ligamiento y recombinación ii · experimentos de creighton y mc clintock 1932: estudios de...
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Ligamiento y Recombinación II
Base física de la recombinación
El cromosoma es la unidad de transmisión
en la meiosis
C. Bridges: cr. X asociado al color de los
ojos de Drosophila
N. Stevens yE. Wilson: determinación
cromosómica del sexo en insectos
Experimentos de Creighton y Mc Clintock
1932: estudios de ligamiento en maíz. Evidencia
física de la recombinación. Demostración de
intercambio de segmentos entre cromosomas
homólogos con técnicas citogenéticas
Experimentos de Creighton y Mc Clintock
Línea de maiz dihíbrida con el par de crs. 9
heteromórfico
Botón de tinción densa porción de otro cr.
Experimentos de Creighton y Mc Clintock
Par 9: genes de color y tipo de
grano
C wx
c Wx
C= grano coloreado
c= grano blanco
wx= grano ceroso
Wx= grano amiláceo
Experimentos de Creighton y Mc Clintock
Gametas esperadas:
Coloreado ceroso
C wx
c Wx
Blanco amiláceo
Experimentos de Creighton y Mc Clintock
Cromosomas resultantes del crossing-over
Experimentos de Creighton y Mc Clintock
Cromosomas resultantes del crossing-over
Experimentos de Creighton y Mc Clintock
Cruzamiento de prueba
¿Existen entrecruzamientos entre
cromátidas hermanas?
Demostración de entrecruzamientos
entre cromátidas hermanas con técnicas
de tinción diferencial:
Cromosomas arlequín:
2 fases de síntesis en presencia de
bromodesoxiuridina, análogo de Timina. Se
tiñen los cromosomas (Giemsa + colorante
fluorescente). Las cromátides con el análogo
en ambas cadenas se tiñen más claro; aquellas
con una hebra original y otra con BdU se tiñen
más fuerte.
Demostración de entrecruzamientos
entre cromátidas hermanas
Cromosomas arlequin
Comprobación estadística de la
existencia de ligamiento
Cálculo de chi cuadrado en un cruzamiento
de prueba de un dihíbrido
Planteo de hipótesis:
H0: segregación independiente
Las cuatro clases fenotípicas en la descendencia se encuentran
en proporciones iguales, de ¼ cada una. Valor de chi cuadrado
menor o igual al de tabla
H1: no se cumple la proporción de ¼ cada clase
Las proporciones observadas responden a otra causa. El valor
de chi cuadrado obtenido se aparta de las probabilidades. Valor
mayor al de tabla.
Cálculo de chi cuadrado en un cruzamiento
de prueba de un dihíbrido
Clases fenotípicas n observado n esperado (O-E)2/E
A- B- 45 65,25 6,28
A- bb 91 65,25 10,56
aaB- 86 65,25 6,60
aabb 39 65,25 10,56
Total 261 34,00
Grados de libertad = clases fenotípicas – 1 = 4-1 = 3
Para α = 0,05 Valor de tabla = 7,8147
No se cumple H0
¿Por qué no se cumple H0?
1- ¿hay una alteración en la segregación del gen A?
2- ¿hay una alteración en la segregación del gen B?
3- ¿ambos genes están ligados?
Cálculo de chi cuadrado para el gen A
Planteo de hipótesis:
H0: la segregación de los alelos del gen A responde
a lo esperado según leyes mendelianas (½ cada
una). Chi cuadrado menor o igual al de tabla
H1: no se cumple la proporción de 1/2 cada clase,
las proporciones observadas responden a otra
causa.
Chi cuadrado: se aparta de las probabilidades (valor
mayor al de tabla).
Cálculo de chi cuadrado para el gen A
Clases fenotípicas n observado n esperado (O-E)2/E
A- 45 + 91 = 136 130,5 0,0421
aa 86 + 39 = 125 130,5 0,0421
Total 261 0,0842
Grados de libertad = clases fenotípicas – 1 = 2-1 = 1
Para α = 0,05 Valor de tabla = 3,8415
Se cumple H0
Cálculo de chi cuadrado para el gen B
Planteo de hipótesis:
H0: la segregación de los alelos del gen B responde
a lo esperado según leyes mendelianas (½ cada
una). Chi cuadrado menor o igual al de tabla
H1: no se cumple la proporción de 1/2 cada clase,
las proporciones observadas responden a otra
causa.
Chi cuadrado: se aparta de las probabilidades (valor
mayor al de tabla).
Cálculo de chi cuadrado para el gen B
Clases fenotípicas n observado n esperado (O-E)2/E
B- 45 + 86 = 131 130,5 0,0038
bb 91 + 39 = 130 130,5 0,0038
Total 261 0,0076
Grados de libertad = clases fenotípicas – 1 = 2-1 = 1
Para α = 0,05 Valor de tabla = 3,8415
Se cumple H0
Chi cuadrado de ligamiento
Chi cuadrado de ligamiento =
Chi cuadrado total – Chi del gen A – Chi del gen B
= 34 - 0,0842 – 0,0076 = 33, 9082
Grados de libertad = 3 - 1 - 1 = 1
Para α = 0,05 Valor de tabla = 3,8415
No se cumple H0
Los genes están ligados
Tabla de chi cuadrado
Análisis de una Filial 2
proveniente de F1xF1
Fenotipos Genotipos
AABB + AABb + AaBB + AaBb
Aabb + Aabb
aaBB + aaBb
aabb
F1 x F1
Fenotipos
AB Ab aB ab
AB
Ab
aB
ab aabb
Análisis de la F2
Fenotipo observado Genotipos
A-B- AABB,AABb,
AaBB, AaBb
A-bb AAbb, Aabb
aaB- aaBB, aaBb
aabb aabb
No se pueden identificar los 2 genotipos recombinantes
Análisis de la F2
Parentales en repulsión (trans)
AB Ab aB ab
AB
Ab
aB
ab aabb
aabb es una combinación nueva (recombinante)
aabb = ¼ r2
½ r
½ (1-r)
½ (1-r)
½ r
½ r ½ (1-r) ½ (1-r) ½ r
Análisis de la F2
Parentales en repulsión (trans)
aabb es una combinación nueva (recombinante)
¼ r2 = aabb
total
r2 = aabb x 4
total
r = Ѵ aabb x 4
total
Análisis de la F2
Parentales en repulsión (trans)
Análisis de la F2
Parentales en acoplamiento (cis)
AB Ab aB ab
AB
Ab
aB
ab aabb
aabb es una combinación parental
aabb = ¼ (1-r)2
½ (1-r)
½ r
½ r
½ (1-r)
½ (1-r) ½ r ½ r ½ (1-r)
Análisis de la F2
Parentales en acoplamiento (cis)
aabb es una combinación parental
¼ (1-r)2 = aabb
total
(1-r)2 = aabb x 4
total
1-r = Ѵ aabb x 4
total
r = 1 - Ѵ aabb x 4
total
Análisis de la F2
Parentales en acoplamiento (cis)
Frecuencias de recombinación
según las combinaciones parentales
Prueba de 3 puntos
Prueba de 2 puntos:
cuando están muy alejados no se detectan dobles
crossing over
Pérdida de información entre ambos loci:
crossing over dobles entre A y C no se perciben
Prueba de 3 puntos
Incorporación de un gen entre A y C
Prueba de 3 puntos
Prueba de 3 puntos
Fenotipos Observados
triple salvaje 5.701
triple mutante 5.617
A-bbcc 388
aaB-C- 367
A-B-cc 1.412
aabbC- 1.383
A-bbC- 60
aaB-cc 72
15.000
Las clases recíprocas presentan frecuencias parecidas
Prueba de 3 puntos
Fenotipos Observados
triple salvaje 5.701
triple mutante 5.617
A-bbcc 388
aaB-C- 367
A-B-cc 1.412
aabbC- 1.383
A-bbC- 60
aaB-cc 72
15.000
132 dobles rec.
rec. Simples A-B
rec. Simples B-C
Prueba de 3 puntos
Distancia A-B=
(388+367+132)/15.000*100= 5,91%
•Distancia B-C=
•(1.412+1.383+132)/15.000*100= 19,51%
* Distancia A-C=
(755*+2795*+2*132)/15.000*100=25,42%
Mapa de ligamiento
Representación gráfica que determina el
locus en posición central y establece las
distancias
A B C
a b c
5,91cM 19,51cM
25,42cM
Coeficiente de coincidencia
¿un entrecruzamiento en una determinada región
favorece o impide que se den más entrecruzamientos
en esa región?
Obs = 132/15000 = 0,0088
Esp = 0,059 * 0,195 = 0,0115
Observados
Fenotipos Observados
triple salvaje 5.701
triple mutante 5.617
A-bbcc 388
aaB-C- 367
A-B-cc 1.412
aabbC- 1.383
A-bbC- 60
aaB-cc 72
15.000
132 dobles rec.
Interferencia
+ : se observan menos entrecruzamientos dobles
que los esperados
- : se observan más entrecruzamientos dobles que
los esperados
I = 1 - c
0 : no hay interferencia
Técnicas de mapeo de genes
Mapas de ligamiento: mapeo con
frecuencias de recombinación
- resume toda la información: orden y distancia
entre genes
- constituye el mapa de un grupo de ligamiento, e
incluye todos los genes que se localizan en un
cromosoma particular.
- se obtiene el mismo mapa genético sin importar
cuál de los progenitores aportó un alelo particular, y
no resultan modficados si la fase de ligamiento es
en acoplamiento o en repulsión (cis o trans).
Mapas cromosómicos por hibridación de
células somáticas
Fusión in vitro de 2 líneas celulares somáticas de
especies diferentes de mamíferos
Línea celular somática: células tumorales o células
modificadas por virus
Fusión celular por tratamiento con polietilenglicol
Mapas cromosómicos por hibridación de
células somáticas
Fusión de células de humano y ratón: pérdida de
cromosomas en las células híbridas.
Los cromosomas que se van perdiendo pertenecen
exclusivamente a uno de los conjuntos parentales.
En híbridos humano/roedor:
se pierden los humanos
Mapas cromosómicos por hibridación de
células somáticas
Línea Proteína Cr.1 Cr.2 Cr.3 Cr.4 Cr.5 Cr.6 Cr.7 Cr.8 Cr.9 Cr.10 Cr.11 Cr.12 Cr.13 Cr.14 Cr.15 Cr.16 Cr.17 Cr.18 Cr.19 Cr.20 Cr.21 Cr.22 Cr.X Cr.Y
1 sí + + + + + + +
2 sí + + + + + + + +
3 no + + + + + + +
4 sí + + + + + + + +
5 no + + + + + +
6 sí + + + +
Panel de líneas híbridas humano/ratón estables
permite asociar uno o varios fenotipos con un cromosoma
particular
Técnicas moleculares
Hibridación de sondas
Técnicas moleculares
Secuenciación directa
Técnicas moleculares
Secuenciación directa