâncare
şi tulburări ale analizatorului gustativ care însoţesc neoplaziile şi sunt uneori accentuate şi de
tratamentele de care au parte pacienţii.Se pare că este vorba de anumiţi factori produşi fie de
tumora malignă,fie de organismul gazdă care acţionează fie direct asupra centrilor
hipotalamici ai saţietăţii sau în mod indirect prin lezarea unor ţesuturi care astfel eliberează
substanţe anorexigene.Prima citokină asociată pierderilor metabolice a fost caşectina,care mai
târziu s-a dovedit a avea aceeaşi structură ca şi factorul de necroză tumorală(TNF),o citokină
secretată de către macrofage ca şi răspuns la proliferarea tumorală.TNF acţionează asupra
centrilor saţietăţii şi suprimă secreţia de lipoprotein-lipază,enzimă care ajută la eliberarea
acizilor graşi din lipoproteine,astfel încât acesteaacţionează asupra centrilor saţietăţii şi
suprimă secreţia de lipoprotein-lipază,enzimă care ajută la eliberarea acizilor graşi din
lipoproteine,astfel încât acestea să poată fi utilizate de ţesuturi,prin aceste efecte Tnf având un
rol puternic anorexigen.O altă citokină secretată de macrofage,interleukina-1(IL-1) are şi ea
abilitatea de a contribui la iniţierea caşexiei[2,11,12].
Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor
6
Pe lăngă semnele şi simptomele pe care boala canceroasă le produce în situl de origine
şi în organele unde apar determinări secundare mai apar manifestări ale cancerului în zone
care nu sunt direct afectate de neoplazie,aceste manifestări fiind de o mare diversitate şi
purtând numele generic de sindroame paraneoplazice[4].
Carcinogeneza se referă atât la aspectele moleculare ale apariţiei şi multiplicării
celulelor neoplazice cât şi la dezvoltarea şi răspândirea prin organism a masei
tumorale.Cancerele nu au cum să aibă o singură cauză ci mult mai probabil apar ca efect al
interacţiunii dintre diferiţi factori carcinogenetici sau ca efect al expunerii repetate la un
anumit agent carcinogenetic.Au fost descoperiţi şi studiaţi multiplii factori de risc ai
cancerului,care ar putea avea un rol cauzal în declanşarea bolii,constituindu-se diferite teorii
patogenetice ale neopalaziilor[1,3,20].
1.2Teorii patogenetice în neoplazii.
Referitor la neoplazii există în medicina actuală numeroase teorii care încearcă să
lămurească apariţia şi răspândirea acestor afecţiuni,unele dintre cele mai grave şi
controversate patologii cu care se confruntă omenirea în această eră[6].
Dintre factorii de risc,care au un rol deosebit de important în iniţierea apariţiei
cancerelor au fost menţionate vârsta,factorul genetic,ereditatea,factorii carcinogeni chimici şi
ambientali,viruşii cu rol în oncogeneză şi defectele imunologice[5].
Marea majoritate a neoplaziilor(76%)apar la persoane cu vârsta de la 75 de ani în
sus.În Statele Unite ale Americii se estimează o dublare a cazurilor de cancer până în 2050
datorită îmbătrânirii populaţiei[1].
Variabilitate în incidenţa şi prognosticul cancerelor se întâlneşte şi referitor la
rasă,zonă geografică sau nivel socio-economic.Factorii de mediu,precum şi expunerea la
diferite toxine şi alţi factori referitori la dietă au o contribuţie evidentă,deşi încă incomplet
explicată în oncogeneză[2].
1.2.1 Factorul genetic în apariţia neoplaziilor.
Cauzele majorităţii cancerelor rămân necunoscute,însă cercetările în domeniul
biologiei moleculare au început să deceleze căi complexe care duc la creşterea celulelor
canceroase,a tumorilor şi metastazarea.S-au descoperit legături între proliferarea celulară
anormală şi mutaţii ale unor secvenţe de ADN care duc la expresia anormală a
Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor
7
protooncogenelor sau la deleţia unor gene supresoare tumorale.Majoritatea tumorilor prezintă
diferite anormalităti cromozomiale cum ar fi deleţii,inversaţii,translocaţii sau duplicaţii[5,7].
Achiziţia unei singure mutaţii genetice nu poate să transforme celule normale în celule
canceroase,această transformare părând să necesite activarea mai multor gene independente
mutante.Proto-oncogenele sunt importante pentru o creştere şi proliferare normală a celulelor
organismului sănătos.Ele sunt implicate în procesul de oncogeneză prin apariţia unei mutaţii
la nivelul ţesutului ţintă,aceasta transformând proto-oncogena în oncogenă[17,18].
Anti-oncogenele au rolul de a opri proliferarea celulară în cadrul tumorilor.În
momentul în care aceste celule sunt inactivate dispare semnalul genetic care inhibă
proliferarea cauzând astfel debutul creşterii neregulate a celulei.Una din genele supresoare ale
cancerului care a fost identificată este gena p53,localizată pe braţul scurt al cromozomului
17.Mutaţia acestei gene este implicată în dezvoltarea neoplaziilor pulmonare,de sân şi
colon.De asemenea gena p53 pare să fie iniţiatoarea apoptozei celulelor tumorale afectate de
radio- şi chimioterapie[14].
Transformare celulelor normale în celule canceroase trece prin trei stadii-
iniţierea,promoţia şi progresia.Iniţierea implică dozele necesare ale unui agent
carcingenetic,care acţionând asupra celulelor le face susceptibile la transformarea
malignă.După acţiunea acestui agent carcinogenetic schimbările în genomul celulei sunt
ireversibile.Promoţia cuprinde inducerea unei creşteri neregulate şi accelerate ale celulelor
trecute prin faza de iniDupă acţiunea acestui agent carcinogenetic schimbările în genomul
celulei sunt ireversibile.Promoţia cuprinde inducerea unei creşteri neregulate şi accelerate ale
celulelor trecute prin faza de iniţiere prin intermediul diferitelor substanţe chimice şi a unor
factori de creştere.Celulele care au trecut prin faza ireversibilă de iniţiere pot parcurge faza de
promoţie chiar şi după perioade foarte lungi de latenţă.Unii carcinogeni chimici sunt numiţi
carcinogeni compleţi deoarece pot să iniţieze precum să şi promoveze transformarea
neoplazică.În faza de progresie celulele tumorale îşi însuşesc schimbări ale fenotipului care le
permit să aibă capacitatea de a invada,de a metastaza şi de a prezenta o dezvoltare autonomă
şi o crescută instabilitate la nivelul cariotipului[8,9,10].
1.2.2 Ereditatea în patogeneza cancerelor.
O predispoziţie ereditară a fost descoperită în aproximativ 50 de tipuri de cancer.De
exemplu cancerul de sân are o importantă componentă ereditară,apărând mult mai frecvent la
femei care au mai avut cazuri în familie.Procentul de pacienţi oncologici care mai au o rudă
Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor
8
de gradul 1 afectată de boală este de 10%,la cei care au doi membrii ai familiei afectaţi este de
15%,iar la cei cu trei membrii ai familiei bolnavi procentul urcă la 30%.În cazul femeilor de
peste 65 de ani cu istoric familial de cancer de sân riscul urcă până la 50%[7,19].
Există unele tipuri de cancer care se transmit prin mecanism autozomal dominant.De
exemplu,predispoziţia pentru retinoblastom este transmisă prin acest tip de
mecanism.Ameninţarea genetică în retinoblastom este ridicată,95% dintre purtătorii genei
dezvoltând cel puţin o formaţiune tumorală.Un alt exemplu de acest fel este reprezentat şi de
polipoza adenomatoasă familială a colonului,în care gena este de asemenea transmisă prin
mecanism autozomal dominant.La aceşti pacienţi se pot dezvolta sute de polipi
adenomatoşi,unii dintre aceştia evoluând inevitabil către malignitate[10].
1.2.3 Agenţi carcinogeni chimici
Din cele peste şase milioane de elemante chimice identificate până în ziua de azi se
estimează că mai puţin de 1000 au fost examinate pentru a li se descoperi eventualul caracter
carcinogen.Agenţi chimici carcinogeni pot fi împărţiţi în două grupe,direcţi şi indirecţi.Cei
direcţi nu necesită activere pentru a deveni carcinogeni,în timp ce ceilalţi cunoscuţi ca şi
procarcinogeni sau iniţiatori sunt capabili de carcinogeneză doar după conversia
metabolică.Din aceste substanţe chimice se formează specii cu reactivitate crescută,care
acţionează asupra materialului genetic al celulei ţintă cauzând mutaţii ale celulei sau alterări
în sinteza de enzime şi proteine de structură modificând replicarea celulei.Acţiunea agenţilor
carcinogeni este augmentată de anumite substanţe numite promoteri,care singure nu ar avea
efect carcinogen,dar astfel uşurează acţiunea carcinogenilor propriu-zişi prin creşterea sintezei
de ADN,accelerând dezvoltarea materialului genetic şi dăunând bunei comunicări
intercelulare[11,13].
Fumul de ţigară conţine atât procarcinogeni cât şi elemente promotoare,fiind direct
asociat cu cancerele de laringe şi pulmonar şi contribuind la apariţia cancerelor
esofagiene,pancreatice,renale ale colului uterin şi vezicii urinare.Anumite elemente din
dietă,ca de exemplu anumite hidrocarburi policiclice sunt transformate în agenţi carcinogeni
dacă sunt gătite prin refolosirea uleiului.[13]
Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor
9
Cancerul de colon se asociază cu un consum ridicat de grăsimi,proteine şi carne de vită
împreună cu un consum deficitar de fibre .O dietă bogată în grăsimi creşte nivelul acizilor
biliari primari din materiile fecale.Aceştia sunt transformaţi de flora bacteriană a colonului în
acizi biliari secundari,care par a fii promoteri tumorali[14].
Efectele procarcinogene ale elementelor chimice sunt de obicei dependente de
doză,crescând direct proporţional cu doza şi timpul de expunere.Unii agenţi chimici pot
acţiona în colaborare cu alţi carcinogeni,cum ar fi radiaţiile ionizante sau viruşii.În general
trec undeva înter 5 şi 30 de ani de la momentul expunerii la agentul cancerigen şi până la
apariţia propriu-zisă a bolii[14].
1.2.4 Efectele radiaţiilor ionizante.
Efectele acestui tip de agenţi carcinogeni au fost foarte bine investigate la
supravieţuitorii atacurilor cu bombe atomice de la Hiroshima şi Nagasaki.Cele mai răspândite
neoplazii la acestă populaţie au fost leucemiile şi epitelioamele maligne,rata mortalităţii
leucemiei la supravieţuitorii atacurilor nucleare fiind de 30 de ori mai ridicată decât valorile
normale[13,16].
Tipul de cancer care se dezvoltă ca urmare a acţiunii radiaţiilor ionizante depinde de
doza de radiaţii,de sexul persoanei şi de vârsta la care a avut loc iradierea.Perioada dintre
momentul expunerii şi aparitia neoplaziei este în relaţie cu vârsta individului.De exemplu
dacă un copil este expus radiaţiilor înainte de naştere,acesta prezintă un risc crescut de a
dezvolta leucemii în primii 2,3 ani de viaţă,perioada de latenţă crescând la 5-10 ani în cazul
expunerii postnatale[8,11]
Asocierea între expunerea directă la radiaţiile solare şi cancerele de piele este
cunoscută de mai bine de 100 de ani.Efectele razelor ultraviolete este aditiv şi trece o lungă
perioadă de timp între expunere şi momentul în care cancerul poate să fie diagnosticat[13].
1.2.5 Virusurile oncogenice.
Virusurile sunt mici particule conţinătoare de material genetic(ADN sauARN) care
pătrund în celula gazdă unde se încorporează în materialul genetic al acesteia.O mare parte a
Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor
10
virusurilor au fost relaţionate cu producerea de neoplazii la animale,însă la om puţine au putut
fi incriminate de participare în carcinogeneză.Printre acestea se numără virusul
papilloma(HPV),virusul Epstein-Barr(EBV),virusul hepatitei B(HBV) şi virusul leucemiei cu
limfocite T de tip 1(HTLV-1)[16].
Există mai mult de 60 de tipuri diferite de HPV,din punct de vedere genetic.Unele din
acestea s-au dovedit a fii implicate în producerea cancerului de col uterin.Este vorba de HPV
tip 16 şi 18 şi mai rar tipurile 31,33,35 şi 51.Ele au fost descoperite în 85% din cazurile de
cancer scuamos de col şi precursori ai acestuia(displazia severă şi carcinomul in situ)[16]..
EBV,membru al familiei virusurilor herpetice ezuri este implicat în producerea a patru
tipuri de neoplazii:limfom Burkitt,cancer de nazofaringe,limfomul cu limfocite B la
imunosuprimaţi şi în unele cazuri de limfom Hodgkin[1]
HBV,agentul etiologic al hepatitei B este implicat şi în apariţia cirozei şi a
carcinomului hepatocelular.Mecanismul exact prin care virusul contribuie la apariţia
carcinomului nu a putut fi încă decelat însă se pare că este un rezultat al distrugerii şi
regenerării prelungite a ficatului produse prin acţiunea HBV[1]
1.2.6 Implicarea sistemului imunitar în oncogeneză
Există tot mai multe dovezi care certifică participarea sistemului imunitar în lupta
împotriva răspândirii cancerului în organism.Imunoterapia este folosită pentru a augmenta
răspunsul imun general al pacientului şi asfel a creşte distrugerea ţesutului tumoral[18].
Dezvoltarea neoplaziilor ar putea fi asociată cu deficienţe ale sistemului
imunitar,cum ar fi de exemplu la pacienţii cu boli care afectează imunitatea(SIDA asociată cu
apariţia sarcomului Kaposi) sau la cei care au organe transplantate şi primesc tratament
imunosuprimant[21].
Practic capacitatea de a eradica celulele canceroase este prezentă la toate celulele
componente ale sistemului imunitar,aici menţionând limfocitele T şi B,anticorpii,macrofagele
şi celulele NK.Limfocitele T sunt direct implicate în uciderea celulelor tumorale şi de
asemenea au rolul de a activa celelalte componente ale sistemului imunitar[22,23].
Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor
11
Un sistem imunitar slăbit uşurează procesele de creştere şi răspândire ale tumorilor în
organism[22].
1.3 Fiziopatologia cancerului de colon
Cancerul de colon reprezintă a doua cauză de mortalitate prin neoplazii în Statele
Unite ale Americii.Marea majoritate a cancerelor de colon sunt adenocarcinoame,care tind să
formeze fie mase tumorale voluminoase fie leziuni de formă inelară,constrictive[23].
Aproximativ 85% dintre cancerele colorectale prezintă pierderea funcţiei uneia sau
mai multor antioncogene(p53,APC sau DCC) prin apariţia diferitelor mutaţii spontane
asociate cu instabilitate cromozomială şi aneuploidie.Un procent de 15% din cazuri apar la
pacienţii cu instabilitate microsatelită,datorită inactivării genelor reparatoare ale ADN-
ului.Marea majoritate a cazurilor apar la pacienţi cu vârsta peste 50 de ani,vârful de incidenţă
apărând în jurul vârstei de 70 de ani[25].
Factorii ereditari sunt implicaţi în producerea a 20-30% din totalul cancerelor
colorectale.Riscul este proporţional cu numărul şi vârsta rudelor de gradul 1 bolnave de
cancer de colon[24,27].
În cazul pacienţilor suferinzi de afecţiuni inflamatorii intestinale,cum ar fi rectocolita
ulcerohemoragică sau boala Crohn riscul de apariţie a cancerului apare la 7-10 ani după
declanşarea bolii inflamatorii.Tratamentul cu agenţi 5-ASA şi folaţi este asociat cu o scădere
a riscului de neoplazie la aceşti pacienţi[26,30].
Un important factor de risc în cancerul colorectal este prezenţa polipozelor
ereditare,respectiv polipoza familială,sindromul Gardner,sindromul Turcot,pacienţii cu aceste
tipuri de afecţiuni prezentând risc crescut de apariţe a neoplasmului şi sindromul Peutz-
Jeghers,cu un risc moderat[23,28].
Adenocarcinoamele de colon prezintă o creştere lentă şi pot fi prezente perioade lungi
de timp fără a fi detectate,deoarece rămân asimptomatice.Unele dintre tumorile acestea pot fi
totuşi detectate prin apariţia de sângerări oculte în materiile fecale.Simtomele depind de
localizarea carcinomului.În cazul prezenţei neoplaziei pe colonul drept,hemoragiile cronice
Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor
12
pot să producă anemie feriprivă,manifestă prin oboseală şi slăbiciune.Obstrucţia în acest caz
este rar întâlnită,datorită diametrului crescut al colonului drept şi a consistenţei lichide a
materiilor fecale care îl străbat.Uneori pot apărea dureri abdominale necaracteristice,dar
prezenţa acestora nu este raportată decât de o parte a pacienţilor,alţii fiind complet
asimptomatici[33,34]
Leziunile colorectale stângi sunt adesea circumferenţiale,inelare.Deoarece aici
diametrul intestinal este mai scăzut iar consistenţa materiilor fecale este mai tare,apar
simptome obstructive,însoţite de durere abdominală colicativă şi uneori de modificări
semnificative ale defecaţiei obişnuite a pacientului.Perioadele de constipaţie alternează de
multe ori cu perioade în care este prezentă diareea.În scaune se poate observa sânge
uneori,dar nu se produc de obicei sângerări însemnate cantitativ,putându-se constata prezenţa
sângelui doar la suprafaţa scaunului[31,32]
Cea mai frecventă clasificare a cancerelor rectale este clasificarea Duke[2](tabelul I).
Tabelul I-Clasificarea Duke a cancerelor colorectale
Pacienţii cu boala în stadiile Duke A şi B pot fii trataţi eficient chirurgical.
Cancerele rectale mai pot fi clasificate şi prin intermediul clasificării TNM[2](tabelul
II).
Tabelul II-Clasificarea T M a cancerelor colorectale
Stagiu Clasificare T M
I T1-2, N0, M0
IIA T3, N0, M0
IIB T4, N0, M0
IIIA T1-2, N1, M0
IIIB T3-4, N1, M0
IIIC T(oricare), N2, M0
IV T(oricare), N(oricare), M1
13
Capitolul 2
Oxidul nitric
Capitolul 2 Oxidul nitric
14
2.Oxidul nitric
2.1Sinteza oxidului nitric.
Oxidul nitric(NO) este prezent în multe ţesuturi ale organismului uman,unde acţionează
ca moleculă de semnalizare,asigurând reglarea multor procese fiziopatologice.Sinteza oxidului
nitric se face din molecula aminoacidului l-arginină cu ajutorul enzimelor din familia
sintetazelor oxidului nitric(NOS)(fig 2.1.1)[35].
Aceste enzime(NOS) convertesc l-arginina în citrulină,în urma procesului rezultând oxid
nitric.Oxigenul şi NADPH-ul sunt cofactori necesari procesului[37,43].
Figura 2.1.1-Sinteza oxidului nitric
2.2 Acțiunea �OS
2.2.1Structura �OS
Proteina NOS funcţională este un dimer format din două subunităţi identice.Fiecare
subunitate conţine câte 3 domenii-domeniul reductazei,domeniul ligandului de calmodulină şi
domeniul oxigenazei[36,41].
Domeniul reductazei conţine FAD şi FMN şi are rolul de a transfera electroni de la
NADPH la domeniul oxigenazei de pe subunitatea opusă a dimerului[41].
Legarea calmodulinei este necesară pentru activitatea tuturor tipurilor de NOS,deoarece
detectează modificările nivelului calcemic intracelular,funcţia sa exactă fiind însă diferită la
fiecare din cele trei izoforme de NOS(fig 2.2.1-Structura generală a NOS)[48].
Capitolul 2 Oxidul nitric
15
Domeniul oxigenazei conţine situsul de legare al tetrahidrobiopterinei,hemului şi
argininei,şi catalizează conversia l-argininei la citrulină şi NO[39].
Figura 2.2.1-Structura generală a �OS
2.2.2 �O-sintetazele(�OS)
NOS sunt un grup de enzime care efectuează sinteza oxidului nitric din atomul de
nitrogen terminal al l-argininei,în prezenţa oxigenului şi a cofactorilor NADPH(nicotinamid-
adenin-dinucleotid-fosfat),FAD(flavin-adenin-dinucleotid),FMN(flavin-mononucleotid),hem şi
tetrahidrobioptrină[35].
NOS au fost descoperite în 1980 de către Furchgott,şi de atunci se clasifică în:
-NOS neuronală(NOS1)
-NOS inductibilă(NOS2)
-NOS endotelială(NOS3)
Cele trei izoforme ale NOS prezintă unele diferenţe legate de funcţia individuală a
fiecăreia.Reglarea transcripţională şi post-transcripţională a activităţii catalitice este distinctă
pentru fiecare dintre izoforme[41].
Capitolul 2 Oxidul nitric
16
n�OS(�OS1)
Enzima nNOS este prezentă în sistemul nervos central şi periferic şi în muşchii
scheletici.Deşi nNOS este considerată a fi o enzimă constitutivă,exprimarea ei este influenţată de
către anumiţi stimuli psihologici,ca de exemplu stresul[38].
Sintetaza neuronală a oxidului nitric este asociată cu proteina post-sinaptică de
densitate(PSD-95) la nivelul membranei neuronale.Ca răspuns la creşterea nivelului de calciu
intracelular nNOS reacţionează cu calmodulina[48].Complexul calciu-calmodulină,în combinaţie
cu BH4 se leagă de nNOS,inducându-i acesteia translocaţia către citoplasmă.Defosforilarea
nNOS prin calcineurină iniţiază producţia de oxid nitric.NO activează apoi guanilil-ciclaza şi
diferitele reacţii reglate de către cGMP(fig 2.2.2-acţiunea nNos).nNOS este apoi inactivată de
către proteinkinaza A sau C prin fosforilare[38].
Figura 2.2.2-acţiunea n�os
i�OS(�OS2)
Această izoformă a fost iniţal izolată din citoplasma macrofagelor unde activitatea ei
apărea ca răspuns la unii stimuli cum ar fi acţiunea endotoxinelor sau a citokinelor
proinflamatorii.Acum enzima a fost descoperită ca exprimându-se într-un număr mare de celule
ale organismului[39,43].
Capitolul 2 Oxidul nitric
17
La nivelul macrofagelor NO este generat de iNOS,ca urmare a expunerii la anumite
citokine cum ar fi de exemplu interferonul(IFN).Receptorii pentru IFN transmit semnalul prin
intermediul JAK(Janus kinaze) şi STAT(transductori de semnal şi activatori ai transmisiei).După
activarea STAT asociaţi aceştia trec printr-un proces de translocaremajungând la nucleu unde
cresc expresia factorului de transcripţie IRF-1 care se leagă de regiunea din ADN-ul celular cu
rol de promoter al iNOS,pentru a creşte exprimarea respectivei gene.iNOS nu este dependentă de
creşterea nivelului de calciu intracelular pentru a se putea activa(Figura 2.2.3-activarea iNOS
(11).Gena iNOS se află sub control transcripţional,care este influenţat de mecanisme de control
care influenţează stabilitatea mARN,degradarea proteinelor,translaţia şi disponibilitatea
substraturilor şi cofactorilor.Oxidul nitric produs de către macrofage este o moleculă efectoare cu
rolul de a ucide sau inactiva celulele ţintă[40,44].
În anumite patologii avem de-a face cu o supraproducţie de NO prin intermediul
iNOS,ca de exemplu în şocul septic.Excesul de NO duce la scăderea severă a presiunii arteriale
şi disfuncţii ale unor organe.Având atât rol de imunomediator cât şi de moleculă efectoare oxidul
nitric poate avea şi efecte benefice cât şi efecte dăunătoare,în funcţie de circumstanţe[47].
Figura 2.2.3-Activarea i�OS
Capitolul 2 Oxidul nitric
18
e�OS(�OS3)
Enzima eNOS se găseşte în endoteliul vascular,în cardiomiocite şi în epiteliul
pulmonar,la nivelul membranei bazale a microtubulilor ciliari[36].
În vasele de sânge NO produs prin intermediul eNOS are rol de vasodilatator,reglând
fluxul sanguin şi presiunea arterială,în timp ce la nivel cardiac influenţează contractilitatea[45].
Calmodulina legată este necesară pentru activarea eNOS,iar legarea ei are loc la
creşterea concentraţiei de calciu intracelular.Cercetări recente au relevat rolul esenţial al eNOS în
procesele de angiogeneză şi vasculogeneză(de novo)[51,62].
În sistemul cardiovascular eNOS are un rol protector.De asemenea eNOS are un rol de
protecţie faţă de ischemia cerebrală,păstrând fluxul sanguin cerebral.În ateroscleroză şi
inflamaţii,concentraţia scăzută de NO previne moartea prin apoptoză a celulelor
endoteliale,astfel contribuind la păstrarea integrităţii endoteliului[45,52].
2.3 Efecte fiziologice ale oxidului nitric.
Pe lângă efectul cunoscut de a produce vasodilataţie,oxidul nitric mai are şi alte efecte
fiziologice în organism.Este vorba de implicarea în apoptoză,rolul în relaţie cu sistemul
imunitar,sistemul nervos,relaxarea muşchiilor netezi,angiogeneză şi sarcină[44,45,46].
2.3.1 Rolul imunitar al �O.
Macrofagele activate prin acţiunea citokinelor pot produce oxid nitric în concentraţie
mare pentru ca acesta să acţioneze asupra celulelor ţintă,cum ar fi de exemplu celulele tumorale
sau bacteriile.Oxidul nitric acţionează în celulele ţintă prin interacţiunea cu ciclul
Krebs,întrerupând sinteza ADN-ului şi perturbând funcţia mitocondriilor[49].
2.3.2 Acţiunea asupra musculaturii netede.
NO relaxează musculatura netedă a tractului gastrointestinal,astfel contribuind la buna
desfaşurare a mişcărilor peristaltice intestinale.Deficitul de oxid nitric la acest nivel este implicat
Capitolul 2 Oxidul nitric
19
în anumite afecţiuni care se manifestă prin lisa peristaltismului normal,ca de exemplu boala
Hirschprung,achalazia, sau pseudoobstrucţia cronică intestinală[44,45].
Oxidul nitric are rol de inhibitor al contracţiei la nivelul musculaturii uterine.Astfel,la
apropierea momentului naşterii,secreţia de NO scade[48].
2.3.3 Oxidul nitric şi inflamaţia
Inflamaţia în vasele de sânge este inhibată prin acţiunea NO produs de eNOS de a opri
exocitoza de mediatori ai inflamaţiei din celulele endoteliale.Exocitoza din alte tipuri de
celule,cum ar fi limfocitele T ar putea să fie şi ea blocată prin intervenţia NO[47].
Oxidul nitric poate acţiona şi ca mediator în anumite procese inflamatorii,prin stimularea
efectelor ciclooxigenazelor şi stimularea producţiei de eicosanoizi pro-inflamatorii.Anumiţi
factori cu implicare în procesul inflamator,cum sunt interferonul gamma,interleukinele,alfa-TNF
şi LPS(factor de virulenţă bacterian proinflamator) pot stimula producţia de NO prin intermediul
iNOS[47].
2.3.4 �O şi efetele sale asupra sistemului nervos.
La nivelul sistemului nervos,oxidul nitric are rolul de transmiţător de semnal al
neuronilor nonadrenergici şi noncolinergici.În accidentele vasculare se pare că prezenţa de NO
în exces contribuie la afectarea neuronală ce apare ca şi consecinţă a AVC[42].
Unii neuroni parasimpatici de tip motor folosesc şi ei NO ca şi neurotransmiţător,mediind
probabil acţiunile NO care influenţează erecţia sau peristaltismul intestinal[48].
Hemoglobina transportă NO deodată cu oxigenul,descărcarea lor în ţesuturi având loc
simultan.Celulele medullei oblongata reacţionează în cazul scăderii severe a aportului de
oxigen,datorită sensibilităţii lor la oxidul nitric,cauzând o respiraţie cu frecvenţă si amplitudine
mărite[49].
S-au efectuat studii experimentale pe animale de laborator pentru a se vedea ce efect are
oxidul nitric asupra creierului.S-a demonstrat astfel legătura dintre NO şi stimularea receptorilor
NMDA implicaţi în învăţare şi memorare.La nivelul sinapselor NO poate să îşi augmenteze
efectul,deorece eliberarea sa într-o sinapsă afectează şi sinapsele din vecinătate.La şobolanii
Capitolul 2 Oxidul nitric
20
cărora le-au fost inoculaţi inhibitori ai NOS s-au văzut încetiniri ale achiziţiei răspunsului
condiţionat[50].
2.3.5 Importanţa �O în uciderea germenilor patogeni
NO contribuie la uciderea agenţilor patogeni în lizozomii macrofagelor.La şoarecii cărora
le-a fost sistată abilitatea de a sintetiza NO în macrofage s-a descoperit creşterea susceptibilităţii
la infecţii produse de bacterii intracelulare.Celulele t-helper de tip 1 au proprietatea de a secreta
oxid nitric[62].
Bacteriile comensale din faringe transformă nitraţii ingeraţi prin hrană în nitriţi.În
stomac,cu ajutorul sucului gastric din aceşti nitriţi este generat NO,care distruge aproape în
totalitate bacteriile din hrană[64,65].
2.3.6 �O şi longevitatea
Atât deficienţa cât şi excesul de oxid nitric sunt dăunătoare bunei funcţionari a
organismului,având implicări în multiple stări patologice.Tonusul vascular este influenţat
puternic de nivelul oxidului nitric,un deficit în acest sens fiind asociat hipertensiunii.Funcţia
endotelială anormală are şi ea printre manifestări un nivel scăzut al NO,iar această disfuncţie
endotelială apare în patologiile aterogene:hipertensiune,diabet zaharat,hiperlipidemii[47].
Nitraţii exogeni sunt folosiţi în terapia afecţiunilor coronariene.Este vorba de
nitroglicerină,isosorbid dinitrat şi mononitrat,sau nitroprusiat care sunt toate metabolizate în oxid
nitric.Din punctul de vedere al aparatului respirator oxidul nitric poate fi folosit în tratamentul
hipertensiunii pulmonare persistente a nou-născutului,la concentraţii de 10-40 ppm.De
asemenea şi-ar putea demonstra utilitatea în tratamentul vasoconstricţiei pulmonare din hernia
diafragmatică concenitală,hipertensiunea pulmonară primară sau sindromul de detresă
respiratorie.Trebuie însă acţionat cu grijă deoarece inhalarea NO în concentraţii mai mari poate
fii toxică[39].
Capitolul 2 Oxidul nitric
21
În concluzie,oxidul nitric a fost demonstrat a fii un transmiţător endogen care îndeplineşte
diferite roluri fiziologice.Asta în ciuda faptului că pentru mult timp oxidul nitric a fost considerat
a fi un produs nociv de combustie[48].
Se efectuează în prezent cercetări privitoare la reglarea secreţiei de NO şi a sintetazelor
sale(NOS),iar concluziile acestora ar trebui să ducă la completarea cunoştinţelor referitoare la
rolul jucat de oxidul nitric în patogeneza a diferite afecţiuni.Studiul oxidului nitric se poate
dovedi eficient şi în înţelegerea rolului jucat de alte micromolecule ce funcţionează ca
biotransmiţători[37].
2.4 Implicarea oxidului nitric în fiziopatologia neoplaziilor.
Toate cele trei tipuri de NOS au fost detectate în celulele tumorale în cursul diverselor
studii,dar rolul oxidului nitric în biologia tumorală nu este încă nici pe departe complet
elucidat[46].
Dintre efectele oxidului nitric activitatea citotoxică a acestuia şi participarea la
neoformaţia vasculară au importanţă în biologia neoplaziilor.Angiogeneza este un proces de
maximă importanţă pentru creştere şi dezvoltarea neoplaziilor,în timp ce efectul citotoxic al
oxidului nitric poate contribui la eradicarea celulelor tumorale care apar în organism[46].
Cercetările efectuate au relvat atât efecte de promovare cât şi efecte inhibitorii asupra
dezvoltări cancerelor.Mutaţiile antioncogenei p53 au efecte adverse asupra organismului gazdă
prin creşterea producţiei de NO.Există şi o ipoteză conform căreia oxidul nitric ar induce mutaţii
ale oncogenelor myc şi p21 iar astfel ar ajuta la progresia tumorală[61,63].
Însă s-au descoperit şi efecte antitumorale al NO,care ar produce moartea celulelor
tumorale prin citotoxicitatea sa.Mecanismele posibil implicate în acest proces sunt afectarea
directă a ADN-ului,inhibarea sintezei de ADN,inhibiţia ribonucleotid-reductazei şi alte efecte
toxice intracelulare[67].
Prima formă de NOS implicată în uciderea celulelor canceroase mediată de macrofage a
fost iNOS.iNOS a fost detectată mai ales în macrofagele peritumorale şi intratumorale.De
asemenea eNOS a fost descoperită în cancerul de sân invaziv.Este posibil ca oxidul nitric generat
prin activarea eNOS să contribuie la supravieţuirea celulelor neoplazice în diferite condiţii de
Capitolul 2 Oxidul nitric
22
stres,ca de exemplu hipoxia.Prezenţa oxidului nitric şi a NOS a mai fost demonstrată şi în cazul
altor localizări,de exemplu:carcinomul ductal,de colon,de creier,al capului şi gâtului,carcinomul
cu celule renale,cancerul esofagului,pulmonar,de vezică,prostată,gastric sau cel cu localizare
ginecologică[59].
Cercetările în domeniul cancerului de cap şi gât s-au concentrat pe carcinomul epitelial
scuamos din această localizare.Cercetările lui Rosbe au demonstrat prezenţa izoformelor de NOS
la acest carcinom,iar Brennan a descoperit o exprimare crescută a iNOS în aceste tumori.Gallo a
efectuat cercetări pe acelasi tip de carcinom,concluzionând existenţa unui rol important al iNOS
generator de NO pentru angiogeneza tumorală şi de aemenea şi pentru metastazare[59].
Expresia diferitelor NOS este crescută atât în tumori benigne(adenom pleomorf) cât şi în
tumori maligne(adenocarcinoame).În cancerul oral invaziv s-a sugerat existenţa unui rol al iNOS
în transformarea malignă al displaziei epiteliale[59].
În cancerul colorectal s-a constatat o creştere a exprimării iNOS în comparaţie cu
mucoasa normală,existând de asemenea o corelaţie între acest nivel crescut al iNOS şi
metastazarea tumorei.Cercetările lui Ahn şi Oshima au demonstrat o relaţie cauză-efect specifică
între creşterea exprimării genei pentru iNOS şi cancerul colorectal.Tumorile derivate din
adenocarcinoame colorectale modificate în laborator pentru a produce continuu oxid nitric au o
vascularizaţie evident mai bogată şi sunt mai invazive decât celelalte[23,25].
În legătură cu neoplaziile,oxidul nitric prezintă aşadar un caracter dual.Această moleculă
are atât rol de promoţie tumorală cât şi de inhibiţie a dezvoltării neoplaziei.Se pare că apariţia
unuia sau altuia dintre aceste efecte este în relaţie directă cu concentraţia NO[59].
La concentraţii crescute oxidul nitric inhibă creşterea şi proliferarea tumorală,în timp ce
prezenţa unor concentraţii scăzute ale oxidului nitric creşterea cancerului este stimulată[61].
Supraproducţia de NO endogen ar cauza citotoxicitate la nivelul tumorei,ar induce
apoptoza celulelor canceroase şi ar avea rol de prevenţie a angiogenezei tumorale.În schimb
oxidul nitric produs în microambientul tumorei,în concentraţie mult mai mică,joacă un rol
important în angiogeneza tumorală şi dilatarea vaselor de sânge care deservesc tumora[61].
Capitolul 2 Oxidul nitric
23
Reglarea creşterii tumorii,care se poate face fie de către oxidul nitric însuşi,precum şi
printr-un inhibitor al producerii sale ar putea aduce beneficii utile pentru eficienţa terapiei
anticancerose[59,64].
24
Capitolul 3
Evaluarea sintezei de oxid nitric și a
stresului oxidativ în tumorile rectale
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
25
3.1 Scopul studiului
Interesul pentru studiul stresului oxidativ a crescut exponențial în ultimele două
decade,unul dintre motive fiind acela că efecele speciilor reactive ale oxigenului sunt duale,pe
de o parte benefice iar pe de altă parte dăunătoare.
Efectele benefice sunt determinate de implicarea speciilor reactive de oxigen în
fiziologia celulară ca răspuns la hipoxie.Efectele nocive ale speciior reactive de oxigen sunt
determinate de către producerea lor în exces,ceea ce induce leziuni moleculare și celulare.
În condiții fiziologice,efectele nocive sunt contracarate de către acțiunea substanțelor
cu rol antioxidant.
În condiții patologice,cel mai studiat efect al speciilor reactive ale oxigenui este efectul
mutagen,deoarece acesta poate să fie un bioindicator al carcinogenezei.Una dintre etapele
critice ale oncogenezei este reprezentată de către mutațiile survenite în ADN.Se pare că
leziunile oxidative ale ADN sunt legate de inițierea transformărilor maligne.
Un alt mecanism de implicare a speciilor reactive ale oxigenului în cancerogeneză este
reprezentat de către implicarea lor în semnalizare,pe calea proliferării celulare.
În concluzie,leziunile,mutațiile și alterarea expresiei genice din ADN reprezintă
procese cheie în fiziopatologia cancerogenezei.
Stresul oxidativ este implicat de asemenea și în tratamentul neoplaziilor,prin
toxicitatea indusă în timpul radioterapiei.
Având toate acestea în vedere,studiul de față și-a propus determinarea unor parametrii
de stres oxidativ la pacienții cu cancer colorectal operat,înainte și după tratamentul combinat
constând în radioterapie și chimioterapie,pentru a evalua dacă acești parametri pot să fie
utilizați ca parametri de screening în monitorizarea postchirurgicală.
3.2 Materiale şi metode
3.2.1 Grupurile de studiu
Sângele recoltat pe anticoagulant EDTA a fost a fost centrifugat la 5000g X min, timp
de 10 minute. Supernatantul a fost prelevat şi păstrat la -80°C până la citirea probelor.
Pacienţii incluşi în grupul de studiu au fost selectaţi pe baza criteriilor de includere
respeciv de excludere:
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
26
Criterii de includere:
- pacienţi diagnosticaţi cu cancer gastric confirmat la Institutul Oncologic
Profesor Doctor I. Chiricuţă, Cluj Napoca, în stadiul postoperator.
- pacienţi care au urmat radioterapie şi chimioterapie; radioterapia s-a efectuat
folosind acceleratorul liniar în doze de 50 Gray administrate în 25 de fracţiuni
şi chimioterapia a constat în administrarea de acid folinic şi 5 fluoro-uracil
- consimţământul informat al pacienţilor de a fi incluşi în lotul de studiu
- acordul Comisiei de Etică al Universităţii de Medicină şi Farmacie „Iuliu
Haţieganu”, Cluj Napoca
Criterii de excludere:
- cancer colorectal inoperabil
- refuzul pacienţilor de a participa în studiu
- boli sistemice grave ( colagenoze, hepatite cronice, ciroze, insuficienţă renală,
insuficienţă cardiacă, deficite imune)
- alte tipuri de neoplazii
- tratamente ce pot influenţa stressul oxidativ şi sinteza de oxid nitric
Conform acestor criterii au fost selecţionaţi 30 de pacienţi.
3.2.2 Reactivii folosiţi.
Sulfat de amoniu feros, orto-dianisidin dihidroclorhidrat ( 3-3V-dimetoxibenzidina,
analogol hidrosolubil al vitaminei E ( Trolox; 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-acid
carboxilic) a fost de la Sigma-Aldrich Chemical Co. Toate chimicalele au fost de grad ultra
pur şi s-a folosit reactiv de tip I apă deionizată.
Trolox-ul a fost dizolvat în tampon de fosfat ( 10mm, pH 7,4 ).Xylenol orange [ o-
cresosulfonftaleina-3,3-bis (metiliminodiacetat de sodiu )], diclorhidrat de orto dianisidină (
3-3'-dimetoxibenzidină), sulfat feros de amoniu, hidrogen peroxid ( H2O2), acid sulfuric, acid
clorhidric, glicerol, au fost achiziţionate de la Sigma Co. Şi Meck Co. Toate chimicalele au
fost de grad ultra pur şi s-a folosit reactiv de tip I apă deionizată.
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
27
3.2.3 Determinarea nitriţilor
Serul, prelevat de la pacienţi, a fost deproteinizat înainte de analiza metabolitului NO.
Deproteinizarea s-a făcut cu un amestec de metanol/dietileter. După deprotenizare serul a fost
centrifugat 10 minute la 5000 Xg şi supernatantul a fost utilizat pentru determinarea nitriţilor
şi nitraţilor serici.
Nivelurile de nitrat/nitrit au fost măsurate folosind metoda Griess. Pe scurt, 100µl de
VCl3 au fost adăugaţi la 100µl de probă, urmată imediat de adăugarea reactivului Griess (
50µl sulfanilamidă + 50µl dihidroclorid de etilendiamină). După ce au fost ţinute 30-45 min la
temperatura camerei, la întuneric, a fost măsurată absorbţia la 540nm cu ajutorul unui
spectrofotometru (CECIL 3021). [ ] Calcularea concentraţiei de nitriţi şi nitraţi s-a făcut
utilizând o curbă standard obţinută prin diluţii succesive de nitrit de sodiu şi s-a exprimat în
milimol/L.[68]
Curba standard pentru nitriți
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
28
3.2.4 Determinarea răspunsului antioxidativ total (TAR).
Principiul metodei
O soluţie standard a unui complex de Fe2+ şi o-dianisidină reacţonează cu o soluţie
standard de hidrogen peroxid ( H2O2) printr-o reacţie de tip Fenton, rezultând ionul OH-.
Acesta oxidează moleculele de o-dianisidină la culoarea galben-maronie a radicalilor
dianisidil la pH scăzut[69].
Reacţia de oxidare progresează între radicalii dianisidil şi se dezvoltă în continuarea
reacţii de oxidare. Antioxidanţii din probe supresează reacţiile de oxidare şi formarea culorii.
Aceste reacţii pot fi monitorizate prin spectrofotometrie(tabel III)[69].
Reactivii metodei:
Reactivul 1
Soluţia Clark şi Lubs ( 75 mM, pH 1,8 ) a fost preparatăî după cum urmează: 5.591 g
de KCl a fost dizolvată în 1000 ml de apă deionizată (concentraţia finală a fost de 75 mM).
Gradul de reactiv de reactiv acid clorhidric ( 36,5%, 6,41 ml) a fost diluat cu 1000 ml cu apă
deionizată ( concentraţie finală, 75mM).
Soluţia preparată de KCl (800 ml) a fost amestecată cu 200 ml soluţie de HCl sub un
pH metru (pH final, 1,8). Diclorhidratul de ortodianisidină (3,17 g) a fost dizolvat în această
soluţie (concentraţia finală a fost de 10.0 mM), şi ulterior 0.01764 g de Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O
a fost dizolvat în această soluţie (concentraţia finală, 45 AM). (ATENŢIE: o-dianisidina este o
substanţă demonstrată toxică şi carcinogenetică. Asiguraţi-vă că folosiţi mănuşi de cauciuc şi
purtaţi mască facială ţn momentul manipulării acestei substaţe.).
Reactivul astfel preparat a fost folosit ca Reactiv 1 în textul testului. Acest reactiv este stabil
pentru cel puţin 6 luni la 4°C.
Reactivul 2
Soluţia de hidrogen peroxid (7,5 mM) a fost preparată dupa cum urmează: 0,641 ml
soluţie de H2O2 comercială (35%, Merck) a fost diluată în 1000 ml cu soluţie Clarck and
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
29
Lubs. Concentraţia de hidrogen peroxid a fost confirmată spectrofotometric prin absorbţie la
240nm. Această soluţie este stabilă pentru cel putin 1 lună la 4°C.
Tabelul III
Volumul
reactivului 1
800 µl [reactiv 1: o-dianisidină(10 mM),ionul feros (45 AM) în
soluţia Clarck şi Lubs (75 mM, pH 1,8)]
Volumul
probei
29 µl (ser sau alte fluide, pure sau soluţii de complexe de
antioxidanţi)
Volumul
Reactivului 2
40 µl [reactivul 2: H2O2 (7,5 mM) în soluţia Clarck şi Lubs]
Lungimea de undă 444 nm
Punctul de citire
Măsurarea la punctul de sfârşit. Prima absorbţie este luată inainte
amestecarea R1 cu R2 (ca probă control) şi ultima absorbţie este
luată când reacţia ajunge la o linie de platou (aproape 3-4 min după
amestecare)
Tipul de calibrar Linear
Rezultatele se exprimă raportat o curbă standard trasată cu diluţii consecutive de trolox
(milimol trolox Equiv./L).
Curba standard trasată cu trolox
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
30
3.2.5 Determinarea statusului oxidativ total .
Principiul metodei:
Oxidanţii prezenti în probe oxidează complexul ion feros-o-dianisidină la ion feric. Reacţia de
oxidare este consolidată de moleculele de glicerină, care sunt prezente din abundenţă în
mediul de reacţie. Ionul feric formează un complex colorat cu xylenol orange într-un mediu
acid. Intensitatea culorii, care poate fi determinată spectrofotometric(tabel IV), este legată de
cantitatea totală de molecule de oxidanţi prezente în probe. Evaluarea se calibrează cu apă
oxigenată şi rezultatele se exprimă în unităţi micromolare de echivalenţi/litru de apă oxigenată
(µmol H2O2 Equiv./L)[69].
Reactivii folosiţi:
Reactivul 1
Reactivul 1 a fost preparat prin dizolvarea 114 mg de xylenol orange şi 8,18 g de NaCl în 900
mL de soluţie de H2SO4, ,25 mM. 100 ml de glicerol au fost adăugaţi în soluţie. Reactivul
final a fost compus din 150 µM xilenol orange, 140 mM NaCl şi 1,35 M glicerol. Valoarea
pH-ului reactivului este stabilă cel puţin 6 luni la 4 grade Celsius..
Reactivul 2
Reactivul 2 a fost preparat prin dizolvarea a 1,96 g de sulfat de amoniu feros şi 3,17 g de
diclorhidrat de o-dianisidină în 1000ml de soluţie de H2SO4, 25 mM. Reactantul final a fost
constituit din 5 mM sulfat de amoniu feros şi 10 mM diclorhidrat de o-dianisidina. Acest
reactiv este stabil pentru cel puţin 6 luni la temperatura de 4 grade Celsius.
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
31
Tabel IV
Volumul
reactivului 1
900µl (reactivul 1: xilenol orange 150µM, NaCl 140 mM şi glicerol 1,35
M în 25 mM de soluţie de H2SO4 , pH 1,75)
Volumul
probei
140 µl (ser sau alte fluide, pure sau soluţii de complexe de antioxidanţi)
Volumul
reactivului 2
44 µl (reactivul 2: ion feros 5mM şi 10 mM o-dianisidina în 25 mM de
soluţie de H2SO4
Lungimea de
undă
Principala lungime de undă 560 nm, secundara lungime de undă 800 nm
(Biocromatic)
Punctul de citire
Măsurarea la punctul de sfârşit. Prima absorbţie este luată inainte
amestecarea R1 cu R2 (ca probă control) şi ultima absorbţie este luată
când reacţia ajunge la o linie de platou (aproape 3-4 min după amestecare)
Tipul de
calibrare
Linear
3.2.6 Indicele de stres oxidativ.
Un alt parametru calculat a fost OSI(indicele de stres oxidativ).Acesta se calculează
făcând raportul dintre capacitatea oxidativă totală și capacitate antioxidativă
totală(TOS/TARx100)[69].
3.2.7 Analiza statistică.
Toate rezultatele au fost exprimate ca medii ± SEM. Comparaţia loturilor a fost
efectuată cu testul ANOVA. O valoare p mai mică decât 0.05 a fost considerată a fi
semnificativă. Analiza corelaţiilor dintre parametrii s-a realizat cu testul Pearson.
Analiza statistica a fost relizată cu programul SPSS 18.0[69].
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
32
3.3 Rezultate. 3.3.1 Analiza demografică a pacienților.
În lotul de studiu au fost selecționți conform criteriilor de includere/excludere treizeci
de pacienți cu cancer colorectal operat dintre care treisprezece au fost femei iar șaptesprezece
bărbați.Pentru fiecare parametru studiat grupul a fost subîmpărțit în funcție de sex și categorii
de vârstă.
Deși numărul paciențiilor din subgupe nu a fost statistic semnificativ,fiind sub 30 de
pacienți/subgrupă,am făcut o analiză preliminară și a acestor subgrupe.(Tabel 3.1)
Tabel 3.1 Datele demografice ale lotului de studiu TOTAL FEMEI/BĂRBAȚI Nr pacienți total 30 13/17 40-50 ani 6 2/4 50-60 ani 7 3/4 60-70 ani 11 3/8 70-80 ani 6 2/4
3.3.2 Analiza generală a lotului de studiu.
La pacienții din grupul de studiu,statusul oxidativ total(TOS) a scăzut foarte
semnificativ după tratamentul combinat,radioterapie și chimioterapie(p˂0,01)(fig 3.3.1).
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
33
Statusul oxidativ total
0
50
100
150
200
250
300
TOS1 TOS2
mic
rom
oliH
2O
2e
qu
iv./L
p<0,001
Figura 3.3.1 Statusul oxidativ total
Răspunsul antioxidativ total(TAR) al pacienților din studiu nu a fost influențat
semnificativ de către terapia combinată(p˃0,05)(fig 3.3.2).
Răspunsul antioxidativ total
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
TAR1 TAR2
mil
imo
li T
rolo
x E
qu
iv./
L
p>0,05
Figura 3.3.2 Răspunsul antioxidativ total
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
34
La pacienții din lotul de studiu indicele de stres oxidativ(OSI) a scăzut semnificativ
după tratament(p˂0,001,fig 3.3.3)
Indicele de stres oxidativ
0
2
4
6
8
10
12
14
16
OSI1 OSI2
p<0,001
Figura 3.3.3 Indicele de stres oxidativ
Oxidul nitric total
102
104
106
108
110
112
114
116
GRIESS1 GRIESS2
mic
rom
oli
/L
p<0,01
Figura 3.3.4 Oxidul nitric total
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
35
Cantitatea de nitriți și nitrați serici ai paciențiilor din studiu au scăzut semnificativ
după radioterapie și chimioterapie(p˂0,001)(fig 3.3.4).
Corelațiile dintre cei trei parametri au fost nesemnificative atât înainte cât și după
tratament(r²˂0,5).
3.3.3 Analiza sublotului de femei
La grupul de femei din studiu statusul oxidativ total a scăzut foarte
semnificativ(p˂0,001)(fig 3.3.5).
Status oxidativ total-feminin
0
50
100
150
200
250
300
350
TOS1 TOS2
mic
rom
oli
H2O
2E
q./
L
p<0,001
Figura 3.3.5 Statusul oxidativ total la femei
La femeile din grupul de studiu,răspunsul antioxidativ total nu s-a modificat
semnificativ(p˃0,05)(fig 3.3.6).
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
36
Răspuns antioxidativ total feminin
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
TAR1 TAR2
mm
oli
Tro
lox e
q./
L
p>0,05
Figura 3.3.6 Răspusul antioxidativ total la sexul feminin
În cazul pacienților din sublotul de sex feminin nivelul indicelui de stres oxidativ a
înregistrat o scădere semnificativă(p˂0,001,fig 3.3.7)
Cantitatea totală de nitrați și nitrați la pacienții de sex feminin a crescut ușor după
tratamentul combinat radioterapie și chimioterapie(p˂0,05)(fig 3.3.8).
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
37
Indicele de stres oxidativ-feminin
0
5
10
15
20
25
OSI1 OSI2
p<0,001
Figura 3.3.7 Indicele de stres oxidativ-feminin
Oxidul nitric total-feminin
107,5
108
108,5
109
109,5
110
110,5
111
111,5
112
112,5
113
GRIESS1 GRIESS2
mic
rom
oli
/L
p<0,05
Figura 3.3.8 Oxidul nitric total la sexul feminin
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
38
Corelații semnificative s-au sesizat doar înainte de tratament între statusul oxidativ
total și cantitatea totală de nitrați și nitriți(r²=-0,77).
3.3.4 Analiza sublotului de bărbați
La sublotul de bărbați statusul oxidativ total a scăzut foarte semnificativ după
tratamentul combinat radioterapie și chimioterapie.(p˂0,001)(fig 3.3.9)
Statusul oxidativ total-masculin
0
50
100
150
200
250
300
350
TOS1 TOS2
mic
rom
oli
mo
li H
2O
2 E
q/L
p<0,001
Figura 3.3.9 Statusul oxidativ total la bărbați
Răspunsul antioxidativ total nu a prezentat modificări semnificative din punct de
vedere statistic la pacienții de sex masculin participanți la studiu.(p˃0,05)(fig 3.3.10).
La pacienții de sex masculin indicele de stres oxidativ(OSI) s-a diminuat semnificativ
după tratamentul combinat radioterapie și chimioterapie(p˂0,001,fig 3.3.11).
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
39
Raspunsul antioxidativ total-masculin
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
TAR1 TAR2
mm
oli
Tro
lox E
q/L
p>0,05
Figura 3.3.10 Răspunsul antioxidativ total la bărbați
Indicele de stres oxidativ-masculin
0
2
4
6
8
10
12
14
osi1 osi2
p<0,001
Figura 3.3.11 Indicele de stres oxidativ-masculin
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
40
În ceea ce privește cantitatea de nitriți și nitrați s-a înregistra o reducere ușoară a
cantității acestora după tratamentul combinat.(p˂0,05)(fig 3.3.12).
Oxidul nitric total-masculin
0
20
40
60
80
100
120
140
GRIESS1 GRIESS2
mic
rom
oli
/L
p<0,05
Figura 3.3.12 Oxidul nitric total la bărbați
Nu au existat corelații semnificative între cei trei parametri la sublotul de bărbați,nici
înainte și nici după tratament.( r²˂0,5).
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
41
3.3.5 Analiza pe grupe de vârstă
3.3.5.1 Grupa 40-50 de ani
La pacienții cu vârste cuprinse între 40 și 50 de ani statusul oxidativ total a scăzut
semnificativ după efectuarea tratamentului combinat(p˂0,001)(fig 3.3.13).
Răspunsul antioxidativ total nu a prezentat modificări semnificative după tratament la
pacienții cu vârstele cuprinse în intervalul 40-50 de ani(p˃0,05)(fig 3.3.14).
Status oxidativ total 40-50 ani
0
100
200
300
400
500
600
TOS1 TOS2
mic
rom
oli
H2O
2 E
q/L
Figura 3.3.13 Statusul oxidativ total 40-50 de ani
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
42
Raspuns antioxidativ total-40-50 ani
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
TAR1 TAR2
mm
oli
Tro
lox E
q/L
.
p>0,05
Figura 3.3.14 Răspuns antioxidativ total 40-50 de ani
În cazul pacienților făcînd parte din grupa de vârstă 40-50 de ani am avut de-a face cu
un nivel semnificativ mai scăzut al indicelui de stres oxidativ(OSI)(p˂0,001)(fig 3.3.15)
Indicele de stres oxidativ 40-50 ani
0
5
10
15
20
25
30
osi1 osi2
p<0,001
Figura 3.3.15 Indicele de stres oxidativ la 40-50 de ani
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
43
Oxidul nitric total-40-50 ani
0
20
40
60
80
100
120
140
GRIESS1 GRIESS2
mic
rom
oli
Eq
/L. p<0,05
Figura 3.3.16 Oxidul nitric total 40-50 de ani
Nitriții și nitrații au înregistrat o creștere ușor semnificativă la această categorie de
vârstă.(p˂0,05)(fig 3.3.16)
În ceea ce privește corelațiile dintre parametri înainte de tratament acestea au fost
nesemnificative din punct de vedere statistic(r²˂0,5),iar după tratament între TOS și
TAR(r²=0,84) și între TAR și GRIESS(r²=0,68) corelațiile au fost semnificative.
3.3.5.2 Grupa 50-60 de ani
La pacienții cuprinși în studiu a căror vârstă a fost cuprinsă între cincizezi și șaizeci de
ani statusul oxidativ total a prezentat o scădere ușor semnificativă după tratamentul
oncologic.(p˂0,05)(fig 3.3.17).
Răspunsul antioxidativ total nu a prezentat modificări semnificative la această grupă
de vârstă după tratamentul combinat radioterapie și chimioterapie(p˃0,05)(fig 3.3.18).
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
44
Statusul oxidativ total 50-60 ani
0
50
100
150
200
250
TOS1 TOS2
mic
rom
oli
H2O
2 E
q/L
.
p<0,05
Figura 3.3.17 Statusul oxidativ total 50-60 de ani
Raspunsul antioxidativ total 50-60 ani
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
TAR1 TAR2
mm
oli
Tro
lox E
q/L
.
p>0,05
Figura 3.3.18 Răspunsul antioxidativ total 50-60 de ani
Pacienții din grupa de vârstă 50-60 de ani au prezent din punct de vedere al indicelui
de stres oxidativ o scădere semnificativă din punct de vedere statistic(p˂0,01)(fig 3.3.19).
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
45
Indicele de stres oxidativ 50-60 ani
0
2
4
6
8
10
12
OSI1 OSI2
p<0,01
Figura 3.3.19 Indicele de stres oxidativ 50-60 de ani
Oxidul nitric total 50-60 ani
108,4
108,45
108,5
108,55
108,6
108,65
108,7
GRIESS1 GRIESS2
mic
rom
oli
/L. p>0,05
Figura 3.3.20 Oxidul nitric total 50-60 de ani
În cazul acestei categorii de vârstă nitriții și nitrații totali nu au prezentat modificări
semnificative din punct de vedere statistic.(p˃0,05)(fig 3.3.20).
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
46
Din punct de vedere al corelațiilor,acestea nu au fost semnificative înainte de
tratament(r²˂0,5).După tratament însă TOS și TAR(r=0,6) și GRIESS și TAR(r²=-0,6) s-au
corelat ușor semnificativ.
3.3.5.4 Grupa 60-70 de ani
La pacienții aparținând grupei de vârstă 60-70 de ani statusul oxidativ total a prezentat
o scădere foarte semnificativă după tratamentul combinat(p˂0,001)(fig 3.3.21).
La aceiași pacienți răspunsul antioxidativ total nu a prezentat modificări
importante(p˃0,05)(fig 3.3.22).
Statusul oxidativ total 60-70 ani
0
50
100
150
200
250
TOS1 TOS2
mic
rom
oli
H2O
2 E
q/L
Figura 3.3.21 Statusul oxidativ total 60-70 ani
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
47
Raspunsul antioxidativ total 60-70 ani
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
TAR1 TAR2
mm
oli
Tro
lox E
q/L
.
p>0,05
Figura 3.3.22 Răspunsul antioxidativ total 60-70 de ani
La pacienții din încadrați în categoria 60-70 de ani indicele de stres oxidativ(OSI) a
prezentat o scădere semnificativă(p˂0,01)(fig 3.3.23)
Indicele de stres oxidativ 60-70 de ani
0
2
4
6
8
10
12
14
OSI1 OSI2
p<0,01
Figura 3.3.23 Indicele de stres oxidativ 60-70 de ani
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
48
Oxidul nitric total 60-70 ani
102
104
106
108
110
112
114
116
118
GRIESS1 GRIESS2
mic
rom
oli
/L.
p<0,05
Figura 3.3.24 Oxidul nitric total 60-70 de ani
Cantitatea de nitiți și nitrați serici la această grupă de vârstă a scăzut ușor semnificativ
din punct de vedere statistic după terapie.(p˂0,05)(fig 3.3.24).
La grupa de vârstă 60-70 de ani corelațiile au fost nesemnificative din punct de vedere
statistic atât înainte cât și după tratament(r²˂0,5).
3.3.5.4 Grupa 70-80 de ani
În cazul pacienților din lotul de studiu cu vârsta cuprinsă între 70 și 80 de ani statusul
oxidativ total s-a modificat foarte semnificativ după tratamentul oncologic,prezentând o
importantă scădere(p˂0,001)(fig 3.3.25).
Cu privire la răspunsul antioxidativ total putem afirma că acesta nu a prezentat
modificări semnificative după terapie.(p˃0,05)(fig 3.3.26).
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
49
Statusul oxidativ total 70-80 ani
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
TOS1 TOS2
mic
rom
oli
H2O
2 E
q/L
.
p<0,001
Figura 3.3.19 Statusul oxidativ total 70-80 de ani
Raspunsul antioxidativ total 70-80 ani
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
TAR1 TAR2
mm
oli
Tro
lox E
q/L
.
p>0,05
Figura 3.3.20 Răspunsul antioxidativ total 70-80 de ani
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
50
În ceea ce privește grupa de vârstă 70-80 de ani,pacienții aparținând aici au prezentat
un nivel semnificativ scăzut al indicelui de stres oxidativ(OSI)(p˂0,01)(fig 3.3.27)
Indicele de stres oxidativ 70-80 ani
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
OSI1 OSI2
p<0,01
Figura 3.3.27 Indicele de stres oxidativ 70-80 ani
Oxidul nitric total 70-80 ani
0
20
40
60
80
100
120
140
160
GRIESS1 GRIESS2
mic
rom
oli
/L. p>0,05
Figura 3.3.28 Oxidul nitric total 70-80 de ani
Nitriții și nitrații totali nu s-au modificat semnificativ la categoria de vârstă peste 70 de
ani în urma terapiei combinate(p˃0,05)(fig 3.3.28).
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
51
Înainte de terapia combinată radioterapie și chimioterapie au existat corelații
semnificative statistic între TOS și GRIESS(r²=-0,92).După tratamentul combinat au existat
corelații între GRIESS și TAR(r²=0,79).
3.4 Discuții
Rezultatele obținute în urma studiului efectuat au relevat faptul că statusul oxidativ
total a prezentat o scădere semnificativă după asocierea tratamentului combinat radioterapie și
chimioterapie la tratamentul chirurgical.Având în vedere faptul că rolul TOS este de a aprecia
în ansamblu toți produșii oxidați ca urmare a stresului oxidativ,scăderea TOS reprezintă un
indice global de reducere a stresului oxidativ,fără a ne oferi indicații particulare asupra
componentei specifice care a determinat această scădere[74].
Este important de semnalat faptul că scăderea TOS a fost prezentă la toți pacienții care
au fost luați în studiu,indiferent de modul în care au fost aceștia grupați ,indiferent de grupa
de sex sau vârstă din care au făcut parte[77].
Datele din literatură referitoare la implicarea speciilor reactive ale oxigenului în
patologie au evidențiat caracterul dual al acestora în ceea ce privește implicarea lor în
cancerogeneză[77].
Pe de o parte speciile reactive ale oxigenului(ROS) formate intracelular pot să
acționeze ca mesageri secundari care induc și mențin fenotipul oncogenic la nivelul celulelor
de tip canceros[77].
Pe de altă parte,referitor la aceleași specii reactive ale oxigenului s-a constatat că pot
induce apoptoza la nivel celular și astfel pot să aibă și un rol de oprire a proliferării
tumorale[76,77].
Se pare că cele două efecte contradictorii ale speciilor reactive ale oxegenului în relație
cu proliferarea tumorală depind de balanța ROS și momentul în care are loc acțiunea lor
raportat la stadiul oncogenezei[77].
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
52
S-a constatat că o creștere a stresului oxidativ raportată la momentul oncogenezei
poate să determine cel puțin trei tipuri de răspuns.O creștere ușoară a stresului oxidativ poate
avea un efect adjuvant asupra proliferării tumorale.Dacă apare o creștere moderată este
posibilă apariția mutagenezei,iar o creștere marcată a stresului oxidativ poate produce un efect
de stimulare a apoptozei și a necrozei celulare(fig3.4.1)[77].
Figura 3.4.1 .ivelul SO în relație cu oncogeneza[77]
Principalele mecanisme identificate ca având o implicare în efectul procarcinogen al
speciilor reactive ale oxigenului ar fi prima dată efectul mutagen care este produs prin
modificări produse de ROS la nivelul ADN.Pe lângă efectul mutagen pe ADN speciile reacive
ale oxigenului(ROS) mai acționează și prin reacții cu speciile reactive ale azotului(RNS).Din
aceste reacții se formează peroxinitriții,care la rândul lor sunt impicați în modificări la nivelul
ADN producând mutații[74].
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
53
Speciile reactive ale oxigenului mai sunt de asemenea implicate în carcinogeneză prin
reacția de peroxidare a lipidelor.Odată trecute prin acest proces,lipidele peroxidate pot avea și
ele efect mutagen.Acesta este practic un efect mutagen indirect al ROS[77].
Pe lângă aceste mecanisme prin care ROS sunt implicate în oncogeneză mai există
implicări ale stresului oxidativ și în etapa terapeutică.Radioterapia poate să fie de asemenea
un mecanism de creștere a producției de specii reactive ale oxigenului la nivel celular[71,72].
S-a constatat că în timpul radioterapiei atât celulele iradiate cât și cele neiradiate suferă
modificări genetice.Printre mecanismele implicate în această patogenie se numără și stresul
oxidativ.Producerea stresului oxidativ secundar tratamentului cancerului prin radioterapie
reprezintă un mecanism cu toxicitate crescută.De aceea,practic scăderea nivelului speciilor
libere ale oxigenului indusă de radioterapie ar putea să fie o metodă de protecție împotriva
efectelor secundare ale radioterapiei[70,71].
Chimioterapia are în general ca efect o creștere a stresului oxidativ cu scopul de a
crește citotoxicitatea.Asocierea dintre chimioterapie și radioterapie poate genera stres oxidativ
în cantități mai mari decât necesar ,ceea ce ar induce leziuni secundare nedorite[72].
Având în vedere toate acestea,evoluția stresului oxidativ înainte și după terapia
combinată radioterapie și chimioterapie la pacienții luați în studiu reprezintă un rezultat
favorabil prin reducerea semnificativă a statusului oxidativ total[74].
Având în vedere că în stresul oxidativ efectul final este dependent de balanța dintre
speciile reactive ale oxigenului și mecanismele antioxidante în cadrul studiului nostru am
evaluat pe lângă statusul oxidativ total și răspunsul antioxidativ total(TAR).În ceea ce privește
efectul răspunsului antioxidativ total în legătură cu cancerul s-a constatat că multe dintre
efectele biologice ale antioxidanților nu sunt legate doar de capacitățile de neutralizare ale
radicalilor liberi,ci sunt determinate de capacitatea antioxidanților de a modula căi de
semnalizare intracelulară[77].
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
54
Cele mai importante mecanisme intracelulare modulate de către substanțele
antioxidante în cancer sunt:-reglarea ciclului celular
-inhibarea proliferării neoplazice
-inducerea apoptozei
-inhibarea dezvoltării tumorale și a angiogenezei
-inhibarea inflamației
-stimularea unor enzime de detoxifiere
-blocarea NF-kB[74]
Au fost efectuate studii în cadrul cărora a fost analizată specificitatea anumitor
molecule antioxidante.Astfel cercetările privind superoxid-dismutaza(SOD) au relevat faptul
că aceasta nu are acțiune directă,ci acționează indirect,prin reducerea speciilor reactive de
oxigen(ROS).Alte studii efectuate au evidențiat că antioxidanții cu mobilitate mică sunt însă
direct implicați[77].
Implicarea substanțelor cu efect antioxidant în cancer,deși inițial se considera a avea
un efect antitumoral,s-a constatat că poate să fie și protumorală.Deoarece speciile reactive ale
oxigenului în cantități mari determină apoptoza celulelor tumorale,reducerea ROS prin
administrarea excesivă de antioxidanți poate să stimuleze supraviețuirea celulelor lezate,care
au potențial de proliferare neoplazică.Astfel administrarea substanțelor antioxidante poate să
și stimuleze cancerogeneza,în loc să o blocheze[77].
Din toate acestea putem trage concluzia că antioxidanții pot să fie utili sau nocivi,în
funcție de mai mulți factori.Acești factori sunt concentrația în care se administrează
substanțele antioxidante,mediul în care are loc acțiunea lor și stadiul evolutiv al
cancerogenezei[74].
Din acest motiv am considerat foarte util și chiar necesar să determinăm și răspunsul
antioxidativ total(TAR) la pacienții incluși în studiu[74,77,79].
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
55
Faptul că în cadrul rezultatelor obținute la toți pacienții nu s-a înregistrat o modificare
semnificatică a răspunsului antioxidativ total după tratamentul combinat radioterapie și
chimioterapie,având în vedere că statusul oxidativ total a înregistrat o scădere remarcabilă
rezultatul obținut poate fi considerat unul favorabil[74].
În același timp acest rezultat ne permite să afirmăm că scăderea statusului oxidativ
total nu s-a realizat prin acțiunea de neutralizare a speciilor reactive ale oxigenului(ROS) de
către substanțele cu rol antioxidant[79].
Am considerat util să calculăm și valoarea indicelui de stres oxidativ(OSI) pentru lotul
general de studiu,precum și pentru subcategoriile în care au fost împărțiți pacienții în funcție
de sex și vâstă[80].
Scăderea indicelui de stres oxidativ după tratament la grupul total,precum și la
celelalte subgrupe în funcție de sex și vârstă confirmă faptul că stresul oxidativ(SO) s-a redus
semnificativ postterapeutic[80].
Având în vedere implicarea stresului oxidativ în patologie(inclusiv în fiziopatologia
cancerelor colorectale) acest rezultat reprezintă un element pozitiv în evoluția
postterapeutică[80].
O altă moleculă implicată prin intermediul stresului oxidativ,dar și prin acțiune directă
în patologia cancerului este și oxidul nitric.(NO).Rolul oxidului nitric în modificarea
supraviețuirii tumorale este o temă destul de controversată[23,32,25,73].
S-a constatat că efectul moleculei de oxid nitric depinde de:- concentrația acesteia
-localizare
-momentul secreției
-tipul celular
-statusul redox al celulei
Concluzia generală a fost însă că cele mai importante sunt modificările post-
translaționale induse de oxidul nitric și că oxidul nitric poate să fie un factor reglator atât în
cancerogeneză cât și în chimioterapia neoplaziilor[73].
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
56
Aceste date ne-au determinat să asociem la statusul oxidativ total(TOS) și răspunsul
antioxidativ total(TAR) evaluarea sintezei de oxid nitric prin dozarea nitriților și a nitraților
serici.
La pacienții incluși în studiu s-au înregistrat scăderi semnificative a sintezei de oxid
nitric.
În ceea ce privește distribuția pe sexe reducerea sintezei de oxid nitric s-a înregistrat
predominant la sexul masculin.Aceasta se poate atribui faptului că majoritatea cazurilor care
au participat la studiu erau pacienți de sex masculin[32].
Un alt aspect interesant a fost că la pacienții incluși în categoria de vârstă 40-50 de ani
s-a constatat o ușoară creștere a sintezei de oxid nitric,în timp ce la grupa între 60 și 70 de ani
s-a constatat scăderea sintezei de NO.
Aceste rezultate trebuie să le interpretăm cu precauție având în vedere numărul mic de
pacienți incluși în studiu.
Studiile referitore la implicarea oxidului nitric în cancer au relevat aspecte diferite.În
general concentrațiile crescute ale NO produse de expresia crescută a iNOS stimulează
apoptoza[32,34,73].
În cancerul colorectal s-a constatat un deficit de exprimare a iNOS,ceea ce produce o
reducere a apoptozei și prin aceasta favorizează proliferarea tumorală.Pe de altă parte s-a
observat că creșterea sintezei de oxid nitric în celulele endoteliului vascular promovează
angiogeneza,ceea ce ar stimula creșterea tumorală și metastazarea[23,25].
Un alt mecanism indirect prin care este stimulată angiogeneza tumorală este activarea
ciclooxigenazei prin acțiunea peroxinitriților formați în cadrul reacției dintre oxidul nitric și
speciile reactive libere ale oxigenului[73].
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
57
Alt aspect particular care a fost constatat în cancerul colorectal a fost faptul că la
pacienți diferiți există nivele diferite de sinteză a oxidului nitric.Acest fapt se datorează
polimorfismului iNOS(NOS inductibilă).Au fost identificate patru feluri de iNOS prezente la
pacienții cu cancer colorectal[23,25].
Aceste constatări pot explica parțial diferențele prezente la lotul luat în studiu,diferențe
legate de sex și respectiv de vârstă[23,25].
Unul din factorii de reglare ai expresiei iNOS este și hypoxia inucible factor-1(HIF-
1).De aceea,în perspectivă.analiza sintezei de oxid nitric în cancerul colorectal ar implica
identificarea atât la nivel tumoral cât și peritumoral al HIF-1,iNOS și COX[81].
O altă consecință a creșterii sintezei de oxid nitric în legătură cu cancerul colorectal
este reprezentat de către efectul pe care molecula de NO o are asupra metaloproteinazelor
matriceale.Aceste enzime au proprieatea de a distruge matricea celulară,prin aceasta
favorizând procesul de metastazare[82].
Având în vedere aceste mecanisme,scăderea sintezei de oxid nitric la pacienții aflați în
studiu reprezintă un alt motiv de apreciere pozitivă,deoarece scăderea nivelului de nitriți și
nitrați ar reduce și distrucția matricei celulare prin acțiunea metaloproteinazelor(MMP)[82].
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
58
Concluzii
Pe baza rezultatelor obținute în urma studiului și a datelor din literatură am
ajuns la următoarele concluzii:
1.Terapia combinată radioterapie și chimioterapie aplicată postchirurgical în cancerul
colorectal determină reducerea semnificativă a TOS(statusul oxidativ total),parametru
care cuantifică totalitatea moleculelor oxidate de către speciile reactive ale
oxigenului(ROS).
2.Reducere TOS(statusul oxidati total) nu a fost influențată de sexul sau de vârsta
pacienților.
3.Terapia combinată radioterapie și chimioterapie aplicată după tratamentul
chirurgical în cancerul colorectal nu a modificat semnificativ TAR (răspunsul
antioxidativ total),indiferent de sex sau grupă de vârstă.
4.Faptul că TAR (răspunsul antioxidativ total) nu s-a modificat semnificativ în urma
tratamentului indică faptul că scăderea TOS(statusul oxidativ total) nu s-a datorat
neutralizării ROS (speciilor reactive ale oxigenului )de către AO(antioxidanți).
5.Terapia combinată radioterapie și chimioterapie care a urmat tratamentului
chirurgical al cancerului colorectal a determinat o scădere semnificativă a sintezei de
.O(oxid nitric),ceea ce reprezintă o modificare favorabilă în contextul scăderii
TOS(statusul oxidativ total).
6.Diferențele legate de sex și grupe de vârstă în ceea ce privește sinteza de .O(oxid
nitric) constatată la pacienții din grupul de studiu ar putea să fie explicată parțial prin
existența polimorfismului i.OS.
Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale
59
7. În ansamblu,rezultatele obținute confirmă faptul că înțelegerea rolului stresului
oxidativ și al oxidului nitric la nivel molecular în cancerul colorectal are implicații
profunde în terapia anticanceroasă,contribuind la un diagnostic și tratament
patogenetic mai complex al acestuia.
Bibiliografie
60
Bibliografie
1.McPhee Stephen J, Papadakis Maxine A.,Tierney Lawrence M., Current Medical Diagnosis
& Treatment 2008, 2007 The McGraw-Hill Lange-oncology
2.Moasser Mark M.,in McPhee Stephen J., Ganong, William F., Pathophysiology of Disease:
An Introduction to Clinical Medicine, 5th Edition, 2006 McGraw-Hill, Neoplasia: 90-114.
3. Ciro M et al: Profiling cancer. Curr Opin Cell Biol 2003;15: 213.
4. DeVita VT et al: Cancer: Principles and Practice of Oncology, 6th ed. Lippincott Williams
& Wilkins, 2001.
5. Eng C et al: Genetic testing for cancer predisposition. Annu Rev Med 2001;52:371.
6. Hanash S: Integrated global profiling of cancer. Nat Rev Cancer 2004;4:638.
7. Mendelsohn J et al: The Molecular Basis of Cancer, 2nd ed. WB Saunders, 2001.
8. Peltomaki P: Deficient DNA mismatch repair: A common etiologic factor for colon cancer.
Hum Mol Genet 2001;10: 735.
9. Trosko J.E.,Ruch R.J., Gap junctions as targets for cancer chemoprevention and
chemotherapy, Curr. Drug Target. 3
(2002) 465–482.
10.Guyton K.Z., Kensler T.W., Oxidative mechanisms in carcinogenesis,
Br. Med. Bull. 49 (1993) 523–544.
11. Ames B.N.,Gold L.S., Too many rodent carcinogens — mitogenesis
increases mutagenesis, Science 249 (1990) 970–971.
12. Trush M.A., Kensler T.W., An overview of the relationship
between oxidative stress and chemical carcinogenesis, Free Rad.
Biol. Med. 10 (1991) 201–209.
13. Hengartner M.O., The biochemistry of apoptosis, Nature 407
(2000) 770–776.
14. Oren M., Decision making by p53: life, death and cancer, Cell Death Differ. 10 (2003)
431–442.
15. Trosko J.E., The role of stem cells and gap junctional intercellular
communication in carcinogenesis, J. Biochem. Mol. Biol.
Bibiliografie
61
36 (2003) 43–48.
16. Trosko J.E., Chang C.C., Madhukar B.V., Dupont E., Oncogenes,
tumor suppressor genes and intercellular communication
in the oncogeny as partially blocked ontogeny hypothesis, in:
O.H. Iversen (Ed.), New Frontiers in Cancer Causation, Taylor
& Francis, Washington, DC, 1993, pp. 181–197.
17. American Cancer Society. Estimated new cancer cases and deaths by sex for all sites,
United States, 2000 (table).. Accessed March 13, (2001).
18. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Edited by Johns Hopkins University and
developed for the World Wide Web by the National Center for Biotechnology Information
(NCBI), OMIM#137215.
19. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Edited by Johns Hopkins University and
developed for the World Wide Web by the National Center for Biotechnology Information
(NCBI), OMIM*192090.
20. FERRI FRED F. , 2008 Ferri's Clinical Advisor. Instant Diagnosis and Treatment, 2008
MOSBY ELSEVIER, SECTION I
21. Silbernagl Stefan, Lang Florian, Color Atlas of Pathophysiology,2000,14-16
22.Ghidirim Nicolae,Actualităţi în epidemiologia,etiopatogeneza,diagnosticul,tratamentul şi
profilaxia tumorilor maligne.Tratamentul complicaţiilor cancerului gastric.
23.Fransen K. ,Elander N. ,Soderkvist P. ,Nitric oxide synthase 2 (NOS2) promoter
polymorphisms in colorectal cancer , Cancer Letters 225 (2005) 99–103
24.Thomas Hundley R. ,Basil R. , Nitric Oxide-Donating Aspirin Inhibits Colon Cancer Cell
Growth via Mitogen-Activated Protein Kinase Activation , The Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics (2006) 316:25–34
25.Liu Q., Chan S.T.F. , Ratha M., Nitric oxide induces cyclooxygenase expression and
inhibits cell growth in colon cancer cell lines, Carcinogenesis (2003) vol.24 no.4 pp.637±642
Bibiliografie
62
26.Whitlock E.P., Lin J.S., Liles E., Beil T.L., Fu R. , Screening for Colorectal Cancer: A
Targeted, Updated Systematic Review for the U.S. Preventive Services Task Force, Ann
Intern Med. (2008) ;149:638-658.
27.Hoensch H., Groh B., Edler L., Kirch W., Prospective cohort comparison of flavonoid
treatment in patients with resected colorectal cancer to prevent recurrence, World J
Gastroenterol (2008); 14(14): 2187-2193
28.Abdulkareem F.B., Abudu E.K., Awolola N.A., Elesha S.O.,Rotimi O., Akinde O.R.,
Atoyebi A.O., Adesanya A.A., Daramola A.O., Banjo A.A.F., Anunobi C.C., Colorectal
carcinoma in Lagos and Sagamu, Southwest Nigeria: A histopathological review, World J
Gastroenterol (2008); 14(42): 6531-6535
29.Malila N., Oivanen T., Malminiemi O., Hakama M., Test, episode, and programme
sensitivities of screening for colorectal cancer as a public health policy in Finland:
experimental design, BMJ (2008);337:2261
30.Merlin F., Prochilo T., Tondulli L., Kildani B., Beretta G.D. , Colorectal cancer treatment
in elderly patients: an update on recent clinical studies, Clinical Colorectal Cancer (2008),
Vol. 7, No. 6, 357-363
31.Smith R.A., Cokkinides V., Brawley O.W., Cancer screening in the United States, 2009: a
review of current american cancer society guidelines and issues in cancer screening, CA
CANCER J CLIN (2009);59:27-41
32.Cianchi F., Cortesini C., Fantappie` O., Messerini L., Schiavone N., Vannacci A., Nistri
S., Sardi I., Baroni G., Marzocca C., Perna F., Mazzanti R., Bechi P.,Masini E., Inducible
Nitric Oxide Synthase Expression in Human Colorectal Cancer - Correlation with Tumor
Angiogenesis , American Journal of Pathology, (2003) Vol. 162, No. 3, 793-801
33.Fortes R.C., Recôva V.L., Melo A.L., Novaes M.R.C.G. , Effects of dietary
supplementation with medicinal fungus in fasting glycemia levels of patients with colorectal
cancer: a randomized,double-blind, placebo-controlled clinical study, Nutr Hosp.(
2008);23(6):591-598
Bibiliografie
63
34.Xu W., Liu L.Z, Loizidou M., Ahmed M., Charles I.G., The role of nitric oxide in cancer,
Cell Research (2002); 12(5-6):311-322
35.Nazarewicz R.R.,Zenebe W.J, A. Parihar, S.K. Larson, E. Alidema, J. Choi, P.Ghafourifar,
Tamoxifen induces oxidative stress and mitochondrial apoptosis
via stimulating mitochondrial nitric oxide synthase, Cancer Res. 67 (2007)
1282–1290.
36.Lin S, Fagan K.A, Li K.X, Shaul P.W., Cooper D.M, Rodman D.M, Sustained endothelial
nitric-oxide synthase activation requires capacitative Ca2+ entry. J Biol Chem.2000;275(24):
17979-17985.
37. Van Faassen, E. E.; Vanin, A. F. (eds); ‘Radicals for life: The various forms of Nitric
Oxide.’ Elsevier, Amsterdam 2007.
38. Raines K.W, Cao G.L, Porsuphatana S, Tsai P, Rosen G.M, Shapiro P. Nitric Oxide
inhibition of ERK1/2 activity in cells expressing neuronal nitric-oxide synthase. J Biol Chem.
2004; 279,3933-3940.
39. Miljkovic D, Trajkovic V. Inductible nitric oxide synthase activation by interleukin-17.
Cytokine Growth Factor Rev. 2004;15(1):21-32.
40. Hsieh J.S, Wang J.Y, Lin S.R, et al. overexpression of inductible nitric oxide synzhase in
gastric mucosa of rats with portal hypertension: correlation with gastric mucosal damage. J.
Surg Res. 2003; 115, 24-32.
41. Alderton W.K., Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure, function and
inhibition. Biochem J. 2001 Aud 1; 357(Pt3): 593-615.
42. Zokomori H, Oda M, Ogi M, Kamegaya Y, Tsukda N, Ishii H. Endothelial nitric oxide
synthase and caveolin-1 are co-localized in sinusoidal endothelial fenestrae. Live. 2001 Jun;
21; 198-206.
43.Gong L, Pitari G.M, Schultz S, Waldman S.A. Nitric oxide signaling: systems integration
of oxygen balance in defense of cell integrity. Curr Opin Hematol. 2004; 7-14.
44. Abu-Soud H.M, Hazen S.L. Nitric oxide is a physiological substrate for mammalian
peroxidases. J Bio Chem. 2000;275(48): 37524-37532
45. Schor K, Woditsch I, Strobach H, Schroder H. Interaction between nitric oxide and
prostacyclin in myocardial ischemia and endothelial cell cultures. Basic Res Cardiol. 1991;
86(Suppl 2); 117-25.
46. Stamler J.S., Singel DJ, Loscalzo J, Biochemistry of nitric oxide and its redox-activated
forms. Science. 1992;258: 1898-902.
Bibiliografie
64
47. Taylor BS, Alarcon LH, Billiar TR. Inductible nitric oxide syntase in the liver: regulation
and function. Biochemistry (Mosc) 1998 Jul; 63(7): 766-81.
48. Tottrup A, Glavind EB, Svane D. Involvment of the L-arginine-nitric oxide pathway in
internal anal sphincter relaxation. Gastroenterolgy. 1992; 102: 409-15.
49. Rajfer J, Aronson WJ, Bush PA, Dorey FJ, Ignarro LJ. Nitric oxide as a mediator of
relaxation of the corpus cavernosum in response to nonadrenergic, noncholinergic
neurotranmission. N Engl J Med. 1992;326:90-4.
50. Dawson TM, Dawson VL, Snyder SH. A novel neuronal messenger molecule in brain: the
free radical, nitric oxide. Ann Neurol. 1992;85:2284-90.
51. Busse R, Mulsch A. Calmodulin-dependent nitric oxide sythesis in endothelial cytosol is
mediated bz calmodulin. FEBS Lett. 1990; 265:133-6.
52. Benyo Z, Kiss J, Syabo C, Csaki C, Kovach AG. Importace of basal nitric oxide synthesis
in regulation of myocardial blood flow. Cardiovas Res. 1991;25:700-3.
59.Jenkins D.C.,Charles I.G.,Thomsen L.L., Moss D.W., Holmes L.S., Baylis S.A., P.
Rhodes, K. Westmore, P.C. Emson, S. Moncada, Roles of nitric oxide in tumor growth, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 4392–4396
60.Schonhoff C.M., Matsuoka M.,Tummala H., M.A. Johnson, A.G. Estevez, R. Wu, A.
Kamaid, K.C. Ricart, Y. Hashimoto, B. Gaston, T.L. Macdonald, Z. Xu, J.B. Mannick, S-
nitrosothiol depletion in amyotrophic lateral sclerosis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006)
2404–2409.
61.Wiseman H,Halliwell B., Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen
species: role in inflammatory disease and progression to cancer, Biochem. J.
313 (Pt 1) (1996) 17–29.
62. Handy D.E.,Loscalzo J., Nitric oxide and posttranslational modification of the vascular
proteome: S-nitrosation of reactive thiols, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26 (2006) 1207–
1214.
63.Jeannin J.-F.,Leon L., Cortier M., Sassi N.i, C. Paul,Bettaieb A., Nitric oxide induced-
resistance or sensitization to death in tumor cells, Nitric oxide 19 (2008) 158–163.
64. KRISHNA MT, CHAUHAN AJ, FREW AJ, HOLGATE ST. Toxicological mechanisms
underlying oxidant pollutant-induced airway injury. Rev Environ Health 1998; 13: 59-71.
65. LEE WL, DOWNEY GP. Neutrophil activation and acute lung injury. Curr Opin Crit
Care 2001; 7: 1-7.
Bibiliografie
65
66.Shigenaga M.K.,Gimeno C.J.,Ames B.N.,Urinary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine as a
biological marker of in vivo oxidative DNA damage, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (1989)
9697–9701.
67.Halliwell B.,Gutteridge J.M.C., Free Radicals in Biology and Medicine, 3rd ed., Oxford
University Press, 1999.
68.Miranda KM, Espey MG, Wink DA. A rapid, simple spectrophotometric method for
simultaneous detection of nitrate and nitrite. Nitric Oxide. 2001 Feb;5(1):62-71.
69.Asghar Muhammad Nadeem (2009) Oxidative Stress Status Evaluation at Chemical and
Biochemical Levels using Novel/Improved and Contemporary Methods. PhD thesis, Govt.
College University, Lahore.
70.Azzam E.I.,de Toledo S.M.,Little J.B., “Stress Signaling from Irradiated to Non-Irradiated
Cells”, Current Cancer Drug Targets, 2004, 4, 53-64
71.AzzamE.I.,Little J.B., “The radiation-induced bystander effect:evidence and significance”,
Human & Experimental Toxicology (2004) 23: 61-/65
72.Azzam E.I.,de Toledo S.M.,Little J.B., “Oxidative metabolism, gap junctions and the
ionizing radiation-induced bystander effect”, Oncogene (2003) 22, 7050–7057,
73.Leon L.,Jeannin J. F.,Bettaieb A.,“Post-translational modifications induced by nitric oxide
(NO): Implication in cancer cells apoptosis”, Nitric Oxide 19 (2008) 77–83,
74.Valko .M.,Rhodes C.J.,Moncola J.,Izakovic M.,Mazura M., “Free radicals, metals and
antioxidants in oxidative stress-induced cancer”, Chemico-Biological Interactions 160 (2006)
1-40,
76.de Toledo S. M.,Azzam E.I., “Adaptative and bystander responses in human and rodent
cell cultures exposed to low level ionizing radiation: the impact of linear energy transfer.”,
Dose-Response, 4(4):291–301, 2006,
77.Valko M.,Leibfritz D.,Moncola J.,Cronin M.T.D.,Mazura M., Telser J.,”Free radicals and
antioxidants in normal physiological functions and human disease”, The International Journal
of Biochemistry & Cell Biology 39 (2007) 44–84
Bibiliografie
66
78.Heller A, “Apoptosis-Inducing High CNO Concentrations Are Not Sustained Either in
Nascent or in Developed Cancers”, ChemMedChem 2008,3,1493 – 1499
79.Palmieri B.,Sblendorio V.,”Oxidative stress detection: what for?”, Eur Rev Med Pharmacol
Sci 2006; 10 (6): 291-317
80.Hamra M.,Harma Me.,Ozcan E.,”Increased oxidative stress in patients with hydatiform
mole”, Swiss Med Wkly 2003; 13 3: 563 –566
81.Yu X.J.,Cui L.,Zhang Q.,Cheng H.,Ji P.,”Expression of NOS and HIF-1 in human
colorectal carcinoma and implication in tumor angiogenesis”,World J Gastroenterol 2006
August 7;12(29):4660-4664
82.Yu B.,Dong X.S.,Sun W.,Yang Y,”Effect of a nitric oxide synthase inhibitor NG-nitro-L-
arginine methyl ester on invasion of human colorectal cell line SL-174-T”, World J
Gastroenterol 2005;11(40):6385-6388