lietuvos miŠkŲ institutas darius danusevičius 3.3 kiekybinių požymių lokusų (qtl)...

LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTASDarius Danusevičius

3.33.3 Kiekybinių požymių Kiekybinių požymių lokusų (QTL) identifikavimaslokusų (QTL) identifikavimas

3.3.1 Įvadas.

3.3.2 QTL nustatymo populiacijos sukūrimas ir fenotipiniai požymiai.

3.3.3 QTL paieškos molekulinių žymenų sistemos.

3.3.4 QTL nustatymo statistiniai metodai.

3.3.5 QTL testavimas.

3.3.6 Miško medžių QTL tyrimų apibendrinimas.

3.3.7 Kandidatinių genų paieška.

3.3.8 QTL naudojimas selekcijoje.


3.3.3.3.11 ĮvadasĮvadas

• Kiekybinių požymių lokusai (ang. quantitative trait loci (QTL))- tai vietos chromosomose, kuriose yra genai, sąlygojantys kiekybinius požymius. QTL vietas žymi molekuliniai žymenys.

• Molekuliniai žymenys tai nedidelės DNR molekulės, kurių nukleotidų sekos atitinka nukleotidų sekas, esančias geno sudėtyje ar netoli ir paveldimos vienoje sukibimo grupėje.

• Individų atranka, panaudojant informaciją apie genetinius žymenų sąsajas su genais, vadinama atranka žymenų pagalba (angl. MAS: marker asssisted selection)

QTL geno vieta chromosomoje

Žymuo, susijęs su QTL




Molekulinio žymens samprataMolekulinio žymens samprataMolekuliniai žymenys nustatomi specialiais DNR sukarpymo, specifinių sekų pagausimo, iRNR klonavimo metodais, kurių rezultatas specifiniai DNR fragmentai elektroforezės gelyje





Genų sąlygojančių požymį buvimas nustatomas pagal fenotipinio požymio buvimą

(pvz. ankstyva augimo pradžia)

A

BC

A B CSu požymiais galimai susijęs žymuo nustatomas pagal

specifinius DNR fragmentus elektroforezės gelyje

Lauko bandymasLaboratorinių DNR tyrimų rezultatas:

elektroforezės gelis

DNR pavydžiai


QTL samprataQTL samprata• Dauguma ekonomiškai svarbių požymių yra

sąlygojami daugelio genų (poligenų).• Šie genai vadinami kiekybiniais, nes kiekvieno geno

įtaką galima išreikšti skaitine verte (kiekybe). • Kiekybinių genų vietos chromosomose vadinamos

lokusais (kiekybinių požymių lokusai- QTL).• Tarp jų yra genai turintys didesnę įtaką požymiui

(pagrindiniai genai).• Galima surasti molekulinius žymenis susėjusius su

pagrindiniais genais ir naudoti kaip pagalbinę priemonė atrenkant individus (atranka žymenų pagalba (MAS)).

Kiekybinį požymį sąlygojantys stipresnės įtakos genai, kurių vietos chromosomose vadinamos kiekybinio požymio lokusais (ang. trumpinys- QTL).

20% 50% 15% 5% 5% 5%

Žymuo QTL2QTL1 QTL3


QTL paieškos prielaidosQTL paieškos prielaidos

•Jeigu visi požymį įtakuojantys genai turėtų vienodą įtaką, būtu sunku juos visus atskirai identifikuoti ir naudoti selekcijoje.

•Kai kurie genai turi didesnę įtaką ar įtakuoja kitų genų veiklą (vadinami kiekybinio požymio lokusais).

•Tikslas rasti žymenis susijusias su šiais genais, galutinis tikslas- rasti pačius genus.

•QTL požymis sąlygojamas keliolikos genų= žymens svarba priklausys nuo susijusio geno įtakos

•Priklausomai nuo QTL, žymenys gali turėti skirtingą įtaką požymio kintamumui

20%

50%

15%

5%

5%

5%

ŽymuoM

QTL1

Požy

mis

kontr

oliu

oja

mi eilė

s genų,

kuri

ų įta

ka išr

eik

šta p

roce

nta

is

(pavyzd

žiui ku

o d

idesn

is p

roce

nta

s tu

o d

augia

u m

edie

nos)

QTL2

ŽymuoN


Žymenų ir QTL sąsajos nustatymo Žymenų ir QTL sąsajos nustatymo komponentaikomponentai

1. Polimorfinė populiacija ir požymis (daug skirtingų tikslinio geno formų) ir bent vienas iš tėvų heterozigotinis.

2. Tinkama žymenų sistema tikslinio požymio QTL paieškai.3. Kryžminimai (ar bus žymenys atskirti nuo genų per

rekombinaciją?).4. Palikuonys = QTL nustatymo populiacija (požymių (QTL

buvimo) ir žymenų sąsajos įvertimas).5. Žymens ir QTL sąsajos įvertinimo statistiniai metodai

Statistiniai metodai: požymio ir žymens sąsajai

nustatyti

Daug alternatyvių geno formų

M

G

m

g

Polimorfinė populiacija

Kryžminimas

Palikuonys


Žymenų ir QTL sąsajos nustatymo Žymenų ir QTL sąsajos nustatymo principas (1)principas (1)

QTL nustatomi įvertinant sąsajas tarp molekulinių žymenų ir tikslinių požymių prieš ir po rekombinacijos (tėvai kryžminimai palikuonys).Tikrinama ar rekombinacija atskyrė fenotipinį požymį ir molekulinį žymenį

Lytinės ląstelės

žiedadulkėse

Hipotezė: netiesioginis žymuo M susijęs su teigiamu genu (G), žymuo m susijęs su neigiamu genu (g)

Hipotezė: netiesioginis žymuo M susijęs su teigiamu genu (G), žymuo m susijęs su neigiamu genu (g)

5 nerekombinantiniai

genotipai (QTL ir žymuo vienoje

sukibimo grupėje)

3 rekombinantiniai genotipai (38 %) (QTL ir žymuo

nesusieją nes buvo atskirti)

Principas: kuo silpniau žymuo susiejąs su genu, tuo toliau yra jų lokusai chromosomoje, tuo dažniau juos atskiria rekombinacija

Principas: kuo silpniau žymuo susiejąs su genu, tuo toliau yra jų lokusai chromosomoje, tuo dažniau juos atskiria rekombinacija

Rekombinacija: lytinų ląstelių formavimo metu iš tėvo ir motinos gautos porinės

chromosomos pasikečia dalimis. Galimi 4 genotipai: M-G; M-g; m-

G; m-g

Rekombinacija: lytinų ląstelių formavimo metu iš tėvo ir motinos gautos porinės

chromosomos pasikečia dalimis. Galimi 4 genotipai: M-G; M-g; m-

G; m-g

Porinės chromosomos

M

G

m

g M

G

m

g

m

g

m

g

m

g

m

g

m

g

m

g

m

g

m

g

m

g

m

g

m

G

m

G

m

G

m

G

m

G

m

G

Žymuo

Genas

Pakankamo dydžio ir polimorfizmo tėvinė

populiacija

Įvertinimas, statistiniai metodai

Kryžminimas


Žymenų ir genų sąsajos Žymenų ir genų sąsajos nustatymo principas (2)nustatymo principas (2)

Atlikti kryžminimai: teigiamą požymį (geną G) ir jo žymenį M) turintis individas (vėlyva sezoninio augimo pradžia ir tiesus) kryžminamas su šio geno neturinčiu individu (ankstyva augimo pradžia ir kreivas, daugiastiebis).Palikuonyse nustatyta, kurie iš jų turėjo žymenį (M ar m) ir geną G ir g (pagal požymio išraišką fenotipe).Rekombinacijos dažnis tik 15%. Žymens M patikimumas- 85 %

Hipotezė: netiesioginis žymuo M susijęs su teigiamu genu (G), žymuo m susijęs su neigiamu genu (g)Hipotezė: netiesioginis žymuo M susijęs su teigiamu genu (G), žymuo m susijęs su neigiamu genu (g)

M

G

m

g

Žymuo

Genas

m

g

m

g

M

G

m

g

m

g

m

g

M

g

m

g

m

G

m

g

Tėvai

Paliku

on

ys

Rekombinacija

85 % 15 %

KryžminimasTėvas Motina

Anksti ir vėlai sezoninį augimą pradedantys p. eglės genotipai Baltijos regiono eglės populiacijų bandyme


3.3.2 3.3.2 QTL nustatymo populiacijos QTL nustatymo populiacijos sukūrimas ir fenotipiniai požymiaisukūrimas ir fenotipiniai požymiai

1. Tėvų parinkimas: turintys norimus genus, kurie identifikuojami pagal fenotipinio požymio išraišką; požymis turi būti paveldimas)

Molekulinių žymenų sistema, galinti identifikuoti DNR fragmentus susijusius su tikslinais genais

2. Kryžmindamas= testas ar rekombinacija nutrauks žymens ir geno sąsają?

Pavyzdžiui, ankstyvą augimą

sąlygojančius genus bus

galima identifikuoti

pagal pumpurų sprogimo laiką

3. Palikuonys = QTL nustatymo populiacija: palikuonių įvertinimas tikslu nustatyti kiek palikuonių turėjo ir fenotipinį požymį ir molekulinį žymenį = sąsajos stiprumas (nuo 100-200 medelių)Kiekviename etape medžiaga ir metodai parenkami taip kad maksimaliai

palengvintų tikslo įgyvendinimą

DNR sukarpymas į fragmentus. Išskiriama DNR ir sukarpoma į įvairaus dydžio fragmentus restriktazių pagalba.

DNR+ restriktazė

DNR fragmentai

Elektroforezė. Veikiant elektrai DNR fragmentai juda skirtingu greičiu=

DNR fragmentų atskyrimas

1 2 DNR perkėlimas. Veikiant kapiliarinėms jėgoms šarminis skystis kyla

aukštyn; DNR fragmentai išsivynioja ir pereina iš gelio į spec. membraną

3

Hibridizacija. Membrana su DNR panardinama skystyje su radioaktyviais

DNR markeriais, kurie prisijungia tik prie tam tikrų DNR fragmentų.

4 Perkėlimas į fotopopierių. Fotopopierius uždedamas ant membranos su DNR. Radioaktyvūs žymenis palieka DNR

fragmentų grupių žymes.

5

Nuplauti neapisijungusius žymenis

Foto popierius

Membrana su DNR fragmentais

DNR markeriai maišelyje

Spec. membrana

Servetėlės traukai

Gelis

Kempinė

Šarminis skystis

DNR sukarpymas į fragmentus. Išskiriama DNR ir sukarpoma į įvairaus dydžio fragmentus restriktazių pagalba.

DNR+ restriktazė

DNR fragmentai

Elektroforezė. Veikiant elektrai DNR fragmentai juda skirtingu greičiu=

DNR fragmentų atskyrimas

1 2 DNR perkėlimas. Veikiant kapiliarinėms jėgoms šarminis skystis kyla

aukštyn; DNR fragmentai išsivynioja ir pereina iš gelio į spec. membraną

3

Hibridizacija. Membrana su DNR panardinama skystyje su radioaktyviais

DNR markeriais, kurie prisijungia tik prie tam tikrų DNR fragmentų.

4 Perkėlimas į fotopopierių. Fotopopierius uždedamas ant membranos su DNR. Radioaktyvūs žymenis palieka DNR

fragmentų grupių žymes.

5

Nuplauti neapisijungusius žymenis

Foto popierius

Membrana su DNR fragmentais

DNR markeriai maišelyje

Spec. membrana

Servetėlės traukai

Gelis

Kempinė

Šarminis skystis

Populiacijos sukūrimo principasPopuliacijos sukūrimo principas


Tėvinės porosTėvinės porosTėvinių porų parinkimo problema: kaip parinkti heterozigotines poras (bent vieną iš tėvų)?

Nuo to priklauso QTL nustatymui reikalingos populiacijos sukūrimo metodai Heterozigotinis individas turi skirtingas požymį sąlygojančio geno formas, vadinamas aleliais (polimorfinis genas)

G

M

G

M

Nors žymuo M ir genas G buvo

skirtingose sukibimo grupėse

(nesusiję), jie bus aptikti kartu

palikuonyse

g

m

G

M

g

m

G

M

Hete

rozig

oti

ni

s

Žymuo M ir genas G nesusiję: išreikštas genas G neturės

žymens M

Rekombinacija tarp porinių chromosomų lytinėje ląstelėje

Homozigotos atveju sunku nustatyti ar rekombinaciją tarp žymens (M) ir geno (G), nes M ir G vienodi abejose chromosomose (įvykus rekombinacijai tarp M ir G vienoje chromosomoje, žymuo M ar genas G patektų iš kitos chromosomos)

Po rekombinacijo

s

G

M

G

MH

om

ozig

oti

nis Žymuo


QTL populiacijos sukūrimas (1)QTL populiacijos sukūrimas (1)Klasikinis modelis: tikslas sukurti heterozigotas 2-oje kartoje (prielaida: M1 susijęs su Q1 (aukštas), o M2 su Q2 (žemas)

Aukštas Žema

1 karta

2 karta

3 karta

ŽymuoAukščio QTL

Tarpinis

3 karta= “QTL paieškos populiacija”: lyginamos tokios sąsajos M1-Q1, M2-Q2, pvz. ar yra skirtumai tarp M1M1 ir M1M2 genotipų vidutinio aukščio? PROBLEMA su miško medžiais: savidulka ar giminių kryžminimai = mažai gyvybingi palikuonys

Genotipas 1 Genotipas 2 Genotipas 3

Parenkami kontrastingų požymių tėvai

Parenkami tarpinio aukščio tėvai, kurie yra heterozigotiniai

Jei neįvyko rekombinacija tarp M ir Q, galimos 3 genotipų kombinacijos

Ar aukšti ?

Ar tarpiniai ?

Ar žemi ?

Bandoma ar genotipai atitinka fenotipus: pvz. ar palikuonys tik su M1 žymeniu tikrai aukščiausi.

Savidulka

Bus reikalingi kodominantiniai žymenys nes reikės atskirti heterozigotinius palikuonis

Galimas ir atgalinis kryžminimas su vienu iš tėvų (tik vienas iš tėvų bus heterozingotinis, todėl bus galima nustatyti tik vieno iš alelių sąsają su QTL, todėl dominantiniai žymenys būtų pakankami

M1M1

Q1Q1

M1M1

Q1

M1M1M1

Q1Q1Q1Q1

M2M2

Q2Q2

M2M2

Q2

M2M2M2

Q2Q2Q2Q2

M2M1

Q2Q1

M2M1

Q2

M2M2M1

Q2Q2Q1Q1

M2M1

Q2Q1

M2M1

Q2

M2M2M1

Q2Q2Q1Q1

M2M2

Q2Q2

M2M2

Q2

M2M2M2

Q2Q2Q2Q2

M1M1

Q1Q1

M1M1

Q1

M1M1M1

Q1Q1Q1Q1


QTL populiacijos sukūrimas (2)QTL populiacijos sukūrimas (2)Trijų kartų modelis: tikslas sukurti heterozigotas 2-oje kartoje. Minusas – reikia 3-jų kartų (nemažos laiko sąnaudos) . Išeitis panaudoti selekcines populiacijas su jau atliktais kryžminimais.

Tėvas: aukštas Motina: žema1 karta

2 karta

3 karta

M1M1

Q1Q1

M2M2

Q2Q2

Motina: žema

M3M3

Q3Q3

M4M4

Q4Q4

Žymuo

Aukščio QTL

Tėvas: aukštas

3 karta= QTL populiacija: lyginamos tokios sąsajos M1-Q1, M2-Q2, M3-Q3, M4-Q4, pvz. ar yra skirtumai tarp M1M3 ir M1M4 genotipų vidutinio aukščio?

Genotipas 1 Genotipas 2 Genotipas 3 Genotipas 4

Parenkami kontrastingų požymių tėvai

Parenkami tarpinio aukščio tėvai, kurie yra heterozigotiniai

Jei neįvyko rekombinacija tarp M ir Q, galimos 4 genotipų kombinacijos

M2M1

Q2Q1

M4M3

Q4Q3

Tėvas: tarpinis Motina: tarpinė

M3M1

Q3Q1

M4M1

Q4Q1

M3M2

Q3Q2

M4M2

Q4Q2

Ar Aukšti ? Ar Tarpiniai ?

Ar Tarpiniai ?

Ar Žemi ?Bandoma ar genotipai atitinka fenotipus


QTL populiacijos sukūrimas (3)QTL populiacijos sukūrimas (3)

Dviejų kartų modelis (1): tikslas parinkti genetiškai tolimas tėvines poras, tikintis, kad bent viena jų bus heterozigotinė (aukštos medžių genetinės įvairovės panaudojimas; galimi rūšių hibridai).

1 karta

2 karta= QTL populiacija: tinka dominantiniams žymenims; lyginamos tokios sąsajos pvz. M1 su Q1 (tėvas) ir pvz. M3 su Q3 (motina).

2 karta

M4M3

Q4Q3

Motina: tarpinė

M3M2

Q3Q2

M4M2

Q4Q2

Genotipas 3 Genotipas 4

Parenkami ženkliai skirtingos kilmės tarpinio aukščio tėvai, tikėtina- heterozigotiniai

Jei neįvyko rekombinacija, galimos 4 genotipų kombinacijos, tačiau žymenys identifikuos tik M1 ir M3 genotipus: bus lyginami tik 2-jų grupių fenotipai = nukentės tikslumas

Fenotipai: aukšti+ tarpiniai =aukštesni

Tarpiniai + Žemi=žemesni

Kontroliniai heterozigotiškumo tyrimai

Problema – galimybė, kad tėvai homozigotiniai; sprendimas – kontroliniai kelių kandidatinių tėvinių porų palikuonių heterozigotiškumo tyrimai.

M2M1

Q2Q1

Tėvas: tarpinis

Lyginami

M3M1

Q3Q1

M4M1

Q4Q1


-žemas-žemasaukštas-

aukštas-


QTL populiacijos sukūrimas (4)QTL populiacijos sukūrimas (4)Dviejų kartų modelis (2 pusiau sibai): tikslas parinkti potencialiai heterozigotinį motinmedį ir naudoti laisvo apsidulkinimo sėklas. Vienodai tinka dominantiniams ir kodominantiniams žymenims.

1 karta

2 karta= QTL populiacija: lyginamos tokios sąsajos pvz. M3 su Q3 ir pvz. M4 su Q4.

2 karta

M4M3

Q4Q3

Motina: tarpinė

Parenkami heterozigotiniai motinmedžiai (tėvas laisvo apdulkinimo)

Jei neįvyko rekombinacija, galimos 2 genotipų kombinacijos; žymenys identifikuos tik M1 ir M3 genotipus: bus lyginami tik 2-jų grupių fenotipai

Aukštesni Žemesni

Kontroliniai heterozigotiškumo tyrimai

Problema – galimybė, kad tėvai homozigotiniai; sprendimas – kontroliniai kelių kandidatinių tėvinių porų palikuonių heterozigotiškumo tyrimai.

xx

XX

Tėvas: žiedadulkių mišinys

M3x

Q3X

M4x

Q4X



Tiksliniai fenotipiniai požymiai (1)Tiksliniai fenotipiniai požymiai (1)

QTL nustatymo efektyvumas didžia dalimi priklauso nuo fenotipinio požymio.

Kriterijai:

•Genų sąlygotumo kompleksiškumas (vienos ir kelių grupės susijusių genų) ir QTL nustatymo lengvumas.

•Ekonominė vertė (QTL nustatymas duotų taikomąją naudą).

•QTL analizės tikslas – nustatyti kiek genų kontroliuoja požymį ir koks jų santykinis efektas (įtaka požymiui).

Tinkamiausias požymis: sąlygojamas nedidelio genų skaičiaus; genų įtaka- nuo vidutinės iki stiprios; stipriai paveldimas (ribota aplinkos sąlygų įtaka)


Tiksliniai fenotipiniai požymiai (2)Tiksliniai fenotipiniai požymiai (2)Tikslinės miško medžių fenotipinių požymių grupės:

•Adaptaciniai požymiai (pvz. fenologija: ramybės būsena, sezoninio augimo pradžia ir pabaiga, ūglių medėjimas).

•Reprodukciniai požymiai (pvz. lytinė brada ir asimetrija, žydėjimo gausumas, vegetatyvinis dauginimas).

•Medienos kokybė (pvz. bazinis tankis, cheminės savybės, mikrofibrilių kampas).

•Atsparumas kenkėjams (galima panaudoti gausią ž.ū. kultūrų patirtį).

Tokie požymiai kaip medžių aukštis ar produktyvumas yra kompleksiniai (keliolikos požymių grupių sąveikos išraiška), todėl efektyviau pradžioje nustatyti šių pirminių požymių QTL.


Miško medžių QTL medžiaga (1)Miško medžių QTL medžiaga (1)Tam, kad gauti heterozigotinius individus QTL tyrimams galima

naudoti:

1) Skritingų populiacijų palikuonis. Du tolimos kilmės ir skirtingų adaptacinių požymių genotipų adaptacinių požymių lokusai bus polimorfiniai (skirtingi tam tikro geno aleliai), o dauguma jų palikuonių – heterozigotiniai.

2) Rūšių hibridai. Du artimų rūšių individai yra genetiškai skirtingi daugumoje lokusų, todėl jų palikuonys bus heterozigotiniai. Tikslinga naudoti stipriai tam tikroje rūšyje išreikštų požymių QTL identifikacijai (pvz. “pendula” genas Picea abies porūšyje ar Pinus contorta atsparumas šalčiui).

P. sylvestris populiacijų bandymas Lietuvoje. Stulpeliai parodo populiacijų kilmės vietas

Egzotinių pušų bandymas- P. sylvestris dešinėje, Pinus contorta kairėje


Miško medžių QTL medžiaga (2)Miško medžių QTL medžiaga (2)

Pinus sylvestris tolimų populiacijų bandymas (kilmės vietos pažymėtu stulpeliais, kurie

parodo šių populiacijų produktyvumą-

aukščiau brūkšnio pranašesni už

vietines.

Populiacijų bandymai. Tai želdiniai skirti populiacijų genetinės įvairovės, požymių genetinio kintamumo, paveldėjimo laipsnio ir perkėlimo naudos tyrimui. Populiacijų atstovai tolygiai išdėstyti bandymo plote (sumišrinti), kad specifinių dirvos sąlygų įtaka jų augimui būtų kuo mažesnė. 4 raudoni tam tikros

grupės individai auga beveik visose dirvos sąlygose, todėl jų grupės vidutinės požymiu reikšmės nebus stipriai iškraipytas dirvos sąlygų skirtumų.

Bandymo įveisimas: medeliai išdėstomi

eilėse pagal spec.

mišrinimo schemą

P. eglės populiacijų bandymas


Miško medžių QTL medžiaga (3)Miško medžių QTL medžiaga (3)Eglės populiacijų perkėlimo bandymas Lietuvoje. Populiacijų kilmės vietos pažymėtos taškais. Rezultatai: genotipai ženkliai skyrėsi savo adaptaciniais požymiais, priklausomai nuo kilmės vietos temperatūros ir fotoperiodo.

Adaptacinių požymių QTL paieškoje, kryžminti šiaurinį ir pietinį genotipus.

Palikuonyse dominuotų heterozigotiniai lokusai

Taškai žymi kilmės vietas. Didesni taškai= ankstesnė sezoninio augimo pradžia ir pabaiga, mažesnis aukštis, daugiau dvistiebių medelių. Šiaurinių ir pietinių genotipų adaptaciniai požymiai esminiai skiriasi.

AB

ab

AB

ab QTL

paieškos tyrimai

Š-šiaurinis, P- pietinis

genotipai

PŠ


3.3.3.33.3 QTL paieškos QTL paieškos molekulinimolekuliniųų žymenų sistemosžymenų sistemos

Žymenų sistemos tikslas QTL tyrimuose yra identifikuoti tikslinių požymių genus jų paveldėjimo iš tėvų į palikuonis metu.

Žymenų sistemos skiriasi genų žymėjimo efektyvumu ir kaštais, kas turi esminę įtaką QTL nustatymo metodikai.

M

G

m

g

Polimorfinė populiacija (Žymuo susijęs su požymiu)

Kryžminimas (rekombinacija)

Palikuonys Žymuo susijęs su

požymiu

Specifinis DNR fragmentas elektroforezės gelyje būdingas tik tam tikrą požymį turintiems

medžiams


Žymenų tipai (2)Žymenų tipai (2)Dominantiniai žymenys negali atskirti vieno geno alternatyvių formų (alelių). Gali tik identifikuoti ar genas (vienas iš alelių) yra, pvz. RAPD

Q1Q1= homozigotinis

ankstyvas

Q1Q2= heterozigotinis tarpinis

Q2Q2= homozigotinis

vėlyvas

1 2 3

M

RAPD analizės rezultatai: DNR fragmentai gelyje

žymuo

Žymuo M gali identifikuoti ankstyvos augimo pradžios alelį Q1 (bet ne jo alternatyvią formą- vėlyvos augimo pradžios alelį Q2)

Kodominantiniai žymenys- gali identifikuoti alternatyvias vieno geno formas (alelius)

Q1Q1= homozigotinis

ankstyvas

Q1Q2= heterozigotinis tarpinis

Q2Q2= homozigotinis

vėlyvas

1 2 3

N

RFLP analizės rezultatai: DNR fragmentai gelyje

Žymuo

Žymuo N gali identifikuoti abu ankstyvos Q1 ir vėlyvos augimo pradžios alelį Q2. Todėl gali atskirti heterozigotinius genotipus= tikslesni, bet sudėtingesni.

GT

AT

AT

GA

GT

GG

TT

AG

GT

GA

GT

GG

Q1 Q2

GT

AT

AT

GA

GT

GG

TT

AG

GT

GA

GT

GG

Q1 Q2

Q1 ir Q2 aleliai porinėse

chromosomose gali skirtis tik keliais

nukleotidais


Žymenų tipai (3)Žymenų tipai (3)

Dominantiniai žymenys tinka vieno motinmedžio genų identifikacijai jo palikuonių (pusiau sibų) šeimoje.

Tėvas: aukštas Motina: žema

M1M1

Q1Q1

M2M2

Q2Q2

M2M1

Q2Q1

Palikuonis: tarpinis

Tėvas: aukštas Motina: tarpinė

M1M1

Q1Q1

M1M2

Q1Q2

M2M1

Q2Q1

Palikuonis: tarpinis

Ar M1 susijęs su Q1 ir ar M2 susijęs su Q2? Žymenų sistema turi sugebėti atskirti Q1 ir Q2

Ar M2 susijęs su Q2? Tereikia identifikuoti Q2 QTL. Tik motinmedis turi M2 ir Q2.

Kodominantinių žymenų reikia abiejų tėvų genų identifikacijai jų palikuonių (pilnų sibų) šeimoje


Mikrosatelitai ir QTLMikrosatelitai ir QTL

SSR gali būti naudojami QTL paieškoje: SSR yra kodominantiniai ir gali efektyviai identifikuoti didelį skaičių tam tikro geno alternatyvių formų (alelių) populiacijoje pagal kartotinių sekų pakartojimų skaičiaus polimorfizmą (daug įvairaus ilgio kartotinių sekų fragmentų = daug alelinių variantų).

Esant aukštam alelių identifikacijos tikslumui ir tikslinių genų formų įvairovei (polimorfizmui) populiacijoje, yra santykinai didesnė galimybe rasti sąsajas tarp šių fragmentų ilgio ir palikuonių tikslinių požymių QTL. CACACACACACACA

GTGTGTGTGTGTGT

CACACACACACACACACACACACACAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT

QTL

CACACACAGTGTGTGT


QTL paieškos efektyvumasQTL paieškos efektyvumasQTL paieškos efektyvumas didžia dalimi priklauso nuo bandomos medžiagos ir taikomos žymenų sistemos

DNRPorinės chromosomos

Polim

orfi

nia

i ale

liai

(dvi skirtin

gos v

ieno

geno fo

rmos)

Tėvinė

Monom

orfi

nia

i ale

liai (d

vi

vie

nodos v

ieno

geno fo

rmos)

Motininė

5 genai sąlygojantys vieną požymį (didesni turi svaresnę

įtaką)

Heterozigotinis genotipas (dauguma genų turi polimorfinius alelius)

Žymenų sistema: turėtų remtis žiniomis apie tikslinių genų sekas (DNR tyrimai reikalauja nemažų kaštų)

Medžiaga: genetinė įvairovė (skirtingi genai) = dauguma požymį sąlygojančių alternatyvių genų formų (alelių) yra skirtingi (polimorfiniai) ir stipriai paveldimi.

Pagrindinio ar su juo susijusių genų dalies sekų žinojimas ženkliai padidintų žymenų

paieškos efektyvumą

Atsitiktinės žymenų sistemos bando atsitiktiniu būdu aptikti

gana mažą DNR sekų fragmentą tarp milijono kitų

sekų


Miško medžių QTL: žymenysMiško medžių QTL: žymenys• Naudojant atsitiktines žymenų sistemas, tikimybė aptikti QTL žymenis

nedidelė (neefektyvu),• Išeitis- paruošti žymenis pagal tam tikrose sąlygose išreikštų

polimorfinių genų dalių kopijas (EST žymenys).• Principas: vieno genotipo kopijos auginamos skirtinguose, tam tikro

geno išraišką skatinančiose sąlygose; izoliuojama iRNR→cDNR-AFLP skirtingų cDNR identifikacijai, žymenų kūrimas iš polimorfinių cDNR dalių)

sausra laistymas

Išreikšti genai

šaltis šiluma

Išreikšti genai

pakenktas

sveikas

Išreikšti genai

klonai klonai klonai


Neutralūs ir išreikšti žymenysNeutralūs ir išreikšti žymenys

Žymenų sistemos pasirinkimas priklauso nuo tyrimo tikslo:

Neutralūs žymenys tinkamiausi siekiant įvertinti genetinę įvairovę ar atrankai neutralių požymių QTL.

Ieškant adaptacinių požymių QTL, išreikštus genus identifikuojantys žymenys yra pranašesni (atsitiktinė paieška neefektyvi).

Išreikšti žymenys: EST, cDNR-AFLP; neutralūs pvz.: RFLP, RAPD, AFLP

Kadangi didžioji dalis genomo sudaryta iš nekoduojamos DNR(~95%), dauguma tradicinių žymenų sistemų žymi nekoduojamas sekas, kurios nepriklausomos nuo atrankos (žymenys neutralūs atrankai)

Genominė DNR (visų chromosomų DNR laisvoje formoje): dalys kur yra aktyvūs genai sudaro tik ~15 proc (storos atkarpos paveiksle).

Sekvenuoto Populus genomo dydis- 500 mln. bp, Eucalyptus 340-580 mln bp, Pinus 25 000 mln. bp


Specialių žymenų kūrimas (1)Specialių žymenų kūrimas (1)•Genų ekspresijos bandymas: vieno genotipo kopijos skirtingose sąlygose.

•iRNR izoliacija ir kopijavimas į cDNR (klonavimas plazmidėse),

•AFLP analizė: polimorfinių cDNR identifikacija,

•Polimorfinių cDNR bangų izoliavimas gelyje ir sekvenavimas,

(a) Žymenų pažyminčių tikslinius ar susijusius genus kūrimas,

(b) cDNR atitikmenų paieška DNR mikrosekų metodu, genų bibliotekose siekiant nusakyti kandidatinius genus.

•Žymenų testavimas ir naudojimas QTL paieškoje (pagrinde SNP ir EST žymenys).


2. Komplimentarios DNR (cDNR) sintetinimas pagal iRNR kopijas ir cDNR sukarpymas dviejų skirtingų restriktazių pagalba (viena dažnai, kita retai kerpanti).

3. DNR fragmentų galų jungimosi neutralizavimas prijungiant adapterius (pagal restriktazių sekas)

4a. PCR 1 ciklas: naudojami 2 pradmenys (sekos= restriktazių atpažįstamos sekos + 1 nukleotidas). Atrenkami pradų sekoms tinkantys fragmentai.

4b. PCR 2 ciklas: 2 nauji pradmenys (sekos = restriktazės sekos + 1 +2 ar > naujų nukleotidų). Rezultate atrenkami tam tikri fragmentai

Specialių žymenų kūrimas (2)Specialių žymenų kūrimas (2)“cDNR+AFLP=EST” metodas: tikslas identifikuoti tam tikrose aplinkose išreikštus genus ir iš jų pagaminti žymenis, taikomus įvairiose žymenų sistemose.1. Tam tikroje aplinkoje auginamų genotipų iRNR izoliavimas iš

audinių, kuriuose tiksliniai genai yra išreikšti (pvz. pumpuras, jei tiriami pumpurų ramybės būsenos genai).

5. Elektroforezės gelyje bus matomi po 2-jų atrankos ciklų patekę DNR fragmentai. Polimorfiniai fragmentai- tai bandomose sąlygose išreikšto geno dalys (genotipai identiški, skirtumas tik aplinkos sąlygose, kurios įtakavo skirtingų genų išraišką). Šie fragmentai izoliuojami iš gelio ir sekvenuojami tolesniam išbandymui.

5. Elektroforezės gelyje bus matomi po 2-jų atrankos ciklų patekę DNR fragmentai. Polimorfiniai fragmentai- tai bandomose sąlygose išreikšto geno dalys (genotipai identiški, skirtumas tik aplinkos sąlygose, kurios įtakavo skirtingų genų išraišką). Šie fragmentai izoliuojami iš gelio ir sekvenuojami tolesniam išbandymui.


Specialių žymenų kūrimas (3)Specialių žymenų kūrimas (3)

Gelis

Restriktazės Rekombinuotos plazmidės

cDNR

cDNR

Bakterijos

Sekų lyginimas duomenų bazėseDNR mikrosekų

bibliotekose

8. Atitikmenų paieška.Žymenų kūrimas ir testavimas

pagrinde EST, SNP, STS

žymenys (RFLP markeriai ir PCR

pradai),

Elektroforezės gelyje izoliuoti polimorfiniai cDNR fragmentai (išreikštų genų dalys) įterpiami į bakterijų plazmides (patogiau atlikti tolesnius sekvenavimo darbus)

cDNR

6. cDNR izoliavimas ir klonavimas

7. cDNR sekvenavimas

9. Testavimas bandymuose.

10. Rezultatas- kandidatiniai genai

cDNR fragmentų identifikacija: nukleotidų sekų nustatymas automatiniuose sekvenatoriuose

Prieš bandant cDNR fragmentus kaip žymenis, bandoma nustatyti jų sekų atitikmenis su jau rastais genais ar žymenismi duomenų bazėse ar DNR mikrosekų bibliotekose (hibridizacija su žinomais genais)

www.ncbi.nlm.nih.gov



1. DNR sukarpymas 2 skirtingomis restriktazėmis,

2. Adapterių prijungimas (“lipnių” fragmentų galų neutralizavimas),

3a. Pirmas PCR ciklas: pradmuo= restriktazės atpažįstama seka + 1 naujas nukleotidas; PCR pagausinimas tik tam tikrų fragmentų, turinčių naują nukleotidą po restriktazės sekos.

3b. Antras PCR ciklas: specialių pradmenų gamyba- restriktazės seka + 1 + 2 nukleotidai; PCR amplifikacija (tam tikrų fragmentų atranka)

RestriktazėBandoma DNR

Adapteris

Adapteris

Pradmuo

Pradmuo

Pradmuo

Pradmuo

AFLP detalės: adapterių prijungimo, PCR pradmenų gamybos ir DNR pagausino principai



Augimo pabaigos imitacijaAugimo sąlygų imitacija

Bandymas klimatinėje kameroje. Tikslas: rasti žymenis susijusius su augimo pabaigos QTL. Metodai: Du to paties genotipo klonai auginami skirtingose sąlygose ir išreikštų genų identifikacija pagal cDNR-AFLP analizę. Pumpurų krovimo

pradžios stadijoje iš pumpurų izoliuojama iRNR

cDNR sintetinamas ir sukarpymas restriktazėmis

Adapterių prijungimas

PCR 1 ciklas (pradmenys+1 nukleotidas)PCR 2 ciklas (pradmenys+2 ir > nukleotidai)Elektroforezė,

polimorfinių bangų izoliavimas ir žymenų kūrimasRezultatas: gauti skirtingi iš viršūninių meristemų izoliuotos iRNR

fragmentai – galimos atsakingų genų (QTL) dalys; reikalingas tolesnis patikrinimas tyrimais

Šviesa,

+20C

Tamsa,

+10 C



Bandymo klimatinėje kameroje pavyzdys. Tikslas įvertinti p. eglės genotipų toleranciją šalčio sausrai: vienas genotipų rinkinys laikytas 1-2 savaites su užšaldytomis šaknimis po intensyvia šviesa (pažeidimo pobūdis: intensyvi šviesa= garinamas vanduo, o užsalusios šaknys nekompensuoja vandens netekties = džiuvimas), kitas tų pačių genotipų rinkinys – optimaliose augimui sąlygose. Nuotraukoje vonios pripildytos gliukolio (-3C) intensyvioje šviesoje.


cDNR pritaikymas žymenų sistemosecDNR pritaikymas žymenų sistemose

•EST žymenų gamyba: EST tai 200-500 bp ilgio polimorfinių cDNR fragmentų dalys, žyminčios cDNR pradžią ir pabaigą (PCR pradai ar markeriai hibridizacijai DNR gardelėse ir RFLP sistemoje)

•EST savo ruožtu naudojami SNP (pavienių nukleotidų polimorfizmo atkarpų) žymenų paieškai

•DNR mikrosekose - geną identifikuojančios dalys.

•RFLP markeriai hibridizacijai: ilgis~100 bp (polimorfiniai cDNR fragmentai) -1500 bp (identifikuoti nedideli genai)

•Pradai žymintys unikalių sekų atkarpas (STS) (SSR ar ISSR pradai: specifinės DNR atkarpos, juosiančios 2-3 bp (1-10 bp) dydžio sekų pasikartojimo regionus DNR molekulėje)


Genominės duomenų bazėsGenominės duomenų bazėsPuiki išeitis žymenų sistemų analizės optimizavimui (markerių , adapterių pradų sekų paieška).

Augalų genomo duomenų bazė: RFLP markeriai tam tikro geno hibridizacijai

(kukurūzas)

Nacionalinio biotechnologijų centro duomenų bazės: cDNR ar EST sekos


EST sukūrimasEST sukūrimas•Genotipai bandomi tam tikroje aplinkoje.

•Iš specifinių audinių, kuriuose vyksta atsakas į stresą, izoliuojama iRNR (geno kopijos), iš jų sintetinamos stabilesnės cDNR molekulės.

•Atsitiktiniu būdu atrankos cDNR dalinai sekvenuojamos ir lyginamos su cDNR bibliotekose esančiomis žinomos funkcijos cDNR sekomis

•Nustačius atitinkamus, pagaminami EST žymenys identifikuojantį tam tikrą geną.

•EST žymenys naudojami QTL testavimui ir kandidatinių genų paieškos tymuose.

Sekvenavimas ir atitinkančių sekų

paieška bibliotekose

ACGGACUGcDNR

Genotipo atsakas į stresą= išreikšti genai

Nacionalinio biotechnologijų centro cDNR duomenų bazės

iRNR


Žymenų sistemos: santraukaŽymenų sistemos: santrauka•RFLP (+) tiksli , kodominantinė, (-) reikalauja daug darbo, nemažo DNR kiekio, ir darbo su radioaktyviomis medžiagomis.

•RAPD (+) nedaug DNR (tinka sėklų analizėms), pigus, greitas (-) dominantinis ir mažiau tikslus; patobulinimas- AFLP (RFLP ir PCR kombinacija: tikslesnis, vis tiek dominantinis),

•Eilė PCR ir restriktazių panaudojimu pagrįstų naujų sistemų, kurios skiriasi tuo kaip gaunami PCR pradai ar markeriai identifikacijai (kodominantiniai, tikslūs):

•EST, SCAR, STS, SNP (pradų sekos iš cDNR bibliotekų ar genų ekspresijos tyrimų, iš genominės DNR bibliotekų ir polimorfinių RAPD fragmentų)

•Efektyvus miško medžių žymenų generavimo būdas- genų sekų duomenų bazių analizė ar genų ekspresijos tyrimai ir DNR mikrogardelių panaudojimas


3.3.3.3.4. QTL nustatymo statistiniai 4. QTL nustatymo statistiniai metodaimetodai

•Statistinių metodų tikslas nustatyti potencialaus QTL žymens ir požymio ryšio esmingumą ir QTL žymens įtaką fenotipinio požymio išraiškai.

•Paversti DNR fragmentų buvimą gelyje į skaičius (0- nėra, 1- yra) ir suskirstyti palikuonių fenotipinių požymių vertes pagal kiekvieno fragmento buvimo ir nebuvimo klases (pagal žymenų genotipus).

•Kiekvienam fragmentui (potencialiam žymeniui), palyginti palikuonių fenotipinio požymio vidurkius tarp tarp žymenų genotipų (t.y. nustatyti pvz. palikuonių aukščio skirtumus tarp M1M1 ir M2M2 (kodominantinis žymuo) ar tarp turinčiu ir neturinčių M fragmento palikuonių (dominantinis žymuo):

•ANOVA, t-testas, regresija (kodais išreikštų žymenų genotipų sąsaja su požymio fenotipu),

•Chi-kvadrato testas (kategoriniai kintamieji).

• Jei skirtumai esminiai- žymuo susijęs su atitinkamo požymio QTL; skirtumo tarp vidurkių esmingumas = žymens sąsajos su QTL stiprumo rodiklis.

•Jei yra daugiau nei vienas potencialus žymuo (žymenų polimorfizmas gelyje), naudojamas intervalų interpoliacijos (maksimalios tikimybės) metodas (Maximum Likelihood-Lander & Botstein, 1989), alternatyva Composite Interval Mapping (Linked markers-Zeng, 1993).


Duomenų paruošimasDuomenų paruošimas

DNR fragmentų (bangų) buvimas gelyje paverčiamas į 0 ir 1 duomenų masyvą pagal fragmentų dydį ir požymio išraiškos vienetą.

100

400

1200

2000A A B B C C

A B CEglės žievės forma

DN

R f

ragm

ento

dydis

(b

p)

100

400

1200

2000A A B B C C

1

1

0

1

1

1

0

1

1

1

0

1

1

1

0

1

1

1

1

1

1

1

1

1DN

R f

ragm

ento

dydis

(b

p)

PalikuonysPalikuonys

A B C100 100 100 100400 100 100 100

1200 0 0 1002000 100 100 100

Žievės forma

Genotipų , turinčių tam tikro ilgio DNR fragmentą skaičius (%)

kiekvienoje žievės formos klasėje

DN

R f

ragm

ento

dydis

(b

p)

Fragmentų dydžio skalė


Žymens ir požymio ryšys (1)Žymens ir požymio ryšys (1)Tikslas rasti žymenis, susijusius su sezoninio augimo pradžios QTL

Q1Q1= homozigotinis ankstyvas

Q1Q2= heterozigo

tinis tarpinis

Q2Q2= homozigotinis vėlyvas

1 2 3

Tėvinė populiacija: polimorfizmas augimo pradžios laike, pvz., provenencijų bandymas

QTL genotipų požymiai: Q1Q1=

homozigotinis, ankstyva pradžia; Q1Q2 = heterozigotinis, tarpinis; Q2Q2 = homozigotinis, vėlyvas. Kryžminimui parenkami tėvai: ankstyvas (Q1Q1), tarpinis (Q1Q2), atliekami jų DNR tyrimai (pvz. RFLP), kur žymuo M1~ susijęs su Q1 (ankstyvas), o M2 ~ susijęs su Q2 (vėlyvas).

Q1

M1

Q1

M1

Q2

M2

Q1

M1

M

RFLP gelis

M Polimorfinio žymens lokusas

Kiti lokusai

Žymuo

QTL

Tėvas

Motina

Jei M žymuo susijęs su augimo pradžios QTL, tai po rekombinacijos palikuonys tik su M1 žymeniu bus ankstyvi, o su M1M2 – tarpiniai.


Žymens ir požymio ryšys (2)Žymens ir požymio ryšys (2)1.Atliekami palikuonių DNR tyrimai: RFLP metodu nustatomas palikuonių RFLP genotipas (M1M1 ar M1M2);

2.Lauko bandyme nustatomas palikuonių RFLP genotipų augimo pradžios laikas (fenotipas =QTL indikatorius)

3. ANOVA pagalba lyginamas RFLP genotipų vidutinis augimo pradžios laikas: jei skirtumas esminis- M žymuo susijęs su augimo pradžios QTL; skirtumo esmingumas = sąsajos stiprumas

Palikuonio Nr.

100

400

1200

2000

1 2 3 4 150

fragm

ento

dydis

(b

p)

M

(…)

Tarp

ini

sTarp

ini

sFenotipas lauko bandym

e Anks

tyva

s

Anks

tyva

sŽymuo

RFLP genotipa

s

M1

M1

M1

M2

M1

M2

M1

M1

M1

M1

Tarp

ini

s

Žymens M RFLP genotipai

Žymens M RFLP genotipai

Alternatyva 1: M žymuo susijęs su augimo pradžios

QTL, sąsajos stiprumas R2=78%

M1M1

Augim

o

pra

dži

a2

1

M1M2

Anksti

VėlaiSkirtumas esminis, p<0,05, R2=78%

Alternatyva 2: M žymuo nesusijęs su augimo pradžios QTL (atskirti rekombinacijos)

M1M1

Augim

o

pra

dži

a

M1M2

Anksti

Vėlai2

1

Skirtumas neesminis R2=8%

Yij= µ +Mi +ij


Žymens ir požymio ryšys (3)Žymens ir požymio ryšys (3)Vertinant kelis žymenų lokusus (polimorfiniai DNR fragmentai gelyje): ANOVA žymenų sąsajai, Maksimalios tikimybės algoritmas- atrankai tarp žymenų

Palikuonio Nr.

100

400

1200

2000

1 2 3 4 150M

(…)

Žymuo

RFLP genotip

ai

M1M1

M1M2

M1M2

M1M1

N

P

R

N1N1 N2N2 N1N1 N1N1

nėra P1P2 P1P1 P1P1

R2R2 R1R2 nėra R2R2

Aug

imo

prad

žia

2

1Anksti

Vėlai

Aug

imo

prad

žia

2

1Aug

imo

prad

žia

2

1

2

1Anksti

Vėlai

a1 a2Rezultatai: sankabos grupių

žemėlapyje, kur atstumai tarp žymenų (a) = rekombinacijų

tarp žymenų % M (78%) N (41%)

a3

R (11%)

P (25%)

Skirtumo esmingumas pvz. F reikšmė

Maksimali QTL tikimybė tarp žymenų M ir N

3. Tinkamiausio žymens nustatymas pagal skirtumo dydį

Riba kai sąsajos nėra

1. RFLP gelis

Žymens M genotipai

Skirtumas esminis R2=78%2

1

2

1

2

1

Esminis R2=41%

Esminis R2=25%

Esminis R2=11%2

1

2

1

2

1

2

1

2

1

2

1

2. ANOVA modelis Yij= µ +Mi +ij

M1M1 M2M2Žymens N genotipai

N1N1 N2N2Žymens P genotipai

P1P1 P2P2Žymens R genotipai

R1R1 R2R2


Žymens ir požymio ryšys (4)Žymens ir požymio ryšys (4)

Kategoriniams kintamiesiems tinka Chi-kvadrato testas, t.y. kai fenotipinis požymis vertinamas keliomis klasėmis (pvz. žievės forma): tikrinama ar sąsaja tarp kiekvieno DNR fragmento ir žievės formos yra atsitiktinė.

Neatsitiktinę sąsają parodo genotipų, turinčių tam tikrą DNR fragmentą, skaičiaus skirtumas tarp atskirų požymio klasių.

A B CEglės žievės forma

Skirtumo esmingumas = QTL ir žymens sąsajos stiprumas

Chi-kvadrato testas naudojamas nustatyti: ar yra esminis nukrypimas nuo atsitiktinio DNR fragmentų pasiskirstymo atskirose žievės formos klasėse?

Fragmento dydis 400 bp

0

20

40

60

80

100

A B CŽievės forma

Gen

otip

ų sk

aič

ius

(%)

`

Fragmento dydis 1200 bp

0

20

40

60

80

100

A B CŽievės forma

Gen

otip

ų sk

aič

ius

(%)

`

Skirtumai neesminiai (visų žievės formų genotipai turėjo vienodą skaičių genotipų su fragmentu)= sąsajos tarp

fragmento ir žievės formos nėra

Skirtumai esminiai (tik C žievės formos genotipai

turėjo šį fragmentą)


Žymens ir požymio ryšys (5)Žymens ir požymio ryšys (5)

Dviejų žymenų identifikacijos atvejis (M1 = lygi, M2 = supleišėjusi žievė). Genotipas M1-M1 = fenotipas (lygi žievė) (A tipas nuotraukoje), M1-M2 = tarpinė (B) ir M2-M2= supleišėjusi (C).

A B C

M1 lygi žievė (A forma nuotraukoje)

M1 ir M2 tarpinė žievė (B forma nuotraukoje)

M2 supleišėjusi žievė (C forma nuotraukoje)

100

400

1200

2000A B C

DN

R f

ragm

ento

dydis

(b

p)

M1

M2

Skirtumai tarp žievės klasės vidurkių nustatomi ANOVA ar t-testu

26 medžiai 54 medžių 23 medžiai

Jei skirtumai esminiai = potencialus QTL žymuoSkirtumų esmingumas = sąsajos su QTL

stiprumas

Žymuo M10 1Ž

ieves

form

a b

ala

is,

A=

1, B

= 2

, C

= 3

3

0

Žymuo M20 1Ž

ieves

form

a b

ala

is,

A=

1, B

= 2

, C

= 3

3

0

Dominantinio žymens atveju, atliekama ANOVA, kur įvertimas fenotipinio požymio skirtumo esmingumas tarp palikuonių su žymeniu ir be žymens.


Žymens ir požymio ryšys (6)Žymens ir požymio ryšys (6)•Tam, kad gauti pakankamą individų skaičių sąsajos analizei reikalingas pakankamas šeimos palikuonių skaičiaus.

•Pavyzdžiui, dispersinės analizės patikimumas, lyginant 2 medžių grupių skirtumo esmingumą, priklauso nuo medžių skaičiaus grupėse; paprastai, lyginant miško medžių kiekybinius požymius, grupių skaičius turėtų būti nemažesnis nei 20 (priklauso nuo požymio dispersijos).

•Todėl lyginant vieno žymens genotipus, reikėtų apie 40 palikuonių (20+20)

2

1

2

1

2

1

20 202

1

2

1

2

1

2

1

2

1

2

1

Medžių skaičius kiekvienoje žymens genotipo grupėje

Žymens N genotipaiN1N1 N2N2

Žymens P genotipaiP1P1 P2P2

Žymens R genotipaiR1R1 R2R2

20 2020 20 = 120 palikuonių

•Tikėtina, kad dauguma QTL paieškos žymenų sistemų produktuos 3-4 polimorfinius (potencialius) QTL žymenis, todėl apytikris minimalus QTL nustatymo populiacijos dydis > 100 individų

Viso


Žymens įtakos nustatymasŽymens įtakos nustatymasSu žymeniu susijusio QTL įtaka požymiui nustatoma lyginant žymens genotipų fenotipinio požymio skirtumą su kitų žymenų genotipų skirtumais

Pvz. M žymens genotipų (M1M1 ir M2M2) skirtumas pakeltas kvadratu / iš kitų žymenų genotipų skirtumų kvadratinės sumos.

a1 a2

M (80%) N

a3

RP

Augim

o p

radži

os

skir

tum

as,

die

nom

is

Maksimali QTL tikimybė tarp žymenų M ir N

Žymenų išdėstymas sankabos grupėje (cM)

Riba kai sąsajos nėra

M įtaka= Gm2 / suma(Gi

2)

1 2

3

4

5

6

7

8

=7*7 / ((4*4)+(6*6)+(3*3)) = (49 /61)*100 = 80 %


Intervalinė interpoliacijaIntervalinė interpoliacijaJei yra keli QTL žymenys, tinkamiausias nustatomas Maksimalios tikimybės1 metodu kiekvienam žymeniui paskaičiuojant LOD* rodiklį, kuris pagrinde išreiškia rekombinacijos tarp žymens ir QTL dažnį, dažnius paverčiant tikimybėmis.

a1 a2

M N

a3

RP

LOD

re

ikšm

ės

Maksimali QTL tikimybė netoli nuo M žymens: LOD interpoliacijos rezultatas

Žymenų išdėstymas sankabos grupėje (cM)

Riba kai sąsajos nėra LOD<3

LOD= log (Ty sąsaja yra/ Tn kad sąsaja atsitiktinė), kurTikimybė (Ty) =Prop(nerekomb)n * Prop(rekomb)m, kur n ir m = nerekombinantų ir rekombinantų skaičius, Prop = proporcija.

Tikimybė (Tn) =0.5 n+m

* LOD- logarythm of odds ratio

1-Lander & Botstein, 1989

LOD rodiklis leidžia palyginti skirtingus žymenis ir požymius


QTL nustatymo efektyvumo QTL nustatymo efektyvumo padidinimas (1)padidinimas (1)

Palikuonių klonavimas:

a)Fenotipinių požymių įvertinimo tikslumo padidinimas (vietoje vieno fenotipo išbandome keliolika jo kopijų= tiksliau nustatomas fenotipinio požymio genetinis sąlygotumas)

b)DNR tyrimams reikalingų individų skaičiaus sumažinimas = mažesni kaštai.

Tipinių fenotipų atranka lauko bandymuose DNR žymenų identifikacijai

Palikuonys klonuojami

Tėvai

Palikuonys Išbandomi



Atrankinis genotipavimas- tik atrinktų palikuonių genotipų DNR analizė (ang. selective genotyping).

a)Pasirenkami palikuonys su ekstremaliomis fenotipinio požymio reikšmėmis, siekiant padidinti QTL aptikimo tikimybę.

b)DNR tyrimams reikalingų individų skaičiaus sumažinimas = mažesni kaštai.

Ekstremalių fenotipų (pvz. aukštas ir žemas medis) atranka lauko

bandymuose DNR žymenų identifikacijai


Tėvai



Grupinis genotipavimas- atrinktų genotipų mišinio DNR analizė (ang. bulk segregant analysis).

a)Siekiant padidinti QTL aptikimo tikimybę, pasirenkami palikuonys su ekstremaliomis fenotipinio požymio reikšmėmis

b)Jų DNR apjungiama ir analizuojama atskirai.

c) DNR tyrimams reikalingų individų skaičiaus sumažinimas = mažesni kaštai.

Ekstremalūs fenotipai atrenkami lauko bandymuose, jų DNR pavydžiai

apjungiami ir naudojami žymenų ir požymio sąsajų tyrime

Tėvai


Aukštų medžių DNR

Žemų medžių DNR

DNR apjungiam

aDNR

apjungiama


QTL nustatymo statistiniai metodai QTL nustatymo statistiniai metodai (sankibos grupių žemėlapiai)(sankibos grupių žemėlapiai)

• Kiekybinis požymis gali būti sąlygojamas keliolikos genų,

• Sudaromi genus žyminčių žymenų sąsajos su jų QTL žemėlapiai (sankibos grupių žemėlapiai kiekvienai žymenų kategorijai)

• Tam tikrų QTL žymenys išdėstomi žemėlapiuose, kur atstumas tarp dviejų žymenų išreiškiamas pagal tai kaip dažnai jie paveldimi vienoje sukibimo grupėje

• Rekombinacijos tarp dviejų žymenų dažnis išreiškiamas centimorganais (cM) = rekombinantinių genotipų (žymenys buvo atskirti rekombinacijos metu) procentas.

• Vienoje sankibos grupėje esantys žymenys ~ atitinka vieną chromosomą

0

11

25

43

cM

M1 Tiesus

M2 žievė lygi

M3 Vėlyva forma

M3 Minkšta mediena

Sankibos grupe Nr.1.

SSR žymenų sistemaPvz, atstumas (cM) tapr

žymenų M1 ir M2rekombinantų sk. x 100

bendras medžių sk.=

33

300= = 11% arba 11

cM


Nustačius QTL: tolesni žingsniaiNustačius QTL: tolesni žingsniaiNustačius QTL tolesni žingsniai:

a) QTL testavimas (tikrinimas)

b) Kandidatinių genų identifikacija ir tai alternatyvių geno/QTL formų (alelių paieška)

Alternatyvios vieno geno formos (aleliai) galai

skirtis tik keliais nukleotidais: identifikavus QTL žinoma tik viena iš šio

geno formų

QTL QTL QTL

•EST žymenys genų izoliavimui ir klonavimui.

•EST genų polimorfizmo nustatymas pavienių nukleotidų polimorfizmo (SNP) ar DNR mikro sekų metodais.

S e k v e n a v im a s i r a t i t in k a n č ių s e k ų

p a ie š k a b ib l io t e k o s e

A C G G A C U Gc D N R

G e n o t ip o a t s a k a s įs t r e s ą = iš r e ik š t i g e n a i

N a c io n a l in io b io t e c h n o lo g i j ų c e n t r o c D N R d u o m e n ų b a z ė s

iR N R

S e k v e n a v im a s i r a t i t in k a n č ių s e k ų

p a ie š k a b ib l io t e k o s e

A C G G A C U GA C G G A C U Gc D N R

G e n o t ip o a t s a k a s įs t r e s ą = iš r e ik š t i g e n a i

N a c io n a l in io b io t e c h n o lo g i j ų c e n t r o c D N R d u o m e n ų b a z ė s

iR N R

•Gausių cDNR ir EST sekų duomenų bazių efektyvus panaudojimas

Tam reikalingos tikslias nukleotidų sekas atpažįstančios žymenų sistemos:


3.3.3.3.5 QTL testavimas5 QTL testavimas•Efektyviam QTL panaudojimui selekcijoje, reikalingas QTL patikrinimas skirtingose aplinkose, skirtingu laiku (skirtingame amžiuje) ir naudojant skirtingas genetines linijas (šeimas).

•Be šių testavimo tyrimų, QTL tinkami naudoti tik toje aplinkoje ir su ta šeima, su kuriais jie buvau gauti.

Ar tie patys QTL (požymio ir žymenų sąsajos) bus gauti su skirtingais tėviniais genotipais?

Palikuonys

Tėvai

Nr. 1 Nr. 2

QTL

Palikuonys

Tėvai

Nr. 3 Nr. 4

QTL?

Palikuonys

Tėvai

Nr. 1 Nr. 2

QTL

Ar tie patys QTL bus gauti išbandant tuos pačius genotipus skirtingose aplinkose kelių augimo periodų metu?

Palikuonys

Tėvai

Nr. 1 Nr. 2

QTL?


•Jei testavimo bandymo metu QTL nebuvo pakartotinai gauti, priežastis gali būti per mažas QTL populiacijos dydis, todėl QTL nustatymui reikalingos didesnės palikuonių populiacijos (ypač mažos įtakos QTL nustatymui).

•Pageidautinas mažesnis požymių kompleksiškumas: pvz. vietoje aukščio vertinti fenologinius požymius ir fotosintetinį potencialą.

•Nepriklausomų tyrimų rezultatai turi būti įrašomi į bendrus tam tikrai rūšiai genolapius (palyginamieji genolapiai)

•Pavyzdys: Eucalyptus grandis- keli nepriklausomi tyrimai su skirtingomis šeimomis aptiko medienos bazinio tankio QTL homologinėse sankibos grupėse (Grattapagia ir kt. 1996, Verhaegen ir kt. 1997).

Šalčio pakenkimų rizika

Šalčio pakenkimų

rizika

Vasara ŽiemaŽiemaGenotipas A (ankstyva AP pabaiga) Genotipas B

(vėlyva AP pabaiga)

QTL identifikacijai naudingas požymių išskaidymas siekiant prieiti kaip galima arčiau prie tiesiogiai požymį sąlygojančių genų. Pavyzdys dešinėje: genotipo aukštis priklauso nuo jo sezoninio augimo trukmės: vėlesnė augimo pabaiga=ilgesnis augimo laikas= didesnis aukštis. Todėl pravartu ieškoti sąsajų tarp žymenų ir augimo pabaigtos laiko, o ne medelių aukščio.


3.3.3.3.6 Miško medžių QTL 6 Miško medžių QTL identifikacijos rezultataiidentifikacijos rezultatai

Tiksliniai požymiai:

•Adaptaciniai požymiai (fenologija, tolerancija šalčiui, sausrai)

•Reprodukciniai požymiai (lytinė branda, žydėjimo gausumas, lytinė asimetrija),

•Atsparumas ligoms ir kenkėjams (tolerancija aliuminiui)

•Medienos kokybė (bazinis tankis, stiebo suktumas, gravitaciniai požymiai, cheminės savybės (celiuliozės išeiga))

•Kiti požymiai (pvz. eglės “pendula” forma, lapų požymiai, stiebo tiesumas, H, D, šaknydamosi energija, dauginimosi gyvašakėmis geba)


•Rūšys (eilės tvarka): Eukaliptas, Populus gentis, pietinės pušys, P. eglė, p. pušis, pocūgė.

•Pagrinde naudotos selekcinių populiacijų rėmuose sukurtos sibų šeimos: atbuline seka nuo palikuonių link tėvų.

•Naudos žymenų sistemos pradedant nuo RAPD, RFLP, AFLP, SSR, dabartiniu metu: cDNA-AFLP, EST, SNP.

•Efektyvi tolimų populiacijų ir artimų rūšių hibridizacija.

•Pastaba: tokie požymiai kaip aukštis yra išvestiniai, kelių kitų kiekybinių požymių išdava, todėl efektyviau sumažinti požymį įtakojančių genų grupių skaičių (kompleksiškumą) ir ieškoti tiesioginių genų grupių QTL.


Rūšis Požymis Kryžminimo schema (palikuonių sk.)

Žymenų sistema

Referencija

Pinus elliottii aliuminio tolerancija F1 (186) RAPD Kubisiak ir kt. (1999) Pinus palustris x eliotti

sėjinuko aukštis F1 (72) RAPD Kubisiak ir kt. (1997b)

Pinus pinaster megagametofito svoris; sėklų dygimo laikas, sėjinuko aukštis

F2 savidulka (120) RAPD Plomion ir kt. (1996a)

Pinus radiata kankorėžių skaičius; šakų kokybė, stiebo skersmuo F1 (134) RAPD Emebiri ir kt. (1997) medienos bazinis tankis F1 kraštutinių genotipų

atranka RFLP, SSR Devey ir kt. 2004

Pinus teada medienos tankis; vėlyvos medienos procentas, mikrofibrilių kampas, ląstelės sieneles cheminė sudėtis

F2 (172) RAPD, RFLP Groover ir kt. (1994), Knott ir kt. (1997), Brown ir kt. (2003)

cheminės medienos savybės F2 (172) RFLP Neatle ir kt. 1997 Skersmuo, aukštis F2(172) RFLP, RAPD Kaja ir kt. 1999 Pseudotsuga menziesii

adaptaciniai požymiai F2 (205) RFLP, RAPD Neatle ir kt. 1997

Picea abies pedula forma; genotipų DNR mišiniai RAPD Lehner ir kt. (1995) aurea forma (geltoni sprogstantys ūgliai) ankstyva

lytinė branda F1 (73) EST, AFLP,

SSR Achere ir kt. (2004)

medienos bazinis tankis įvairios šeimos ir genotipų DNR mišiniai

AFLP, SCAR Markussen ir kt. (2004)

Pinus sylvestris Ūglių lignifikacijos laipsnis, sėjinukų aukštis, augimo pabaigos laikas

F1 (108) pietinis x šiaurinis

RAPD Yazdani ir kt. (2003)

Aukštis, skersmuo, ūglių lignifikacijos laipsnis, šakų kampas,

F1 (95) AFLP Lerceteu ir kt. 2000

Spygliuočių miško medžių rūšyse rasti QTL (tipiniai pavydžiai)


Lapuočių miško medžių rūšyse rasti QTL (tipiniai pavydžiai)Rūšis Požymis Kryžminimo schema

(palikuonių sk.) Žymenų sistema

Referencija

Castanea dentata x C. mollissima

Atsparumas sėklų ligoms, lapų dydis, ūglių plaukuotumas, stiebo spalva

F2 (186) RFLP, RAPD Kubisiak ir kt. (1997a)

Eucalyptus grandis x E. urophyla

stiebo suktumas, medienos tankis, žievės sausas svoris, celiuliozės išeiga, geba daugintis gyvašakėmis, ūglių šaknydinimas

F1 pusiau sibai (300) ir F2 sibai (122)

RAPD Grattapagia ir kt. (1996, 1995)

Eucalyptus urophyla x E. grandis

medienos tankis, stiebo nulaibėjimas, gyvybingumas

F1 (200) RAPD Verhaegen ir kt. (1997)

Eucalyptus nittens

tolerancija šalčiui F2 (118) RFLP Byrne ir kt. (1997)

Populus trichocarpa x P. deltoides

aukštis, skersmuo, stiebo forma, pumpurų sprogimas ir krovimas; atsparumas dėmėtligei; įvairūs lapų požymiai

F2 savidulka (55) (107) (90)

RFLP, RAPD, STS AFLP,

Brandshaw ir Steffer 1995; Newcombie ir Brandshaw 1996; Frewen ir kt. 2000.


QTL rezultatai įrašomi į genolapiusQTL rezultatai įrašomi į genolapius

LG-1(I) LG-2(VI)

LG-19(XII)

LG-4(III) LG-5(II)LG-3(X) LG-6(XIII)

LG-24 LG-25 LG-26LG-27 LG-28

LG-9(XI) LG-10 LG-11(XVIII) LG-12(IV) LG-13(VIII) LG-14

LG-22LG-15

LG-29

LG-16(XIV)

LG-18

LG-30

LG-17

LG-23LG-20(XVI)

LG-7 LG-8(V)

LG-21

Height Age 4Boardman,Biomass Age 1Wallula,Basal Callus

Biomass Age 1Wallula

Height Age 1WallulaLateral RootGrowth

Height Age 1Wallula

Height Age 4Boardman

Height &Diameter Age 8Clatskanie

Height Age 4Clatskanie



Height &Diameter Age 4Boardman,Height &Diameter Age 8Clatskanie

Height Age 4ClatskanieHeight Age 4Clatskanie

Lateral Root Length

Diameter Age 4Boardman

Height Age 4Clatskanie,Height Age 4Boardman,Biomass Age 1Wallula





Biomass Age 1 Wallula




Root Biomass Age 1 Wallula


Root BiomassAge 1 Wallula

Root Initiation

Height &Diameter Age 4Boardman


0 cM

20 cM

•Populus sankibos grupių genolapis: kiekybinius požymius lemia vienu metu daug genų (QTL), išsidėsčiusių daugelyje chromosomų vietų (medžių aukščio QTL pažymėti raudonai)


MAS ir QTL tyrimų pasiskirstymas pagal medžių gentis (FAO 2004)


MAS ir QTL tyrimų pasiskirstymas pagal požymius (FAO 2004)


Reprodukcinių požymio pavyzdys: lytinė branda. Sėklinės kilmės paprastosios pušies genotipas pasiekęs lytinė brandą 9 metų amžiuje (paprastai pasiekiam 15-20 m). Nuotraukoje matomi vyriški ir moteriški strobilai (netikri žiedai).

Reprodukciniai požymiai (naudingi selekcijai):

•Lytinė branda,

•Žydėjimo gausumas

•Lytinė asimetrija (vyriškų ir moteriškų žiedų santykis)

•Ūglių šaknydamosi geba

Picea abies moteriškas strobilas


•Adaptaciniai požymiai tai požymiai turintys esminę įtaką individų išlikimui (tuo pačiu ekonominei naudai).

•Šiaurėje vieni iš svarbiausių yra fenologiniai požymiai ir su jais suėjusi tolerancija šalčiui ir šalnų išvengimas, pietose- tolerancija sausrai.Fenologiniai požymiai tai medžio fiziologinių būsenų kitimo laikas metų bėgyje (augimo pradžia ir pabaiga, ramybės būsena, ūglių sumedėjimo lapsnis, ramybės būsenos praradimas)

a) b)

a) anksti pradėjęs sezoninį augimą šiaurinės Lietuvos p. eglės genotipas pakenktas pavasarinių šalnų

b) iš šaltesnio klimato atkelti p. eglės genotipo pradeda augimą anksčiau nei vietiniai.


Medienos kokybės požymiai (naudingi selekcijai):

•Medienos bazinis tankis (kietumas)

•Tracheidžių ilgis, mikrofibrilių kampas

•Celiuliozės išeiga

•Cheminės savybės

Mikrofibrilių kampas- vidutinis celiuliozės molekulių kampas ląstelės sienleje

0 50 100

200

400

600

Den

sity

(kg

/m3)

Distance (x 25µm)

Medienos Bazinis tankis priklauso nuo ląstelių sienelės storio; vėlyvos medienos (formuojamos augimo sezono pabaigoje) ląstelių sienelės yra storesnės

Tracheidžių ilgis


Rezultatų apibendrinimasRezultatų apibendrinimas

•Rezultatus galima sisteminti pagal tokius kriterijus:

– Požymį sąlygojančių QTL skaičius ir QTL įtakos stiprumas (kiek QTL sąlygoja požymį ir kokia QTL įtaka požymio išraiškai?),

– Įvairių požymių QTL išsidėstymas genome (chromosomose) (ar panašių požymių QTL yra netoli vienas kito?),

– QTL išraiškos stabilumas (ar pakartojus tyrimą su ta pačia medžiaga bus gauti tie patys QTL?).


Požymio QTL skaičius ir įtakaPožymio QTL skaičius ir įtaka

•Nors teoriškai kiekybiniai požymiai sąlygojami daugelio geno, rastas stebėtinai mažas tam tikro požymio QTL skaičius (vidurkis 2,7 QTL per požymį)

•QTL sąlygotas fenotipinio požymio kintamumo procentas vyravo nuo 4 iki 63 %= pagrinde rasta nedaug bet svarios įtakos QTL,

•Daugumai poligeninių požymių tokias išvadas sunku pritaikyti,

•Priežastis sąlyginai mažos (<150) palikuonių QTL tyrimo populiacijos (dėl aukštų DNR tyrimų kaštų) = buvo aptiktas mažesnis QTL skaičius nei iš tikrųjų bei jų įtaka fenotipiniams požymiams gauta didesnė nei iš tikrųjų

•Todėl, galutinės išvados dėl QTL skaičiaus ir įtakos darytinos tik po tolesnių QTL testavimo tyrimų

Apibendrinimas paveiksle: tam tikrą požymį sąlygojantys QTL ir jų įtaka fenotipiniam požymiui

Nustatytas tyrimais QTL skaičiusTikėtinas QTL skaičius


QTL išsidėstymas chromosomoseQTL išsidėstymas chromosomose•Principas: ta pati QTL nustatymo populiacija tiriama skirtingais žymenimis ir vertinami įvairūs fenotipiniai požymiai

•Rezultatai:

•Pagrinde, fenotipiškai susijusių požymių QTL buvo vienodose ar netolimose sankibos grupėse

•Jei QTL įtaka vienoda= vienas genas koduoja baltymą, kuris yra nors ir nevienodai bet reikalingas abiem požymiams,

•Jei QTL įtaka skirtinga: du susiję genai ar kitą bet susijusį požymi sąlygojantys genai.

•Jei fenotipiškai nesusijusių požymių QTL buvo susiję= pleotropija- vienas genas įtakoja kelis požymius.

•Pavydžiai: Eucalyptus (lapo plotas-H; medienos kietumas-stiebo suktumas-žievės masė), Castanea (ūglių plaukuotumas-stiebo spalva); Populus (įvairūs lapų požymiai)


QTL išraiškos stabilumas (1)QTL išraiškos stabilumas (1)•QTL aptikimas ir išreikštumas priklauso nuo laiko, aplinkos ir genetinių faktorių

•Laiko faktoriai: genai įjungiami tam tikrame medžių ontogenezės etape (pvz. lytinės branda)

•Aplinkos faktoriai: aplinka inicijuoja tam tikrų genų įjungimą (pvz. pumpurų ramybės būsena ar sezoninio augimo pradžia)

•Genetiniai faktoriai: kai kurie QTL būdingi tik tam tikrai šeimai; todėl vertingiausia QTL aptikti keliose šeimose

•Stiprios įtakos QTL greičiausiai yra genai įjungėjai, priimantys aplinkos signalus ir inicijuojantys kitų genų grupių veiklą (pvz. sezoniniai medžių fiziologinės būsenos pokyčiai)


QTL išraiškos stabilumas (2)QTL išraiškos stabilumas (2)•QTL nebuvo pakartotinai aptikti vienoje QTL populiacijoje:Aukštis (H) ir skersmuo (D) kelių augimo periodų (AP) metu (Populus, Pinus taeda),

Priežastys: vieno AP metu aptikti susijusių požymių QTL, kurie dėl kitokių aplinkos sąlygų ar fiziologinės būsenos buvo kitaip išreikšti ir turėjo kitokias sąsajas su medžių H ir D kito AP metu (= reikalinga mažiau kompleksinių požymių analizė, pvz. augimo ritmas vietoje aukščio)

•Buvo aptikti kelių augimo periodų metu: Lapų dėmėtligė (Populus), jaunų sėjinukų aukštis (Pinus pinaster), medienos tankis (Eucalyptus, Pinus taeda), pumpurų sprogimas (Pseudotsuga menziesi)

•Išvada: didesnis QTL stabilumas rastas adaptaciniams požymiams (priežastis= aukštesnis paveldimumas) ir rezistentiškumo kenkėjams požymiams (mažesnis kompleksiškumas).

•Patikima strategija: kandidatinių genų paieška ir jų STS ar EST žymenų gamyba ir naudojamas selekcijoje


QTL išraiškos stabilumas (3)QTL išraiškos stabilumas (3)•Požymio ir QTL sąsaja gali žymėti ir su tuo požymiu susijusių kitų požymių QTL

•Pavyzdžiui: kadangi medžių medienos bazinis tankis (medienos kietumas) yra susijęs su jų sezoninio augimo pabaigos laiku, QTL susijęs su medienos kietumu gali būti ir genų atsakingų už augimo terminaciją dalis.

•Metinė rievė susideda iš ankstyvosios (minkštos) ir vėlyvosios (kietos) medienos.

•Augimui į aukštį pasibaigus, medis tebeauga į skersmenį, suformuodamas vėlyvąja medieną; kuo ankstesnė augimo pabaiga tuo daugiau formuojama kietesnės vėlyvosios medienos. Šiaurinis

genotipas

Gegužes 1d. Liepos 1d. Rugpjūčio 1d.

Gegužes 1d. Liepos 1d. Rugpjūčio 1d.

Pietinis genotipas

Šiaurinis genotipas

Gegužes 1d. Liepos 1d. Rugpjūčio 1d. Gegužes 1d. Liepos 1d. Rugpjūčio 1d.

Gegužes 1d. Liepos 1d. Rugpjūčio 1d. Gegužes 1d. Liepos 1d. Rugpjūčio 1d.

Pietinis genotipas

Perkelti į pietus, šiauriniai genotipai sustoja augti į H anksčiau, todėl priaugina < minkštos ankstyvos medienos ir > vėlyvos (kietos) medienos.


3.3.3.3.7 Kandidatinių genų paieška7 Kandidatinių genų paieška

•Tikslas sumažinti atstumą tarp žymenų ir QTL bei identifikuoti QTL genus.

•Kandidatiniai genai tai sekvenuoti genai, kurie gali įtakoti požymio išraišką (t.y. genai sąlygojantys tikslius biocheminių procesus, pvz. enzimas kanalizuojantis lignino monomerų jungtis).

•Potencialūs kandidatiniai genai gali būti identifikuojami panaudojant žinomus QTL žymenis ir specifinių audinių cDNR bibliotekas bei naudojant tinkamas cDNR sekas kaip geno žymenis:

•įprastinėse QTL analizėse, geno efektui nustatyti.

•alternatyvių alelių sąsajų su požymiais tyrimus klonų archyvuose ar kitose polimorfinėse populiacijose= pagrindinių genų (t.y. genų, kurių polimorfizmas turi esminę įtaką fenotipui) paieška.


Pagrindiniai paieškos principaiPagrindiniai paieškos principai

Žymenų naudojimas geno patikrinimui (geno sąsajos su

fenotipiniu požymiu patikrinimas) ir polimorfizmo

studijos

1. Kandidatinius genus žyminčių žymenų kūrimas: genų ekspresijos tyrimas polimorfinių cDNR identifikacija sekų nustatymas atitikmenų paieška bibliotekose geną žyminčių žymenų kūrimas (EST ar STS)

cDNR

GTATAGGTCTCTGT

Kandidatinio geno seka

Specifinės sekos žyminčios abi geno puses naudojamos kaip žymenys

Sekvenavimas

2. Kandidatinius genus žyminčių žymenų naudojimas geno ir požymio sąsajai patikrinti ir polimorfinių geno formų (alelių identifikacijai)

Polimorfinių cDNR nusatymas

cDNR atitinkančių genų paieška bibliotekose

kelių populiacijų ir keliolikos šeimų bandymai

Alternatyvios vieno geno formos (aleliai) galai skirtis tik keliais nukleotidais:

identifikavus QTL žinoma tik viena iš šio geno formų

QTL QTL QTL


Klonų archyvas: alelių “kasykla”Klonų archyvas: alelių “kasykla”

Klonų archyvai (genotipų kopijų kolekcijos) ir tolimų populiacijų bandymai gali tarnauti kaip puiki medžiaga įvairių žinomo geno formų alelių identifikacijai. Kadangi šiuose bandymuos sukaupta nemaža dalis rūšiai atstovaujančios genetinės įvairovės.

Alternatyvios vieno geno

formos gali skirtis

nedideliu sekų

skaičiumi

Skirtingų klonų DNR molekulės su poligenais

Pinus sylvestris klonų archyvas

Žinant geno sekas (ar jo dalies sekas iš EST bibliotekų) šie archyvai gali būti naudojami kaip alternatyvių šio geno formų (alelių) “kasyklos”


SNP žymenų taikymas (1)SNP žymenų taikymas (1)• SNP ir juos žyminčios specifinės gretimos

DNR nukleotidų atkarpos randamos:

a) sekvenuojant polimorfinius PCR fragmentus, pagausintus naudojant EST žymenis polimorfinėse populiacijose (kilmės, klonų archyvai)

b) analizuojant cDNR sekų duomenų bazėse esančias genų sekas (vadinami eSNP). Paprastai SNP randamas kas 1000-2000 nukleotidų.

• Žinant SNP vietą žyminčias DNR atkarpų sekas, tolesnis SNP taikymas ženklai palengvėja naudojant DNR mirko sekas ar PCR ir automatinio sekvenavimą.

Toliau SNP identifikuojami pagal tam pagamintus žymenis (specifines DNR sekas abiejose SNP šonuose) ir naudojami geno polimorfizmo paieškoje

SNP žymuo

CTCAGACAGAGTCTGT

Vieno nukleotido pokytis

Genotipas B

GAGTATGT


SNP žymuo

CTCATACAGenotipas A

SNP žymuo SNP žymuo

GAGTCTGTCTCAGACA

EST žymenys (PCR pradai) identifikuojantys geną

CTCAGACAGAGTCTGT

Išreikšto geno dalis (cDNR dalis)

PCR pagausimas ir sekvenavimas

Polimorfinės populiacijos genotipų

analizė ir SNP atradimas

QTL

QTL

QTL


SNP žymenų taikymas (2)SNP žymenų taikymas (2)1. SNP žymenų naudojimas geno (cDNR) polimorfizmo nustatymui polimorfinėje populiacijoje.

Išreikštų skirtingų fenotipų atranka polimorfinėje populiacijoje (klonų archyvas ar tolimų populiacijų bandymas)

Polimorfinės populiacijos

pavyzdys: Pinus sylvestris klonų

archyvas

Alternatyvios vieno geno formos gali

skirtis nedideliu

sekų skaičiumi

Skirtingų klonų DNR molekulės su poligenais

Alternatyvios vieno geno formos gali

skirtis nedideliu

sekų skaičiumi

Skirtingų klonų DNR molekulės su poligenais2. PCR produktų sekvenavimas ir SNP polimorfizmo nustatymas

Elektroforezės gelis Bakterijos

Fragmentai izoliuojami iš gelio ir terpiami į bakterijų plazmides (saugojimui) ir sekvenuojami taip nustatant SNP polimorfizmą, kuris lyginamas su fenotipu.

SNP žymuo

CTCAGACAGAGTCTGT


Genotipas B

SNP žymuo

CTCAGACAGAGTCTGT


Genotipas B

GAGTATGT


SNP žymuo

CTCATACAGenotipas A

SNP žymuoGAGTATGT


SNP žymuo

CTCATACAGenotipas A

SNP žymuo

CTCATACAGenotipas A

SNP žymuo

Alternatyviai naudojama hibridizacija su žinomų genų cDNR DNR mirko gardelėse

Sekvenatorius

SNP žymenys

Ypač efektyvus metodas svarių genų (major genes) identifikavai (t.y. genų kurių polimorfizmas turi esminę įtaką fenotipinio požymio išraiškai); būtent svarių genų nustatymas naudingas selekcijai.


Miško medžių klonų archyvaiMiško medžių klonų archyvai

Du skirtingo šakojimosi tipo klonai paprastosios eglės klonių

archyve (genus žymintis požymis – šakojimosi tipas) (Šlėnava)

Poskiepis ir įskiepis genetiškai skirtingi ir pradega augimą skirtingu laiku: genus

žymintis požymis pumpurų sprogimo laikas

Miško medžių klonų archyvai tai sistematikiškai išdėstyti genotipų kopijų želdinai, skirti vertingų genų išsaugojimui


3.3.3.3.8 QTL naudojimas selekcijoje8 QTL naudojimas selekcijojeMolekulinių žymenų, patikimai susijusių su tam tikrais požymiais, naudojimas atrenkant individus vadinamas atranka žymenų pagalba (ang. marker assisted selection (MAS)).





A

BC

A B C

Lauko bandymas: kuris iš jaunų medelių turės kietą medieną?

Laboratorinių DNR tyrimų rezultatas: elektroforezės gelis

Pavyzdys: reikia atrinkti kietos medienos genotipus jauname amžiuje

QTL žymuo naudojamas laboratorinėse analizėse, kurių rezultate nustatomi požymiui specifiniai DNR fragmentai


MAS nauda selekcijojeMAS nauda selekcijoje

Pavyzdys: medžių aukštis, sąlygojamas 4 genų, kurių reikšmė išreikšta skaitine verte; požymio vertes įtakoja aplinka taip suformuodama fenotipą

11 1 4

11 2 5

11 3 9

7

9

12

+6

+5

-5

13

14

7

A

B

C

Gen

oti

pas

Ap

lin

ka

Fen

oti

pas 42 1 4

11 2 5

13 3 15

16

9

15

-6

+7

+4

13

17

7

Gen

oti

pas

Ap

lin

ka

Fen

oti

pas

Poligenai

QTL QTL

Reali padėtis: žinomos genų vertės, genotipas, aplinka ir fenotipas

Matoma vertinant: žymenų sąsajos su QTL ir fenotipo matavimo duomenys

Informacija apie žymenų sąsają su QTL ženkliai padidintų atrankos efektyvumą (padėtų identifikuoti pranašius individus).


MAS efektyvumas MAS efektyvumas

•Tam, kad nustatyti QTL ir panaudojimo galimybės tam tikroje selekcinėje populiacijoje, galima kryžminti QTL nustatymui naudotą šeimą su visos selekcinės populiacijos narių žiedadulkių miškiniu ir sekti QTL žymens rekombinacijos dėsningumus palikuonyse

•QTL panaudojimas efektyviausias žemo paveldimumo požymiams arba požymiams kurių nustatymui riekia daug laiko (reprodukciniai požymiai, medienos kokybė)

•Jei žinomi dviejų požymių žymenys, efektyvu juos panaudoti nustatant kurie iš palikuonių paveldėjo abu požymius kontroliniuose kryžminimuose

•Rastam QTL suteikiamas svorinis indeksas pagal procentą paaiškinto tikslinio požymio kintamumo.


Literatūros sąrašasLiteratūros sąrašas•Bahrman N, Damerval C (1989) Linkage relationships of loci controlling protein amounts in maritime pine (Pinus pinaster Ait.). Heredity 63: 267-274

•Binelli G, Bucci G (1994) A genetic linkage map of Picea abies Karts., based on RAPD markers, as a tool in population genetics. Theor Appl Genet 88: 283-288

•Benfey, P. 2004. Essentials of Genomics. Prentice Hall ISBN: 0130470198.

•Cato, S.A, Gardenr, R.C., Kent, UJ., Richardson T.E. 2001. A rapid PCR-based method for genetically mapping ESTs. Theoretical and Applied Genetics 102: 296-306.

•Carlson JE, Tulsieram LK, Glaubitz JC, Luk VWK, Kauffeld C, Rutledge R (1991) Segregation of random amplified DNA markers in F1 progeny of conifers. Theor Appl Genet 83: 194-200

•Devey ME, Bell JC, Smith DN, Neale DB, Moran GF (1996) A genetic map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD and microsatellite markers. Theor Appl Genet 92: 673-679

•Devey ME, Fiddler TA, Liu BH, Knapp SJ, Neale BD (1994) An RFLP linkage map for loblolly pine based on a three-generation outbred pedigree. Theor Appl Genet 88: 273-278

•Falconer, D.S. and Mackay, T. F.C. 1996. Introduction to Quantitative Genetics (4th Edition). Prentice Hall, ISBN: 0582243025.

•FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification. Forest Genetic Resources Working Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.

•Grattapaglia D, Sederoff R (1994) Genetic linkage maps of Eucalyptus grandis and E. urophylla using a pseudo-testcross mapping strategy and RAPD markers. Genetics 137: 1121-1137

•Grattapagia, D.F., Bertolucci, R., Pencher, R., Sederoff, R. 1996. Genetic mapping of QTLs controlling growth and wood quality traits of Eucalyptus grandis using a materal half sib family and RAPD markers. Genetics 144: 1205-1214.

•Harry DE, Neale DB (1994) PCR-based genetic markers for loblolly pine developed from cloned cDNAs. The International Conference on the Plant Genome II, 24-27 january. San Diego, CA poster # 76

•Hutchison K, Singer P, Volkaert H, Deker A, Costello L, Greenwood M (1994) A PCR-based molecular genetic map for the conifer Larix decidua. The International Conference on the Plant Genome II, 24-27 january. San Diego, CA poster # 90


•Kumar, S. and Fladung, M. 2004. Molecular Genetics and Breeding of Forest Trees. Food Products Press, ISBN: 1560229594.

•Krutovskii, K.V., Neale, D. B. Forest genomics for conserving adaptive genetic diversity. Forest Genetic Resource Working Paper FGR/3(E), FAO, Rome Italy.

•Liu, B.-H. 1998. Statistical Genomics: linkage, mapping and QTL analysis. CRC Press, New Yourk.

•Lehner A, Campbell MA, Wheeler NC, Pöykkö T, Glössl J, Kreike J, Neale DB (1995) Identification of a RAPD marker linked to the pendula gene in Norway spruce (Picea abies (L.) Karst. f. pendula). Theor Appl Genet 91: 1092-12094

•Mei-Ling Ting Lee. 2004. Analysis of Microarray Gene Expression Data. ISBN: 0792370872. Springer.

•Michelmore R, Paran I, Kesseli RV (1991) Identification of marker linked to disease resistance gene by bulk segregant analysis : a rapid mathod to detect markers in specific genomic regions using segregating populations. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9828-9832

•Paran I, Michelmore RW (1993) Development of reliable PCR-based markers linked to downy resistance genes in lettuce. Theor Appl Genet 85: 985-993

•Paterson, A. H. 1997. Molecular Dissection of Complex Traits. CRC-Press; 1 edition ISBN: 0849376866.

•Paterson, A. H. 1995. Molecular Dissection of Quantitave traits: Progress and Prospects. Genome Research 3: 321-333.

•Plomion C, Bahrman N, Durel C-E, O'Malley DM (1995a) Genomic mapping in Pinus pinaster (Maritime pine) using RAPD and protein markers. Heredity 74: 661-668

•Sewell, M.M, Neatle, D. 2000. Mapping quasntitative trait sin forest trees. In: Molecular biology of woody plants. Forestry Sciences, Vol. 64 (S.M. Jain and S.C. Minocha eds.) pp. 407-423.

•Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius, ISBN 9986-433-36-3.

•Smith DN, Devey ME (1994) Occurrence and inheritance of microsatellites in Pinus radiata. Genome 37: 977-983

•Wakamiya I, Newton RJ, Johnston JS, Price HJ (1993) Genome size and environmental factors in the genus Pinus. Am J Bot 80: 1235-1241.

•Wilcox PL (1995) Genetic dissection of fusiform rust resistance in loblolly pine. Ph D thesis, North Carolina State University, 125p

•Verhaegen, D.C., Plomion, J-M., Gion, M. Kremer, A. 1997. Quantitative trait dissection analysis in Eucalyptus using RAPD markers. Theor. Applied Genetics 95: 597-608.

•Yazdani R, Yeh F, Rimsha J (1995) Genomic mapping of Pinus sylvestris (L.) using random amplified polymorphic DNA markers. For Genet 2: 109-116

lietuvos miŠkŲ institutas darius danusevičius 3.3 kiekybinių požymių lokusų (qtl)...

Documents